DE69730251T2 - Anwendung von scherflussbeanspruchung auf chondrozyten - Google Patents

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Description

  • Bereich der Erfindung
  • Diese Erfindung bezieht sich auf Säugetiergewebekulturen und künstlichen Knorpel.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Knorpel ermöglicht den Gelenken, sich reibungslos zu bewegen.
  • Knorpel besteht im Wesentlichen aus hochspezialisierten Zellen, die als Chondrozyten bekannt und von einer dichten extrazellulären Matrix (ECM) umgeben sind. Im Fall von Gelenkknorpel wird das Gewebe hauptsächlich aus Kollagen II, Proteoglykanen und Wasser gebildet. Voll ausgereifter Knorpel weist ein begrenztes Vermögen zum Nachwuchs und zur Ausbesserung als Reaktion auf Schädigung durch Trauma oder degenerative Gelenkerkrankungen auf. Chirurgische Arbeitsverfahren wurden zum Ersetzen des beschädigten Knorpels mit in Gewebekultur gewachsenem Knorpel entwickelt. Bioreaktoren werden zum Züchten von kultivierten Zellen, z. B. Chondrozyten, zur Verwendung bei der Erzeugung von gewebe-rekonstruiertem Knorpel verwendet, wie zum Beispiel in US 5,041,138 .
  • Die Beanspruchung durch Scherströmung wurde auf Endothelzellen (WO 94/25584) und Patent Abstract of Japan, Band 016, Nr. 490 (C-0994) ausgeübt, um die Zellen zur Bildung von Rohren in einlagiger Schicht anzuregen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Wir haben entdeckt, dass sich kultivierte Chondrozyten unter Beanspruchung durch Scherströmung nicht ausrichten. Wir haben auch entdeckt, dass das Ausüben von Beanspruchung durch Scherströmung von kultivierten Chondrozyten die Aufrechterhaltung des chondrozytischen Phänotyps verbessert. Dies wird durch die erhöhte Ablagerung von Kollagen II in den Chondrozyten wiedergespiegelt.
  • Auf der Basis dieser Entdeckungen weist die Erfindung einen Bioreaktor zur Herstellung von künstlichem Knorpel auf. Der Bioreaktor umfasst eine Wachstumskammer zum Unterbringen von kultivierten Säugetierzellen, ein Substrat zum Anhaften der Zellen und ein Mittel zum Ausüben von Beanspruchung durch Scherströmung. Der Bioreaktor übt Beanspruchung durch Scherströmung auf einem Niveau zwischen ungefähr 1 und ungefähr 100 dyn/cm2 aus, und er kann vorzugsweise Beanspruchung durch Scherströmung auf einem Niveau zwischen ungefähr 1 und ungefähr 50 dyn/cm2 ausüben. In einigen Ausführungsformen der Erfindung wird die Beanspruchung durch Scherströmung durch einen Behälter, eine Pumpe und untereinander verbundene Verrohrung ausgeübt. Diese Komponenten sind angeordnet, um den kontinuierlichen Durchfluss von flüssigem Wachstumsmedium aus dem Behälter durch die Wachstumskammer und zurück zum Behälter, als Reaktion auf eine von der Pumpe ausgeübte Kraft, zu ermöglichen.
  • Das Substrat in dem Bioreaktor kann ein Gerüst sein, dass das Wachstum einer 3-dimensionalen Zellkultur unterstützt. Das Gerüst kann biologisch resorbierbar sein. Als Alternative dazu kann das Substrat eine nicht poröse Oberfläche sein, die das Wachstum von kultivierten Zellen in einer einlagigen Schicht unterstützt. Die nicht poröse Oberfläche kann die glatte Oberfläche einer drehbaren Trommel, einer drehbaren Scheibe oder einer stationären Platte sein. Wenn eine Trommel oder Scheibe verwendet wird, wird Beanspruchung durch Scherströmung durch die Bewegung, d. h. Drehung der Trommel oder Scheibe durch den flüssigen Nährboden erzeugt. Wenn eine stationäre Platte verwendet wird, wird Beanspruchung durch Scherströmung durch die Bewegung des flüssigen Nährbodens vorbei an der Platte, unter Krafteinwirkung von einer Pumpe, erzeugt.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung künstlichen Knorpels bereit. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (a) Bereitstellen einer Wachstumskammer, die ein Substrat zur Zellanhaftung beinhaltet; (b) Baden des Substrats mit einem flüssigen Wachstumsmedium; (c) Beimpfen des Mediums mit Chondrozyten, chondrozytischen Stammzellen oder Zellen, die zu einem chondrozytischen Phänotyp transdifferenzieren; (d) Ermöglichen der Anhaftung der Zellen an das Substrat; (e) Ausüben und Aufrechterhalten einer Beanspruchung durch Scherströmung zwischen ungefähr 1 ungefähr 100 dyn/cm2 auf die Zellen, vorzugsweise zwischen ungefähr 1 und ungefähr 50 dyn/cm2; und (f) Kultivieren der durch Scherströmung beanspruchten Zellen für eine ausreichende Zeit, um künstlichen Knorpel herzustellen.
  • Das Substrat kann ein Gerüst sein, und das Gerüst kann biologisch resorbierbar sein. Das Substrat kann auch eine nicht poröse Oberfläche, wie beispielsweise eine drehbare Trommel, eine drehbare Scheibe oder eine stationäre Platte sein.
  • Die durch Scherströmung beanspruchten Zellen, die gemäß diesem Verfahren gezüchtet werden, zeigen verbesserte Aufrechterhaltung eines chondrozytischen Phänotyps. Zusätzlich stellen sie eine extrazelluläre Matrix her, die ein verbessertes Verhältnis von Kollagen II zu Kollagen I enthält.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Induzieren der Differenzierung von Stammzellen zu Chondrozyten bereit. Das Stammzelldifferenzierungverfahren umfasst die folgenden Schritte: (a) Bereitstellen einer Wachstumskammer, die ein Substrat zur Zellanhaftung enthält; (b) Baden des Substrats mit einem flüssigen Wachstumsmedium; (c) Beimpfen des Mediums mit Säugetierstammzellen; (d) Ermöglichen der Anhaftung der Stammzellen an das Substrat; (e) Ausüben und Aufrechterhalten einer Beanspruchung durch Scherströmung zwischen ungefähr 1 und ungefähr 100 dyn/cm2, vorzugsweise zwischen ungefähr 1 und ungefähr 50 dyn/cm2, auf die Stammzellen; und (f) Kultivieren der Stammzellen für eine ausreichende Zeit, um es ihnen zu ermöglichen, sich zu Chondrozyten zu differenzieren.
