Technisches Gebiet
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Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines
therapeutischen Mittels, das aus Interferon-γ vom Hund besteht, für die
Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von hartnäckiger
Hundedermatitis.
Allgemeiner Stand der Technik
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Interferon-γ (hier nachstehend als "IFN" bezeichnet) wird
hauptsächlich von T-Zellen erzeugt und hat bekanntlich drei hauptsächliche
Funktionen, d. h. eine antivirale Aktivität, eine Aktivität gegen die
Zellproliferation bzw. -wucherung und die Immunosteuerung (Referenz
1). Mit der neuesten Entwicklung in der Genmanipulationstechnik
wurden nicht nur Human-LFN-Gene sondern auch IFN-Gene vom Tier,
wie vom Rind, Pferd und der Katze, abgetrennt, und in bezug auf
Hunde wurde von IFN-α, -β und -γ berichtet (Referenzen 2 und 3). Im
Vergleich mit Human-IFN-γ oder IFN-γ von der Maus wurden jedoch
aus in vitro und in vivo Untersuchungen bei IFN-γ vom Hund nur
wenige Erkenntnisse erhalten (Referenz 12), und es gibt keinen
Bericht, IFN-γ vom Hund als therapeutisches Mittel für bestimmte
Hundekrankheiten zu verwenden.
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Beim Menschen wurde IFN-γ bereits als therapeutisches Mittel für
bösartige Tumore praktisch verwendet, und in Hinblick auf
Hauterkrankungen berichteten Hanifin et al. (Referenz 4) und Rheinhold et al.
(Referenzen 5 und 6) und WO 91/07984 von dessen Wirksamkeit bei
der Behandlung von atopischer Dermatitis und einem von Steroiden
abhängigem
Asthma. Aus folgenden Gründen gibt es jedoch in Hinblick
auf die Verwendung von Human-IFN-γ für atopische Dermatitis beim
Menschen Zweifel (Referenz 7): für die effektive Behandlung
atopischer Dermatitis beim Menschen mit Human-IFN-γ ist eine tägliche
Verabreichung sechs Wochen hintereinander oder länger erforderlich;
IFN-γ hat Nebenwirkungen, wie Fieber und Kopfschmerz, und führt bei
den Patienten zu einer ziemlich starken Belastung, wohingegen seine
Wirkungen relativ gering sind; und IFN-γ-Formulierungen sind teuer.
Bei der Dermatitis beim Menschen wurden Diagnosekriterien
aufgestellt (Referenz 8), und ein genetischer Hintergrund wird als
wichtiges Kriterium angesehen. Außerdem ist bekannt, daß atopische
Dermatitis beim Menschen eine allergische Reaktion vom Typ I ist, bei
der die Erzeugung einer Überschußmenge von IgE als Reaktion auf
Lebensmittel, Schuppen von Tieren, Insektengiften und dergleichen
sehr stark beteiligt ist (Referenz 9). Es gab jedoch keine
systematischen Untersuchungen zur atopischen Hundedermatitis (Referenz 13).
Deshalb sind die Auswertungskriterien unklar, und der Zusammenhang
zwischen der Erzeugung eines IgE-Überschusses beim Hund und der
atopischen Dermatitis ist nicht klar.
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Im allgemeinen schließen Hauterkrankungen von Hunden Ekzeme,
Urtikarie, allergische Dermatitis, traumatische Dermatitis, Räude,
Gehörgangsentzündung, eine den Pruritus betreffende Dermatitis und
dergleichen ein. Herkömmlich wurden für die vorstehend genannten
Erkrankungen folgende Mittel verwendet: Antihistamine
(Diphenhydramine), Antiphlogistika (Dibucainhydrochlorid, usw.),
Insektizide und Bakteriozide (Malathion, Benzalkoniumchlorid, usw.)
und Steroide (Dexamethason, usw.).
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Bei den herkömmlichen therapeutischen Mitteln, die für die
Behandlung von Hauterkrankungen beim Hund verwendet wurden, gibt es
jedoch bei der Verwendung von nicht-steroiden Mitteln Nachteile, da
deren Wirkungen unzureichend sind und deren therapeutische Effekte
sehr gering sind, und obwohl steroide Mittel extrem starke
pharmakologische Effekte haben, zeigen sie gelegentlich Nebenwirkungen, wie
eine Zunahme von Infektionen in den erkrankten Bereichen und eine
verstärkte Brüchigkeit der Gefäßwände, und bei einer
Langzeitanwendung können sie aufgrund von Einflüssen auf andere Organe zur
Fettsucht oder systematischen Nebenwirkungen führen.
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Im allgemeinen können Hauterkrankungen beim Hund als auch beim
Menschen wegen der schlechten häuslichen Bedingungen nicht geheilt
werden; deshalb werden Hunde häufig mit wiederholten Dosen der
vorstehend beschriebenen herkömmlichen therapeutischen Mittel
behandelt. Die Behandlungszeiträume sind somit lang, und gelegentlich
werden die Erkrankungen nicht vollständig geheilt, selbst wenn die
Behandlung mehr als ein halbes Jahr andauert, und in einigen Fällen
wird die Behandlung über einige Jahre ausgedehnt, was zu einer
starken Belastung für den Hundebesitzer führt. Deshalb besteht Bedarf
nach einem therapeutischen Mittel mit einer starken und anhaltenden
Wirkung bei hartnäckiger Hundedermatitis, die durch eine
Langzeitbehandlung mit herkömmlichen therapeutischen Mitteln nicht
vollständig geheilt werden kann.
