DE69734012T2

DE69734012T2 - Methode zur tiefkühlkonservierung von biologischen proben

Info

Publication number: DE69734012T2
Application number: DE69734012T
Authority: DE
Inventors: M. Mark FRIEDMAN; Amir Arav
Original assignee: STATE OF ISRAEL; STATE OF ISRAEL BET DAGAN
Current assignee: STATE OF ISRAEL; STATE OF ISRAEL BET DAGAN
Priority date: 1996-11-01
Filing date: 1997-10-21
Publication date: 2006-06-08
Anticipated expiration: 2017-10-22
Also published as: EP0953129B1; DE69734012D1; EP0953129A1; WO1998020275A1; EP0953129A4; AU4912097A; US5715686A

Description

FELD UND HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kryokonservierung einer biologischen Probe in einem kryogenen Fluid, und insbesondere ein Verfahren zur Vitrifikation bzw. Kälteverglasung der Proben, bei welchem Wärme von der Probe auf das kryogene Fluid effizienter als dies bislang möglich war übertragen wird.
Biologische Proben werden gewöhnlich mittels Eintauchens derselben in flüssigen Stickstoff vitrifiziert. Üblicherweise ist der verwendete flüssige Stickstoff im Gleichgewicht mit dem Stickstoff-Dampf, bei der Stickstoff-Siedetemperatur von ungefähr –196°C. Wenn die Probe in dem flüssigen Stickstoff angeordnet wird, strömt Wärme von der Probe zu dem flüssigen Stickstoff, was dazu führt, dass der flüssige Stickstoff in der unmittelbaren Umgebung der Probe siedet, wodurch eine Tasche bzw. eine Blase aus Stickstoff-Dampf um die Probe herum erzeugt wird. Die Wärmeleitung durch den Stickstoff-Dampf ist weitaus weniger effizient als die Wärmeleitung durch den flüssigen Stickstoff. Folglich isoliert die Dampfblase bzw. die Dampftasche, welche die Probe umgibt, die Probe von dem flüssigen Stickstoff und verzögert bzw. hemmt den weiteren Wärmeübergang. Daher müssen biologische Proben, welche vitrifiziert werden sollen, von einer hochkonzentrierten Lösung aus einem Kryo-Schutzmittel umgeben sein. Kryo-Schutzmittel sind Verbindungen, wie zum Beispiel polyhydrierte Alkohole, welche in für die Kryokonservierung bzw. für die Tieftemperaturkonservierung wirksamen Konzentrationen tendenziell toxisch sind. Biologische Proben, welche von einer Kryo-Schutzmittel-Lösung umgeben sind, welche ausreichend verdünnt ist, um nicht toxisch zu sein, erleiden aufgrund des internen thermischen Gradienten, welcher zwischen der kalten Proben-Peripherie und dem warmen Proben-Inneren existiert, gewöhnlich thermischen Schaden, während die Wärme langsam durch die Dampfblase geleitet wird.
Ein Verfahren, welches angewandt wurde, um die Bildung der Dampfblasen zu hemmen bzw. zu unterdrücken, besteht darin, die Temperatur von dem flüssigen Stickstoff unter die seines Siedepunkts abzusenken mittels Anbringens eines Soges, um in dem Dampf oberhalb des flüssigen Stickstoffes ein teilweises Vakuum zu erzeugen. Dies hat zur Folge, dass ein Teil des Stickstoffes verfestigt wird, wodurch ein Stickstoff-Schlammeis mit der Gefriertemperatur von Stickstoff, d.h. ungefähr –210°C, erzeugt wird. Eine Probe, welche in das Stickstoff-Schlammeis eingetaucht wird, bleibt von Flüssigkeit umgeben, wenn sie sich verfestigt. Unter Verwendung dieses Verfahrens konnten Peter Mazur und seine Kollegen (Mazur, P., Cole, K. W., Hall, W. H., Schreuders, P. D., Mahowald, A. P., Cryobiological preservation of Drosophila embryos, Science, vol. 258 pp. 1932–1935 (1992)) ganze Drosophila Embryonen vitrifizieren und anschließend wiederbeleben. Die Wärmeleitung von der Probe zu dem Stickstoff-Schlammeis ist ausreichend schnell, um eine Vitrifikation der biologischen Proben unter Verwendung von verdünnten Kryo-Schutzmittel-Lösungen zu ermöglichen.
Dennoch ist dieses Verfahren nicht so effizient wie es sein könnte, insbesondere da die Probe mittels einer Haltevorrichtung, zum Beispiel mittels einer Zange, gehalten werden muss, während sie in das Schlammeis hinein eingetaucht und dann von dem Schlammeis entfernt und zur Aufbewahrung in ein mit Flüssig-Stickstoff gefülltes Kryogenfläschchen überführt wird. Sowohl die Probe als auch die Zange werden durch das Schlammeis gekühlt. Folglich ist die Rate der Wärmeübertragung von der Probe auf das Schlammeis nicht so groß wie sie sein würde, wenn nur die Probe mit dem Schlammeis in Kontakt sein würde. Hierdurch wird eine nicht notwendige einschränkende obere Grenze bezüglich der Abkühl-Rate und der Kryo-Schutzmittel-Konzentration auferlegt, welche in Verbindung mit diesem Verfahren verwendet werden können.
Es besteht folglich ein weitgehend erkannter Bedarf für ein Verfahren zum Einfrieren einer biologischen Probe in Stickstoff-Schlammeis, bei welchem nur die Probe in Kontakt mit dem Schlammeis kommt, und es wäre höchst vorteilhaft ein solches Verfahren zu haben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren für die Kryokonservierung einer Probe geschaffen, aufweisend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Behälters, welcher teilweise mit einer ersten kryogenen Flüssigkeit gefüllt ist, (b) Bereitstellen eines teilweisen Vakuums oberhalb der ersten Flüssigkeit, wodurch Schlammeis erzeugt wird und (c) herunterlassen der Probe in das Schlammeis hinein.
Das Prinzip der Erfindung ist es, kryogenes Schlammeis in dem Behälter, in welchem die gefrorene Probe aufbewahrt werden soll, zu erzeugen und die Probe in das Schlammeis hinein herunterzulassen. Auf diese Weise wird die gesamte äußere Fläche von der Probe mit der kryogenen Flüssigkeit in Kontakt gebracht, womit der Wärmeübergang von der Probe auf das Schlammeis optimiert wird.
Ein zusätzlicher Vorteil der Erfindung ist, dass die vitrifizierte Probe anschließend in demselben Behälter aufbewahrt werden kann, in welchem sie vitrifiziert wurde.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Beispieles mit Bezug auf die angehängte Zeichnung beschrieben, wobei die alleinige Figur eine schematische Querschnittsansicht von einer bevorzugten Ausführungsform zum Durchführen des Verfahrens gemäß der Erfindung ist.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vitrifikation (= Kälteverglasung) oder zum schnellen Einfrieren von biologischen Proben. Insbesondere kann das Verfahren verwendet werden, um biologische Proben in Kryo-Schutzmittel-Lösungen zu vitrifizieren, welche schwächer konzentriert sind als die Lösungen in den Verfahren gemäß dem Stand der Technik.
Die Prinzipien und die Durchführung des Kryokonservierungs-Verfahrens gemäß der Erfindung können unter Bezugnahme der Zeichnung und der folgenden Beschreibung besser verstanden werden.
Mit Bezug auf die Zeichnung ist die alleinige Figur eine schematische Querschnittsansicht von einer bevorzugten Ausführungsform zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Ein standardgemäßes Kryogen-Aufbewahrungs-Fläschchen bzw. ein Kryogen-Aufbewahrungs-Behälter 10 wird teilweise mit flüssigem Stickstoff 12 aufgefüllt und wird teilweise in ein größeres Bad 40 aus flüssigem Stickstoff für zusätzliche thermische Stabilität eingetaucht. Das Fläschchen bzw. der Behälter 10 wird mit einem Gummistopfen 20 bereitgestellt. Der Behälter 10 wird mittels Hineinsteckens des Stopfens 20 in das offene Ende von dem Behälter 10 abgedichtet und wird mittels Herausziehens des Stopfens 20 aus dem offenen Ende von dem Behälter 10 geöffnet. Eine hohle Nadel 30, welche durch ein Loch 22 in dem Stopfen 20 durch denselben hindurch eingebracht wird und welche ein proximales Ende 32 aufweist, welches außerhalb von dem Behälter 10 ist, wenn der Behälter 10 durch den Stopfen 20 abgedichtet wird, stellt einen Zugang zu dem Dampf oberhalb des flüssigen Stickstoffes 12 bereit. Ein Thermoelement 34, welches durch ein Loch 24 in dem Stopfen 20 eingebracht ist, ist zum Überwachen der Temperatur des flüssigen Stickstoffes 12 bereitgestellt.
Bei Anwendung wird ein Sog an das proximale Ende 32 von der Nadel 30 angebracht, um flüssigen Stickstoff 12 in Schlammeis umzuwandeln. Vorzugsweise weist das derart über dem flüssigen Stickstoff 12 erzeugte teilweise Vakuum einen Druck von 0,8 bar auf. Der Stopfen 20 wird von dem Behälter 10 entfernt, die biologische Probe, welche auf einem Elektronenmikroskop-Gitter sitzt, wird in das Schlammeis hinein abgesenkt und der Stopfen 20 wird wieder in das offene Ende von dem Behälter 10 hinein eingebracht. Optional kann weiterhin ein Sog an das proximale Ende 32 von der Nadel 30 angebracht werden, um das Schlammeis auf der Gefriertemperatur von Stickstoff zu halten.
Obgleich die Erfindung bezüglich einer begrenzten Anzahl von Ausführungsformen beschrieben worden ist, ist es offensichtlich, dass viele Variationen, Modifikationen und andere Anwendungen der Erfindung gemacht werden können.