  • Die Erfindung weist auch ein Verfahren zum Induzieren der Transdifferenzierung von kultivierten Zellen zu Chondrozyten auf. Das Transdifferenzierungsverfahren beinhaltet die folgenden Schritte: (a) Bereitstellen einer Wachstumskammer, die ein Substrat zur Zellanhaftung enthält; (b) Baden des Substrats mit einem flüssigen Wachstumsmedium; (c) Beimpfen des Mediums mit anderen Säugetierzellen als Chondrozyten oder chondrozytischen Stammzellen; (d) Ermöglichen der Anhaftung der Zellen an das Substrat; (e) Ausüben und Aufrechterhalten einer Beanspruchung durch Scherströmung zwischen ungefähr 1 und ungefähr 100 dyn/cm2, vorzugsweise zwischen ungefähr 1 und ungefähr 50 dyn/cm2, auf die Zellen; und (f) Kultivieren der Zellen für eine ausreichende Zeit, um es ihnen zu ermöglichen, sich zu Chondrozyten zu transdifferenzieren. Bevorzugte nicht chondrozytische Zellarten zur Verwendung in diesem Transdifferenzierungsverfahren sind Fibroblasten und Myozyten.
  • Wie hier verwendet, bedeutet „biologisch resorbierbar" biologisch abbaubar in Zellkulturen oder in dem Körper des Empfängers eines künstlichen Knorpeltransplantats.
  • Wie hier verwendet, bedeutet „Chondrozyt" eine Knorpelzelle. Chondrozyten finden sich in verschiedenen Arten von Knorpeln, z. B. Gelenk-(oder Hyalin-)Knorpel, elastischem Knorpel und Faserknorpel.
  • Wie hier verwendet, bedeutet „Substrat" eine unterstützende Struktur, an die sich kultivierte Zellen verankern oder anhaften, in einer Wachstumskammer.
  • Wie hier verwendet, bedeutet „Gerüst" eine 3-dimensionale, poröse, zellverträgliche Struktur, an die kultivierte Säugetierzellen durchweg anhaften können, um eine 3-dimensionale Kultur zu bilden. So wie die Begriffe hier verwendet werden, ist ein Gerüst eine Art Substrat.
  • Wie hier verwendet, bedeutet „Beanspruchung durch Scherströmung" eine Fluid getragene Kraft, die auf kultivierte Zellen, auf Grund relativer Bewegung zwischen einem flüssigen Nährboden und den Zellen wirkt. Beanspruchung durch Scherströmung kann durch Bewegen einer Flüssigkeit an den stationären Zellen vorbei durch das Bewegen der Zellen durch eine stationäre Flüssigkeit oder durch das gleichzeitige Bewegen der Flüssigkeit und der Zellen erzeugt werden. Die Beanspruchung durch Scherströmung wird im Allgemeinen in Form von dyn/cm2 quantitativ bestimmt.
  • Wie hier verwendet, bedeutet „Stammzelle" eine undifferenzierte Zelle, die Tochterzellen, die zu den ein bestimmtes Gewebe kennzeichnenden spezialisierten Zellen reifen werden, erzeugt.
  • Wie hier verwendet, bedeutet „Transdifferenzierung" die Veränderung einer differenzierten Zelle von einem Phänotyp, d. h. Myoblast oder Fibroblast, zu einem anderen Phänotyp, d. h. einem Chondrozyten.
  • Wenn nicht anders definiert, weisen alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung auf, wie allgemein von einem Fachmann auf dem Gebiet der Zellkultivierungstechniken verstanden wird. Obwohl Materialien und Verfahren, ähnlich oder gleich jenen der hier beschriebenen, in der Praxis oder beim Testen der Erfindung verwendet werden können, werden die unten beschriebenen Verfahren und Materialien bevorzugt. Alle Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patente und andere hier erwähnten Bezüge werden unter Bezugnahme aufgeführt. Zusätzlich dienen die Materialien, Verfahren und Beispiele lediglich zur Veranschaulichung und sollen nicht begrenzend sein.
  • Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung werden aus der detaillierten Beschreibung und aus den Ansprüchen hervorgehen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist eine diagrammatische Darstellung eines Scherströmungs-Bioreaktorsystems, das eine Wachstumskammer, eine Pumpe, einen Medienbehälter und eine verbindende Verrohrung umfasst.
  • 2 ist eine diagrammatische Darstellung einer Scherströmungs-Wachstumskammer, die konzentrische innere und äußere Trommeln enthält, die mindestens teilweise in dem flüssigen Nährboden eingetaucht sind.
  • 3 ist eine diagrammatische Darstellung einer Scherströmungs-Wachstumskammer, die eine sich innerhalb der Wachstumskammer drehende Scheibe enthält.
  • 4 ist eine diagrammatische Darstellung einer Scherströmungs-Wachstumskammer, die stationäre parallele Platten innerhalb der Wachstumskammer enthält.
  • 5 ist ein Balkendiagramm, das die Daten von Kollagen und sulfatierten GAG-Niveaus in Konstruktionen aus künstlichem Knorpel nach zwei Wochen und vier Wochen zusammenfasst. Weiße Balken, sulfatierte GAG; schwarze Balken, Kollagen.
  • 6 ist ein Balkendiagramm, das die Daten von Kollagen und sulfatierten GAG-Niveaus in Konstruktionen aus künstlichem Knorpel nach zwei Wochen, vier Wochen und in nativem Knorpel zusammenfasst. Weiße Balken, sulfatierte GAG; schwarze Balken, Kollagen.
  • Detaillierte Beschreibung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Vorrichtungen und Verfahren zum Ausüben von Beanspruchung durch Scherströmung auf Säugetierzellkulturen, die zur Herstellung von künstlichem Knorpel verwendet werden, bereit.
  • Das Ausüben von Beanspruchung durch Scherströmung auf eine dreidimensionale Chondrozytenkultur oder Chondrozytenkultur in einlagiger Schicht verbessert vorteilhafterweise das Verhältnis von Kollagen II zu Kollagen I, das durch die Chondrozyten hergestellt wurde.