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Somit besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der
Bereitstellung eines wirksamen therapeutischen Mittels für hartnäckige
Hundedermatitis.
Offenbarung der Erfindung
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Die hier genannten Erfinder gelangten zur vorliegenden Erfindung,
indem sie feststellten, daß Hauterkrankungen beim Hund, die nach dem
Stand der Technik schwer geheilt werden konnten, deutlich verbessert
wurden, wenn eine Formulierung von IFN-γ vom Hund verabreicht
wird. Mit anderen Worten besteht die Aufgabe der vorliegenden
Erfindung in der Bereitstellung eines therapeutischen Mittels, das IFN-γ
vom Hund als Wirkstoff enthält, für die Herstellung eines Medikaments
für die Behandlung von hartnäckiger Hundedermatitis.
Beste Art und Weise der Durchführung der Erfindung
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Das in der vorliegenden Erfindung verwendete IFN-γ vom Hund ist
zum Beispiel ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die mit der
Sequenzidentifizierungsnummer 1 bis 6 dargestellt ist. Selbst wenn
diese Aminosäuresequenz die Substitution, Insertion oder Deletion von
einem oder mehreren Aminosäureresten aufweist, liegt das Polypeptid
jedoch innerhalb der vorliegenden Erfindung, solange es die
biologische Aktivität des ursprünglichen IFN-γ zeigt, wie sie in der Referenz
1 angegeben ist, der Grund ist, daß das Polypeptid in diesem Fall als
mit der vorliegenden Erfindung ähnlichen Effekten angesehen wird.
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Obwohl IFN-γ vom Hund durch ein Isolations- und
Reinigungsverfahren von natürlichen Biomaterialien, durch chemische Synthese oder
durch Genrekombinationsverfahren erzeugt werden kann, ist die
Verwendung von IFN-γ vom Hund, das durch Genrekombinationsverfahren
erzeugt worden ist, aus ökonomischer Sicht bevorzugt. Das Verfahren
zur Herstellung von IFN-γ vom Hund durch
Genrekombinationsverfahren ist nicht besonders begrenzt, IFN-γ von. Hund kann zum
Beispiel hergestellt werden, indem Wirtszellen oder Wirtstiere
verwendet werden, in die ein Gen, das die Aminosäuresequenz von IFN-γ
vom Hund, die mit der Sequenzidentifizierungsnummer 1 bis 6
dargestellt ist, vollständig oder teilweise codiert, durch ein bereits
anerkanntes herkömmliches Verfahren aufgenommen worden ist. Zum
Beispiel kann nach der Proliferation von Escherichia coli, in die die cDNA
der ganzen oder eines Teils der Basensequenz von IFN-γ vom Hund,
die in der Sequenzidentifizierungsnummer 1 bis 6 gezeigt ist,
aufgenommen worden ist, IFN-γ vom Hund durch Abtrennung und
Reinigung von Bakterienzellen oder Überständen von
Bakterienkulturen erhalten werden. Nach der Infektion einer gezüchteten Insektenzellinie,
wie Zellen von Spondoptera frugiperda und Bombyx mori oder
Seidenraupen mit dem Baculovirus, in die die cDNA der gesamten oder
eines Teils der Basensequenz von IFN-γ vom Hund, die in der
Sequenzidentifizierungsnummer 1 bis 6 gezeigt ist, aufgenommen
worden ist, kann zudem IFN-γ vom Hund durch Abtrennung und
Reinigung aus den gezüchteten Zellen, den Überständen von Zellkulturen
oder der Hämolymphe der Seidenraupen erhalten werden. In den
vorstehenden Fällen ist die Basensequenz des IFN-γ vom Hund nicht auf
die Sequenzidentifizierungsnummer 1 bis 6 begrenzt, solange sie in die
Aminosäuresequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 1 bis 6
aufgenommen werden kann. Außerdem kann IFN-γ vom Hund, das der
vorliegenden Erfindung ähnliche Effekte hat, unter Verwendung der
cDNA erzeugt werden, die eine ein Polypeptid kodierende
Basensequenz hat, selbst wenn die Aminosäuresequenz eine Substitution,
Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäurenresten
aufweist.