Claims

Verfahren für die Kryokonservierung einer Probe, aufweisend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Behälters (10), welcher teilweise mit einer ersten kryogenen Flüssigkeit (12) gefüllt ist, (b) Bereitstellen eines teilweisen Vakuums oberhalb der ersten Flüssigkeit (12), wodurch Schlammeis erzeugt wird, (c) Öffnen des Behälters (10) und (d) Herunterlassen der Probe in das Schlammeis hinein.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste kryogene Flüssigkeit (12) flüssigen Stickstoff aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das teilweise Vakuum einen Druck von 0,8 bar aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, weiter aufweisend den Schritt des Bereitstellens eines teilweisen Vakuums oberhalb des Schlammeises.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das teilweise Vakuum bereitgestellt wird durch die Schritte: (i) Bereitstellen des Behälters (10) mit einem Deckel (20), welcher eine hohle Nadel (30) aufweist, welche durch den Deckel (20) hindurch eingebracht ist, wobei die Nadel (30) ein proximales Ende (32) außerhalb des Behälters (10) aufweist, und (ii) Anbringen eines Soges an das proximale Ende (32).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, ferner aufweisend den Schritt, dass der Behälter (10) teilweise in eine zweite kryogene Flüssigkeit (42) eingetaucht ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die zweite kryogene Flüssigkeit (42) flüssigen Stickstoff aufweist.