  • Die Beanspruchung durch Scherströmung verbessert auch vorteilhafterweise die Aufrechterhaltung des chondrozytischen Phänotyps. Daher verbessert das Ausüben von Beanspruchung durch Scherströmung gemäß dieser Erfindung das funktionale Ergebnis einer dreidimensionalen Chondrozytenkultur oder Chondrozytenkultur in einlagiger Schicht und erhöht die nützliche Lebensdauer der Kultur in einlagiger Schicht.
  • Das Ausüben von Beanspruchung durch Scherströmung auf Stammzellen induziert oder fördert die Differenzierung der Stammzellen zu Chondrozyten. Das Induzieren oder Fördern der Differenzierung von Stammzellen zu Chondrozyten, wird durch das Substituieren der Stammzellen für Chondrozyten in dem hier beschriebenen Scherströmungsverfahren mit Bezug auf Chondrozyten erreicht. Die aus dem Stammzellendifferenzierungsprozess hervorgehenden Chondrozyten werden in der Kultur unter Beanspruchung durch Scherströmung für eine ausreichende Zeit gehalten, um die Herstellung von künstlichem Knorpel zu ermöglichen.
  • Die Beanspruchung durch Scherströmung kann auch gemäß dieser Erfindung verwendet werden, um Transdifferenzierung von differenzierten Zellen zu Chondrozyten zu induzieren. Transdifferenzierung wird durch Substituieren von anderen differenzierten Zellen als Chondrozyten, z. B. Myoblasten oder Fibroblasten, in dem hier beschriebenen Scherströmungsverfahren mit Bezug auf Chondrozyten erreicht. Als Reaktion auf die Beanspruchung durch Scherströmung transdifferenzieren die differenzierten Zellen zu Chondrozyten. Die aus dem Transdifferenzierungsprozess hervorgehenden Chondrozyten werden in der Kultur unter Beanspruchung durch Scherströmung für eine ausreichende Zeit gehalten, um die Herstellung von künstlichem Knorpel zu ermöglichen.
  • Künstlicher Knorpel, der gemäß einer beliebigen Ausführungsform dieser Erfindung hergestellt wurde, kann gemäß den etablierten medizinischen Arbeitsverfahren für chirurgische Transplantation verwendet werden, um beschädigten oder fehlenden Knorpel zu ersetzen. Typischerweise wird künstlicher Knorpel bei der Ausbesserung von menschlichen Gelenken, z. B. Knien und Ellenbogen, eingesetzt.
  • In den Vorrichtungen und Verfahren dieser Erfindung kann eine Beanspruchung durch Scherströmung auf die kultivierten Zellen durch verschiedene Mittel ausgeübt werden. Zum Beispiel kann eine Beanspruchung durch Scherströmung durch Züchten von Chondrozyten in einlagiger Schicht auf der Oberfläche einer sich drehenden Trommel oder sich drehenden Scheibe, die in das flüssige Wachstumsmedium getaucht ist, ausgeübt werden. Als Alternative dazu kann eine Beanspruchung durch Scherströmung durch Züchten von Chondrozyten in einlagiger Schicht auf stationären Platten, an denen das flüssige Wachstumsmedium vorbeigepumpt wird, ausgeübt werden. Beanspruchung durch Scherströmung kann auch durch Etablierung der Kultur in einer Kammer, durch die flüssiges Wachstumsmedium gepumpt wird, auf eine 3-dimensionale Chondrozytenkultur ausgeübt werden.
  • Die auf die Chondrozyten ausgeübte Menge an Beanspruchung durch Scherströmung wird durch Einstellen der Drehgeschwindigkeit der Trommel oder Scheibe oder durch Einstellen der Pumprate des flüssigen Mediums gesteuert. In dieser Erfindung liegt das Niveau der Beanspruchung durch Scherströmung, die auf die Chondrozyten oder andere Zellen ausgeübt wird, zwischen ungefähr 1 und ungefähr 100 dyn/cm2. Vorzugsweise liegt die Beanspruchung durch Scherströmung zwischen ungefähr 1 und ungefähr 50 dyn/cm2. Die Beanspruchung durch Scherströmung wird gemäß Gleichung (1) berechnet: Beanspruchung durch Scherströmung = τ = 6 μQ/bh2 dyn/cm2 wobei:
    μ = Viskosität des Fluids (N sec/m2);
    Q die Fließgeschwindigkeit (ml/min) ist;
    b = Kammerbreite (cm); und
    h = Kammerhöhe (cm).
  • Kultivierte Chondrozyten
  • Vorzugsweise sind die kultivierten Chondrozyten an ein Substrat verankert, d. h. angehaftet, ob als eine einlagige Schicht gezüchtet oder in einer 3-dimensionalen Kultur gezüchtet. Eine Oberfläche, die die einlagige Schicht unterstützt oder ein 3-dimensionales Gerüst wird in einem Bioreaktor mit Chondrozyten, Stammzellen oder differenzierten Zellen, die für eine Transdifferenzierung geeignet sind, beimpft. Künstlicher Knorpel kann durch Züchten von Chondrozyten in einem herkömmlichen Säugetiergewebenährboden, z. B. RPMI 1640, Fisher, Iscove oder McCoy Medium, hergestellt werden. Derartige Medien sind im Fach wohl bekannt und sind im Handel erhältlich. Typischerweise werden die Zellen bei 37°C in mit 5% CO2 angereicherter Luft kultiviert. Unter diesen Bedingungen wird eine einlagige Schicht von Chondrozyten mit oder eine dreidimensionale Knorpelmatrix in Abhängigkeit von der für die Beimpfung verwendeten Zellart und den Kulturbedingungen in ungefähr 7 bis 56 Tagen hergestellt.
  • Isolierte Chondrozyten können verwendet werden, um die Reaktoroberfläche oder die 3-dimensionale Matrix zu beimpfen. Als Alternative dazu können Stammzellen oder für die Transdifferenzierung geeignete Zellen für die Beimpfung verwendet werden.
  • Zellen, die für die Beimpfung von Kulturen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, verwendet werden, können durch jedes beliebige geeignete Verfahren isoliert werden. Verschiedene Ausgangsmaterialien und Verfahren zur Isolation von Chondrozyten sind bekannt. Siehe im Allgemeinen Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, zweite Ausgabe, A. R. Liss Inc., New York, S. 137–168 (1987). Beispiele von Ausgangsmaterialien für Chondrozytenisolation umfassen Säugetierkniegelenke oder -brustkörbe.