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Das Verfahren zur Isolation und Reinigung von IFN-γ vom Hund, das
durch Genrekombinationsverfahren erzeugt worden ist, ist nicht
besonders begrenzt, und es können herkömmliche
Proteinreinigungsverfahren angewendet werden. Mit der antiviralen Aktivität von IFN-γ
vom Hund als Index kann IFN-γ vom Hund zum Beispiel gereinigt und
abgetrennt werden, wenn die folgenden Verfahren zum Entsalzen oder
Konzentrieren kombiniert werden: Chromatographie unter Verwendung
von Kieselgelträgern, Ionenaustauschträgern, Gelfiltrationsträgern,
Chelatträgern, Pigment-Ligand-Trägern oder dergleichen;
Ultrafiltration; Gelfiltration; Dialyse; Aussalzen und dergleichen. Im
vorstehend genannten Verfahren kann die antivirale Aktivität von IFN-γ
vom Hund nach dem CPE-Verfahren der Referenz 10 gemessen werden,
wobei der vesikuläre Stomatitisvirus (VSV) als Virus und MDCK vom
Hund (ATCC CCL-34) als empfindliche Zellen verwendet werden.
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In der vorliegenden Erfindung wird die hartnäckige Hundedermatitis
als eine Gruppe von Hauterkrankungen definiert, die durch Behandlung
mit herkömmlichen therapeutischen Mitteln für Hauterkrankungen beim
Hund über mindestens mehr als ein halbes Jahr nicht deutlich
verbessert werden oder die wieder auftreten, nachdem die Symptome
einmal vermindert worden waren; Beispiele herkömmlicher
therapeutischer Mittel für die Behandlung von Hauterkrankungen beim
Hund sind folgende: von außen auf die Haut aufgebrachte bakteriozide
Desinfektionsmittel, Antihistamine, Steroidhormone, Analgetika,
Antipuriginosa, Adstringens, entzündungshemmende Mittel und Mittel
für parasitäre Hauterkrankungen. Die hartnäckige Hundedermatitis
wird durch Steroidhormone häufig nicht deutlich verbessert, oder
selbst wenn die Symptome geringer werden, treten sie nach dem Ende
der Verabreichung bald wieder auf. Hartnäckige Hundedermatitis
schließt allergische Dermatitis, Pemphigus, hypertrophe Dermatitis,
Mycodermatitis, atopische Dermatitis, hartnäckiges
Arzneimittelexanthem und dergleichen ein.
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Zusätzlich zum IFN-γ vom Hund kann das therapeutische Mittel für
hartnäckige Hundedermatitis, das in der vorliegenden Erfindung
verwendet wird, wahlfrei andere Komponenten enthalten. Die dem
Mittel zugesetzten Komponenten werden hauptsächlich in Abhängigkeit
vom Verabreichungsweg bestimmt. Wenn das Mittel als Feststoff
verwendet wird, können zum Beispiel Füllstoffe, wie Lactose,
Bindemittel, wie Carboxymethylcellulose und Gelatine, Färbemittel und
Beschichtungsmittel, verwendet werden; ein solches Mittel, das in fester
Form vorliegt, kann für die orale Verabreichung geeignet sein.
Außerdem kann das Mittel eine Formulierung sein, die extern auf die
Schädigungen aufgebracht wird, wie eine Creme, eine Lotion, ein Latex und
dergleichen, indem Träger oder Exzipientien, wie weißes Petrolatum,
Cellulosederivate, oberflächenaktive Mittel, Polyethylenglycol, Silicon
oder Olivenöl, zugesetzt werden. Wenn das Mittel als Flüssigkeit
verabreicht wird, kann es im allgemeinen verwendete physiologisch
verträgliche Lösungsmittel, Emulgatoren und Stabilisatoren enthalten.
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Beispiele von Lösungsmitteln sind Wasser, PBS und eine isotonische
physiologische Kochsalzlösung; Beispiele der Emulgatoren sind
oberflächenaktive Mittel aus Polyoxyethylen, oberflächenaktive Mittel
aus einer Fettsäure und Silicon; und Beispiele der Stabilisatoren sind
Proteine, wie Serumalbumin vom Hund, und Gelatine, Polyole, wie
Polyethylenglycol und Ethylenglycol, und Saccharide, wie Sorbitol und
Trehalose. Obwohl der Verabreichungsweg des erfindungsgemäßen
therapeutischen Mittels nicht besonders begrenzt ist, können durch
Injektion stärkere therapeutische Wirkungen erwartet werden. Es kann
irgendein Injektionsverfahren angewendet werden, einschließlich der
intravenösen Verabreichung, der intramuskulären Verabreichung, der
subkutanen Verabreichung, der intraperitonealen Verabreichung und
der intrapleuralen Verabreichung, die subkutane Verabreichung ist
jedoch bevorzugt, da deren Verfahren einfach ist und bei den
erkrankten Hunden weniger Streß hervorruft.
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Obwohl die Behandlungsdosis je nach Größe des Individuums,
Verabreichungsweg, Symptomen und dergleichen geeignet bestimmt wird,
wird im allgemeinen eine Dosierung verabreicht, die ausreicht, um die
Symptome der hartnäckigen Hundedermatitis zu verringern. Im
Hinblick auf die Effektivität und aus ökonomischer Sicht zeigt zum
Beispiel eine Verabreichung von 0,002 bis 1,0 ME/kg IFN-γ vom Hund
und vorzugsweise von 0,005 bis 0,5 ME/kg pro Tag ausreichende
Wirkungen. Vorstehend ist kg die Einheit für das Gewicht des
erkrankten Hundes und U ist eine Zahleneinheit, die durch die antivirale
Aktivität von IFN-γ bestimmt wird, die nach dem CPE-Verfahren der
Referenz 10 wie folgt gemessen wird, wobei der vesikuläre
Stomatitisvirus (VSV) als Virus und MDCK vom Hund (ATCC CCL-34) als
empfindliche Zellen verwendet werden: die Menge von IFN-γ, die die
zytopatische Wirkung von VSV gegen MDCK vom Hund (ATCC CCL-
34) um 50% verringern kann, wird als eine Einheit definiert.
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Außerdem wird auch die Häufigkeit der Verabreichung in Abhängigkeit
von der Größe des Individuums, dem Verabreichungsweg, den
Symptomen und dergleichen bestimmt, es wird jedoch allgemein
angenommen, daß durch die ein- oder zweimalige Verabreichung pro
Woche die Symptome in der zweiten Woche nach Beginn der
Behandlung deutlich abnehmen. Obwohl es möglich ist, die Häufigkeit
oder die Anzahl der Verabreichung zu verändern, wobei der
Behandlungsverlauf beobachtet wird, ist in Hinblick auf das Ausmaß der
Belastung für den Hundebesitzer und die therapeutische Wirkung eine
zwei- bis zehnmalige Verabreichung alle zwei Tage oder sieben Tage
bevorzugt.
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Bei diesem Behandlungsverfahren kann ein herkömmliches
therapeutisches Mittel für die Behandlung von Hauterkrankungen beim Hund
hilfsweise in Kombination verwendet werden. In diesem Fall werden
die in der vorliegenden Erfindung verwendeten therapeutischen Mittel
mit anderen Mitteln verabreicht, die aus Antihistaminen
(Diphenhydraminen), Antiphlogistica (Dibucainhydrochlorid, usw.),
Insektiziden und Bakterioziden (Malathion, Benzalkoniumchlorid, usw.),
Steroiden (Dexamethason, usw.) und dergleichen ausgewählt sind.
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Wie vorstehend ausführlich erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung
die Verwendung eines therapeutischen Mittels für die Herstellung eines
Medikaments für die Behandlung von hartnäckiger Hundedermatitis
bereit, das als Wirkstoff IFN-γ vom Hund aufweist. Durch die
Verabreichung des in der vorliegenden Erfindung verwendeten
therapeutischen Mittels können Hauterkrankungen beim Hund, die
durch herkömmliche therapeutische Mittel für Hundedermatitis schwer
geheilt werden konnten, wirksam ohne Nebenwirkungen behandelt
werden.
BEISPIELE
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Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele
ausführlicher erläutert, die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf
diese Beispiele begrenzt.
BEISPIEL 1 Messung der antiviralen Aktivität von IFN-γ vom
Hund
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Die antivirale Aktivität von IFN-γ vom Hund wurde grundsätzlich nach
dem in der Referenz 10 beschriebenen Verfahren gemessen, wobei
MDCK-Zellen vom Hund (ATCC CCL-34) und der VSV verwendet
wurden. Mit anderen Worten wurde eine verdünnte Lösung einer Probe,
die IFN-γ vom Hund enthielt, MDCK-Zellen vom Hund (ATCC CCL-
34) zugegeben, die bei 37ºC auf einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen
gezüchtet worden waren, bis sie den Zusammenfluß erreichten, und die
Zellen wurden dann außerdem 20 bis 24 Stunden bei 37ºC inkubiert,
wodurch die antivirale Aktivität eingeleitet wurde. Die Zellen wurden
mit dem VSV gemischt und 24 Stunden bei 37ºC gezüchtet, die
lebenden MDCK-Zellen vom Hund, die an der Mikroplatte hafteten,
wurden mit einer Kristallviolettlösung gefärbt, die 20% Formalin
enthielt. Die Menge des Kristallvioletts auf der Mikroplatte wurde durch
Messen der Absorption bei 570 nm erhalten, um die Menge von IFN-γ
vom Hund auszuwerten, bei der 50% der Zellen am Leben waren. Die
erhaltene Menge von IFN-γ vom Hund wurde als eine Einheit (1 E) der
antiviralen Aktivität definiert.
BEISPIEL 2 Produktion von IFN-γ vom Hund durch Escherichia
coli dessen DNA IFN-γ vom Hund codiert
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Nach einem herkömmlichen Verfahren wurde die cDNA von IFN-γ vom
Hund, die mit der Sequenzidentifizierungsnummer 5 angegeben ist, in
pET8c eingefügt, das ein Manifestationsvektor von Escherichia coli ist,
und dann wurde Escherichia coli HB101 nach einem herkömmlichen
Verfahren transformiert. Die erhaltenen Transformanten wurden in ein
LB-Medium geimpft, das 100 ug/ml Ampicillin enthielt. Die
Transformanten wurden bei 37ºC gezüchtet, bis der OD&sub6;&sub0;&sub0;-Wert etwa
0,7 erreichte, wurden mit Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)
bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM gemischt und dann weitere
1,5 h gezüchtet. Die erhaltenen 11 l des Kulturmediums wurden 5
Minuten mit 200 s&supmin;¹ (12000 U/min) zentrifugiert, um den Überstand
abzutrennen, der Rest wurde in 60 ml 10 mM Tris-Cl (pH = 7,5)
suspendiert, und die bakteriellen Zellen wurden durch Beschallen auf Eis
vollständig aufgebrochen. Das entstandene Produkt wurde 30 Minuten
mit 333 s&supmin;¹ (20000 U/min) zentrifugiert, und der Überstand wurde
gewonnen, wodurch 54 ml einer löslichen Proteinfraktion erhalten
wurden. Diese Fraktion wies eine antivirale Aktivität von nicht weniger als
10&sup6; E/ml auf.