  • Wenn das Ausgangsmaterial ein Gewebe ist, in dem Chondrozyten im Wesentlichen der einzige vorhandene Zelltyp sind, z. B. Gelenkknorpel, können die Zellen direkt durch herkömmliche Kollagenase-Digestion und Gewebekulturverfahren erhalten werden. Als Alternative dazu können die Zellen von anderen, in dem Ausgangsmaterial vorhandenen Zellarten isoliert werden. Ein bekanntes Verfahren zur Chondrozytenisolation umfasst unterschiedliche Adhäsion an Gewebekulturgefäßen aus Kunststoff. In einem zweiten Verfahren können Antikörper, die sich an chondrozytische Zelloberflächenmarker binden, als Schicht auf Gewebekulturplatten aufgetragen und dann verwendet werden, um Chondrozyten aus einer heterogenen Zellpopulation selektiv zu binden. In einem dritten Verfahren wird Durchflusszytometrie (fluorescence activated cell sorting = FACS) verwendet, die Chondrozyten spezifische Antikörper verwendet, um Chondrozyten zu isolieren. In einem vierten Verfahren werden Chondrozyten mittels Zentrifugieren durch einen Dichtegradienten wie beispielsweise Ficoll auf der Basis ihrer Auftriebsdichte, isoliert.
  • Beispiele von Geweben, aus denen Stammzellen zur Differenzierung oder differenzierte Zellen, die für die Transdifferenzierung geeignet sind, isoliert werden können, umfassen Plazenta, Nabelschnur, Knochenmark, Haut, Muskel, Knochenhaut oder Knorpelhaut. Zellen können aus diesen Geweben durch Explantatkultur und/oder enzymatische Digestion der umgebenden Matrix unter Verwendung herkömmlicher Verfahren isoliert werden.
  • Wenn die künstliche Knorpelkonstruktion auf die gewünschte Größe und Zusammensetzung gezüchtet wurde, kann ein Konservierungsfluid in das System eingeführt werden. Das Konservierungsfluid friert die künstliche Knorpelkonstruktion für die spätere Verwendung ein.
  • Kältekonservierungsverfahren und Materialien für Gewebekulturmaterial von Säugetieren sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.
  • Bioreaktordurchflusssystem
  • Wie in 1 gezeigt, wird in einigen Ausführungsformen dieser Erfindung ein System 16 mit zirkulierendem Durchfluss mit einer Wachstumskammer 11 verwendet. Das System 16 mit zirkulierendem Durchfluss umfasst einen Medienbehälter 9, eine Pumpe 10, eine Wachstumskammer 11 und eine Verrohrung 12.
  • Jedes sterilisierbare Flüssigkeitsbehältnis kann zur Verwendung als ein Behälter 9 angepasst werden. Eine Art bevorzugter Behälter ist ein steriler Beutel. Geeignete sterile Beutel sind im Handel erhältlich, z. B. von Gibco/BRL. In einigen Ausführungsformen der Erfindung wird ein oberer Behälter dem Bioreaktor vorgeschaltetet platziert, ein unterer Behälter wird dem Bioreaktor nachgeschaltet platziert und die Pumpe führt flüssiges Medium von dem unteren Behälter zum oberen Behälter zurück.
  • Der Behälter 9 kann einen sterilen Filter umfassen, um der Flüssigkeit in dem System eine direkte Quelle von sterilem Gas bereitzustellen. Als Alternative dazu kann der Behälter 9 eine Gas durchlässige Verrohrung oder aus Silizium oder Teflon gefertigte Membranen umfassen, z. B. um dem System durch Diffusion eine indirekte Quelle sterilen Gases bereitzustellen. Vorzugsweise umfasst das Durchflusssystem eine oder mehrere Ventile und einen Durchflussmesser.
  • Die Pumpe 10 ist angelegt, um Flüssigkeit von dem Behälter 9 zur Wachstumskammer 11 unter sterilen Bedingungen wieder zurückzuführen und zu übertragen. Typischerweise steuert die Pumpe 10 sowohl die Fließgeschwindigkeit als auch den Druck innerhalb des Systems. Die Pumpe 10 kann eine peristaltische Pumpe sein. Als Alternative dazu kann eine Elastomerblase mit einer Wechseldruckquelle verwendet werden. Das Variieren des externen Drucks bewirkt, dass sich die Blase aufbläht oder sich entleert. Ein Paar Rückschlagventile kann verwendet werden, um eine unidirektionale Bewegung des sterilen Fluids in dem System zu erreichen.
  • Die verbindende Verrohrung 12 zum Zirkulieren der sterilen Flüssigkeit innerhalb des Systems kann ein Edelstahlrohr oder haltbare, medizinisch einwandfreie Kunststoffverrohrung sein. Als Alternative dazu kann die Verrohrung 12 ein Gas durchlässiges Material wie beispielsweise Silikon sein.
  • 3-dimensionale Kulturen
  • Verfahren und Materialien für 3-dimensionale Kulturen von Säugetierzellen sind im Fach bekannt. Siehe z. B. U.S. Patent Nr. 5,266,480. Typischerweise wird ein Gerüst in einer Bioreaktor-Wachstumskammer verwendet, um eine 3-dimensionale Kultur zu unterstützen. Das Gerüst kann aus einem beliebigen porösen Gewebekultur kompatiblen Material gefertigt sein, in das kultivierte Säugetierzellen eintreten und an das sie sich anhaften oder verankern können. Derartige Materialien umfassen Nylon (Polyamide), Dacron (Polyester), Polystyrol, Polypropylen, Polyacrylate, Polyvinylchlorid, Polytetrafluorethylen (Teflon), Nitrozellulose und Baumwolle. Vorzugsweise ist das Gerüst ein biologisch resorbierbares oder biologisch abbaubares Material, wie beispielsweise Polyglykolsäure, Catgut-Material oder Gelatine. Im Allgemeinen ist die Form des Gerüsts nicht entscheidend.
  • Vor dem Beimpfen des Gerüsts mit Chondrozyten wird das Gerüst wahlweise mit stromalen Zellen beimpft, und es wird ihnen ermöglicht, eine stromale Matrix zu bilden. Die stromale Matrix wird dann mit den Chondrozyten beimpft. Die stromalen Zellen können Fibroblasten umfassen. Die stromalen Zellen können auch andere Zellarten umfassen.