BEISPIEL 3 Erzeugung von IFN-γ vom Hund durch Zellen von
Bombyx mori oder Seidenraupen, die beide eine DNA
aufweisen, die IFN-γ vom Hund codiert
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Nach einem herkömmlichen Verfahren wurde die cDNA von IFN-γ vom
Hund, die mit der Sequenzidentifizierungsnummer 1 angegeben ist, in
einem Vektor (Referenz 11) aufgenommen, wodurch ein rekombinantes
Plasmid pBMγ erhalten wurde. Rekombinante Baculoviren wurden nach
dem Verfahren der Referenz 11 präpariert. Mit anderen Worten wurden
sowohl die DNA des Kerns des Stammes BmNPV T3 des
Polyhedrosevirus von Bombyx mori (Referenz 11) als auch die DNA
des rekombinanten Plasmids pBMγ für die Cotransfektion in Zellen von
Bombyx mori, Bm-N-Zellen nach dem Calciumphosphatverfahren,
verwendet und danach wurden rekombinante Baculoviren rBNVγ mit
einer DNA, die IFN-γ vom Hund codiert, durch ein eingeschränktes
Lösungsverfahren mit folgender Tatsache als Index geklont:
mikroskopisch, wenn eine Virusinfektion beobachtet wurde und wenn
keine Polyhedrinpartikel entstanden. Jeweils 0,5 ml der Lösung des
erhaltenen rekombinanten Virus wurden zu etwa 3 · 10&sup6; Bm-N-Zellen
gegeben, die in einem 25 cm² Gewebekulturkolben im Medium TC-
100, das 10% FBS enthielt, gezüchtet worden waren. Nach 30 Minuten
wurde das Medium durch 5 ml frisches Medium TC-100, das 10% FBS
enthielt, ersetzt und 3 Tage bei 27ºC gezüchtet. Der zentrifugierte
Überstand des Mediums wurde aufgefangen und es zeigte sich, daß er
eine antivirale Aktivität von 10&sup4; E/ml aufwies.
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Seidenraupen erhielten am zweiten Tag ihres fünften Stadiums eine
Injektion von 50 ul/Raupe der Flüssigkeit des rekombinanten
Baculovirus rBNVγ mit einer DNA, die IFN-γ vom Hund codiert, sie erhielten
4 Tage bei 25ºC eine handelsübliche künstliche Nahrung (Kanebo Silk
Elegance Co.), dann wurde der Unterbauch von zehn dieser
Seidenraupen aufgeschnitten, um ihre Hämolymphe in einem Eppendorf-
Röhrchen aufzufangen, das auf Eis gekühlt wurde. Die entstandene
Hämolymphe wurde zentrifugiert, und der erhaltene Überstand wurde
durch Filtration mit einem 0,22 um Filter sterilisiert, was zu einer
gemessenen antiviralen Aktivität von 10&sup7; E/ml führte.
BEISPIEL 4 Herstellung von IFN-γ vom Hund
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20 mM Phosphat-Puffer (pH = 7,0) wurden verwendet, um eine
zweifache Verdünnung von 50 ml der in Beispiel 2 erhaltenen löslichen
Proteinfraktion zu erhalten, und danach wurde sie in eine Säule
gegeben, die mit 20 ml Kieselgel gepackt war, das mit dem gleichen Puffer
ausgeglichen worden war; die Säule wurde mit einer ausreichenden
Menge 20 mM Phosphat-Puffer (pH = 7,0) gewaschen. Die absorbierten
Komponenten wurden mit 20 mM Phosphat-Puffer (pH = 7,0) eluiert,
der 3 M Ammoniumchlorid und 5% Polyethylenglycol enthielt,
wodurch 45 ml Eluat aufgefangen wurden. Das erhaltene Eluat enthielt
etwa 30 mg Protein, und die Proteinausbeute betrug etwa 30%.
Nachdem 40 ml des Eluats zweimal mit dem 10-fachen Volumen von
20 mM Phosphat-Puffer (pH = 7,0) dialysiert worden waren, wurde das
entstandene Produkt in eine Säule gegeben, die mit 10 ml SP Sepharose
FF gepackt war, und die Säule wurde mit 100 ml 20 mM Phosphat-
Puffer (pH = 7,0) gewaschen. Die absorbierten Komponenten wurden
mit einem Gradienten der NaCl-Konzentration eluiert, wodurch eluierte
Fraktionen aufgefangen wurden, die IFN-γ vom Hund enthielten. Die
erhaltene Eluatfraktion enthielt etwa 15 mg Protein, und die Reinheit
des IFN-γ vom Hund betrug etwa 30%. Das Eluat wurde außerdem nach
einem ähnlichen Verfahren erneut chromatographiert, und das erhaltene
Eluat wurde nach einem herkömmlichen Verfahren entsalzt, wobei eine
Gelfiltrationssäule verwendet wurde, die mit 80 ml Sephadex G-25
gepackt war, wodurch 10 ml einer gereinigten Fraktion von IFN-γ vom
Hund erhalten wurden. Durch die Analyse mittels SDS-PAGE wurde
nachgewiesen, daß diese Fraktion 5 mg Protein enthielt und die
Reinheit des IFN-γ vom Hund nicht weniger als 80% betrug.
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Etwa 2 mg des IFN-γ vom Hund, das eine Reinheit von mehr als 85%
aufwies, wurden aus 100 ml der in Beispiel 3 erhaltenen Hämolymphe
von der Seidenraupe erhalten, in der die rekombinanten Baculoviren
inaktiviert worden waren.
BEISPIEL 5 Herstellung einer Formulierung von IFN-γ vom Hund
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Eine physiologische Kochsalzlösung für die Injektion, Gelatine mit
geringem Molekulargewicht für die Injektion (Nitta Gelatin Inc.) und
Sorbitol wurden zu der in Beispiel 4 erhaltenen gereinigten Lösung von
IFN-γ vom Hund gegeben, bis eine Endkonzentration von Gelatine von
0,5% und eine Endkonzentration von Sorbitol von 30% erreicht wurde.
Das entstandene Produkt wurde dann mit POSIDYNE (Poll Filtron Co.)
behandelt, um Pyrogene zu entfernen, und jeweils 1 ml Filtrat wurde in
Glasampullen gegeben, die 2 Stunden durch trockene Wärme mit 250ºC
sterilisiert worden waren. Durch aseptisches Gefriergetrocknen wurde
dann eine Formulierung von IFN-γ vom Hund erhalten, wobei jede
Ampulle 0,1 bis 2,5 ME IFN-γ vom Hund enthielt. Diese Formulierung
von IFN-γ vom Hund war im Dunklen bei Raumtemperatur stabil und in
Wasser oder einer physiologischen Kochsalzlösung stark löslich.
BEISPIEL 6 Behandlung von hartnäckiger Hundedermatitis durch
IFN-γ vom Hund
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Für diese Untersuchung wurden Hunde benutzt, die 0,5 bis 7 Jahre mit
herkömmlichen therapeutischen Mitteln behandelt worden waren, ohne
daß sie eine deutliche Verringerung der Symptome der
Hauterkrankungen zeigten oder bei denen sie immer wieder auftraten. Die Hunde
für diese Untersuchung schlossen jene ein, die die Komplikation einer
Mykose aufwiesen, die vermutlich auf die nachteiligen Einflüsse von
Steroidhormonen zurückzuführen ist. Die in Beispiel 5 hergestellte
Formulierung von IFN-γ vom Hund wurde für die Injektion in 1 ml
physiologischer Kochsalzlösung gelöst und den Hunden subkutan
verabreicht; die therapeutischen Wirkungen wurden ausgewertet, indem
die klinischen Symptome der Hauterkrankungen und Nebenwirkungen
beobachtet wurden. Tabelle 1 zeigt die Dosis pro Verabreichung und
das Verabreichungsschema. Die Schwere der Hauterkrankungen der
Hunde wurde wie folgt ausgewertet: 6 Parameter, d. h. Erythem, Papel,
Ekzem, Flechte, Exkoriation und Schuppen wurden mit 0 (keine), 1
(schwach), 2 (mäßig) und 3 (stark) bewertet; die Bewertungen der
Parameter insgesamt wurden als gesamte klinische Schwere definiert. Die
therapeutischen Effekte wurden anhand der Schwere der klinischen
Symptome ausgewertet. Die therapeutischen Effekte sind in Tabelle 1,
die eine Formulierung von IFN-γ vom Hund betrifft, die aus
Escherichia coli hergestellt worden war, und in Tabelle 3 gezeigt, die
die von Seidenraupen zeigt.
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Wie aus den Tabellen 1 und 3 deutlich wird, war bei jedem für diese
Untersuchung verwendeten Hund die klinische Schwere der
Hauterkrankungen deutlich verringert worden, was darauf hinweist, daß IFN-γ
vom Hund für die Behandlung von Hauterkrankungen äußerst wirksam
ist. Außerdem waren die Symptome der in der Tabelle 1 aufgeführten
fünf Hunde durch die Steroidhormon-Therapie nicht merklich
abgeschwächt worden, von der angenommen wird, daß sie von den
herkömmlichen therapeutischen Mitteln das wirksamste darstellt, oder
zeigten bald nach Abbruch der Verabreichung von Steroidhormonen ein
erneutes Auftreten, die Symptome wurden jedoch durch ein- oder
zweimalige Verabreichung des erfindungsgemäßen LFN-γ vom Hund
schnell geheilt. Außerdem wurden bei keinem dieser fünf Hunde
irgendwelche Nebenwirkungen mit klinischer Bedeutung beobachtet.