  • Eine 3-dimensionale Kultur kann in einem System 16 mit zirkulierendem Durchfluss, wie beispielsweise jenes, das schematisch in 1 abgebildet ist, verwendet werden. Die Beanspruchung durch Scherströmung wird auf die Chondrozyten durch die Bewegung des flüssigen Nährbodens ausgeübt, der durch die Wachstumskammer, welche die 3-dimensionale Kultur enthält, gepumpt wird. Vorzugsweise sind das Gerüst und die anhaftenden Zellen stationär.
  • Die aus den zwei Bioreaktorsystemen, Apollo und Gemini I, erhaltenen Daten zeigen, dass das Erhöhen der Fließgeschwindigkeiten, d. h. die Erhöhung der Belastung durch Scherung, das Gedeihen der Chondrozyten in 3-dimensionalen Kulturen, die zur Herstellung von künstlichem Knorpel verwendet werden, verbessert.
  • Apollo-Bioreaktor
  • Gelenkknorpel wurde aseptisch aus den femoralen/tibialen Gelenken von im Skelett ausgewachsenen weißen Neuseeland-Kaninchen innerhalb von 4 Stunden nach der Tötung entnommen. Chondrozyten wurden durch Kollagenase-Digestion, wie von Dunkelman et al. (Biotech. Bioengineering 46: 299–305 (1995)) beschrieben, isoliert. Sie wurden dann für zwei Durchgänge im Nährboden (DMEM, das 10% fötales Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 2 mM nicht essenzielle Aminosäuren, 50 mg/mL Prolin, 1 mM Natriumpyruvat und 35 mg/mL Gentamycin enthält) gezüchtet.
  • Spritzguss-Polycarbonatbioreaktoren (1,2 mL internes Volumen) wurden unter Verwendung von Gas durchlässigem Silikon und Biopreneverrohrung zusammengesetzt und durch Elektronenstrahl-Emission (2,5 Mrad) sterilisiert. Polyglykolsäure(PGA)-Netz (52 mg/cc, ohne Wärme plattiert, 1,9 mm dick, 1 cm Durchmesser, Porosität 97% Hohlraumvolumen) wurden durch Ethylenoxidgas sterilisiert und bis zur Verwendung unter Stickstoff gelagert. Das sterile PGA-Netz wurde in dem Nährboden vorher über Nacht bei 37°C eingeweicht und in sterile Bioreaktorsysteme platziert.
  • Das Netz wurde unter Verwendung von einer Umlauf-Impf-Technik angeimpft, bei der jedes Bioreaktorsystem (5 Tandem-Bioreaktoren) an einen Medienbeutel, der eine Zellsuspension von 30 × 106 Zellen in 35 mL Nährboden enthielt, angebracht wurde. Das System wurde an eine Pumpe (Cole-Parmer) angeschlossen, um eine Nährboden-Fließgeschwindigkeit von 0,2 mL/min zu erhalten, und in einen befeuchteten Inkubator bei 37°C platziert. Nach dem Animpfen wurden die Konstruktionen mit Medien, die Ascorbat (50 μg/mL) enthielten bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,05 mL/min, kultiviert. Nach einer Inkubation über Nacht stieg die Fließgeschwindigkeit um 0,2 mL/min an, dann wöchentlich in Inkrementen von 0,2 mL/min. Die Fließrichtung veränderte sich in 5 Tagen pro Woche.
  • Nach zwei oder vier Wochen Kultur, wurden die Knorpelkonstruktionen auf gesamte sulfatierte Glykosaminoglyane (GAGs) durch Binden von Dimethylmethylenblau, wie von Farndale et al. (Biochem. Biophys. Acta 883: 173–177 (1986)) beschrieben, analysiert. Der Gesamtkollagengehalt wurde durch Hydroxyprolinquantifizierungen, wie von Woessner et al. (Arch. Biochem. Biophys. 93: 440–447 (1961)) beschrieben, analysiert.
  • Separate Proben wurden entnommen, in 10% gepuffertem Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Fünf Schnitte von fünf Mikrometer wurden mit Safranin O oder Kollagenantikörpern (Southern Biotech, Birmingham, AL) gefärbt, um die Quantität und die Verteilung von sulfatierten Glykosaminoglykanen (GAG) bzw. Kollagenarten einzuschätzen.
  • Nach zwischen zwei und vier Wochen Kultur unter hydrodynamischen Bedingungen wurde eine wesentliche Erhöhung (p < 0,05) der Niveaus sowie des Prozentsatzes von Kollagen und sulfatiertem GAG auf den Knorpelkonstruktionen beobachtet (5 und 6). Nach vier Wochen unterschieden sich die Konzentrationen nicht signifikant von jenen im Knorpelgewebe bei ausgewachsenen Kaninchen (6). Obwohl die Kollagenniveaus zwischen zwei und vier Wochen der Kultivierung anstiegen, lag der Kollageninhalt nach vier Wochen immer noch unterhalb dem des Kaninchenngelenkknorpels. Im Vergleich zu diesen hydrodynamisch gezüchteten Konstruktionen waren in den Kulturen, die für den gleichen Zeitabschnitt stationär gehalten wurden, weniger Kollagen und sulfatiertes GAG anwesend.
  • Das Muster von sulfatierten GAG, die sich auf den Konstruktionen, die unter hydrodynamischen Bedingungen gezüchtet wurden, ablagerten, glichen in histologischer Sicht dem des nativen Kaninchenngelenkknorpels, während das der stationär gezüchteten Konstruktionen uneinheitlich war, wobei im Zentrum der Konstruktion wenig sulfatiertes GAG vorhanden war. Kollagen II war in immungefärbten Konstruktionen mit einer ähnlichen Verteilung wie der, die in nativem Gelenkknorpel zu sehen ist, vorhanden. Lakunen umgaben die meisten Zellen in den hydrodynamischen, aber nicht in den stationär gehaltenen Konstruktionen.
  • Gemini I Bioreaktor
  • Ähnliche Ergebnisse wurden in Experimenten, die unter Verwendung eines maßstäblich vergrößerten Bioreaktors durchgeführt wurden, erhalten. Die Kaninchenchondrozyten wurden mit 30 E6 Zellen/System angeimpft und entweder bei 0,05 ml/min konstanter Fließgeschwindigkeit oder bei einer Fließgeschwindigkeit, die allmählich von 0,05 auf 0,8 ml/min erhöht wurde, gezüchtet. Die unter der erhöhten Fließgeschwindigkeit gezüchtete Zelle zeigte eine höhere Matrixablagerung. In Kulturen, die bei der erhöhten Fließgeschwindigkeit gezüchtet wurden, lagen Glykosaminoglykan(GAG)-Niveaus bei 25% bis 50%, wohingegen in vergleichbaren Zellen, die bei der niedrigen Fließgeschwindigkeit (0,05 ml/min) gezüchtet wurden, die GAG-Niveaus bei ungefähr 3% lagen. In Kulturen, die bei der erhöhten Fließgeschwindigkeit gezüchtet wurden, lagen Kollageniveaus bei 12% bis 20%, wohingegen in vergleichbaren Zellen, die bei der niedrigen Fließgeschwindigkeit (0,05 ml/min) gezüchtet wurden, die Kollagen-Niveaus bei ungefähr 5% lagen.
  • Kulturen in einlagiger Schicht
  • Bioreaktoren können auf viele verschiedene Arten angelegt sein, um Beanspruchung durch Scherströmung auf einer einlagigen Chondrozytenschicht herzustellen. Dies induziert und hält den chondrozytischen Phänotyp aufrecht.
  • 2 stellt eine Scherströmungs-Wachstumskammer 3, die konzentrische Trommeln 1, 2 umfasst, schematisch dar. Die Oberfläche von Trommel 1 oder 2 oder beiden kann als Substrat zur Anhaftung von Zellen dienen. Eine der Trommeln kann stationär bleiben, während sich die andere Trommel dreht. Alternativ dazu können sich beide Trommeln drehen. In jeder Anordnung sind die Trommeln 1, 2 mindestens teilweise in das flüssige Wachstumsmedium 15 eingetaucht. Die relative Bewegung zwischen den Trommel verankerten Zellen und dem flüssigen Wachstumsmedium 15 erzeugt die Beanspruchung durch Scherströmung.
  • Die Menge an Beanspruchung durch Strömung, die auf die Zellen ausgeübt wird, kann durch das Einstellen der Trommeldrehgeschwindigkeit gemäß obiger Gleichung (1) eingestellt werden. Der Abstand 13 zwischen den Trommeln 1, 2 ist Parameter (h) in Gleichung (1). Vorzugsweise wird die Trommelgeschwindigkeit ausgewählt, um eine Beanspruchung durch Scherströmung von ungefähr 1 bis ungefähr 100 dyn/cm2 und besser von ungefähr 1 bis ungefähr 50 dyn/cm2 zu erreichen. Vorzugsweise wird die Trommel mittels eines Elektromotors mit variabler Geschwindigkeit gedreht. Der optimale Abstand zwischen den zwei Trommeln hängt von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich der Trommelgröße und dem Material, aus dem sie gemacht sind. Die Bestimmung der optimalen Trommelkonfiguration ist dem Fachmann bekannt. Da die Beanspruchung durch Scherströmung durch die Trommeldrehung erzeugt wird, ist eine kontinuierliche Durchflussanordnung, die einen Flüssigkeitsbehälter und eine Pumpe einschließt, freigestellt.
  • 3 stellt eine Scherströmungs-Wachstumskammer 5, die eine sich drehende Scheibe 4 in der Wachstumskammer 5 umfasst, schematisch dar. Die Scheibe 4 ist in den flüssigen Nährboden 15 getaucht, wo sie als ein Substrat zur Anhaftung von Zellen dient. Die Menge an Beanspruchung durch Strömung, die auf die Zellen ausgeübt wird, kann durch das Einstellen der Scheibendrehgeschwindigkeit gemäß obiger Gleichung (1) eingestellt werden. Der Abstand 13 zwischen der Scheibe 4 und der Wachstumskammerwand ist Parameter (h) in Gleichung (1). Vorzugsweise wird die Scheibendrehgeschwindigkeit ausgewählt, um eine Beanspruchung durch Scherströmung von ungefähr 1 bis ungefähr 100 dyn/cm2 zu erreichen und besser von ungefähr 1 bis ungefähr 50 dyn/cm2 zu erreichen. Wahlweise kann eine Mehrzahl von Scheiben auf eine einzelne Drehwelle platziert werden, um den Gesamtbereich der Oberfläche, der zur Unterstützung von Zellanhaftung und Zellwachstum zur Verfügung steht, zu erhöhen. Typischerweise wird die Scheibe durch einen Elektromotor mit variabler Geschwindigkeit gedreht. Da die Beanspruchung durch Scherströmung durch die Scheibendrehung erzeugt wird, ist eine kontinuierliche Durchflussanordnung, die einen Flüssigkeitsbehälter und eine Pumpe einschließt, freigestellt.
  • Zellen in der Nähe der Peripherie der sich drehenden Scheibe bewegen sich mit einer größeren Geschwindigkeit als Zellen, die sich in der Nähe der zentralen Welle befinden. Deshalb sind sie einer größeren Beanspruchung durch Scherströmung ausgesetzt. Das Ausmaß dieses Effekts hängt von der Scheibengröße ab. Daher ermöglicht die Ausführungsform der Erfindung der sich drehenden Scheiben gleichzeitiges Wachstum von Zellen, die einem kontinuierlichen Bereich von Scherströmungs-Beanspruchungsniveaus innerhalb eines einzelnen Bioreaktors ausgesetzt sind. Dieses Merkmal kann für den systematischen Vergleich des Effekts von variierenden Scherströmungs-Beanspruchungsniveaus auf eine festgelegte Zellart in einem festgelegten Nährboden sein.
  • 4 stellt eine Scherströmungs-Wachstumskammer 8, die zwei parallele, stationäre Platten oder Wände 6 und 7, innerhalb der Wachstumskammer 8 umfasst, schematisch dar. Ein einzelnes Paar stationärer Platten 6, 7 kann verwendet werden, oder mehr als ein Paar kann in der gleichen Wachstumskammer 8 verwendet werden. Da die Platten 6, 7 stationär sind, wird die Beanspruchung durch Scherströmung ausschließlich durch die Bewegung des flüssigen Nährbodens 15, der durch die Kammer 8 gepumpt wird, erzeugt. Der flüssige Nährboden 15 wird an den parallelen Platten 6 und 7 vorbeigepumpt, um eine Beanspruchung durch Scherströmung zwischen ungefähr 1 und ungefähr 100 dyn/cm2 und vorzugsweise zwischen ungefähr 1 und ungefähr 50 dyn/cm2 zu schaffen. Die Beanspruchung durch Scherströmung wird durch das Einstellen der Fließgeschwindigkeit des flüssigen Nährbodens 15 gemäß der obigen Gleichung (1) eingestellt. Der Abstand 13 zwischen den stationären Platten 6, 7 ist Parameter (h) in Gleichung (1). Die stationären Platten 6, 7 sind vorzugsweise zueinander parallel und im rechten Winkel zur vorherrschenden Strömung des flüssigen Wachstumsmediums 15.
  • Der Vorteil der Erhöhung der Anzahl von Platten 6, 7 ist ein größerer gesamter Oberflächenbereich, auf dem die Zellen eine einlagige Schicht bilden können. Der potentielle Nachteil von mehrfachen Platten liegt darin, dass, wenn die Anzahl von Platten steigt, es möglicherweise relativ schwieriger wird, ein gleichmäßiges Niveau an Beanspruchung durch Scherströmung die der Zellen in der gesamten Kammer 8 aufrecht zu erhalten. Eine Möglichkeit, ein gleichmäßiges Niveau an Beanspruchung durch Scherströmung aufrecht zu erhalten, ist die Dispergierung des eintretenden flüssigen Nährbodens 15a über einen breiten Bereich auf einer Wand der Kammer 8, während der austretende flüssige Nährboden 15b von einem ähnlich breiten Bereich auf der gegenüberliegenden Wand der Kammer gesammelt wird.
  • Die sich drehenden Trommeln 1, 2, die sich drehende Scheibe 4 oder die stationären Platten 6, 7 müssen aus einem Material gefertigt sein, das mit der Gewebekulturen kompatibel ist. Verschiedene Materialien, die mit Gewebekultur kompatibel sind, sind bekannt, z. B. Polystyren, Polycarbonat und Edelstahl. Die Auswahl eines geeigneten Materials für die Wände der Wachstumskammer und das Substrat, das die einlagige Schicht unterstützenden, ist dem Fachmann bekannt.
  • In unten beschriebenen Experimenten wurde die Fließgeschwindigkeit der Flüssigkeit in einem Bioreaktor eingestellt, um vorgewählte Beanspruchungsniveaus durch Scherströmung von ungefähr 1 dyn/cm2 und ungefähr 24 dyn/cm2 zu erhalten. Die Viskosität (μ) des flüssigen Nährbodens betrug 0,0012 N sec/m2, die Kammerbreite (b) betrug 2,5 cm und die Kammerhöhe (h) betrug 0,025 cm. Unter Verwendung der obigen Gleichung (1) wurde berechnet, dass bei einer Beanspruchung durch Scherströmung von 1 dyn/cm2 die Fließgeschwindigkeit (Q) 1,3 ml/min betragen sollte. Es wurde berechnet, dass für eine Beanspruchung durch Scherströmung von 24 dyn/cm2 die Fließgeschwindigkeit (Q) 31,25 ml/min betragen sollte.
  • Für das Animpfen von Chondrozyten wurden Platten (7,5 cm mal 3,75 cm) von großen Gewebekulturschalen abgeschnitten. Die Platten wurden durch Behandlung mit 70% Ethanol, gefolgt von einer einstündigen Behandlung mit ultraviolettem Licht in einer sterilen Werkbank sterilisiert. Die Platten wurden dann in Petrischalen platziert und mit einer 1 ml Suspension aus Kaninchenchondrozyten aus Durchgang 2 mit einer Dichte von ungefähr 100 000 Zellen pro Platte plattiert. Der in diesem Arbeitsverfahren verwendete Zellnährboden war ein Vollmedium ohne Ascorbat. Die Platten wurden mit dem Medium abgedeckt und 6 Stunden lang stehen gelassen. Sie wurden dann in einen Inkubator für 2 Tage bei 37°C übertragen. Ungefähr 15 ml von zusätzlichem Medium wurden hinzugefügt, und die Platten wurden in den Durchflussregelkreis platziert. Zu diesem Zeitpunkt waren die Zellen subkonfluent.
  • Experimente wurden durchgeführt, um bei niedrigen und hohen Fließgeschwindigkeiten in diesem System die erhaltenen Ergebnisse zu vergleichen. Eine niedrige Fließgeschwindigkeit, die 1 dyn/cm2 erzeugte, wurde mit Chondrozyten bei einer Dichte verwendet, die mit der Dichte, welche in einer Roller-Flaschenvorrichtung mit Beanspruchung durch Scherung, die bei 1 rpm betrieben wird, vergleichbar ist. Eine hohe Fließgeschwindigkeit, die 24 dyn/cm2 erzeugte, wurde zum Vergleich auch getestet.
  • Die Ergebnisse demonstrierten einen von der Beanspruchung durch Scherströmung abhängigen Unterschied in der Chondrozytenkollagenherstellung. Bei 24 dyn/cm2 wurde die Herstellung von Kollagen I im Vergleich zu den Ergebnissen der stationären Roller-Flaschen vermindert. Bei 24 dyn/cm2 wurde die Herstellung von Kollagen II im Vergleich zu den Ergebnissen der stationären Roller-Flaschen verbessert. Unter den Bedingungen der Beanspruchung durch Scherung in diesen Experimenten gab es keine Ausrichtung der Zellen in Richtung der Strömung.
  • Andere Ausführungsformen liegen innerhalb der folgenden Ansprüche.

Claims (31)

  1. Ein Bioreaktor zur Herstellung von Knorpel, der eine Wachstumskammer (11) beinhaltet, die ein Substrat zur Anhaftung von Zellen, die Knorpel herstellen können, und ein Mittel zum Ausüben relativer Bewegung zwischen einem flüssigen Nährboden und dem Substrat beeinhaltet, um die an dem Substrat anhaftenden Zellen mit einer Beanspruchung durch Scherströmung von ungefähr 1 bis ungefähr 100 dyn/cm2 zu versehen.
  2. Bioreaktor gemäß Anspruch 1, der ferner ein Mittel zum Ausüben einer Beanspruchung durch Scherströmung von ungefähr 1 bis ungefähr 50 dyn/cm2 beinhaltet.
  3. Bioreaktor gemäß Anspruch 1, wobei das Mittel zum Ausüben einer Beanspruchung durch Scherströmung einen Behälter (9), eine Pumpe (10) und eine Verrohrung, die die Wachstumskammer (11), den Behälter und die Pumpe untereinander verbindet, beinhaltet, um einen kontinuierlichen Fluss flüssigen Wachstumsmediums aus dem Behälter durch die Wachstumskammer und zurück zum Behälter als Reaktion auf eine von der Pumpe ausgeübte Kraft zu ermöglichen.
  4. Bioreaktor gemäß Anspruch 1, wobei das Substrat ein Gerüst ist.
  5. Bioreaktor gemäß Anspruch 1, wobei das Gerüst biologisch resorbierbar ist.
  6. Bioreaktor gemäß Anspruch 1, wobei das Substrat eine nicht poröse Oberfläche ist, die das Wachstum der Zellen in einer einlagigen Schicht unterstützt.
  7. Bioreaktor gemäß Anspruch 6, wobei die nicht poröse Oberfläche die Oberfläche einer drehbaren Trommel ist.
  8. Bioreaktor gemäß Anspruch 6, wobei die nicht poröse Oberfläche die Oberfläche einer drehbaren Scheibe ist.
  9. Bioreaktor gemäß Anspruch 6, wobei die nicht poröse Oberfläche eine stationäre Platte ist.
  10. Ein Verfahren zum Herstellen von Knorpel, wobei das Verfahren die folgenden Schritte beinhaltet: (a) Bereitstellen einer Wachstumskammer (11), die ein Substrat zur Zellanhaftung beinhaltet; (b) Abdecken des Substrats mit einem flüssigen Wachstumsmedium; (c) Beimpfen des Mediums mit Zellen, die Knorpel herstellen können; (d) Ermöglichen der Anhaftung der Zellen an das Substrat; (e) Ausüben und Aufrechterhalten relativer Bewegung zwischen dem flüssigen Wachstumsmedium und den an dem Substrat anhaftenden Zellen, um die Zellen mit einer Beanspruchung durch Scherströmung von ungefähr 1 bis ungefähr 100 dyn/cm2 zu versehen, wodurch durch Scherströmung beanspruchte Zellen hergestellt werden; und (f) Kultivieren der durch Scherströmung beanspruchten Zellen für eine ausreichende Zeit, um Knorpel herzustellen.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Beanspruchung durch Scherströmung ungefähr 1 bis ungefähr 50 dyn/cm2 beträgt.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das Substrat ein Gerüst ist.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das Gerüst biologisch resorbierbar ist.
  14. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das Substrat eine nicht poröse Oberfläche ist, die das Wachstum der Zellen in einer einlagigen Schicht unterstützt.
  15. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die nicht poröse Oberfläche die Oberfläche einer drehbaren Trommel ist.
  16. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die nicht poröse Oberfläche die Oberfläche einer drehbaren Scheibe ist.
  17. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die nicht poröse Oberfläche eine stationäre Platte ist.
  18. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die durch Scherströmung beanspruchten Zellen: (a) eine verbesserte Aufrechterhaltung eines chondrozytischen Phänotyps zeigen; und (b) eine extrazelluläre Matrix herstellen, die ein verbessertes Verhältnis von Kollagen II zu Kollagen I enthält.
  19. Ein Verfahren zum Induzieren der Differenzierung von Stammzellen zu Chondrozyten, wobei das Verfahren die folgenden Schritte beinhaltet: (a) Bereitstellen einer Wachstumskammer (11), die ein Substrat zur Zellanhaftung beinhaltet; (b) Abdecken des Substrats mit einem flüssigen Wachstumsmedium; (c) Beimpfen des Mediums mit Säugetierstammzellen; (d) Ermöglichen der Anhaftung der Zellen an das Substrat; (e) Ausüben und Aufrechterhalten relativer Bewegung zwischen dem flüssigen Wachstumsmedium und den an dem Substrat anhaftenden Zellen, um die Stammzellen mit einer Beanspruchung durch Scherströmung von ungefähr 1 bis ungefähr 100 dyn/cm2 zu versehen, wodurch durch Scherströmung beanspruchte Stammzellen hergestellt werden; und (f) Kultivieren der durch Scherströmung beanspruchten Stammzellen für eine ausreichende Zeit, um es ihnen zu ermöglichen, sich zu Chondrozyten zu differenzieren.
  20. Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei die Beanspruchung durch Scherströmung ungefähr 1 bis ungefähr 50 dyn/cm2 beträgt.
  21. Ein Verfahren zum Induzieren von Transdifferenzierung von kultivierten Zellen zu Chondrozyten, wobei das Verfahren die folgenden Schritte beinhaltet: (a) Bereitstellen einer Wachstumskammer (11), die ein Substrat zur Zellanhaftung beinhaltet; (b) Abdecken des Substrats mit einem flüssigen Wachstumsmedium; (c) Beimpfen des Mediums mit anderen Säugetierzellen als Chondrozyten oder chondrozytischen Stammzellen; (d) Ermöglichen der Anhaftung der Zellen an das Substrat; (e) Ausüben und Aufrechterhalten relativer Bewegung zwischen dem flüssigen Wachstumsmedium und den an dem Substrat anhaftenden Zellen, um die Zellen mit einer Beanspruchung durch Scherströmung von ungefähr 1 bis ungefähr 100 dyn/cm2 zu versehen, wodurch durch Scherströmung beanspruchte Zellen hergestellt werden; und (f) Kultivieren der durch Scherströmung beanspruchten Zellen für eine ausreichende Zeit, um es ihnen zu ermöglichen, sich zu Chondrozyten zu transdifferenzieren.
  22. Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die Beanspruchung durch Scherströmung ungefähr 1 bis ungefähr 50 dyn/cm2 beträgt.
  23. Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die differenzierten Säugetierzellen aus der Gruppe, bestehend aus Fibroblasten und Myozyten, ausgewählt werden.
  24. Bioreaktor gemäß Anspruch 1, wobei die Zellen aus der Gruppe, bestehend aus Chondrozyten, chondrozytischen Stammzellen, mesenchymalen Stammzellen und Zellen, die sich zu einem chondrozytischen Phänotyp transdifferenzieren, ausgewählt werden.
  25. Bioreaktor gemäß Anspruch 4, wobei das Gerüst biokompatibel ist.
  26. Bioreaktor gemäß Anspruch 25, wobei das Gerüst biologisch abbaubar ist.
  27. Bioreaktor gemäß Anspruch 25, wobei das Gerüst nicht biologisch abbaubar ist.
  28. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Zellen aus der Gruppe, bestehend aus Chondrozyten, chondrozytischen Stammzellen, mesenchymalen Stammzellen und Zellen, die sich zu einem chondrozytischen Phänotyp transdifferenzieren, ausgewählt werden.
  29. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das Gerüst biokompatibel ist.
  30. Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei das Gerüst biologisch abbaubar ist.
  31. Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei das Gerüst nicht biologisch abbaubar ist.
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