BEISPIEL 7 Behandlung von hartnäckiger Hundedermatitis durch
IFN-γ vom Hund in Kombination mit anderen
therapeutischen Mitteln.
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Ähnlich wie in Beispiel 6 wurden für diese Untersuchung Hunde
benutzt, die mindestens ein halbes Jahr mit herkömmlichen
therapeutischen Mitteln behandelt worden waren, ohne daß sie eine merkliche
Verringerung der Symptome der Hauterkrankungen zeigten oder bei
denen es immer wieder zum Auftritt der Krankheit kam. Die Tests und
die therapeutische Auswertung der Wirkung erfolgte nach ähnlichen
Verfahren, wie sie in Beispiel 6 beschrieben sind, außer daß die in
Tabelle 2 gezeigten therapeutischen Mittel in Kombination mit der in
Beispiel 5 hergestellten Formulierung von IFN-γ vom Hund verwendet
wurden. Anhand der in Tabelle 2 gezeigten Ergebnisse wird klar, daß
IFN-γ vom Hund die klinischen Symptome aufgrund der hartnäckigen
Hundedermatitis schnell verringert und effektiv ist, selbst wenn es in
Kombination mit herkömmlichen therapeutischen Mitteln verwendet
wird. Außerdem geht der Trend dahin, daß IFN-γ vom Hund bei einer
geringeren Dosis im Vergleich mit Beispiel 6 ausreichende
therapeutische Effekte zeigt, wenn es in Kombination mit herkömmlichen
therapeutischen Mitteln verwendet wird. Außerdem wurden Nebenwir
kungen aufgrund der kombinierten Therapie nicht besonders
beobachtet.
Tabelle 1 (1) Therapeutische Wirkungen von IFN-γ vom Hund bei hartnäckiger Hundedermatitis
(IFN-γ vom Hund allein)
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1) Verabreichungstag: so definiert, daß der 1. Tag der Verabreichung der Tag 0 ist.
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2) Schwere der klinischen Symptome: 0 (keine), 1 (schwach), 2 (mäßig), und 3 (stark).
Tabelle 1 (2) Therapeutische Wirkungen von IFN-γ vom Hund bei hartnäckiger Hundedermatitis
(IFN-γ vom Hund allein)
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1) Verabreichungstag: so definiert, daß der 1. Tag der Verabreichung der Tag 0 ist.
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2) Schwere der klinischen Symptome: 0 (keine), 1 (schwach), 2 (mäßig), und 3 (stark).
Tabelle 2 (1) Therapeutische Wirkungen von IFN-γ vom Hund bei hartnäckiger Hundedermatitis
(Kombination mit einem (mehreren) herkömmlichen therapeutischen Mittel(n))
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1) Verabreichungstag: so definiert, daß der 1. Tag der Verabreichung der Tag 0 ist.
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2) Schwere der klinischen Symptome: 0 (keine), 1 (schwach), 2 (mäßig), und 3 (stark).
Tabelle 2 (2) Therapeutische Wirkungen von IFN-γ vom Hund bei hartnäckiger Hundedermatitis
(Kombination mit einem (mehreren) herkömmlichen therapeutischen Mittel(n))
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1) Verabreichungstag: so definiert, daß der 1. Tag der Verabreichung der Tag 0 ist.
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2) Schwere der klinischen Symptome: 0 (keine), 1 (schwach), 2 (mäßig), und 3 (stark).
Tabelle 3 (1) Therapeutische Wirkungen von IFN-γ vom Hund bei hartnäckiger Hundedermatitis (IFN-γ vom Hund allein)
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1) Verabreichungstag: so definiert, daß der 1. Tag der Verabreichung der Tag 0 ist.
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2) Schwere der klinischen Symptome: 0 (keine), 1 (schwach), 2 (mäßig), und 3 (stark).
Tabelle 3 (2) Therapeutische Wirkungen von IFN-γ vom Hund bei hartnäckiger Hundedermatitis (IFN-γ vom Hund allein)
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1) Verabreichungstag: so definiert, daß der 1. Tag der Verabreichung der Tag 0 ist.
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2) Schwere der klinischen Symptome: 0 (keine), 1 (schwach), 2 (mäßig), und 3 (stark).
Zitierte Referenzen
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11. Horiuchi et al.: Agic. Biol. Chem., 51, 1573-1580, (1987)
-
12. Zucker et al.: J. Interferon-Research, 13, 91-97 (1993)
-
13. Frank et al.: Clinics in Dermatology, 12, 565-571 (1994)
SEQUENZLISTE
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INFORMATION ZUR SEQUENZIDENTIFIZIERUNGSNR. 1:
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(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
-
(A) LÄNGE: 498 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
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(C) STRÄNGIGKEIT: Doppel
-
(D) TOPOLOGIE: Linear
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(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA
-
(vi) ORIGINALQUELLE:
-
(A) ORGANISMUS: Hund
-
(ix) MERKMAL:
-
(A) NAME/SCHLÜSSEL: sig_Peptid
-
(B) GENAUE ANORDNUNG: 1..72
-
Verfahren zur Bestimmung des Merkmals:
-
Durch die Ähnlichkeit mit einer bekannten Sequenz oder
einer nachgewiesenen Consensus-Sequenz.
-
(xi) MERKMAL:
-
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_Peptid
-
(B) GENAUE ANORDNUNG: 73..498
-
Verfahren zur Bestimmung des Merkmals:
-
Durch die Ähnlichkeit mit einer bekannten Sequenz oder
einer nachgewiesenen Consensus-Sequenz.
(ix) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 1:
-
INFORMATION ZUR SEQUENZIDENTIFIZIERUNGSNR. 2
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
-
(A) LÄNGE: 498 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: Doppel
-
(D) TOPOLOGIE: Linear
-
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA
-
(vi) ORIGINALQUELLE:
-
(A) ORGANISMUS: Hund
-
(ix) MERKMAL:
-
(A) NAME/SCHLÜSSEL: sig_Peptid
-
(B) GENAUE ANORDNUNG: 1..72
-
Verfahren zur Bestimmung des Merkmals:
-
Durch die Ähnlichkeit mit einer bekannten Sequenz oder
einer nachgewiesenen Consensus-Sequenz.
-
(xi) MERKMAL:
-
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_Peptid
-
(B) GENAUE ANORDNUNG: 73..498
-
Verfahren zur Bestimmung des Merkmals:
-
Durch die Ähnlichkeit mit einer bekannten Sequenz oder
einer nachgewiesenen Consensus-Sequenz.
(ix) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 2:
-
INFORMATION ZUR SEQUENZIDENTIFIZIERUNGSNR. 3
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
-
(A) LÄNGE: 498 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: Doppel
-
(D) TOPOLOGIE: Linear
-
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA
-
(vi) ORIGINALQUELLE:
-
(A) ORGANISMUS: Hund
-
(ix) MERKMAL:
-
(A) NAME/SCHLÜSSEL: sig_Peptid
-
(B) GENAUE ANORDNUNG: 1..72
-
Verfahren zur Bestimmung des Merkmals:
-
Durch die Ähnlichkeit mit einer bekannten Sequenz oder
einer nachgewiesenen Consensus-Sequenz.
-
(xi) MERKMAL:
-
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_Peptid
-
(B) GENAUE ANORDNUNG: 73..498
-
Verfahren zur Bestimmung des Merkmals:
-
Durch die Ähnlichkeit mit einer bekannten Sequenz oder
einer nachgewiesenen Consensus-Sequenz.
(ix) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 3:
-
INFORMATION ZUR SEQUENZIDENTIFIZIERUNGSNR. 4
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
-
(A) LÄNGE: 498 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: Doppel
-
(D) TOPOLOGIE: Linear
-
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA
-
(vi) ORIGINALQUELLE:
-
(A) ORGANISMUS: Hund
-
(ix) MERKMAL:
-
(A) NAME/SCHLÜSSEL: sig_Peptid
-
(B) GENAUE ANORDNUNG: 1..72
-
Verfahren zur Bestimmung des Merkmals:
-
Durch die Ähnlichkeit mit einer bekannten Sequenz oder
einer nachgewiesenen Consensus-Sequenz.
-
(xi) MERKMAL:
-
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_Peptid
-
(B) GENAUE ANORDNUNG: 73..498
-
Verfahren zur Bestimmung des Merkmals:
-
Durch die Ähnlichkeit mit einer bekannten Sequenz oder
einer nachgewiesenen Consensus-Sequenz.
(ix) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 4:
-
INFORMATION ZUR SEQUENZIDENTIFIZIERUNGSNR. 5
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
-
(A) LÄNGE: 435 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: Doppel
-
(D) TOPOLOGIE: Linear
-
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA
-
(vi) ORIGINALQUELLE:
-
(A) ORGANISMUS: Hund
-
(xi) MERKMAL:
-
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_Peptid
-
(B) GENAUE ANORDNUNG: 1..435
-
Verfahren zur Bestimmung des Merkmals:
-
Durch die Ähnlichkeit mit einer bekannten Sequenz oder
einer nachgewiesenen Consensus-Sequenz.
(ix) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 5:
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INFORMATION ZUR SEQUENZIDENTIFIZIERUNGSNR. 6
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
-
(A) LÄNGE: 432 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: Doppel
-
(D) TOPOLOGIE: Linear
-
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA
-
(vi) ORIGINALQUELLE:
-
(A) ORGANISMUS: Hund
-
(xi) MERKMAL:
-
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_Peptid
-
(B) GENAUE ANORDNUNG: 1..432
-
Verfahren zur Bestimmung des Merkmals:
-
Durch die Ähnlichkeit mit einer bekannten Sequenz oder
einer nachgewiesenen Consensus-Sequenz.
(ix) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 6: