DE69735006T2

DE69735006T2 - Kontrastmittel

Info

Publication number: DE69735006T2
Application number: DE69735006T
Authority: DE
Inventors: Jo Klaveness; Anne Naevestad; Alan Cuthbertson
Original assignee: Amersham Health AS
Current assignee: GE Healthcare AS
Priority date: 1996-10-28
Filing date: 1997-10-28
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2017-10-29
Also published as: AU4786897A; DE69735006D1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf diagnostische Bildgebungstechniken, in denen ein Krankheitszustand unter Verwenden eines gezielten Kontrastmittels abgebildet werden kann und auf gezielte Kontrastmittel, die zur Verwendung in derartigen Techniken geeignet sind. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung derartiger Kontrastmittel, in denen der Targeting-Vektor an Angiotensin II-Rezeptoren bindet.
Angiotensin II (im folgenden genannt A II) ist ein Octapeptid (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe), die die primär wirksame Spezies in dem Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (das RAS-System) ist, das den Blutdruck und die Elektrolyt- und Wasserbalance reguliert. Das RAS-System ist schematisch in 1 dargestellt, welche auf 1 im Artikel von Foote et al. in Ann. Pharmacother. 27: 1495–1503 (1993) basiert.
A II übt seine biologischen Effekte über Wechselwirkung mit spezifischen Rezeptoren aus, die in vielen Geweben im menschlichen oder tierischen Körper vorhanden sind (z.B. Blutgefäße, Herz, Hirn, Leber, Niere, Uterus und Ovarien). Während es einer seiner Haupteffekte ist, Vasokonstriktion zu fördern, besitzt A II mehrere andere Effekte, die zu einem erhöhten Blutdruck und Natriumretention führen. So wird z.B. als Reaktion auf eine Stimulation der A II-Rezeptoren in der Nebennierenrinde Aldosteron freigesetzt und dies stimuliert die Natrium- und Wasserretention und die Kaliumausscheidung in den distalen Tubuli und corticalen Sammelducti der Niere. A II besitzt auch einen direkten Effekt auf die Niere, einschließlich glomerulärer Hypertrophie und angestiegener proximaler Tubulus-Natrium-Reabsorption. Außerdem wirkt A II zentral, um Durst zu stimulieren und die antidiuretische Hormonfreisetzung zu verbessern, wodurch es zu einem vergrößerten intravaskulären Volumen führt.
Demgemäß wurde die Suppression der A II-Effekte therapeutisch verwendet, z.B. beim Management der Hypertension und der kongestiven Herzinsuffizienz. Dies wurde auf eine Anzahl von Arten erreicht: durch die Verwendung von Renin-Inhibitoren, die die Konversion von Angiotensinogen zu Angiotensin I (dem Precursor von A II) blockieren; durch die Verwendung von Inhibitoren des Angiotensin umwandelnden Enzyms (ACE), die die Konversion von Angiotension I zu A II blockieren (und auch die Biokonversion von Bradykinin und Prostaglandinen blockiert); durch die Verwendung von anti-A II-Antikörpern; und durch die Verwendung von A II-Rezeptorantagonisten.
Es wurde gefunden, dass verschiedene Typen von A II-Rezeptoren (Bindungsstellen) innerhalb des Körpers existieren und dass die A II-Bindung verschiedene Effekte an verschiedenen Bindungsstellen besitzt. So vermittelt der AT1-Rezeptor die kardiovaskuläre Hauptwirkung des RAS und wird inhibiert durch die A II-Rezeptorantagonisten Losartan und DTT, während die andere Rezeptor-Hauptfamilie, AT2, inhibiert wird durch PD 123177 und seine strukturellen Analoga. Andere Rezeptoren für A II außer AT1 und AT2 sind bekannt und werden im allgemeinen bezeichnet als AT_atypical (s. Kang et al., Am. Heart J. 127: 1388–1401 (1994)).
US-Patent Nr. 5,444,069 offenbart die Verwendung von 4,5,6,7-Tetrahydro-1H-imidazo[4,5-c]pyridine-6-carbonsäuren und Analoga davon beim Antagonisieren der Bindung von Angiotensin II an AT₂-Rezeptoren, um Gedächtnisverlust zu behandeln.
Es wurde nun gefunden, dass es möglich ist, A II-Rezeptorstellen in vivo unter Verwenden von gezielten Kontrastmitteln abzubilden, in denen der Targeting-Vektor eine Affinität für A II-Rezeptorstellen besitzt. Die A II-Rezeptoren sind allgemein innerhalb des kardiovaskulären Systems angeordnet und für derartige Kontrastmittel zugänglich, wenn sie in den Blutstrom verabreicht werden. Demgemäß ist es unter Verwenden derartiger gezielter Kontrastmittel möglich, Krankheiten und Störungen, wie Herzinsuffizienz, Atherosklerose und beschränkten Blutfluss zu detektieren, wie auch andere vaskuläre Krankheiten und Störungen und auch das Fortschreiten der Be handlung für derartige Krankheiten und Störungen zu überwachen. Von einem Aspekt aus gesehen stellt deshalb die Erfindung eine Stoffzusammensetzung der Formel I bereit V-L-R (I)wobei V eine organische Gruppe mit einer Bindungsaffinität für einen Angiotensin II-Rezeptorort ist, L eine Linkereinheit oder eine Bindung ist und R eine Einheit ist, die bei einer in vivo-Bildgebung eines menschlichen oder tierischen Körpers detektierbar ist unter den Maßgaben, dass wenn V für Angiotensin oder ein peptidisches Angiotensin-Derivat oder analog ist, V-L-R ein anderes ist als ein nicht-metallisches Radionuklid-substituiertes Peptid (z.B. ¹²⁵I-substituiertes Angiotensin II) und L-V ein anderes ist als einfach ein Peptid mit einem Chelatbildner-Amid, das an eine Seitenkette davon gebunden ist.
Bevorzugt, wo R ein Radionuklid ist, ist es ein Iod, das direkt oder indirekt an V gebunden ist, oder es ist ein Metallion, dass durch eine chelatbildende Gruppe in L chelatiert ist und/oder es ist trennbar von V durch Bioabbau einer organischen Linkergruppe L. (Es sollte beachtet werden, dass Wasserstoffradionuklide, während sie in vitro detektierbar sind, nicht dem Erfordernis genügen, dass R bei einer in vivo-Bildgebung detektierbar ist.)
Bevorzugt ist, wo V für Angiotensin steht, R nicht ein Metallion.
In vielen Fällen wird die Stoffzusammensetzung der Formel I eine charakterisierbare Verbindung sein. In anderen kann sie eine Kombination von Verbindungen sein, die miteinander verbunden oder andernfalls assoziiert sind, z.B. konjugiert sind. Der Einfachheit halber wird die Stoffzusammensetzung im folgenden als ein Mittel bezeichnet werden.
Von einem weiteren Aspekt aus gesehen stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend eine wirksame Menge (z.B. eine Menge, die zum Verstärken des Bildkontrastes in einer in vivo-Bildgebung wirksam ist) eines Mittels der Formel I zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch wirksamen Träger oder Hilfsstoff.
Von einem noch weiteren Aspekt aus gesehen stellt die Erfindung die Verwendung eines Mittels der Formel I für die Herstellung eines Kontrastmediums zur Verwendung in einem Diagnoseverfahren bereit, das beinhaltet die Verabreichung des Kontrastmediums an ein lebendes Subjekt und die Erzeugung eines Bildes mindestens eines Teils des Subjektes.
Von einem noch weiteren Aspekt aus gesehen stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen eines Bildes eines lebenden menschlichen oder nicht-menschlichen (bevorzugt Säuger oder Vogel) tierischen Subjektes bereit, das beinhaltet Verabreichen eines Kontrastmittels an das Subjekt und Erzeugen eines Bildes mindestens eines Teils des Subjektes, an das das Kontrastmittel verteilt wurde, z.B. durch Röntgenstrahlungs-, MR-, Szintigraphie-, PET-, SPECT-, elektrische Impedanz-, Licht- oder magnetometrische Bildgebungsmodalitäten, dadurch gekennzeichnet, dass als das Kontrastmittel ein Mittel der Formel I verwendet wird.
Von einem weiteren Aspekt aus gesehen stellt die Erfindung ein Verfahren zum Überwachen des Effektes der Behandlung eines menschlichen oder nicht-menschlichen tierischen Subjekts mit einem Arzneimittel bereit, um Effekte zu bekämpfen oder zu provozieren, die mit Angiotensin II assoziiert sind, wobei das Verfahren beinhaltet Verabreichen an das Subjekt ein Mittel der Formel I und Detektieren der Aufnahme des Mittels durch Angiotensin II-Rezeptoren, wobei die Verabreichung und die Detektion optional, aber bevorzugt wiederholt bewirkt wird, z.B. vor, während und nach der Behandlung mit dem Arzneimittel.
Von einem noch weiteren Aspekt aus gesehen stellt die Erfindung einen Prozess für die Herstellung eines Mittels der Formel Ibereit, wobei der Prozess umfasst Konjugieren ((i) einer organischen Verbindung mit einer Bindungsaffinität für einen A II-Rezeptor an (ii) eine Verbindung, die in einer diagnostischen Bildgebungsprozedur detektierbar ist oder eine chelatbildende Verbindung, und, falls nötig, Metallieren der chelatbildenden Gruppen in dem resultierenden Konjugat mit einem Metallion, das in einer diagnostischen Bildgebungsprozedur detektierbar ist.
Die Mittel der Formel I besitzen drei charakteristische Komponenten: einen Vektor (V); einen Linker (L); und einen Reporter (R). Der Vektor muss die Fähigkeit besitzen, die Verbindung auf A II-Rezeptoren zu zielen, der Reporter muss in einer diagnostischen in vivo-Bildgebungsprozedur detektierbar sein; und der Linker muss den Vektor an den Reporter koppeln, mindestens bis die Bildgebungsprozedur abgeschlossen worden ist.
Vektoren
Als den Vektor kann man eine beliebige Verbindung mit einer Affinität für A II-Rezeptoren verwenden. Dies kann ein Peptid sein, wie A II selbst, oder ein Analogon, wie Saralasin (Sar-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-β-Ala) oder ein Nicht-Peptid, wie Iosartan oder PD-123177, obwohl Nicht-Peptide bevorzugt sind. Auf ähnliche Weise kann ein Vektor eine Verbindung sein (wie losartan), die eine ausgeprägtere Affinität für einen Typ von A II-Rezeptor als für andere Typen besitzt, oder eine Verbindung (wie A II selbst), die eine allgemeine Affinität für alle A II-Rezeptoren besitzt. Verbindungen mit einer ausgeprägteren Affinität für bestimmte Typen von A II-Rezeptoren (wie AT1 oder AT2) werden im allgemeinen bevorzugt werden.
Bevorzugt ist das Mittel eine Verbindung, die keinerlei inakzeptable biologische Reaktion auslöst, insbesondere Verbindungen, die als A II-Rezeptorantagonisten wirken, und nicht die Reaktionen, die mit A II selbst assoziiert sind, auslösen, insbesondere die Blutdruck-modifizierenden Reaktionen. Jedoch können, falls erwünscht, die biologischen Reaktionen durch Verabreichung eines therapeutischen Mittels modifiziert werden, z.B. vor, zur selben Zeit oder nach der Verabreichung des Mittels der Formel I.
Unter peptidischen Vektoren können Oligopeptide mit dem Motiv Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro oder ein analoges Motiv, in dem einer der fünf Aminosäurereste, entweder individuell oder gemeinsam mit strukturellen oder funktionellen Isosteren derart variiert werden, dass das strukturelle oder funktionelle Motiv konserviert wird, um so eine effektive Wechselwirkung mit Angiotensin II-Rezeptorstellen zu erlauben. Als Beispiel werden die Motive Arg-Val-Tyr*-XX-His-Pro (wo Tyr* ein gegebenenfalls modifiziertes Tyr, z.B. Me-Tyr und XX eine Aminosäure ist, z.B. Ile oder Val) bevorzugt, z.B. A II und insbesondere Saralesin und Sarmesin. Jedoch, wo A II oder derartige nahe Angiotensinanaloga als der Vektor verwendet werden, kann es erwünscht sein, Linker-Reporter-Kombinationen zu nutzen, die andere sind als metallierte Chelatbildner (z.B. einschließlich eines Radionuklids oder eines paramagnetischen Metallions), die direkt an die peptidische Struktur gebunden sind; so kann es erwünscht sein, einen nicht-metallischen Radionuklidreporter zu verwenden oder einen teilchenförmigen Reporter zu verwenden.
Andere geeignete Oligopeptidvektoren können leicht bestimmt werden unter Verwenden eines Phagen-Displays, kombinatorischer Chemie (sowohl peptidischer als auch nicht-peptidischer kombinatorischer Chemie), HTS (high throughput synthesis) und CAM.D-Techniken.
Unter nicht-peptidischen Vektoren sind losartan und PD 123177 bevorzugt. Andere geeignete nicht-peptidische Vektoren umfassen heterocyclische Verbindungen (wie Imidazole, kondensierte Imidazole, Xanthine und Pyridone). Beispiele geeigneter nicht-peptidischer Vektoren sind angegeben in WO-91/17148, US-A-4355040, WO-91/18888, WO-91/19715, WO-91/15209, EP-A-420237, EP-A-459136 und US-A-5338744. Die Entwicklung geeigneter nicht-peptidischer A II-Rezeptorantagonisten wird diskutiert z.B. von Timmermans et al., in TiPS 12: 55–62 (1991) und Pharm. Rev. 45: 20–251 (1993) und von van Meel et al. in Arzneim-Forsch./Drug Res. 43: 242–246 (1993).
Geeignete nicht-peptidische Vektoren werden im allgemeinen einen 5- oder 6-gliedrigen ungesättigten heterocyclischen N₁-, N₂- oder N₃-Ring enthalten, der gegebenenfalls einen kondensierten 5- oder 6-gliedrigen ungesättigten, gegebenenfalls heterocyclischen Ring trägt und gegebenenfalls anhängende Gruppen trägt, die eine oder mehrere (z.B. 1, 2 oder 3) 5- oder 6-gliedrige homo- oder heterocyclische Arylgruppen umfassen, z.B. Aryl-Methyl-Biphenyltetrazole. Beispiele umfassen DuP 753, L-158809, SR-47436, GR 117289, SKF 108566, BIBS 39, BIBS 222, ExP 3892 und CG 48933.
Daher kann die Vektorverbindung z.B. eine Verbindung der Formel II sein
wobei R₁ und R₂ für Carboxy-Gruppen oder C_1-6-Alkyl-Gruppen stehen, die gegebenenfalls mit Oxa-, Oxo-, Phenyl-, Amino-, Carboxyl- oder Hydroxy-Gruppen substituiert sind, oder R₁ zusätzlich eine Oxo-Gruppe repräsentieren kann, und
R₃ und R₄ für Methyl-biphenyl-carboxyl- oder Methyl-biphenyl-tetrazol-Gruppen oder C_1-6-Alkyl-Gruppen stehen, die gegebenenfalls mit Oxa-, Oxo-, Phenyl-, Amino-, Carboxyl- oder Hydroxy-Gruppen substituiert sind, wobei R₄ nur vorhanden ist, wenn R₁ für Oxo steht, wobei bevorzugt eine der Gruppen R₃ und R₄ eine Biphenyl-enthaltende Gruppe repräsentiert und eine der Gruppen R₁, R₂, R₃ und R₄ eine Alkyl-Gruppe repräsentiert, die mit Oxa-, Oxo-, Phenyl-, Amino-, Carboxyl- oder Hydroxy-Gruppen substituiert ist.
In derartigen Verbindungen können die Amino-, Hydroxy-, Carbonyl- oder Carboxy-Funktionen leicht verwendet werden, um den Vektor an den Reporter zu konjugieren.
So umfassen Beispiele derartige Triazolvektoren
wobei R₃₀ steht für
R₃₁ steht für COOH, Tetrazol-5-yl, NH₂SO₂CF₃, SO₂NHCO-Phenyl, SO₂NHCO-Cyclopropyl und R₁₀ und R₂₀ stehen für

wobei R₄₀ steht für
R₃₁ wie oben definiert ist und R₂₀ und R₃₉ stehen für
Auf ähnliche Weise kann der Vektor eine Verbindung der Formel III sein
wobei die Doppelbindung, die mit einem Sternchen markiert ist, gegebenenfalls durch eine Einfachbindung ersetzt ist; R₁₀₀ für ein Wasserstoffatom, eine Phenyl-Gruppe, die gegebenenfalls mit mindestens einer Hydroxy- oder Amino-Gruppe substituiert ist, oder eine C_1-6-Alkyl-Gruppe, die gegebenenfalls mit einer Hydroxy-Gruppe substituiert ist oder gegebenenfalls über einen Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff gebunden ist, steht; R₄₀₀ für eine Arylmethyl-Gruppe steht, z.B. eine Methylbiphenyl (gegebenenfalls substituiert auf einem Phenylring durch eine Säurefunk tion, z.B. ein Carboxyl oder ein Ester davon, z.B. eine (C_1-6-Alkoxy)-carbonylgruppe) oder Methylbiphenyltetrazol-Gruppe, die über die Methylgruppe gebunden ist, oder eine gegebenenfalls C_1-6-Alkyl-, Amino- und/oder Hydroxy-substituierte Benzylgruppe; R₃₀₀ für eine Carboxymethyl-Gruppe oder eine gegebenenfalls Hydroxysubstituierte C_1-6-Alkyl-Gruppe steht, z.B. eine Hydroxy-Methylgruppe, und R₂₀₀ für Chlor steht oder R₃₀₀ und R₂₀₀ zusammen mit den zwischengeschalteten Kohlenstoffen einen kondensierten 6-gliedrigen carbocyclischen oder heterocyclischen aromatischen Ring (enthaltend 0, 1 oder 2 Ring-Stickstoffe) bilden, der gegebenenfalls an einem Ring-Kohlenstoff mit einer Hydroxy-, Carboxyl-, C_1-6-Alkyl- oder Acyloxy-Gruppe (wobei die Acyl-Gruppe eine C_1-6-Alkyl-, Phenyl- oder Benzyl-Gruppe umfasst) oder an einem Ring-Stickstoff mit einer Acyl-Gruppe substituiert ist (z.B. eine C_1-6-Alkylcarbonyl-Gruppe, die gegebenenfalls mit Phenyl-Gruppen substituiert ist). Bevorzugt enthält mindestens eine von R₁₀₀, R₂₀₀, R₃₀₀, und R₄₀₀ eine Hydroxy-, Amino-, Thiol-, Mercapto-, Aldehyd-, Keton-, oder Carbonsäure-Gruppe, oder eine Vielfachbindung (z.B. eine C=C-Bindung) oder eine beliebige andere funktionelle Gruppe, die zum Binden des Vektors an die Reportereinheit verwendet werden kann.
So kann beispielsweise die Verbindung der Formel III von der Formel
sein, wobei R₃₀₉ für Hydroxymethyl oder Carboxy steht, oder von der Formel
sein, wobei R₁₀₁-Phenyl- für 3,4-Dihydroxyphenyl, 4-Aminophenyl oder 2-Hydroxyphenyl steht, oder von der Formel
sein, wobei R₃₀ wie oben definiert ist, z.B. Methyl-Biphenyl-Tetrazol oder Methylbiphenylcarboxyl, und R₂₀₂ und R₃₀₂ sind wie folgt
Alternativ kann der Vektor der Formel III z.B. von der Formel
sein, wobei R₃₀ wie oben definiert ist, oder von der Formel
sein, wobei R₃₀ wie oben definiert ist und R₁₀₂ für C_1-3-Alkyl, gebunden über O, S oder NH, steht, oder von der Formel
sein, wobei R₇₇ für Hydroxy oder Amino steht und die gestrichelte Bindung eine Doppel- oder eine Einfachbindung ist, bevorzugt eine Doppelbindung, wo R₇₇ für Amino steht, und eine Einfachbindung, wo R₇₇ für Hydroxy steht.
Außerdem kann der Vektor eine Verbindung der Formel IV sein
wobei R₅₀₁ für eine gegebenenfalls fluorierte C_1-6-Alkyl-Gruppe steht, R₅₀₄ für eine gegebenenfalls fluorierte C_1-6-Alkyl-Gruppe steht, R₅₀₂ für eine Carboxy-, Hydroxy-, C_1-6-Alkyl- oder CHO-Gruppe steht; oder die Doppelbindung, die mit einem Sternchen markiert ist, durch eine Einfachbindung ersetzt ist und R₅₀₄ für eine =O oder =NR₅₀₅-Gruppe steht (wobei R₅₀₅ für C_1-6-Alkyl steht), R₅₀₂ eine gegebenenfalls fluorierte C_1-6-Alkylgruppe steht und R₅₀₃ für eine Carboxyphenyl-Gruppe steht; und R₃₀ wie oben definiert ist (z.B. wenn R₃₁ für Tetrazol-5-yl, NH₂SO₂CF₃, SO₂NHCO-Cyclopropyl oder SO₂NHCO-Phenyl).
So kann z.B. der Vektor der Formel IV von der Formel sein
wobei R₂₇ für Methyl oder C₂F₅ steht,
R₂₆ für COOH, CHO oder CH₂OH steht,
R₂₅ für Butyl oder Propyl steht,
R₂₈ für =O oder =NCH₃ steht, und
R₂₁ für Tetrazol-5-yl, NH₂SO₂CF₃, SO₂NHCO-Cyclopropyl oder SO₂NHCO-Phenyl steht.
Andere Verbindungen, die zur Verwendung als Vektoren geeignet sind, umfassen Verbindungen wie jene, die beschrieben sind in WO 92/18529, US-A-5156977, EP-A-435827, EP-A-424317, EP-A-420237, EP-A-426021, WO 92/09556, WO 91/19715, WO 91/18888, WO 91/17148, EP-A-446062, WO 92/09563, WO 91/15479, WO 91/15209, EP-A-459136, EP-A-445811, EP-A-442473, EP-A-430300, US-A-4355040, US-A-4340598 und US-A-5338744.
Die Vektoren der Formeln II bis IV können durch die Techniken hergestellt werden, die in den Patentveröffentlichungen beschrieben sind, auf die hier Bezug genommen wird.
CAM-D und andere mögliche Identifikations- und Bewertungstechniken wie oben erwähnt, können auch verwendet werden, um mögliche nicht-peptidische Vektoren weiter zu bewerten.
So ist es auch möglich, Moleküle zu erhalten, die spezifisch an Angiotensin II-Rezeptoren binden, durch direktes Screenen molekularer Bibliotheken. Zum Beispiel könnten Phagen-Bibliotheken, die kleine Peptide zeigen, für eine derartige Auswahl verwendet werden. Die Auswahl kann durch einfaches Mischen der Rezeptoren und der Phagen-Display-Bibliothek und Eluieren der Phagen, die an die Rezeptoren binden, ausgeführt werden. Falls erwünscht, kann die Auswahl ausgeführt werden unter „physiologischen Bedingungen" (z.B. im Blut), um Peptide zu eliminieren, die mit Blut-Komponenten kreuzreagieren. Bindende Einheiten, die auf diese Weise identifiziert werden, können (durch chemische Konjugation oder über Peptidsynthese, oder auf dem DNA-Level für rekombinante Vektoren) an ein Linkermolekül gekoppelt wer den, was ein allgemeines Werkzeug zum Binden irgendwelcher Vektormoleküle an den Reporter bildet.
Vektormoleküle können auch aus kombinatorischen Bibliotheken erzeugt werden, ohne notwendigerweise das genaue molekulare Ziel zu kennen, durch funktionelles Auswählen (in vitro, ex vivo oder in vivo) von Molekülen, die an die abzubildende Region/Struktur binden.
Die Vektoreinheit in den Mitteln der Formel I wird bevorzugt eine Bildungskonstante für R-L-V besitzen: Angiotensin II-Rezeptorstellen-Konjugation von mindestens 100.
Wie oben erwähnt umfassen die Mittel der Formel I Vektor-, Linker-, und Reporter-Einheiten. Eine Linker-Einheit kann dazu dienen, einen Vektor an einen Reporter zu binden; alternativ kann sie mehr als einen Vektor und/oder mehr als einen Reporter miteinander verbinden. Auf die gleiche Weise kann ein Reporter oder ein Vektor an mehr als einen Linker gebunden sein. Eine Verwendung einer Mehrzahl von Repor tern auf diese Weise (z.B. mehrere Linker-Reporter-Einheiten, gebunden an einen Vektor oder mehrere Reporter, die an einen Reporter gebunden sind, der selbst an einen Vektor gebunden ist), kann ermöglichen, dass die Detektierbarkeit des Kontrastmittels erhöht wird (z.B. durch Erhöhen seiner Strahlenundurchlässigkeit, Echogenität oder Relaxivität), oder kann ihm ermöglichen, in mehr als einer Bildgebungsmodalität detektiert zu werden. Eine Verwendung einer Mehrzahl von Vektoren auf diese Weise kann die Targeting-Effizienz des Kontrastmittels vergrößern oder kann das Kontrastmittel befähigen, auf mehr als eine Stelle zu zielen, z.B. verschiedene Reporter für ein Mittel, das eine Rezeptor-Heterogenität besitzt. So kann z.B. das Mittel der Formel I Vektor-Einheiten enthalten, mit Affinitätsstellen, die andere sind als Angiotensin-Rezeptoren, z.B. mit Affinitäten für Zelloberflächen auf Körperductus-Wandoberflächen. Demgemäß kann das Mittel Vektoren enthalten, wie Antikörperfragmente und Oligopeptide, z.B. enthaltend RGD- oder analoge Zelloberflächen-Bindungspeptid-Motive (z.B. wie beschrieben in EP-A-422937 und EP-A-422938 (Merck)) oder andere Vektoren, wie beschrieben in GB 9700699.3 . Derartige zusätzliche Vektoren können auch ausgewählt sein aus einem beliebigen der Moleküle, die natürlicherweise in einem ausgewählten Zielorgan, -gewebe, -zelle oder -zellgruppen oder einem anderen Ort in einem Säugerkörper in vivo konzentriert werden. Diese können umfassen Aminosäuren, Oligopeptide (z.B. Hexapeptide), molekulare Erkennungseinheiten (MRU's), Einzelkettenantikörper (SCA's), Proteine, nicht-peptidische organische Moleküle, Fab-Fragmente und Antikörper. Beispiele von zielgerichteten Molekülen umfassen Polysaccharide (z.B. CCK und Hexapeptide), Proteine (wie Lektine, Asialofetuin, polyklonales IgG, Blutgerinnungsproteine (z.B. Hirudin), Lipoproteine und Glykoproteine), Hormone, Wachstumsfaktoren, Gerinnungsfaktoren (wie PF4), polymerisierte Fibrinfragmente (z.B. E₁), Serum-Amyloid-Precursor (SAP)-Proteine, Low Density Lipoprotein (LDL)-Precursor, Serumalbumin, Oberflächenproteine intakter roter Blutkörperchen, Rezeptor-bindende Moleküle, wie Östrogene, Leberspezifische Proteine/Polymere, wie Galactosyl-Neoglycoalbumin (NGA) (siehe Vera et al. in Radiology 151:191 (1984)) N-(2-Hydroxy-propyl)methacrylamid (HMPA)-Copolymere mit variierenden Anzahlen von gebundenen Galactosaminen (siehe Duncan et al., Biochim. Biophys. Acta 880:62 (1986)), und Allyl- und 6- Aminohexylglycoside (siehe Wong et al., Carbo. Res. 170:27 (1987)) und Fibrinogen. Das zielgerichtete Protein kann auch ein Antikörper sein. Die Wahl des Antikörpers, insbesondere die Antigen-Spezifität des Antikörpers, wird von der besonderen, beabsichtigten Zielstelle für das Mittel abhängen. Monoklonale Antikörper sind gegenüber polyklonalen Antikörpern bevorzugt. Eine Herstellung von Antikörpern, die mit einem erwünschten Antigen reagieren, ist gut bekannt. Antikörperpräparate sind kommerziell erhältlich von einer Vielfalt von Quellen. Das Fibrin-Fragment E₁ kann hergestellt werden, wie beschrieben von Olexa et al. in J. Biol. Chem. 254:4925 (1979). Die Herstellung von LDL-Precursorn und SAP-Proteinen wird von de Beer et al. in J. Immunol. Methods 50:17 (1982) beschrieben.
Es ist speziell bevorzugt, dass derartige Extravektoren derart binden sollten, dass die Bewegung des Mittels im Blutstrom verlangsamt, aber nicht verhindert wird und es an seiner Stelle verankern, wenn es an eine A II-Rezeptorstelle gebunden wird.
Linker
Die Linkerkomponente des Kontrastmittels ist am einfachsten eine Bindung zwischen den Vektor- und Reportereinheiten. Allgemeiner wird der Linker jedoch ein mono- oder multimolekulares Skelett bereitstellen, das kovalent oder nicht-kovalent einen oder mehrere Vektoren an einen oder mehrere Rezeptoren bindet, z.B. ein lineares, cyclisches, verzweigtes oder retikuläres molekulares Skelett oder ein Molekülaggregat, mit eingebauten oder anhängenden Gruppen, die kovalent oder nicht-kovalent, z.B. coordinativ, mit den Vektor- und Reporter-Einheiten verbunden sind, oder die derartige Einheiten einkapseln, einfangen oder verankern.
So kann das Binden einer Reporter-Einheit an einen erwünschten Vektor durch kovalente oder nicht-kovalente Mittel erreicht werden, üblicherweise beinhaltend eine Wechselwirkung mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen, die auf dem Reporter und/oder Vektor positioniert sind. Beispiele chemisch reaktiver funktioneller Gruppen, die für diesen Zweck eingesetzt werden können, umfassen Amino-, Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Carboxyl- und Carbonyl-Gruppen, wie auch Kohlenwasserstoffgruppen, vicinale Diole, Thioether, 2-Aminoalkohole, 2-Aminothiole, Guanidinyl-, Imidazolyl- und Phenol-Gruppen.
Kovalentes Koppeln von Reporter und Vektor kann deshalb unter Verwenden verbindender Mittel bewirkt werden, die reaktive Einheiten enthalten, die zur Reaktion mit derartigen funktionellen Gruppen fähig sind. Beispiele reaktiver Einheiten, die zur Reaktion mit Sulfhydryl-Gruppen fähig sind, umfassen α-Haloacetyl-Verbindungen des Typs X-CH₂CO- (wobei X = Br, Cl oder I), die eine besondere Reaktivität für Sulfhydryl-Gruppen zeigen, die aber auch verwendet werden können, um Imidazolyl-, Thioether-, Phenol- und Amino-Gruppen zu modifizieren, wie beschrieben von Gurd, F. R. N. in Methods Enzymol. (1967) 11, 532. N-Maleimid-Derivate werden auch als selektiv gegenüber Sulfhydryl-Gruppen betrachtet, können aber zusätzlich beim Koppeln an Aminogruppen unter bestimmten Bedingungen nützlich sein. Reagenzien, wie 2-Iminothiolan, z.B. wie beschrieben von Traut, R. et al. in Biochemistry (1973) 12, 3266, die eine Thiol-Gruppe durch Umwandlung einer Amino-Gruppe einführen, können als Sulfhydryl-Reagenzien betrachtet werden, falls das Binden durch die Bildung von Disulfidbrücken erfolgt. So können Reagenzien, die reaktive Disulfidbindungen in entweder den Reporter oder den Vektor einführen, nützlich sein, da das Binden herbeigeführt werden kann durch Disulfid-Austausch zwischen dem Vektor und dem Reporter; Beispiele derartiger Reagenzien umfassen Ellmans-Reagenz (DTNB), 4,4'-Dithiopyridin, Methyl-3-nitro-2-pyridyldisulfid und Methyl-2-pyridyldisulfid (beschrieben von Kimura, T. et al. in Analyt. Biochem. (1982) 122, 271).
Beispiele reaktiver Einheiten, die zur Reaktion mit Amino-Gruppen fähig sind, umfassen alkylierende und acylierende Mittel. Repräsentative alkylierende Mittel umfassen:

i) α-Haloacetyl-Verbindungen, die eine Spezifität gegenüber Amino-Gruppen bei nicht Vorhandensein reaktiver Thiol-Gruppen zeigen und vom Typ X-CH₂CO- sind (wobei X = Cl, Br oder I), z.B. wie beschrieben von Wong, Y-H. H. in Biochemistry (1979) 24, 5337;
ii) N-Maleimid-Derivate, die mit Amino-Gruppen reagieren können, entweder über eine Reaktion des Michael-Typs oder durch Acylierung durch Addition an die Ring-Carbonyl-Gruppe, wie beschrieben von Smyth, D. G. et al. in J. Am. Chem. Soc. (1960) 82, 4600 und Biochem. J. (1964) 91, 589;
iii) Arylhalogenide, wie reaktive nitrohalo-aromatische Verbindungen;
iv) Alkylhalogenide, wie beschrieben von McKenzie, J. A. et al. in J. Protein Chem. (1988) 7, 581;
v) Aldehyde und Ketone, die zur Schiff-Basen-Bildung mit Amino-Gruppen fähig sind, wobei die gebildeten Addukte üblicherweise durch Reduktion stabilisiert werden, um ein stabiles Amin zu ergeben;
vi) Epoxid-Derivate, wie Epichlorhydrin und Bisoxirane, die mit Amino-, Sulfhydryl- oder phenolischen Hydroxyl-Gruppen reagieren können;
vii) Chlor-enthaltende Derivate von s-Triazinen, der sehr reaktiv gegenüber Nukleophilen, wie Amino-, Sulfhydryl- und Hydroxy-Gruppen sind;
viii) Aziridine, die auf s-Triazin-Verbindungen basieren, die oben im Detail angegeben sind, z.B. wie beschrieben von Ross, W. C. J. in Adv. Cancer Res. (1954) 2, 1, die mit Nukleophilen, wie Amino-Gruppen durch Ringöffnung reagieren.
ix) Quadratsäure-Diethylester, wie beschrieben von Tietze, L. F. in Chem. Ber. (1991) 124, 1215; und
x) α-Haloalkylether, die reaktivere Alkylierungsmittel sind als normale Alkylhalogenide, wegen der Aktivierung, die vom Ether-Sauerstoff-Atom verursacht wird, z.B. wie beschrieben von Benneche, T. et al. in Eur. J. Med. Chem. (1993) 28, 463.

Repräsentative Amino-reaktive acylierende Mittel umfassen:

i) Isocyanate und Isothiocyanate, insbesondere aromatische Derivate, die stabile Harnstoff- bzw. Thioharnstoff-Derivate bilden und verwendet worden sind für das Vernetzen von Protein, wie beschrieben von Schick, A. F. in J. Biol. Chem. (1961) 236, 2477;
ii) Sulfonylchloride, die von Herzig, D. J. et al. in Biopolymers (1964) 2, 349 beschrieben worden sind, und die nützlich sein können für das Einführen einer fluoreszierenden Reporter-Gruppe in den Linker;
iii) Säurehalogenide
iv) Aktive Ester, wie Nitrophenylester oder N-Hyroxysuccinimidylester;
v) Säureanhydride, wie gemischte, symmetrische oder N-Carboxyanhydride;
vi) andere nützliche Reagenzien für eine Amidbindungs-Bildung, wie beschrieben von Bodansky M. et al. in „Principles of Peptide Synthesis" (1984) Springer-Verlag;
vii) Acylazide, z.B. wobei die Azid-Gruppe aus einem vorgeformten Hydrazid-Derivat unter Verwenden von Natriumnitrit erzeugt wird, z.B. wie beschrieben von Wetz, K. et al., ein Anal. Biochem. (1974) 58, 347;
viii) Azlactone, die an Polymere gebunden sind, wie Bisacrylamid, z.B. wie beschrieben von Rasmussen, J. K. in Reactive Polymers (1991) 16, 199; und
ix) Imidoester, die stabile Amidine bei Reaktion mit Amino-Gruppen bilden, z.B. wie beschrieben von Hunter, M. J. und Ludwig, M. L. in J. Am. Chem. Soc. (1962) 84, 3491.

Carbonyl-Gruppen, wie Aldehydfunktionen, können mit schwachen Proteinbasen bei einem pH derart umgesetzt werden, dass nukleophile Protein-Seitenketten-Funktionen protoniert werden. Schwache Basen umfassen 1,2-Aminothiole, wie jene, die in N-terminalen Cysteinresten gefunden werden, die selektiv stabile 5-gliedrige Thiazolidin-Ringe mit Aldehyd-Gruppen bilden, z.B. wie beschrieben von Ratner, S. et al. in J. Chem. Soc. (1937) 59, 200. Andere schwache Basen, wie Phenylhydrazone, können verwendet werden, z.B. wie beschrieben von Heitzmann, H. et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1974) 71, 3537.
Aldehyde und Ketone können auch mit Aminen umgesetzt werden, um Schiff-Basen zu bilden, die vorteilhafterweise durch reduktive Aminierung stabilisiert werden können.
Alkoxylamino-Einheiten reagieren einfach mit Ketonen und Aldehyden, um stabile Alkoxamine zu erzeugen, z.B. wie beschrieben von Webb et al. in Bioconjugate Chem. (1990) 1, 96.
Beispiele reaktiver Einheiten, die zur Reaktion mit Carboxyl-Gruppen fähig sind, umfassen Diazo-Verbindungen, wie Diazoacetatester und Diazoacetamide, die mit hoher Spezifität zum Erzeugen von Ester-Grupper reagieren, z.B. wie beschrieben von Herriot, R. M. in Adv. Protein Chem. (1947) 3, 169. Carbonsäure-modifizierende Reagentien, wie Carbodiimide, die durch O-Acylharnstoff-Bildung, gefolgt von Amidbindungs-Bildung reagieren können auch nützlich eingesetzt werden; das Binden kann vereinfacht werden durch die Zugabe eines Amins oder kann zu einem direkten Vektor-Rezeptor-Koppeln führen. Nützliche wasserlösliche Carbodiimide umfassen 1-Cyclohexy-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimid (CMC) und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC), z.B. wie beschrieben von Zot, H. G. und Puett, D. in J. Biol. Chem. (1989) 264, 15552. Andere nützliche Carbonsäuremodifizierende Reagenzien umfassen Isoxazolium-Derivate, wie Woodwards-Reagenz K; Chloroformiate, wie p-Nitrophenylchloroformiat; Carbonyldiimidazole, wie 1,1'-Carbonyldiimidazol; und N-Carbalkoxydihydrochinoline, wie N-(Ethoxycarbonyl)-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin.
Andere möglicherweise nützliche reaktive Einheiten umfassen vicinale Dione, wie p-Phenylendiglyoxal, die verwendet werden können, um mit Guanidyl-Gruppen zu reagieren, z.B. wie beschrieben von Wagner et al. in Nucleic acid Res. (1978) 5, 4065; und Diazoniumsalze, die elektrophile Substitutionsreaktionen durchlaufen können, z.B. wie beschrieben von Ishizaka, K. und Ishizaka T. in J. Immunol. (1960) 58, 163. Bis-Diazonium-Verbindungen werden einfach durch Behandlung von Aryldiaminen mit Natriumnitrit in sauren Lösungen hergestellt. Es wird anerkannt werden, dass funktionelle Gruppen im Reporter und/oder Vektor, falls erwünscht, zu anderen funktionellen Gruppen vor der Reaktion umgewandelt werden können, z.B. um eine zusätzliche Reaktivität oder Selektivität zu verleihen. Beispiele von Verfahren, die für diesen Zweck nützlich sind umfassen die Umwandlung von Aminen zu Carbonsäuren unter Verwenden von Reagenzien wie Dicarbonsäureanhydride; Umwandlung von Aminen zu Thiolen unter Verwenden von Reagenzien, wie N-Acetylhomocysteinthiolacton, S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid, 2-Iminothiolan- oder Thiol-enthaltende Succinimidyl-Derivate; Umwandlung von Thiolen zu Carbonsäuren unter Verwenden von Reagenzien wie α-Haloacetate; Umwandlung von Thiolen zu Aminen unter Verwenden von Reagenzien wie Ethylenimin oder 2-Bromethylamin; Umwandlung von Carbonsäuren zu Aminen unter Verwenden von Reagenzien wie Carbodiimide, gefolgt von Diaminen; und Umwandlung von Alkoholen zu Thiolen unter Verwenden von Reagenzien, wie Tosylchlorid, gefolgt von einer Umesterung mit Thioacetat und Hydrolyse zum Thiol mit Natriumacetat.
Vektor-Reporter-Koppeln kann auch bewirkt werden unter Verwenden von Enzymen, wie Null-Längen-Vernetzungsmittel; so wurden z.B. Transglutaminase, Peroxidase und Xanthinoxidase verwendet, um vernetzte Produkte zu erzeugen. Reverse Proteolyse kann auch zum Vernetzen durch Amidbindungs-Bildung verwendet werden.
Nicht-kovalentes Vektor-Reporter-Koppeln kann z.B. durch elektrostatische Ladungswechselwirkungen bewirkt werden, z.B. zwischen einem Polylysinylfunktionalisierten Reporter und einem Polyglutamyl-funktionalisierten Vektor, durch Chelatierung in der Form stabiler Metallkomplexe oder durch Hochaffinitäts-Bindungswechselwirkung, wie Avidin/Biotin-Bindung.
Ein Vektor, der einen Peptid-, Lipo-Oligosaccharid- oder Lipopeptid-Linker umfasst oder daran gekoppelt ist, der ein Element enthält, das zum Vermitteln eines Membraneinsetzens fähig ist, kann auch nützlich sein. Ein Beispiel ist beschrieben von Leenhouts, J. M. et al. in Febs Letters (1995) 370(3), 189–192.
Koppeln kann auch bewirkt werden unter Verwenden von Avidin oder Streptavidin, die vier Hochaffinitätsbindungsstellen für Biotin besitzen. Avidin kann deshalb verwendet werden, um Vektor an Reporter zu konjugieren, falls sowohl der Vektor als auch der Reporter biotinyliert sind. Beispiele sind beschrieben von Bayer E. A. und Wilchek, M. in Methods Biochem. Anal. (1980) 26, 1. Dieses Verfahren kann auch ausgebaut werden, um das Binden von Reporter an Reporter einzuschließen, ein Prozess, der die Assoziation des Mittels und die nachfolgend mögliche erhöhte Wirksamkeit fördert. Alternativ kann Avidin oder Streptavidin direkt an die Oblerfläche von Reporterteilchen gebunden werden.
Nicht-kovalentes Koppeln kann auch die bifunktionelle Natur bispezifischer Immunoglobuline nutzen. Diese Moleküle können spezifisch zwei Antigene binden, und sie so verbinden. Zum Beispiel können entweder bispezifisches IgG oder chemisch konstruierte bispezifische F(ab)'₂-Fragmente als Bindungsmittel verwendet werden. Es wurde auch von heterobifunktionellen bispezifischen Antikörpern zum Binden zweier verschiedener Antigene berichtet, z.B. wie beschrieben von Bode C. et al. in J. Biol. Chem. (1989) 264, 944 und von Staerz, U. D. et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83, 1453. Auf ähnliche Weise kann ein beliebiger Reporter und/oder Vektor, der zwei oder mehr Antigendeterminanten enthält (z.B. wie beschrieben von Chen, A.a et al. in Am. J. Pathol. (1988) 130, 216) durch Antikörpermoleküle vernetzt werden und zur Bildung von vernetzten Anordnungen von Mitteln der Formel I einer möglicherweise erhöhten Wirksamkeit führen.
Sogenannte Null-Längen-Bindungsmittel, die ein direktes kovalentes Verbinden zweier reaktiver chemischer Gruppen induzieren, ohne zusätzliches verbindendes Material einzuführen (z.B. wie in der Amidbindungs-Bildung, die unter Verwenden von Carbodiimiden oder enzymatisch induziert wird), kann, falls erwünscht, gemäß der Erfindung verwendet werden, wie auch Mittel, wie Biotin/Avidin-Systeme, die nicht-kovalentes Reporter-Vektor-Binden induzieren, und Mittel, die elektrostatische Wechselwirkungen induzieren.
Am häufigsten wird jedoch das verbindende Mittel zwei oder mehr reaktive Einheiten umfassen, z.B. wie oben beschrieben, verbunden durch ein Spacer-Element. Das Vorhandensein eines derartigen Spacers erlaubt bifunktionellen Linkern, mit spezifischen funktionellen Gruppen innerhalb eines Moleküls oder zwischen zwei verschie denen Molekülen zu reagieren, was zu einer Bindung zwischen diesen zwei Komponenten und Einführen von extrinsischem, vom Linker abgeleiteten Material in das Reporter-Vektor-Konjugat führt.
Die reaktiven Einheiten in einem verbindenden Mittel können dieselben (homobifunktionelle Mittel) oder verschieden (heterobifunktionelle Mittel oder, wo mehrere unähnliche reaktive Einheiten vorhanden sind, heteromultifunktionelle Mittel) sein, die eine Vielfalt möglicher Reagenzien bereitstellen, die eine kovalente Bindung zwischen beliebigen chemischen Spezies herbeiführen kann, entweder intramolekular oder intermolekular.
Die Natur extrinsischen Materials, das durch das verbindende Mittel eingeführt wird, kann einen kritischen Einfluss auf die Targeting-Fähigkeit und allgemeine Stabilität des Endproduktes besitzen. So kann es erwünscht sein, labile Bindungen einzuführen, z.B. Spacer-Arme enthaltend, die bioabbaubar oder chemisch sensitiv sind oder die enzymatische Spaltungsstellen einbauen. Alternativ kann der Spacer polymere Komponenten enthalten, z.B. um als oberflächenaktive Mittel zu wirken und die Stabilität des Mittels zu verstärken. Der Spacer kann auch reaktive Einheiten enthalten, z.B. wie oben beschrieben, um Oberflächen-Vernetzung zu verstärken.
Spacerelemente können typischerweise aus aliphatischen Ketten bestehen, die effektiv die reaktiven Einheiten des Linkers durch Entfernungen zwischen 5 und 30 Å trennen. Sie können auch makromolekulare Strukturen, wie Poly(ethylenglykole) umfassen. Derartige polymere Strukturen, die im folgenden als PEGs bezeichnet werden, sind einfache, neutrale Polyether, denen viel Aufmerksamkeit in biotechnischen und biomedizinschen Anwendungen gegeben wurde (siehe z.B. Milton Harris, J. (Hsg) „Poly(ethylene glycol) chemistry, biotechnical and biomedical applications" Plenum Press, New York, 1992). PEGs sind löslich in den meisten Lösungsmitteln, einschließlich Wasser, und werden in wässrigen Umgebungen stark hydratisiert, wobei zwei oder drei Wassermoleküle an jedes Ethylenglykol-Segment gebunden wird; dies besitzt den Effekt des Verhinderns einer Adsorption entweder anderer Polymere oder von Proteinen auf PEG-modifizierten Oberflächen. PEGs sind dafür bekannt, dass sie nicht toxisch sind und aktive Proteine oder Zellen nicht schädigen, während kovalent gebundene PEGs dafür bekannt sind, nicht-immunogen und nicht-antigen zu sein. Außerdem können PEGs auf einfache Weise modifiziert und an andere Moleküle gebunden werden, mit nur wenig Effekt auf ihre Chemie. Ihre vorteilhafte Löslichkeit und biologischen Eigenschaften sind offenbar von den vielen möglichen Verwendungen der PEGs und der Copolymere davon, einschließlich Blockcopolymere, wie PEG-Polyurethane und PEG-Polypropylene.
Geeignete Molekulargewichte für PEG-Spacer, die gemäß der Erfindung verwendet werden, können z.B. zwischen 120 Dalton und 20 kDalton liegen.
Der Hauptmechanismus für die Aufnahme von Teilchen durch die Zellen des retikuloendothelialen Systems (RES) ist Opsonisierung durch Plasmaproteine im Blut; diese markieren Fremdteilchen, die dann vom RES aufgenommen werden. Die biologischen Eigenschaften von PEG-Spacerelementen, die gemäß der Erfindung verwendet werden, können dazu dienen, die Zirkulationszeit des Mittels in einer ähnlichen Weise zu jener, die für PEGylierte Liposomen beobachtet werden, zu vergrößern (siehe z.B. Klibanov, A. L. et al. in FEBS Letters (1990) 268, 235–237 und Blume, G. und Cevc, G. in Biochim. Biophys. Acta (1990) 1029, 91–97). Vergrößerte Kopplungswirksamkeit an Flächen von Interesse können auch erreicht werden unter Verwenden von Antikörpern, die an die Termini von PEG-Spacern gebunden sind (siehe z.B. Maruyama, K. et al. in Biochim. Biophys. Acta (1995) 1234, 74–80 und Hansen, C. B. et al. in Biochim. Biophys. Acta (1995) 1239, 133–144).
Andere repräsentative Spacer-Elemente umfassen Polysaccharide des strukturellen Typs, wie Polygalakturonsäure, Glycosaminoglykane, Heparinoide, Zellulose und marine Polysaccharide, wie Alginate, Chitosane und Carrageenans; Polysaccharide des Speicher-Typs, wie Stärke, Glykogen, Dextran und Aminodextrane; Polyaminosäuren und Methyl- und Ethylester davon, wie in Homo- und Copolymeren von Lysin, Glutaminsäuren und Asparaginsäure; und Polypeptide, Oligosaccharide und Oligo nukleotide, die Enzym-Spaltungsstellen enthalten können oder nicht enthalten können.
Im allgemeinen können Spacer-Elemente spaltbare Gruppen, wie vicinale Glykol-, Azo-, Sulfon-, Ester-, Thioester-, oder Disulfid-Gruppen enthalten. Spacer, die bioabbaubare Methylendiester- oder Diamid-Gruppen der Formel -(Z)_m·Y·X·C(R¹R²)·X·Y·(Z)_n- enthalten [wobei X und Z ausgewählt sind aus -O-, -S- und -NR- (wobei R für Wasserstoff oder eine organische Gruppe steht); jedes Y für eine Carbonyl-, Thiocarbonyl-, Sulfonyl-, Phosphoryl- oder eine ähnliche säurebildende Gruppe steht: m und n sind jeweils 0 oder 1; und R¹ und R² stehen jeweils für Wasserstoff, eine organische Gruppe oder eine Gruppe -X·Y·(Z)_m-, oder bilden zusammen eine divalente organische Gruppe], können auch nützlich sein; wie diskutiert in z.B. WO-A-9217436, sind derartige Gruppen bei Vorhandensein von Esterasen einfach abbaubar, z.B. in vivo, sind aber stabil bei Abwesenheit derartiger Enzyme. Sie können deshalb vorteilhafterweise an therapeutische Mittel gebunden werden, um die langsame Freisetzung davon zu erlauben:
Poly[N-(2-hydroxyethyl)methacrylamide] sind potentiell nützliche Spacermaterialien aufgrund ihres niedrigen Wechselwirkungsgrads mit Zellen und Geweben (siehe z.B. Volfovd, I., Rihová, B. und V. R. und Vetvicka, P. in J. Bioact. Comp. Polymers (1992) 7, 175–190). Die Arbeit mit einem ähnlichen Polymer, das hauptsächlich aus dem nahe verwandten 2-Hydroxypropyl-Derivat besteht, zeigte, dass es durch das mononukleare Phagocytensystem nur in einem ziemlich geringen Ausmaß endocytosiert war (siehe Goddard, P., Williamson, I., Bron, J., Hutchkinson, L. E., Nicholls, J. und Petrak, K. in J. Bioct. Compat. Polym. (1991) 6, 4–24.).
Andere möglicherweise nützliche polymere Spacer-Materialien umfassen:

i) Copolymere von Methylmethacrylat mit Methacrylsäure; diese können erosionsanfällig sein (siehe Lee, P. I. in Pharm. Res. (1993) 10, 980) und die Carboxylatsubstituenten können einen höheren Grad des Quellens verursachen als mit neutralen Polymeren;
ii) Blockcopolymere von Polymethacrylaten mit bioabbaubaren Polyestern (siehe z.B. San Roman, J. und Guillen-Garcia, P. in Biomaterials (1991) 12, 236–241);
iii) Cyanoacrylate, d.h. Polymere von Estern von 2-Cyanoacrylsäure – diese sind bioabbaubar und wurden in der Form von Nanoteilchen für selektive Arzneimittelfreisetzung verwendet (siehe Forestier, F., Gerrier, P., Chaumard, C., Quero, A. M., Couvreur, P. und Labarre, C. in J. Antimicrob. Chemoter. (1992) 30, 173–179);
iv) Polyvinylalkohole, die wasserlöslich sind und im allgemeinen als biokompatibel angesehen werden (siehe z.B. Langer, R. in J. Control. Release (1991) 16, 53–60);
v) Copolymere von Vinylmethylether mit Maleinsäureanhydrid, die als bioerosionsanfällig angeführt wurden, (siehe Finne, U., Hannus, M. und Urtii, A. in Int. J. Pharm. (1992) 78, 237–241);
vi) Polyvinylpyrrolidone, z.B. mit einem Molekulargewicht von weniger als ungefähr 25.000, die schnell durch die Nieren gefiltert werden (siehe Hespe, W., Meier, A. M. und Blankwater, Y. M. in Arnzeim.-Forsch./Drug Res. (1977) 27, 1158–1162);
vii) Polymere und Copolymere von kurzkettigen aliphatischen Hydroxysäuren, wie Glykol-, Milch-, Butter-, Valerian- und Capronsäuren (siehe z.B. Carli, F. in Chim. Ind. (Milan) (1993) 75, 494–9), einschließlich Copolymere, die aromatische Hydroxysäuren einbauen, um ihre Zersetzungsrate zu vergrößern (siehe Imasaki, K., Yoshida, M., Fukuzaki, N., Asano, M., Kumakura, M. Mashimo, T., Yamanaka, H. und Nagai. T. in Int. J. Pharm. (1992) 81, 31–38);
viii) Polyester, die aus alternierenden Einheiten von Ethylenglykol und Terephthalsäure bestehen, z.B. Dacron^R, die nicht zersetzbar sind, aber hoch-biokompatibel;
ix) Blockcopolymere, umfassend bioabbaubare Segmente aliphatischer Hydroxysäure-Polymere (siehe z.B. Younes, H., Nataf, P. R., Cohn D., Appelbaum, Y. J., Pizov, G. und Uretzky, G. in Biomater. Artif. Cells Artif. Organs (1988) 16, 705–719), z.B. in Zusammenhang mit Polyurethanen (siehe Kobayashi, H., Hyon, S. H. und Ikada, Y. in „Watercurable and biodegradable prepolymers"-J. Biomed. Mater. Res. (1991) 25, 1481–1494);
x) Polyurethane, die dafür bekannt sind, dass sie in Implantaten gut toleriert werden, und die mit flexiblen, weichen Segmenten kombiniert werden können, z.B. umfassend Poly(tetramethylenglykol), Poly(propylenglykol) oder Poly(ethylenglykol) und aromatische, harte Segmente, z.B. 4,4'-Methylenbis(phenylenisocyanat) (siehe z.B. Ratner, B. D., Johnston, A. B. und Lenk, T. J. in J. Biomed. Mater. Res: Applied Biomaterials (1987) 21, 59–90; Sa Da Costa, V. et al. in J. Coll. Interface Sci (1981) 780, 445–452 und Affrossmann, S. et al. in Clinical Materials (1991) 8, 25–31);
xi) Poly(1,4-dioxan-2-one), die angesichts ihrer hydrolysierbaren Esterbindungen als bioabbaubare Ester betrachtet werden können (siehe z.B. Song, C. X., Cui, X. M. und Schindler, A. in Med. Biol. Eng. Comput (1993) 31, S 147–150), und die Glycolideinheiten enthalten können, um ihre Absorbierbarkeit zu verbessern (siehe Bezwada, R. S., Shalaby, S. W. und Newman, H. D. J. in Agricultural and synthetic polymers: Biodegradablity and utilization (1990) (Hrsg. Glass, J. E. und Swift, G.), 167–174 – ACS symposium Series, #433, Washington D. C., U.S.A.- American Chemical Society);
xii) Polyanhydride, wie Copolymere von Sebacinsäure (Oktandisäure) mit Bis(4-carboxy-phenoxy)propan, die in Kaninchenstudien (siehe Brem, H., Kader, A., Epstein, J. I., Tamargo, R. J., Domb, A., Langer, R. und Leong, K. W. in Sel. Cancer Ther. (1989) 5, 55–65) und Rattenstudien (siehe Tamargo, R. J., Epstein, J. I., Reinhard, C. S., Chasin, M. und Brem, H. in J. Biomed. Mater. Res. (1989) 23, 253–266) als nützlich für eine gesteuerte Freisetzung von Arzneimitteln im Hirn ohne evidente toxische Effekte gezeigt worden sind;
xiii) Bioabbaubare Polymere, die Ortho-Estergruppen enthalten, welche für die kontrollierte Freisetzung in vivo eingesetzt worden sind (siehe Maa, Y. F. und Heller, J. in J. Control. Release (1990) 14, 21–28); und
xiv) Polyphosphazene, die anorganische Polymere sind, die aus alternierenden Phosphor- und Stickstoffatomen bestehen (siehe Crommen, J. H., Vandorpe, J. und Schacht, E. H. in J. Control. Release (1993) 24, 167–180).

Die folgenden Tabellen listen verbindende Mittel auf, die in zielbaren Mitteln gemäß der Erfindung nützlich sind.
Fußnoten:

(1) = iodierbar
(2) = fluoreszierend

Zusätzlich zu den bereits in Betracht gezogenen geradkettigen und verzweigten PEG-artigen Linkern (z.B. Polyethylenglykol und andere, die 2 bis 100 wiederauftretende Einheiten von Ethylenoxid enthalten), können Linker im VLR-System unabhängig eine chemische Bindung oder der Rest einer verbindenden Gruppe sein. Der Begriff „Rest einer verbindenden Gruppe", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Einheit, die aus der Reaktion einer Vektor-reaktiven Gruppe mit einer reaktiven Stelle auf einem Vektor verbleibt, resultiert oder davon abgeleitet wird. Der Begriff „Vektor-reaktive Gruppe", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine beliebige Gruppe, die mit funktionellen Gruppen reagieren kann, die typischerweise auf Vektoren gefunden werden, deren Derivatisierung nur die Fähigkeit des Vektors, an seinen Rezeptor zu binden, minimal beeinflusst. Jedoch wird speziell in Betracht gezogen, dass derartige Vektor-reaktive Gruppen auch mit funktionellen Gruppen reagieren können, die typischerweise auf relevanten Proteinmolekülen gefunden werden. So werden in einem Aspekt die Linker, die beim Ausführen dieser Erfindung nützlich sind, von jenen Gruppen abgeleitet, die mit einem beliebigen relevanten Molekül reagieren können, das einen Vektor wie oben beschrieben umfasst, der eine reaktive Gruppe enthält, egal ob ein derartiges relevantes Molekül ein Protein ist, um eine verbindende Gruppe zu bilden.
Bevorzugte verbindende Gruppen werden von Vektor-reaktiven Gruppen abgeleitet, die ausgewählt sind von aber nicht beschränkt sind auf:
eine Gruppe, die direkt reagieren wird mit Carboxy, Aldehyd, Amin (NHR), Alkoholen, Sulfhydryl-Gruppen, aktivierte Methylene und dergleichen, auf dem Vektor, z.B. aktive Halogen-enthaltende Gruppen, einschließlich z.B. Chlormethylphenyl-Gruppen und Chloracetyl [ClCH₂C(=O)-]-Gruppen, aktivierte 2-(mit einer Austrittsgruppe substituierte)-Ethylsulfonyl- und Ethylcarbonyl-Gruppen, wie 2-Chlorethylsulfonyl und 2-Chlorethylcarbonyl; Vinylsulfonyl; Vinylcarbonyl; Epoxy; Isocyanato; Isothiocyanato; Aldehyd; Aziridin; Succinimidoxycarbonyl; aktivierte Acylgruppen, wie Carbonsäurehalogenide; gemischte Anhydride und dergleichen.
Eine Gruppe, die leicht mit modifizierten Vektormolekülen reagieren kann, die eine Vektor-reaktive Gruppe enthalten, d.h. Vektoren, die eine reaktive Gruppe enthalten, die modifiziert ist, um reaktive Gruppen zu enthalten, wie jene, die oben in (1) erwähnt sind, z.B. durch Oxidation des Vektors zu einem Aldehyd oder einer Carbonsäure, in welchem Fall die „verbindende Gruppe" von reaktiven Gruppen abgeleitet werden kann, die ausgewählt sind aus Amino, Alkylamino, Arylamino, Hydrazino, Alkylhydrazino, Arylhydrazino, Carbazido, Semicarbazido, Thiocarbazido, Thiosemicarbazido, Sulfhydryl, Sulfhydrylalkyl, Sulfhydrylaryl, Hydroxy, Carboxy, Carboxyalkyl und Carboxyaryl. Die Alkylteile der verbindenden Gruppen können von 1 bis ungefähr 20 Kohlenstoffatome enthalten. Die Arylteile der verbindenden Gruppen können von ungefähr 6 bis ungefähr 20 Kohlenstoffatome enthalten; und
eine Gruppe, die an den Vektor, der eine reaktive Gruppe enthält oder an den modifizierten Vektor, wie in (1) und (2) oben aufgeführt, durch Verwendung eines Vernetzungsmittels gebunden werden kann. Die Reste bestimmter nützlicher Vernetzungsmittel, wie z.B. homobifunktionelle und heterobifunktionelle Gelatine-Härter, Bisepoxide und Bisisocyanate, können Teil einer verbindenden Gruppe während der Vernetzungsreaktion werden. Andere nützliche Vernetzungsmittel können jedoch das Vernetzen vereinfachen, z.B. als verbrauchbare Katalysatoren, und sind nicht in dem Endkonjugat vorhanden. Beispiele derartiger Vernetzungsmittel sind Carbodiimid und Carbamoylonium-Vernetzungsmittel, wie offenbart in U.S.-Patent Nr. 4,421,847 und die Ether von U.S.-Patent Nr. 4,877,724. Mit diesen Vernetzungsmitteln muss einer der Reaktanten, wie der Vektor, eine Carboxyl-Gruppe besitzen und der andere, wie ein langkettiger Spacer, muss eine reaktive Amin-, Alkohol- oder Sulfhydryl-Gruppe besitzen. Bei der Amidbindungs-Bildung reagiert das Vernetzungsmittel zuerst selektiv mit der Carboxyl-Gruppe, wird dann während der Reaktion der so „aktivierten" Carboxyl-Gruppe mit einem Amin herausgespalten, um eine Amidbindung zwischen den zwei Einheiten zu bilden und so kovalent zu verbinden. Ein Vorteil dieses Ansatzes ist, dass das Vernetzen von ähnlichen Molekülen, z.B. Vektor an Vektor, vermieden wird, während die Reaktion von beispielsweise homobifunktionellen Vernetzungsmitteln nicht selektiv ist und unerwünschte vernetzte Moleküle erhalten werden.
Bevorzugte nützliche verbindende Gruppen werden von verschiedenen heterobifunktionellen Vernetzungsreagenzien abgeleitet, wie jene, die in Pierce Chemical Company Immunotechnology Catalog – Protein Modification Section, (1995 und 1996) aufgelistet ist. Nützliche nicht beschränkende Beispiele derartiger Reagenzien umfassen:

Sulfo-SMCC: Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat
Sulfo-SIAB: Sulfosuccinimidyl-(4-iodacetyl)aminobenzoat
Sulfo-SMPB: Sulfosuccinimidyl-(4-(p-maleimidophenyl)butyrat
2-IT: 2-Iminothiolan
SATA: N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat

Zusätzlich zur vorstehenden Beschreibung können die verbindenden Gruppen ganz oder teilweise auch aus komplementären Sequenzen von Nukleotiden und Resten von Nukleotiden bestehen und davon abgeleitet werden, sowohl natürlich auftretend, als auch modifiziert, bevorzugt nicht selbst-assoziierende Oligonukleotidsequenzen. Besonders nützliche, nicht beschränkende Reagenzien für den Einbau modifizierter Nukleotideinheiten, die reaktive funktionelle Gruppen enthalten, wie Amin- und Sulfhydryl-Gruppen, in eine Oligonukleotidsequenz, sind kommerziell erhältlich von z.B. Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto California) und umfassen Uni-Link AminoModifier (Catalog # 5190), Biotin-ON-Phosphoramidit (Catalog # 5191), N-MNT-C6-AminoModifier (Catalog # 5202), AminoModifier II (Catalog # 5203), DMT-C6-3'Amin-ON (Catalog # 5222), C6-ThiolModifier (Catalog # 5211) und dergleichen. In einem Aspekt werden die verbindenden Gruppen dieser Erfindung von der Reaktion einer reaktiven funktionellen Gruppe abgeleitet, wie eine Amino- oder Sulfhydryl-Gruppe, wie sie in den oben genannten Clontech-Reagenzien verfügbar ist, von denen eine oder mehr in eine Oligonukleotidsequenz eingebaut worden sind, mit z.B. einem oder mehreren der zuvor beschriebenen Vektor-reaktiven Gruppen, wie eine heterobifunktionelle Gruppe auf dem Vektor.
Durch Binden zweier komplementärer Oligonukleotid-Sequenzen, eine an den Vektor und die andere an den Reporter, umfasst das resultierende doppelstrangige, hybridisierte Oligonukleotid dann die verbindende Gruppe zwischen dem Vektor und dem Reporter.
Andere Polymer-Systeme, die als Linker dienen, umfassen:
Poly(L- oder D- oder DL-Aminosäuren) = Proteine und Peptide; natürlich auftretend oder synthetisch
Pseudo-Poly(aminosäuren) = (Aminosäuren, die durch nicht-Amidbindungen verbunden sind)
Poly(L- oder D- oder DL-Lactid) und die Copolymere z.B. Poly(L-Lactid/DL-Lactid) Poly(Glykolid)
L-Lactid/Glykolid-Copolymere
Poly-, -caprolacton und seine Copolymere
Polyanhydride
Poly(orthoester)
Polyphosphazene
Langkettige geradkettige oder verzweigte Lipide (& Phospholipide) Zucker und
Kohlenhydrate
Oligonukleotide (siehe oben)
wie auch Mischungen der obigen.
Verbindende Mittel, die gemäß der Erfindung verwendet werden, werden im allgemeinen das Verbinden des Vektors an den Reporter oder den Reporter an den Re porter mit einigem Grad von Spezifität herbeiführen, und können auch verwendet werden, um ein oder mehrere therapeutisch aktive Mittel zu binden.
Die vorliegende Erfindung stellt demgemäss ein Werkzeug bereit für die therapeutische Arzneimittel-Verabreichung in Kombination mit Vektor-vermittelter Ausrichtung des Produkts auf die erwünschte Stelle. Mit „therapeutisch" oder „Arzneimittel" ist ein Mittel gemeint, das einen günstigen Effekt auf eine spezifische Krankheit in einem lebenden Menschen oder nicht-menschlichen Tier besitzt.
Therapeutische Verbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können im Inneren eines Molekülaggregats oder teilchenförmigen Linkers eingekapselt oder gebunden oder eingebaut in den einkapselnden Wänden eines vesikulären Linkers eingekapselt sein. So kann die therapeutische Verbindung an einen Teil der Oberfläche gebunden sein, z.B. über kovalente oder ionische Bindungen, oder kann physikalisch in ein einkapselndes Materialgemisch gemischt sein, insbesondere falls das Arzneimittel eine zum Material ähnliche Polarität oder Löslichkeit hat, um es davon abzuhalten, aus dem Produkt auszulaufen, bevor beabsichtigt ist, dass es im Körper wirkt. Die Freisetzung des Arzneimittels kann lediglich durch benetzenden Kontakt mit Blut nach der Verabreichung folgend oder als eine Konsequenz anderer interner oder externer Einflüsse initiiert werden, z.B. Auflösungsprozesse, katalysiert durch Enzyme, oder die Verwendung, bei der der Linker-Reporter ein Gas-enthaltendes Vesikel ist.
Die therapeutische Substanz kann an die einkapselnde Membranoberfläche eines vesikulären Linkers unter Verwenden eines geeigneten verbindenden Mittels gebunden werden, z.B. wie hier beschrieben. So kann man z.B. anfänglich ein Phospholipid-Derivat herstellen, an das das Arzneimittel durch eine/einen bioabbaubare(n) Bindung oder Linker gebunden wird, und dann dieses Derivat in das Material einbauen, das zum Herstellen der Vesikelmembran verwendet wird, wie oben beschrieben. Alternativ kann das Mittel anfänglich ohne das Therapeutikum hergestellt werden, das dann an teilchenförmige (z.B. vesikuläre) Mittel vor der Verwendung gekoppelt oder darauf aufgebracht werden kann. So könnte z.B. ein erapeutikum zu einer Suspension von Mikroblasen in wässrigen Medien gegeben werden und geschüttelt werden, um das Therapeutikum an die Mikroblasen zu binden oder anhaften zu lassen.
Das Therapeutikum kann z.B. ein Arzneimittel oder ein Pro-Drug sein, das zur Verwendung beim Behandeln der kongestiven Herzinsuffizienz oder einer anderen kardiovaskulären Therapie bekannt ist.
Durch Targeting eines Mittels gemäß der Erfindung, das ein Pro-Drug-aktivierendes Enzym enthält, auf pathologische Gebiete, kann man das Targeting des Enzyms abbilden, wodurch es möglich wird, zu visualisieren, wenn das Mittel korrekt gezielt wird und wenn das Mittel von Nicht-Zielgebieten verschwunden ist. Auf diese Weise kann man die optimale Zeit für die Injektion eines Pro-Drugs in individuelle Patienten bestimmen.
Eine andere Alternative ist es, ein Pro-Drug, ein Pro-Drug-aktivierendes Enzym und einen Vektor in denselben teilchenförmigen Linker/Reporter auf eine derartige Weise einzubauen, dass das Pro-Drug nur nach einem externen Stimulus aktiviert werden wird. Ein derartiger Stimulus kann z.B. sein ein Sprengen von Vesikeln durch externen Ultraschall, Lichtstimulation eines chromophoren Reporters oder magnetisches Heizen eines superparamagnetischen Reporters, nachdem das erwünschte Targeting erreicht worden ist.
Sogenannte Pro-Drugs können in Mitteln gemäß der Erfindung verwendet werden. So können Drugs derivatisiert werden, um ihre physikochemischen Eigenschaften zu ändern und das Mittel der Erfindung anzupassen; derartige derivatisierte Arzneimittel können als Pro-Drugs angesehen werden und sind üblicherweise inaktiv, bis die Spaltung der derivatisierenden Gruppe die aktive Form des Arzneimittels regeneriert.
Therapeutika können auf einfache Weise gemäß der Erfindung an das Herz und die Vaskulatur im allgemeinen und an die Leber, Milz und die Nieren und andere Regio nen, wie das Lymph-System, Körperhöhlen oder das gastrointestinale System geliefert werden.
Beispielsweise, wo der Reporter eine chelatierte Metallspezies ist (z.B. ein paramagnetisches Metallion oder ein Metallradionuklid) kann der Linker umfassen eine Kette, die an eine Metall-chelatierende Gruppe gebunden ist, eine polymere Kette mit einer Mehrzahl von Metall-chelatierenden Gruppen, die am molekularen Rückgrat hängen oder im molekularen Rückgrat eingebaut sind, ein verzweigtes Polymer mit Metall chelatierenden Gruppen an Verzweigungstermini (z.B. ein dendrimärer Polychelatbildner) etc. Was für den Linker erforderlich ist, ist, dass er die Vektor- und Reportereinheiten einfach zusammenbindet für eine angemessene Zeitdauer. Mit angemessener Zeitdauer ist gemeint eine Zeitdauer, die ausreichend ist, dass das Kontrastmittel seine erwünschten Effekte ausübt, z.B. um den Kontrast in vivo während einer diagnostischen Bildgebungsprozedur zu verstärken.
So kann es unter bestimmten Umständen erwünscht sein, dass der Linker nach der Verabreichung bio-abgebaut wird. Durch Auswählen eines geeigneten bioabbaubaren Linkers ist es möglich, die Biodistributions- und Bioeliminationsmuster für den Vektor und/oder Reporter zu modifizieren. Wo der Vektor und/oder Reporter biologisch aktiv sind oder fähig sind, unerwünschte Effekte auszuüben, falls sie gespeichert werden, nachdem die Bildgebungsprozedur vorüber ist, kann es erwünscht sein, Linker-Bioabbaubarkeit einzuplanen, die eine geeignete Bioelimination oder einen metabolischen Abbau der Vektor- und/oder Reportereinheiten sicherstellt. So kann ein Linker eine bioabbaubare Funktion enthalten, die beim Abbau Abbauprodukte mit modifizierten Biodistributionsmustern ergibt, die aus der Freisetzung des Reporters vom Vektor oder aus der Fragmentierung einer makromolekularen Struktur folgen. Mittels eines Beispiels für Linker, die chelatierte Metallionen-Reporter tragen, ist es möglich, dass der Linker eine bioabbaubare Funktion eingebaut hat, die beim Abbauen eine ausscheidbare Chelatverbindung freisetzt, die den Reporter enthält. Demgemäss können, falls erwünscht, bioabbaubare Funktionen innerhalb der Linkerstruktur eingebaut werden, bevorzugt an Stellen, die (a) Verzweigungsstellen, (b) bei oder nahe von Bindungsstellen für Vektoren oder Reporter oder (c) derart sind, dass ein Bioabbau physiologisch tolerierbare oder schnell ausscheidbare Fragmente ergibt.
Beispiele geeigneter bioabbaubarer Funktionen umfassen Ester-, Amid-, Doppelester-, Phosphorester-, Ether-, Thioether-, Guanidyl-, Acetal- und Ketal-Funktionen.
Wie oben diskutiert kann die Linkergruppe, falls erwünscht, in seinem molekularen Rückgrat Gruppen eingebaut haben, die die Biodistribution des Kontrastmittels beeinflussen, oder die eine geeignete räumliche Konformation für das Kontrastmittel sicherstellen, z.B. um Wasser Zugang zu chelatierten paramagnetischen Metallion-Reportern zu ermöglichen. Beispielsweise kann das Linker-Rückgrat teilweise oder im wesentlichen insgesamt aus einer oder mehreren Polyalkylenoxidketten bestehen.
So kann der Linker angesehen werden als ein Verbund von gegebenenfalls bioabbaubaren Vektorbindungs(V_b)- und Reporterbindungs(R_b)-Gruppen, die über Linker-Rückgrat(R_b)-Gruppen verbunden sind, wobei die Linker-Rückgratgruppen Linkerseitenketten(L_sc)-Gruppen tragen kann, um eine Biodistribution etc. zu modifizieren und können selbst bioabbaubare Funktionen einbauen. Die R_b- und V_b-Bindungsgruppen können vom Linkerrückgrat hängen oder können sich an Linker-Rückgrat-Termini befinden, z.B. mit einer R_b- oder V_b-Gruppe an einem L_b-Terminus, wobei R_b- oder V_b-Gruppen zwei L_b-Termini zusammenbinden oder wobei ein L_b-Terminus zwei oder mehr R_b- oder V_b-Gruppen tragen. Die L_b- und L_sc-Gruppen werden günstigerweise oligomere oder polymere Strukturen sein (z.B. Polyester, Polyamide, Polyether, Polyamine, Oligopeptide, Polypeptide, Oligo- und Polysaccharide, Oligonukleotide, etc.), bevorzugt Strukturen mit mindestens teilweise einer hydrophilen oder lipophilen Natur, z.B. hydrophile, amphiphile oder lipophile Strukturen.
Der Linker kann von niedrigem, mittlerem oder hohem Molekulargewicht sein, z.B. bis zu 2 MD. Linker mit allgemein höherem Molekulargewicht werden bevorzugt sein, falls sie mit einer Vielzahl von Vektoren oder Reportern geladen werden sollen, oder falls es nötig ist Vektor und Reporter voneinander zu trennen, oder falls der Linker selbst dazu dient, eine Rolle bei der Modifikation der Biodistribution zu spielen. Im allgemeinen werden jedoch Linker von 100 bis 100.000 D, speziell 120 D bis 20 kD im Molekulargewicht sein.
Die Konjugation des Linkers an den Vektor und des Linkers an den Reporter kann durch eine beliebige geeignete chemische Konjugationstechnik erfolgen, z.B. kovalentes Binden (z.B. Ester- oder Amidbildung), Metallchelatierung und eine andere Metall-koordinative oder ionische Bindung, wieder wie oben beschrieben.
Beispiele geeigneter Linker-Systeme umfassen die Verstärker-Polychelatbildner-Strukturen der US-A-5364613 und WO 90/12050, Polyaminosäuren (z.B. Polylysin), funktionalisiertes PEG, Polysaccharide, Glycosaminoglykane, dendritische Polymere, wie beschrieben in WO 93/06868 und von Tomalia et al. in Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29: 138–175 (1990), PEG-chelatbildende Polymere, wie beschrieben in WO 94/08629, WO 94/09056 und WO 96/26754, etc.
Wo der Reporter ein chelatiertes Metallion ist, wird die Linkergruppe im allgemeinen die chelatbildende Einheit einbauen. Alternativ kann das chelatierte Metall in oder auf einem besonderen Reporter getragen werden. In jedem Fall können herkömmliche Metall-chelatierende Gruppen, wie sie in den Gebieten der Radiopharmazeutika und MRI-Kontrastmedien gut bekannt sind, verwendet werden, z.B. lineare, cyclische und verzweigte Polyaminopolycarbonsäuren und Phosphoroxysäure-Äquivalenten, und andere Schwefel- und/oder Stickstoff-Liganden, die in der Technik bekannt sind, z.B. DTPA, DTPA-BMA, EDTA, DO3A, TMT (siehe z.B. US-A-5367080), BAT und Analoga (siehe z.B. Ohmono et al., J. Med. Chem. 35: 157–162 (1992) und Kung et al. J. Nucl. Med. 25: 326–332 (1984)), der N₂S₂-Chelatbildner ECD von Neurolite, MAG (siehe Jurisson et al. Chem. Rev. 93: 1137–1156 (1993), HIDA, DOXA (1-Oxa-4,7,10-triazacyclododecantriessigsäure), NOTA (1,4,7-Triazacyclononantriessigsäure), TETA (1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecantetraessigsäure), THT 4'-(3-Amino-4-methoxy-phenyl)-6,8''-bis(N',N'-dicarboxymethyl-N-methylhydrazino)-2,2':6',2''- terpyridin), etc. In dieser Hinsicht wird der Leser auf die Patentliteratur von Sterling Winthrop, Nycomed (einschließlich Nycomed Imaging and Nycomed Salutar), Schering, Mallinckrodt, Bracco und Squibb verwiesen, die sich auf chelatierende Mittel für diagnostische Metalle beziehen, z.B. in MR-, Röntgenstrahlungs- und radiodiagnostischen Mitteln. Siehe z.B. US-A-4647447, EP-A-71564, US-A-4687659, WO 89/00557, US-A-4885363 und EP-A-232751.
Reporter
Die Reportereinheiten in den Kontrastmitteln der Erfindung können eine beliebige Einheit sein, die zur Detektion entweder direkt oder indirekt oder in einer diagnostischen in vivo-Bildgebungsprozedur fähig sind, z.B. Einheiten, die detektierbare Strahlung (z.B. durch radioaktiven Zerfall, Fluoreszenzanregung, Spinnresonanzanregung, etc.) emittieren oder veranlasst werden, diese zu emittieren, Einheiten, die lokale elektromagnetische Felder beeinflussen (z.B. paramagnetische, superparamagnetische, ferrimagnetische oder ferromagnetische Spezien), Einheiten, die Strahlungsenergie absorbieren oder streuen (z.B. Chromophore, Teilchen (einschließlich Gas oder Flüssigkeit enthaltender Vesikel), schwere Elemente und Verbindungen davon, etc.), und Einheiten, die eine detektierbare Substanz erzeugen (z.B. Gas-Mikroblasen-Erzeuger), etc.
Ein sehr breiter Bereich von Materialien, die durch diagnostische Bildgebungseinheiten detektierbar sind, sind aus der Technik bekannt und der Reporter wird gemäß der zu verwendenden Bildgebungsmodalität ausgewählt werden. So kann z.B. für Ultraschallbildgebung ein echogenes Material oder ein Material, das zum Erzeugen eines echogenen Materials fähig ist, normalerweise ausgewählt werden, für Röntgenstrahlungs-Bildgebung wird der Reporter im allgemeinen ein schweres Atom sein oder enthalten (z.B. einer relativen Atommasse von 38 oder darüber), für MR-Bildgebung wird der Reporter entweder ein Nicht-Null-Kernspin-Isotop (wie ¹⁹F) oder ein Material mit ungepaarten Elektronenspins und daher paramagnetischen, superparamagnetischen, ferrimagnetischen oder ferromagnetischen Eigenschaften sein, für Lichtbild gebung wird der Reporter ein Lichtstreuer (z.B. ein gefärbtes oder ungefärbtes Teilchen), ein Lichtabsorber oder ein Lichtemitter sein, für magnetometrische Bildgebung wird der Reporter detektierbare magnetische Eigenschaften besitzen, für Bildgebung mit elektrischer Impedanz wird der Reporter elektrische Impedanz beeinflussen und für Szintigraphie, SPECT, PET etc. wird der Reporter ein Radionuklid sein.
Beispiele geeigneter Reporter sind weit bekannt aus der Literatur der diagnostischen Bildgebung, z.B. magnetische Eisenoxidteilchen, Gas-enthaltende Vesikel, chelatierte paramagnetische Metalle (wie Gd, Dy, Mn, Fe etc.). Siehe z.B. US-A-4647447, WO 97/25073, US-A-4863715, US-A-4770183, WO 96/09840, WO 85/02772, WO 92/17212, WO 97/29783, EP-A-554213, US-A-5228446, WO 91/15243, WO 93/05818, WO 96/23524, WO 96/17628, US-A-5387080, WO 95/26205, GB 9624918.0 , etc.
Besonders bevorzugt als Reporter sind: chelatierte paramagnetische Metallionen, wie Gd, Dy, Fe und Mn, speziell, wenn sie chelatiert sind durch makrocyclische chelatbildende Gruppen (z.B. Tetraazacyclododekan-Chelatbildner wie DOTA, DO3A, HP-DO3A und Analoga davon) oder durch Linker-Chelatbildnergruppen, wie DTPA, DTPA-BMA, EDTA, DPDP, etc.; Metallradionuklide wie ⁹⁰Y, ^99mTc, ¹¹¹In, ⁴⁷Sc, ⁶⁷/Ga, ⁵¹Cr, ^177mSn, ⁶⁷Cu, ¹⁶⁷Tm, ⁹⁷Ru, ¹⁸⁸Re, ¹⁷⁷Lu, ¹⁹⁹Au, ²⁰³Pb und ¹⁴¹Ce; superparamagnetische Eisenoxidkristalle; Chromophore und Fluorophore mit Absorptions- und/oder Emissionsmaxima im Bereich von 300 nm bis 1400 nm, speziell 600 nm bis 1200 nm, insbesondere 650 nm bis 1000 nm; Vesikel, die fluorierte Gase enthalten (d.h., die Materialien in der Gasphase bei 37°C enthalten, die Fluor enthalten, z.B. SF₆ oder perfluorierte C_1-6-Kohlenwasserstoffe oder andere Gase und Gasprecurser, die in WO 97/29783 aufgelistet sind); chelatierte Schwermetallclusterionen (z.B. W- oder Mo-Polyoxyanionen oder die Schwefel- oder gemischten Sauerstoff-/Schwefel-Analoga); kovalent gebundene nicht-metallische Atome, die entweder von einer hohen Ordnungszahl (z.B. Iod) oder radioaktiv sind, z.B. ¹²³I, ¹³¹I, etc.; Atome; eine iodierte Verbindung enthaltende Vesikel; etc.
Allgemein ausgedrückt kann der Reporter sein (1) ein chelatierbares Metall oder ein polyatomares Metall-enthaltendes Ion (d.h. TcO, etc.), wobei das Metall ein Metall einer hohen Ordnungszahl ist (z.B. eine Ordnungszahl größer als 37), eine paramagnetische Spezies (z.B. ein Übergangsmetall oder Lanthanid), oder ein radioaktives Isotop, (2) eine kovalent gebundene nicht-metallische Spezies, die eine ungepaarte Elektronenstelle ist (z.B. ein Sauerstoff oder Kohlenstoff in einem beständigen freien Radikal), ein Nicht-Metall einer hohen Ordnungszahl oder ein Radioisotop, (3) ein polyatomarer Cluster oder Kristall, der Atome mit hoher Ordnungszahl enthält und ein kooperatives magnetisches Verhalten zeigt (z.B. Superparamagnetismus, Ferrimagnetismus oder Ferromagnetismus) oder Radionuklide enthält, (4) ein Gas oder ein Gasprecursor (d.h. ein Material oder eine Mischung von Materialien, die bei 37°C gasförmig ist), (5) ein Chromophor (durch welchen Begriff Spezien enthalten sind, die fluoreszieren oder phosphoreszieren), z.B. eine anorganische oder organische Struktur, insbesondere ein komplexiertes Metallion oder eine organische Gruppe mit einem ausgedehnten delokalisierten Elektronensystem, oder (6) eine Struktur oder eine Gruppe mit Eigenschaften, die die elektrische Impedanz verändern, z.B. aufgrund eines ausgedehnten delokalisierten Elektronensystems.
Beispiele besonders bevorzugter Reportergruppen sind unten detaillierter beschrieben.
Chelatierte Metallreporter: Metall-Radionuklide, paramagnetische Metallionen, fluoreszierende Metallionen, Schwermetallionen und Clusterionen
Bevorzugte Metallradionuklide umfassen ⁹⁰Y, ^99mTc, ¹¹¹In, ⁴⁷Sc, ⁶⁷Ga, ⁵¹Cr, ^177mSn, ⁶¹Cu, ¹⁶⁷Tm, ⁹⁷Ru, ¹⁸⁸Re, ¹⁷⁷Lu, ¹⁹⁹Au, ²⁰³Pb und ¹⁴¹Ce.
Bevorzugte paramagnetische Metallionen umfassen Ionen von Übergangs- und Lanthanid-Metallen (z.B. Metalle mit Ordnungszahlen von 6–9, 21–29, 42, 43, 44 oder 57–71), insbesondere Ionen von Cr, V, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb und Lu, insbesondere aus Mn, Cr, Fe, Gd und Dy, mehr insbesondere Gd.
Bevorzugte fluoreszierende Metallionen umfassen Lanthanide, insbesondere La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb und Lu. Eu ist speziell bevorzugt.
Bevorzugte Schwermetall-enthaltende Reporter können Atome von Mo, Bi, Si und W enthalten und können insbesondere polyatomare Clusterionen sein (z.B. Bi-Verbindungen und W- und Mo-Oxide), wie beschrieben in WO 91/14460, WO 92/17215, WO 96/40287 und WO 96/22914.
Die Metallionen sind erwünschterweise chelatiert durch Chelatbildnergruppen auf der Linkereinheit oder in oder auf einem Teilchen (z.B. ein Vesikel oder ein poröser oder nicht-poröser anorganischer oder organischer Feststoff), insbesondere lineare, makrocyclische, Terpyridin- und N₂S₂-Chelatbildner, wie z.B. DTPA, DTPA-BMA, EDTA, DO3A, TMT. Weitere Beispiele geeigneter Chelatbildnergruppen sind offenbart in US-A-4647447, WO 89/00557, US-A-5367080, US-A-5364613, etc.
Die Linker-Einheit oder das Teilchen kann eine oder mehrere derartige Chelatbildnergruppen enthalten, falls erwünscht metalliert durch mehr als eine Metallspezies (z.B. um so Reporter bereitzustellen, die in verschiedenen Bildgebungsmodalitäten detektierbar sind).
Insbesondere wo das Metall nicht-radioaktiv ist, ist es bevorzugt, dass ein Polychelatbildner-Linker oder ein teilchenförmiger Reporter verwendet wird.
Ein Chelatbildner oder eine chelatierende Gruppe, auf die hier Bezug genommen wird, kann den Rest einer oder mehrerer einer breiten Vielfalt von chelatierenden Mitteln umfassen, die ein Metallion oder ein polyatomares Ion (z.B. TcO) komplexieren.
Wie gut bekannt ist, ist ein chelatierendes Mittel eine Verbindung, die Donoratome enthält, die durch koordinative Bindung mit einem Metallatom kombinieren können, um eine cyclische Struktur zu bilden, die ein 0Chelationkomplex oder Chelat genannt wird. Diese Klasse von Verbindungen ist beschrieben in der Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, Band 5, 339–368.
Der Rest eines geeigneten chelatierenden Mittels kann aus Polyphosphaten ausgewählt werden, wie Natriumtripolyphosphat und Hexametaphosphorsäure, Aminocarbonsäuren, wie Ethylendiamintetraessigsäure, N-(2-Hydroxy)ethylendiamintriessigsäure, Nitrilotriessigsäure, N,N-Di(2-hydroxyethyl)glycin, Ethylen-bis(hydroxyphenylglycin) und Diethylentriaminpentaessigsäure; 1,3-Diketone, wie Acetylaceton, Trifluoracetylaceton und Thenoyltrifluoraceton; Hydroxycarbonsäuren, wie Weinsäure, Zitronensäure, Gluconsäure und 5-Sulfosalicylsäure; Polyamine, wie Ethylendiamin, Diethylentriamin, Triethylentetraamin und Triaminotriethylamin; Aminoalkohole, wie Triethanolamin und N-(2-Hydroxyethyl)ethylendiamin; aromatische heterocyclische Basen, wie 2,2'-Diimidazol, Picolinamin, Dipicolinamin und 1,10-Phenanthrolin, Phenole, wie Salicylaldehyd, Disulfopyrocatechol und Chromotopsäure; Aminophenole, wie 8-Hydroxychinolin und Oximsulfonsäure; Oxime, wie Dimethylglyoxim und Salicylaldoxim; Peptide, die eine proximale chelatierende Funktionalität enthalten, wie Polycystein, Polyhistidin, Polyasparaginsäure, Polyglutaminsäure oder Kombinationen derartiger Aminosäuren; Schiffbasen, wie Disalicylaldehyd-1,2-propylendiimin, Tetrapyrrole, wie Tetraphenylporphin und Phthalocyanin; Schwefelverbindungen, wie Toluoldithiol, Meso-2,3-dimercaptobernsteinsäure, Dimercaptopropanol, Thioglycolsäure, Kaliumethylxanthat, Natriumdiethyldithiocarbamat, Dithizon, Diethyldithiophosphorsäure und Thioharnstoff, synthetische makrocyclische Verbindungen, wie Dibenzo[18]Kronen-6, (CH₃)₆-[14]-4,11]-dien-N₄ und (2.2.2-Cryptat); Phosphonsäuren, wie Nitrilotrimethylenphosphonsäure, Ethylendiamintetra(methylenphosphonsäure) und Hydroxyethylidendiphosphonsäure, oder Kombinationen zweier oder mehrerer der oben genannten Mittel. Der Rückstand eines geeigneten chelatierenden Mittels umfasst bevorzugt eine Polycarbonsäuregruppe und bevorzugte Beispiele umfassen: Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EDTA); N,N,N',N'',N''-Di ethylentriaminpentaessigsäure (DTPA); 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure (DOTA); 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N''-triessigsäure (DO3A); 1-Oxa-4,7,10-triazacyclododecan-N,N',N''-triessigsäure (OTTA); Trans(1,2)-cyclohexanodiethylentriaminpentaessigsäure (CDTPA).
Andere geeignete Reste von chelatierenden Mitteln umfassen Proteine, die für die Chelatierung von Metallen, wie Technetium und Rhenium, modifiziert sind, wie beschrieben in US-Patent Nr. 5078985, dessen Offenbarung hier durch Bezugnahme enthalten ist.
Geeignete Reste chelatierender Mittel können auch abgeleitet werden von N3S- und N2S2-enthaltenden Verbindungen, wie z.B. jene, die in US-Patenten Nr. 4444690; 4670545, 4673562, 4897255, 4965392, 4980147, 4988496, 5021556 und 5075099 offenbart sind.
Andere geeignete Reste chelatierender Mittel sind in WO 92/08494 beschrieben.
Bevorzugte chelatierende Gruppen sind aus der Gruppe ausgewählt, die besteht aus 2-Aminomethylpyridin, Iminoessigsäure, Iminodiessigsäure, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure (DOTA), Carbonyliminodiessigsäure, Methyleniminoessigsäure, Methyleniminodiessigsäure, Ethylenthioethyleniminoessigsäure, Ethylenthioethyleniminodiessigsäure, TMT, einer Terpyridinyl-Gruppe, einem chelatierenden Mittel, das eine Terpyridyl-Gruppe und eine Carboxymethylaminogruppe umfasst, oder einem Salz von einer beliebigen der vorstehenden Säuren. Speziell bevorzugte chelatierende Gruppen sind DTPA, DTPA-BMA, DPDP, TMT, DOTA und HPDO3A.
Repräsentative chelatierende Gruppen sind auch beschrieben in US 5559214 A , WO 95/26754, WO 94/08624, WO 94/09056, WO 94/29333, WO 94/08624, WO 94/08629 A1, WO 94/13327 A1 und WO 94/12216 A1.
Verfahren zum Metallieren beliebiger vorliegender chelatierender Mittel liegen innerhalb des Kenntnisstands in der Technik. Metalle können in eine chelatbildende Einheit durch ein beliebiges von drei allgemeinen Verfahren eingebaut werden: direkter Einbau, Templat-Synthese und/oder Transmetallierung. Direkter Einbau ist bevorzugt.
So ist es erwünscht, dass das Metallion durch das chelatierende Mittel leicht komplexiert wird, z.B. durch lediglich Aussetzen oder Mischen einer wässrigen Lösung der das chelatierende Mittel enthaltenden Einheit mit einem Metallsatz in einer wässrigen Lösung, bevorzugt mit einem pH im Bereich von ungefähr 4 bis ungefähr 11. Das Salz kann ein beliebiges Salz sein, aber bevorzugt ist das Salz ein wasserlösliches Salz des Metalls, wie ein Halogensalz, und bevorzugter sind derartige Salze so ausgewählt, dass sie nicht mit dem Binden des Metallions mit dem chelatierenden Mittel interferieren. Die ein chelatierendes Mittel enthaltende Einheit liegt bevorzugt in wässriger Lösung bei einem pH von zwischen ungefähr 5 bis ungefähr 9, bevorzugter zwischen einem pH von ungefähr 6 bis ungefähr 8 vor. Die Einheit, die das chelatierende Mittel enthält, kann mit Puffersalzen gemischt sein, wie Citrat, Acetat, Phosphat und Borat, um den optimalen pH zu erzeugen. Bevorzugt werden die Puffersalze derart ausgewählt, dass sie nicht mit dem nachfolgenden Binden des Metallions an das chelatierende Mittel interferieren.
Bei der diagnostischen Bildgebung enthält das Vektor-Linker-Reporter(VLR)-Konstrukt bevorzugt ein Verhältnis von Metallradionuklidionen zu chelatierendem Mittel, das in derartigen diagnostischen Bildgebungsanwendungen wirksam ist. In bevorzugten Ausführungsformen beträgt das Mol-Verhältnis von Metallion pro chelatierendem Mittel ungefähr 1:1.000 bis ungefähr 1:1.
In radiotherapeutischen Anwendungen enthält das VLR bevorzugt ein Verhältnis von Metallradionuklidion zu chelatierendem Mittel, das in derartigen therapeutischen Anwendungen wirksam ist. In bevorzugten Ausführungsformen beträgt das Mol- Verhältnis von Metallion pro chelatierendem Mittel ungefähr 1:100 bis ungefähr 1:1. Das Radionuklid kann ausgewählt werden z.B. von Radioisotopen von Sc, Fe, Pb, Ga, Y, Bi, Mn, Cu, Cr, Zn, Ge, Mo, Ru, Sn, Sr, Sm, Lu, Sb, W, Re, Po, Ta und Tl. Bevorzugte Radionuklide umfassen ⁴⁴Sc, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ²¹²Pb, ⁶⁸Ga, ⁹⁰Y, ¹⁵³Sm, ²¹²Bi, ¹⁸⁶Re und ¹⁸⁸Re. Von diesen ist besonders bevorzugt ⁹⁰Y. Diese Radioisotope können atomar oder bevorzugt ionisch sein.
Die folgenden Isotope oder Isotopen-Paare können sowohl für Bildgebung als auch Therapie verwendet werden, ohne dass die Radiomarkierungs-Methodik oder der Chelator geändert werden muss: ⁴⁷Sc₂₁, ¹⁴¹Ce₅₈, ¹⁸⁸Re₇₅, ¹⁷⁷Lu₇₁, ¹⁹⁹Au₇₉, ⁴⁷SC₂₁, ¹³¹I₅₃, ⁶⁷Cu₂₉, ¹³¹I₅₃ und ¹²³I₅₃, ¹⁸⁸Re₇₅ und ^99mTc₄₃; ⁹⁰Y₃₉ und ⁸⁷Y₃₉; ⁴⁷Sc₂₁ und ⁴⁴sc₂₁; ⁹⁰Y₃₉ und ¹²³I₅₃, ¹⁴⁶Sm₆₂ und ¹⁵³Sm₆₂; und ⁹⁰Y₃₉ und ¹¹¹In₄₉.
Wo die Linkereinheit einen einzelnen Chelatbildner enthält, kann jener Chelatbildner direkt an die Vektoreinheit gebunden werden, z.B. über eine der metallkoordinierenden Gruppen des Chelatbildners, die eine Ester-, Amid-, Thioester- oder Thioamidbindung mit einer Amin-, Thiol- oder Hydroxylgruppe auf dem Vektor bilden kann. Alternativ können der Vektor und der Chelatbildner direkt über eine Funktionalität gebunden werden, die an dem Chelatbildnerrückgrat gebunden ist, z.B. eine CH₂-Phenyl-NCS-Gruppe, die an einen Ring-Kohlenstoff von DOTA gebunden ist, wie vorgeschlagen von Meares et al. in JACS 110: 6266–6267 (1988), oder indirekt über einen homo- oder hetero-bifunktionellen Linker, z.B. ein Bis-amid, ein Bis-epoxid, ein Diol, eine Disäure, ein difunktionalisiertes PEG, etc. In jenem Fall wird der bifunktionelle Linker günstigerweise eine Kette von 1 bis 200, bevorzugt 3 bis 30 Atome zwischen Vektor und Chelatbildner-Rückstand, bereitstellen.
Wo die Linkereinheit eine Mehrzahl von Chelatbildner-Gruppen enthält, ist der Linker oder enthält er bevorzugt Teile der Formeln
wobei Ch eine Chelatbildner-Einheit und Li eine Linkerrückgrat-Komponente ist, d.h. der Linker besitzt bevorzugt anhängende Chelatbildner, Chelatbildner im Rückgrat oder terminate Chelatbildner oder eine Kombination davon. Die anhängenden und im Rückgrat vorliegenden polymeren Strukturen können verzweigt sein, sind aber bevorzugter linear und die Wiederholungseinheiten (LiCh) oder andere Wiederholungseinheiten im Polymer können im Rückgrat befindliche oder anhängende, die Biodistribution modifizierende Gruppen aufweisen, z.B. Polyalkylengruppen, wie in WO 94/08629, WO 94/09056 und WO 96/20754. Die terminalen chelatbildenden Stukturen Li(CH)_n, die dendritische Polymere sein können wie in WO 93/06868, können die Biodistribution modifizierende Gruppen besitzen, die an Termini gebunden sind, die nicht durch Chelatbildner besetzt sind, und können den Bioabbau verstärkende Stellen innerhalb der Linkerstruktur wie in WO 95/28966 aufweisen.
Die Chelatbildner-Einheiten innerhalb des Polychelatbildner-Linkers können über Rückgrat-Funktionalisierung des Chelatbildners oder durch Nutzen einer oder mehrerer der metallkoordinierenden Gruppen des Chelatbildners oder durch eine Amid- oder Etherbindungsbildung zwischen dem Säure-Chelatbildner und einem ein Amin oder Hydroxyl tragenden Linkerrückgrat gebunden werden, z.B. wie in PolylysinpolyDTPA, Polylysin-polyDOTA und in den sogenannten Verstärker-Polychelatbildnern der WO 90/12050. Derartige Polychelatbildner-Linker können an einer oder mehreren Vektorgruppen entweder direkt (z.B. unter Nutzen von Amin-, Säure- oder Hydroxylgruppen im Polychelatbildner-Linker) oder über eine bifunktionelle Linker-Verbindung, wie oben diskutiert für Monochelatbildner-Linker, konjugiert werden.
Wo die chelatierte Spezies durch einen teilchenförmigen (oder Molekularaggregat- z. B. vesikulären) Linker getragen wird, kann das Chelat z.B. ein nichtgebundenes Mono- oder Polychelat (wie Gd DTPA-BMA oder Gd HP-DO3A) sein, das innerhalb des Teilchens eingeschlossen ist, oder es kann ein Mono- oder Polychelat sein, das an das Teilchen entweder durch kovalente Bindung oder durch Wechselwirkung einer Ankergruppe (z.B. einer lipophilen Gruppe) auf dem Mono-/Polychelat mit der Membran eines Vesikels (siehe z.B. WO 96/11023) konjugiert ist.
Nicht-metallische atomare Reporter
Bevorzugte nicht-metallische atomare Reporter umfassen Radioisotope, wie ¹²³I und ¹³¹I, wie auch Nicht-Null-Kernspin-Atome, wie ¹⁸F und schwere Atome wie I.
Derartige Reporter, bevorzugt eine Mehrzahl davon, z.B. 2 bis 200, können kovalent an ein Linker-Rückgrat gebunden werden, entweder unter direktem Verwenden konventioneller chemischer Synthesetechniken oder über eine tragende Gruppe, z.B. eine Triiodphenylgruppe.
In einer Ausführungsform dieser Erfindung wird die Verwendung von Radioisotopen von Iod speziell in Betracht gezogen. Zum Beispiel können, falls der Vektor oder der Linker aus Substituenten besteht, die chemisch durch Iod in einer Reaktion der Bildung einer kovalenten Bindung substituiert werden können, wie z.B. Substituenten, die eine Hydroxyphenylfunktionalität enthalten, derartige Substituenten durch gut in der Technik bekannte Verfahren mit einem Radioisotop aus Iod markiert werden. Die Iod-Spezies kann in therapeutischen und diagnostischen Bildgebungsanwendungen verwendet werden. Währenddessen kann zur selben Zeit ein Metall in einem chelatierenden Mittel auf demselben Vektor-Linker auch in entweder therapeutischen oder diagnostischen Bildgebungsanwendungen verwendet werden.
Wie mit den oben diskutierten Metall-Chelatbildnern, können derartige nichtmetallische atomare Reporter an den Linker gebunden werden oder in oder auf einem teilchenförmigen Linker getragen werden, z.B. in einem Vesikel (siehe WO 95/26205 und GB 9624918.0 ).
Linker des oben beschriebenen Typs in Zusammenhang mit den Metall-Reportern können für nicht-metallische atomare Reporter mit den nicht-metallischen atomaren Reportern oder Gruppen, die derartige Reporter tragen, verwendet werden, die den Platz von einigen oder allen der Chelatbildner-Gruppen einnehmen.
Organische chromophore oder fluorophore Reporter
Bevorzugte organische chromophore und fluorophore Reporter umfassen Gruppen mit einem ausgedehnten delokalisierten Elektronensystem, z.B. Cyanine, Merocyanine, Phthalocyanine, Naphthalocyanine, Triphenylmethine, Porphyrine, Pyrilium-Farbstoffe, Thiapyrilium-Farbstoffe, Squarylium-Farbstoffe, Croconium-Farbstoffe, Azulenium-Farbstoffe, Indoaniline, Benzophenoxazinium-Farbstoffe, Benzothiaphenothiazinium-Farbstoffe, Anthrachinone, Naphthochinone, Indathrene, Phthaloylacridone, Trisphenochinone, Azo-Farbstoffe, intramolekulare und intermolekulare Charge-Transfer-Farbstoffe und Farbstoffkomplexe, Tropone, Tetrazine, Bis(dithiolen)-Komplexe, Bis(benzol-dithiolat)-Komplexe, Iodanilin-Farbstoffe, Bis(S,O-dithiolen)-Komplexe, etc. Beispiele geeigneter organischer oder metallierter organischer Chromophore können gefunden werden in „Topics in Applied Chemistry: Infrared absorbing dyes" Ed. M. Matsuoka, Plenum, NY 1990, „Topics in Applied Chemistry: The Chemistry and Application of Dyes", Waring et al., Plenum, NY, 1990, „Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals" Haugland, Molecular Probes Inc, 1996, DE-A-4445065, DE-A-4326466, JP-A-3/228046, Narayanan et al. J. Org. Chem. 60: 2391–2395 (1995), Lipowska et al. Heterocyclic Comm. 1: 427–430 (1995), Fabian et al. Chem. Rev. 92: 1197 (1992), WO 96/23525, Strekowska et al. J. Org. Chem. 57: 4578–4580 (1992), WO (Axis) und WO 96/17628. Besondere Beispiele von Chromophoren, die verwendet werden können, umfassen Xylol-Cyanol, Fluorescein, Dansyl, NBD, Indocyanin-Grün, DODCI, DTDCI, DOTCI und DDTCI.
Besonders bevorzugt sind Gruppen, die Absorptionsmaxima zwischen 600 und 1000 nm besitzen, um Interferenz mit einer Hämoglobin-Absorption zu vermeiden (z.B. Xylol-Cyanol).
Weitere derartige Beispiele umfassen:
Cyanin-Farbstoffe: wie Heptamethincyanin-Farbstoffe, z.B. Verbindungen 4a bis 4g Tabelle II auf Seite 26 von Matsuoka (supra)
und in Tabelle III auf Seite 28 von Matsuoka (supra), d.h.
Chalcogenopyrylomethin-Farbstoffe, z.B. Verbindungen 12 auf Seite 31 von Matsuoka (supra), d.h.
wobei Y = Te, Se, O oder NR;
Monochalcogenopyrylomethin-Farbstoffe, z.B. Verbindungen 13 auf Seite 31 von Matsuoka (supra), d.h.
wobei n = 1 oder 2;
Pyrilium-Farbstoffe, z.B. Verbindungen 14 (X = O) auf Seite 32 von Matsuoka (supra), d.h.
wobei X = O, S oder Se;
Thiapyrilium-Farbstoffe, z.B. Verbindungen 15 auf Seite 32 und Verbindung 1 auf Seite 167 von Matsuoka (supra), d.h.
wobei n = 1 oder 2;
Squarylium-Farbstoffe, z.B. Verbindung 10 und Tabelle IV auf Seite 30 von Matsuoka (supra), d.h.
wobei X = CH=CH, Y = Hund R = Et,
X = S, Y = H und R = Et, und
X = CMe₂, Y = H und R = Me,
und Verbindung 6, Seite 26 von Matsuoka (supra), d.h.
wobei X = CH=CH, Y = H und R = Et;
Croconium-Farbstoffe, z.B. Verbindung 9 und Tabelle IV auf Seite 30 von Matsuoka (supra), d.h.
wobei X = CH=CH, Y = H und R = Et,
X = S, Y = H und R = Et,
X = CMe₂, Y = H und R = Me,
und Verbindung 7, Seite 26 von Matsuoka (supra), d.h.
wobei X = CH=CH, Y = H und R = Et,
Azulenium-Farbstoffe, z.B. Verbindung 8 auf Seite 27 von Matsuoka (supra), d.h.
Merocyanin-Farbstoffe, z.B. Verbindung 16, R = Me, auf Seite 32 von Matsuoka (supra), d.h.
Indoanilin-Farbstoffe, wie Kupfer- und Nickel-Komplexe von Indoanilin-Farbstoffen, z.B. Verbindung 6 auf Seite 63 von Matsuoka (supra), d.h.
wobei R = Et, R' = Me, M = Cu,
R = Et, R' = Me, M = Ni,
R = Me, R' = H, M = Cu, oder
R = Me, R' = H, M = Ni,
Benzo[a]phenoxazinium-Farbstoffe und Benzo[a]phenothiazinium-Farbstoffe, z.B. wie gezeigt auf Seite 201 von Matsuoka (supra), d.h.
wobei X = O oder S;
1,4-Diaminoanthrachinon(N-alkyl)-3'-thioxo-2,3-dicarboximide, z.B. Verbindung 20, auf Seite 41 von Matsuoka (supra)
Indanthren-Pigmente, z.B.
siehe Verbindung 21 auf Seite 41 von Matsuoka (supra);
2-Arylamino-3,4-phthaloylacridon-Farbstoffe, z.B. Verbindung 22 auf Seite 41 von Matsuoka (supra)
Trisphenochinon-Farbstoffe, z.B. Verbindung 23 auf Seite 41 von Matsuoka (supra)
Azo-Farbstoffe, z.B. der Monoazo-Farbstoff, Verbindung 2 auf Seite 90 von Matsuoka (supra), d.h.
wobei X = CH=C(CN)₂, R₁ = R₂ = Et, R₃ = R₄ = H,
X = C(CN)=C(CN)₂, R₁ = R₂ = Et, R₃ = R₄ = H, oder
X =
und Y = C=O, R₁ = R₂ = Et, R₃ = R₄ = H,
oder Y = SO₂, R₁ = H, R₂ = CH(Me)nBu, R₃ = OMe und R₄ = NHAc;
Azo-Farbstoffe, z.B. der Polyazo-Farbstoff, Verbindung 5 auf Seite 91 von Matsuoka (supra), d.h.
intramolekulare Charge-Transfer-Donor-Akzeptor-Infrarot-Farbstoffe, z.B. die Verbindungen 6 und 7 auf Seite 91 von Matsuoka (supra), d.h.
nicht-benzoide aromatische Farbstoffe, z.B. Verbindung 8, ein Tropon, auf Seite 92 von Matsuoka (supra), d.h.
Tetrazin-Radikal-Farbstoffe, z.B. Verbindung 9 auf Seite 92 von Matsuoka (supra), d.h.
in der X = p-Phenylen oder
X = p-Terphenylen, wie auch Verbindung 10 auf Seite 92 von Matsuoka (supra), d.h.
in der X = p-Biphenyl,
Kationische Salze von Tetrazin-Radikal-Farbstoffen, z.B. Verbindung 11 auf Seite 92 von Matsuoka (supra)
in der X = p-Phenylenel;
Intermolekulare Donor-Akzeptor-Charge-Transfer-Farbstoffe, z.B. CT-Komplexe der Verbindungen 13b und 14a bis 14c auf Seite 93 von Matsuoka (supra), d.h.
wobei X = CH=N-N(Ph)₂ im Donor und

a) Y = CN, Z = NO₂
b) Y = CN, Z = H oder
a) Y = Cl, Z = NO₂ in dem Akzeptor;

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Repräsentative Beispiele sichtbarer Farbstoffe umfassen Fluoresceinderivate, Rhodaminderivate, Coumarine, Azo-Farbstoffe, metallierbare Farbstoffe, Anthrachinon-Farbstoffe, Benzodifuranon-Farbstoffe, polycyclische aromatische Carbonylfarbstoffe, indigoide Farbstoffe, Polymethin-Farbstoffe, Azacarbocyanin-Farbstoffe, Hemicyanin-Farbstoffe, Barbituate, Diazahemicyanin-Farbstoffe, Styryl-Farbstoffe, Diarylcarbonium-Farbstoffe, Triarylcarbonium-Farbstoffe, Phthalocyanin-Farbstoffe, Chinophthalon-Farbstoffe, Triphenodioxazin-Farbstoffe, Formazan-Farbstoffe, Phenothiazin-Farbstoffe, wie Methylenblau, Azur A, Azur B und Azur C, Oxazin-Farbstoffe, Thiazin-Farbstoffe, Naphtholactam-Farbstoffe, Diazahemicyanin-Farbstoffe, Azopyridon-Farbstoffe, Azobenzol-Farbstoffe, Beizenfarbstoffe, saure Farbstoffe, basische Farbstoffe, metallierte und vormetallierte Farbstoffe, Xanthen-Farbstoffe, direkte Farbstoffe, Leuco-Farbstoffe, die oxidiert werden können, um Farbstoffe mit Farbtönen zu erzeugen, die bathochrom von jenen der Precursor-Leuko-Farbstoffe verschoben sind, und andere Farbstoffe, wie jene, die aufgelistet sind von Waring, D. R. und Hallas, G., in „The Chemisty and Application of Dyes", Topics in Applied Chemistry, Plenum Press, New York, N.Y., 1990. Zusätzliche Farbstoffe können gefunden werden, aufgelistet in Haugland, R. P., „Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals", 6. Auflage, Molecular Probes, Inc., Eugenen OR, 1996.
Derartige Chromophore und Fluorophore können kovalent entweder direkt an den Vektor oder innerhalb einer Linkerstruktur gebunden werden. Noch einmal können Linker des oben beschriebenen Typs zusammen mit den Metall-Reportern für organische Chromophore oder Fluorophore mit den Chromophoren/Fluorophoren verwendet werden, die den Platz von einigen oder allen chelatbildenden Gruppen einnehmen.
Wie mit den Metall-Chelatbildnern, die oben diskutiert sind, können Chromophore/Fluorophore in oder auf teilchenförmigen Linker-Einheiten getragen werden, z.B. in oder auf einem Vesikel, oder kovalent gebunden an inerte Matrixteilchen, die auch als ein lichtstreuender Reporter fungieren können.
Teilchenförmige Reporter oder Linker-Reporter
Die teilchenförmigen Reporter und Linker-Reporter fallen allgemein in zwei Kategorien -jene, bei denen das Teilchen eine Matrix oder Schale umfasst, die den Reporter trägt oder enthält, und jene, bei denen die Teilchenmatrix selbst der Reporter ist. Beispiele der ersten Kategorie sind: Vesikel (z.B. Mizellen, Liposome, Mikroballons und Mikrobläschen), die eine Flüssigkeit, ein Gas oder eine feste Phase enthalten, die den Kontrast-wirksamen Reporter enthalten, z.B. ein echogenes Gas oder einen Precursor dafür (siehe z.B. GB 9700699.3 ), ein chelatiertes paramagnetisches Metall oder Radionuklid oder ein wasserlösliches iodiertes Röntgenstrahlungs-Kontrastmittel; poröse Teilchen, die mit dem Reporter beladen sind, z.B. mit einem paramagnetischen Metall beladene Molekularsiebteilchen; und feste Teilchen, z.B. eines inerten biotolerablen Polymers, auf dem der Reporter gebunden oder geschichtet ist, z.B. Farbstoff-beladene Polymerteilchen.
Beispiele der zweiten Kategorie sind: lichtstreuende organische oder anorganische Teilchen, magnetische Teilchen (d.h. superparamagnetische, ferromagnetische oder ferrimagnetische Teilchen); und Farbstoffteilchen.
Bevorzugte teilchenförmige Reporter oder Reporter-Linker umfassen superparamagnetische Teilchen (siehe US-A-4770183, WO 97/25073, WO 96/09840, etc.), echogene Vesikel (siehe WO 92/17212, WO 97/29783, etc.), Iod-enthaltende Vesikel (siehe WO 95/26205 und GB 9624918.0 ) und mit Farbstoff beladene Polymerteilchen (siehe WO 96/23524).
Die teilchenförmigen Reporter können einen oder mehrere Vektoren aufweisen, die direkt oder indirekt an ihre Oberflächen gebunden sind. Im allgemeinen wird es bevorzugt sein, eine Mehrzahl (z.B. 2 bis 50) von Vektoreinheiten pro Teilchen zu binden. Besonders günstig wird man, neben dem erwünschten Targeting-Vektor, auch den Fluss verlangsamende Vektoren an die Teilchen binden, d.h. Vektoren, die eine Affinität für das Kapillar-Lumen oder andere Organoberflächen besitzen, die ausreichend ist, um die Passage des Kontrastmittels durch die Kapillaren des Zielorgans zu verlangsamen, aber an sich nicht ausreichend ist, um das Kontrastmittel zu immobilisieren. Derartige den Fluss verlangsamende Vektoren (beschrieben z.B. in GB 9700699.3 ) können außerdem zum Verankern des Kontrastmittels dienen, sobald es an seine Zielstelle gebunden worden ist.
Das Mittel, durch das die Vektor-an-Teilchen-Bindung erreicht wird, wird von der Natur der Teilchenoberfläche abhängen. Für anorganische Teilchen kann die Bindung an das Teilchen z.B. mittels einer Wechselwirkung zwischen einer Metallbindenden Gruppe (z.B. einer Phosphat-, Phosphonat- oder Oligo- oder Polyphosphat-Gruppe) auf dem Vektor oder auf einem Linker, der an den Vektor gebunden ist, erfolgen. Für organische (z.B. polymere) Teilchen kann die Vektor-Bindung erfolgen mittels einer direkten kovalenten Bindung zwischen Gruppen auf der Teilchenoberfläche und reaktiven Gruppen im Vektor, z.B. Amid- oder Esterbindung, oder durch kovalente Bindung des Vektors und des Teilchens an einen Linker. Linker des oben diskutierten Typs in Zusammenhang mit chelatierten Metallreportern können verwendet werden, obwohl im allgemeinen die Linker nicht zum Zusammenkoppeln von Teilchen verwendet werden.
Für Nicht-Feststoff-Teilchen, z.B. Tropfen (z.B. von wasserunlöslichen iodierten Flüssigkeiten, wie beschrieben in US-A-5318767, US-A-5451393, US-A-5352459 und US-A-5569448) und Vesikel kann der Linker günstigerweise hydrophobe „Anker"-Gruppen enthalten, z.B. gesättigte oder ungesättigte C_12-30-Ketten, die die Teilchenoberfläche durchdringen und den Vektor an das Teilchen binden. So kann für Phosphorlipid-Vesikel der Linker zum kovalenten Binden des Vektors an ein Phospholipid dienen, das mit der Vesikelmembran kompatibel ist. Beispiele der Linker-Bindung an Vesikel und anorganische Teilchen sind beschrieben in GB 9622368.0 und WO 97/25073.
Außer den Vektoren können andere Gruppen an die Teilchenoberfläche gebunden sein, z.B. Stabilisatoren (um die Aggregation zu verhindern) und Biodistributions-Modifizierer wie PEG. Derartige Gruppen werden z.B. diskutiert in WO 97/25073, WO 96/09840, EP-A-284549 und US-A-4904479.
Vorzugsweise werden die V-L-R-Mittel der Erfindung nicht-peptidische Vektoren aufweisen (wie losartan), die direkt oder indirekt an einen Reporter gekoppelt sind, z.B. mit kovalent gebundenen Iod-Radioisotopen, mit Metallchelaten, die direkt oder über eine organische Linkergruppe gebunden oder an einen teilchenförmigen Reporter oder Linker-Reporter gekoppelt sind, z.B. superparamagnetische Kristalle (ggf. beschichtet, z.B. wie in WO 97/25073) oder ein Vesikel, z.B. eine Gas enthaltende oder eine/ein/einen iodiertes Kontrastmittel enthaltende Mizelle, Liposom oder Mikroballon.
Die Mittel der Erfindung können an Patienten zur Bildgebung in Mengen verabreicht werden, die ausreichend sind, um den erwünschten Kontrast mit der besonderen Bildgebungstechnik zu ergeben. Wo der Reporter ein Metall ist, sind im allgemeinen Dosierungen von 0,001 bis 5,0 mmol eines chelatierten Bildgebungs-Metallions pro Kilogramm eines Patienten-Körpergewichts wirksam, um angemessene Kontrast-Verstärkungen zu erreichen. Für die meisten MRI-Anwendungen werden die bevorzugten Dosierungen von Bildgebungs-Metallion im Bereich von 0,02 bis 1,2 mmol/kg Körpergewicht liegen, während für Röntgenstrahlungs-Anwendungen Dosierungen von 0,05 bis 2,0 mmol/kg im allgemeinen wirksam sind, um Röntgenstrahlungs-Abschwächung zu erreichen. Bevorzugte Dosierungen für die meisten Röntgenstrahlungs-Anwendungen betragen von 0,1 bis 1,2 mmol der Lanthaniden- oder Schwermetall-Verbindung pro kg Körpergewicht. Wo der Reporter ein Radionuklid ist, werden Dosierungen von 0,01 bis 100 mCi, bevorzugt 0,1 bis 50 mCi normalerweise pro 70 kg Körpergewicht ausreichend sein. Wo der Reporter ein superparamagnetisches Teilchen ist, wird die Dosierung normalerweise 0,5 bis 30 mg Fe/kg Körpergewicht betragen. Wo der Reporter ein Gas oder ein Gas-Erzeuger ist, z.B. in einem Mikroballon, wird die Dosierung normalerweise 0,05 bis 100 μl Gas pro 70 kg Körpergewicht betragen.
Die Dosierung der Verbindungen der Erfindung für eine therapeutische Verwendung wird von dem behandelten Zustand abhängen, aber im allgemeinen wird sie in der Größenordnung von 1 pmol/kg bis 1 mmol/kg Körpergewicht liegen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können mit herkömmlichen pharmazeutischen oder veterinärmedizinischen Hilfsmitteln formuliert werden, z.B. Emulgatoren, Fettsäureestern, Geliermitteln, Stabilisatoren, Antioxidantien, die Osmolalität einstellenden Mitteln, Puffern, den pH einstellenden Mitteln, etc. und können in einer Form vorliegen, die für die parenterale oder enterale Verabreichung geeignet sind, wie z.B. Injektion oder Infusion, oder die Verabreichung direkt in eine Körperhöhle mit einem äußeren Ausgangsduktus, z.B. dem gastrointestinalen Trakt, der Blase oder dem Uterus. So können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in herkömmlichen pharmazeutischen Verabreichungsformen vorliegen, wie Tabletten, Kapseln, Pulvern, Lösungen, Suspensionen, Dispersionen, Sirupen, Suppositorien etc.
Jedoch werden Lösungen, Suspensionen und Dispersionen in physiologisch annehmbaren Trägermedien, z.B. Wasser für Injektionen, im allgemeinen bevorzugt sein.
Die Verbindungen gemäß der Erfindung können deshalb für die Verabreichung formuliert werden unter Verwenden physiologisch annehmbarer Träger oder Hilfsmittel in einer Weise, die vollständig innerhalb des Fachwissens liegt. Zum Beispiel können die Verbindungen, ggf. mit der Zugabe von pharmazeutisch annehmbaren Hilfsmitteln, in einem wässrigen Medium suspendiert oder aufgelöst werden, wobei die resultierende Lösung oder Suspension dann sterilisiert wird.
Für die Bildgebung einiger Teile des Körpers ist der am meisten bevorzugte Modus der Verabreichung von Kontrastmitteln parenteral, z.B. intravenöse Verabreichung. Parenteral verabreichbare Formen, z.B. intravenöse Lösungen, sollten steril und frei von physiologisch nicht annehmbaren Mitteln sein und sollten eine geringe Osmolalität besitzen, um eine Irritation oder andere nachteilige Effekte bei der Verabreichung zu minimieren, und so sollte das Kontrastmittel bevorzugt isotonisch oder leicht hypertonisch sein. Geeignete Vehikel umfassen wässrige Vehikel, die üblicherweise für das Verabreichen von parenteralen Lösungen verwendet werden, wie Natriumchloridinjektion, Ringer's Injektion, Dextroseinjektion, Dextrose- und Natriumchloridinjektion, Lactated Ringer's Injection und andere Lösungen, wie sie in Remington's Pharmaceutical Sciences, 15. Ausgabe, Easton: Mack Publishing Co., Seiten 1405–1412 und 1461–1487 (1975) und The National Formulary XIV, 14. Ausgabe Washington: American Pharmaceutical Association (1975) beschrieben sind. Die Lösungen können Konservierungsmittel, antimikrobielle Mittel, Puffer und Antioxidantien, die herkömmlicherweise für parenterale Lösungen verwendet werden, Hilfsstoffe und andere Additive enthalten, die mit den Chelaten kompatibel sind, und die nicht mit der Herstellung, der Lagerung oder der Verwendung der Produkte interferieren werden.
Die Mittel der Formel I können bei der Behandlung von Krankheitszuständen therapeutisch wirksam sein, wie auch bei einer in vivo-Bildgebung detektierbar sein. So kann z.B. der Vektor auf den Reportereinheiten eine therapeutische Wirksamkeit besitzen, z.B. aufgrund des radiotherapeutischen Effektes eines Radionuklidrepor ters, der Wirksamkeit in der fotodynamischen Therapie eines Chromophor- (oder Fluorophor-)-Reporters oder des chemotherapeutischen Effekts der Vektoreinheit.
Die Verwendung der Mittel der Formel I bei der Herstellung von therapeutischen Zusammensetzungen und in Verfahren der therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung des menschlichen oder nicht-menschlichen tierischen Körpers wird somit als weiterer Aspekt der Erfindung betrachtet.
In einer Ausführungsform umfasst das Kontrastmittel der Erfindung günstigerweise ein Gas-enthaltendes oder Gas-erzeugendes Material, bevorzugt in Suspension in einem wässrigen Trägermaterial und konjugiert an einen oder mehrere Vektoren, von denen mindestens ein Vektor V wie oben definiert ist, z.B. ein AII-Rezeptor-Antagonist wie CV11974 oder TCV-116. Das Gas kann die Form von Mikrobläschen annehmen, die durch eine Monolage eines Film-bildenden oberflächenaktiven Mittels stabilisiert sind, oder durch ein Matrixmaterial stabilisiert sind, das ein anderes ist, als ein oberflächenaktives Mittel. Die Vektoren können z.B. an ein derartiges oberflächenaktives Mittel oder eine Matrix gekoppelt sein und können bioaktiv oder nicht-bioaktiv sein. Die Vektoren können verschiedene Targeting-Spezifitäten besitzen und in einer bevorzugten Ausführungsform sind sie so, dass sie mit ihren Rezeptoren wechselwirken, aber nicht die Gas-enthaltenden Vesikel fest binden.
Die vorliegende Erfindung wird nun weiter mittels der folgenden, nicht beschränkenden Beispiele veranschaulicht. Wenn nicht anders angezeigt, sind alle angegebenen Prozentsätze Gewichtsprozent.
BEISPIEL 1
Angiotensin-Rezeptor-bindendes Kontrastmittel für MR-Bildgebung
Verbindung 1
Diethylentriaminpentaessigsäuredianhydrid (53,8 g, 137 mmol) wird in trockenem DMF (N,N-Dimethylformamid) aufgelöst und 4'-[3-(3-Aminopropyl)-5-butyl-1H-1,2,4-triazol-1-yl)methyl][1,1'-biphenyl]-2-carbonsäure (hergestellt gemäß WO 91/17148, 5 g, 13,7 mmol) aufgelöst in trockenem DMF wird zugegeben. Die Reaktionsmischung wird bei erhöhter Temperatur unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Der Reaktion folgt TLC. Das Lösungsmittel wird rotationsverdampft und die Substanz durch Chromatographie gereinigt.
Gd(III)-Chelat der Verbindung 1
Zu einer Lösung der Verbindung 1 (2 g, 2,7 mmol) in Wasser wird Gadoliniumoxid Gd₂O₃ (0,5 g, 1,4 mmol) zugegeben und die Mischung wird bei 95°C erwärmt. Nach der Filtration wird die Lösung verdampft und in vacuo bei 50°C getrocknet.
BEISPIEL 2
Angiotensin-Rezeptor-bindendes Kontrastmittel für Nuklearmedizin
Tc99m-Chelat der Verbindung 1
Verbindung 1 von Beispiel 1 (1 mg) wird aufgelöst in 0,1 N NaOH, SnCl₂2H₂O (100 μg), aufgelöst in 0,05 N HCl, und eine Lösung von 10–100 mCi Tc99m in der Form von Natriumpertechnetat in Salzlösung wird zugegeben. Der pH der Lösung wird auf pH 7–8 durch Zugabe von 0,5 M Phosphatpuffer (pH 5) nach weniger als einer Minute eingestellt. Der Reaktion folgt TLC und die Substanz wird durch Chromatographie gereinigt.
BEISPIEL 3
Angiotensin-Rezeptor-bindendes Kontrastmittel für Nuklearmedizin
Eine wässrige Lösung von ¹³¹I₂ (2 Äquivalente) und Natriumperchlorat (1 Äquivalent) wird zu einer wässrigen Lösung von 4'-[3,5-Dibutyl-1H-1,2,4-triazol-1-yl)methyl][1,1'-biphenyl]-2-carbonsäure (hergestellt gemäß WO 91/17148, (1 Äquivalent)) zugegeben. Das Lösungsmittel wird rotationsverdampft und die Substanz durch Chromatographie gereinigt.
BEISPIEL 4
Angiotensin-Rezeptor-bindendes Kontrastmittel für Ultraschall- und Lichtstreuungs-Bildgebung
Verbindung 2
Bernsteinsäureanhydrid (2,7 g, 27,4 mmol) wird in trockenem DMF aufgelöst und 4'-(3-(3-Aminopropyl)-5-butyl-1H-1,2,4-trizol-1-yl)methyl][1,1'-biphenyl]-2-carbonsäure (hergestellt gemäß WO 91/17148, 5 g, 13,7 mmol), aufgelöst in trockenem DMF, wird zugegeben. Die Reaktionsmischung wird bei erhöhter Temperatur unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Der Reaktion folgt TLC. Das Lösungsmittel wird rotationsverdampft und die Substanz durch Chromatographie gereinigt.
Verbindung 3
DSPE (Distearoylphosphatidylethanolamin) (0,5 g, 0,7 mmol) wird zu einer Lösung der Verbindung 2 (0,3 g, 0,7 mmol) und DCC (N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid) in trockenem DMF gegeben. Die Reaktionsmischung wird bei Umgebungstemperatur gerührt und der Reaktion folgt TLC. Die Dispersion wird über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Die Dispersion wird filtriert und das Lösungsmittel rotationsverdampft, bevor die Substanz durch Chromatographie gereinigt wird.
Gas-enthaltende Mikroteilchen, die Phosphatidylserin und die Verbindung 3 enthalten
Zu Phosphatidylserin (5 mg) wird 5% Propylenglycol-Glycerol in Wasser (1 ml) gegeben. Die Dispersion wird auf nicht mehr als 90°C für fünf Minuten erwärmt und dann auf Umgebungstemperatur gekühlt. Die Dispersion (0,8 ml) wird in ein Glasfläschchen (1 ml) übertragen und die Verbindung 3 (0,1–1,0 mb) wird zugegeben. Das Glasfläschchen wird auf einem Rollertisch für einige Stunden angeordnet. Der Kopfraum des Glasfläschchens wird mit Perfluorbutan gespült. Das Glasfläschchen wird in einem Kappen-Mischer für 45 Sekunden geschüttelt, wonach die Probe auf einem Rollertisch angeordnet wird. Nach Zentrifugation wird die untere Fraktion mit Wasser ausgetauscht. Die Waschprozedur wird zwei- bis dreimal wiederholt.
BEISPIEL 5
Tc-markiertes Angiotensin-Rezeptor-bindendes Kontrastmittel für Scintigraphie: Tc-Chelat von 2-(4-N-(MAG-3)-Aminophenyl)-1-benzyl-4-chlorimidazol-5-essigsäurehydrochlorid
2-Amino-3,3-dichlorpropenonitril (Verbindung)
Eine Lösung von Dichloracetonitril (55,0 g, 0,5 mol) und Azetoncyanhydrin (46,8 g, 0,55 mol) in Acetonitril (200 ml) und Diethylether (50 ml) wurde auf 0°C gekühlt. Kaliumcyanid (10,65 g, 10,0 mmol) wurde zugegeben und die Mischung wurde unter Stickstoffatmosphäre für 19 Stunden bei 0°C gerührt. Die Lösung wurde verdampft, der braune Rückstand wurde in Diethylether (125 ml) aufgelöst, mit Aktivkohle behandelt, filtriert und verdampft. Der Rückstand wurde mit Diethylether (30 ml) und Hexanen (30 ml) gemischt. Die Titelverbindung, Verbindung 4, wurde durch Filtration isoliert.
Ausbeute 21,2 g (leichtgelbe Kristalle)
Das Filtrat wurde verdampft, der Rückstand wurde mit Ether/Hexanen (1:1, 20 ml) gewaschen. Mehr der Titelverbindung wurde durch Filtration isoliert.
Gesamtausbeute: 34,5 g (50%) Smp. 56–58°C.
NMR bestätigte die Struktur der Titelverbindung (~10% von Cyanhydrin-Ausgangsmaterial als Verunreinigung).
2-(4-Nitrobenzyliden)amino-3,3-dichlorpropenonitril (Verbindung 5)
Eine Lösung von 2-Amino-3,3-dichlorpropenonitril (15,0 g, 0,11 mol) und 4-Nitrobenzaldehyd (15,1 g, 0,1 mmol) in Toluol (200 ml) wurde 23 Stunden unter Rückfluss erwärmt. Die Mischung wurde verdampft, Methanol (100 ml) wurde zugegeben und man ließ die Mischung über Nacht stehen. Nach der Filtration wurde die Titelverbindung als braun-gelber Feststoff isoliert.
Ausbeute 15,0 g, Smp. 171–174°C
Rf = 0,9 (Silica, Ethylacetat: Hexan = 1:2)
Verdampfen der Stammlauge ergab 13,7 g braunen Rückstand. Methanol (25 ml) wurde zugegeben und man ließ die Mischung zwei Tage lang stehen. Eine Filtration hinterließ 6,6 g dunkelbraunes Material (Titelverbindung – Verbindung 5).
Gesamtausbeute: 21,6 g (80%)
NMR bestätigte die Struktur der Titelverbindung.
4-Chlor-5-formyl-2-(4-nitrophenyl)imidazol (Verbindung 6)
HCl-Gas ließ man durch eine Lösung von 2-(4-Nitrobenzyliden)amino-3,3-dichlorpropenonitril (40,0 g, 0,148 mol) in Dioxan (500 ml) bei Raumtemperatur in Blasen durchperlen. Die Mischung wurde 23 Stunden lang bei 50°C gerührt. HCl-Gas ließ man in Blasen durchperlen, gefolgt von Rühren für 24 Stunden bei 50°C. Die Mischung wurde acht weitere Tage bei 50°C mit Zugabe von HCl-Gas alle 24 Stunden gerührt, gefolgt von Rühren bei 50°C für vier weitere Tage. Mehr HCl-Gas wurde zugegeben und drei weitere Tage bei 50°C gerührt. Die Lösung wurde auf 0°C gekühlt und filtriert. Der Rückstand wurde mit Ethanol (96%, 200 ml) gemischt und die Titelverbindung (Verbindung 6) wurde durch Filtration isoliert. Ausbeute: 23,1 g (62%). NMR bestätigte die Struktur der Titelverbindung.
1-Benzyl-4-chlor-5-formyl-2-(4-nitrophenyl)-imidazol (Verbindung 7)
Eine Mischung von 4-chlor-5-formyl-2-(4-nitrophenyl)-imidazol (19,7 g, 78,3 mmol), Benzylbromid (14,5 g, 85,0 mmol) und Kaliumcarbonat (11,7 g, 85,0 mmol) in DMF (150 ml) wurde 1,5 Stunden lang auf 110°C erwärmt. Die Mischung wurde verdampft und der Rückstand in kaltes Wasser gegossen und man ließ ihn über Nacht im Kühlschrank stehen. Der teerartige Rückstand wurde pulverisiert und filtriert. Die Ausbeute der rohen Titelverbindung: 33,4 g. Das Produkt wurde aus Ethanol (96%, 350 ml) umkristallisiert. Ausbeute: 14,0 g. NMR bestätigte die Struktur der Titelverbindung, Verbindung 7.
1-Benzyl-4-chlor-5-(hydroxymethyl)-2-(4-nitrophenyl)-imidazol (Verbindung 8)
Natriumborhydrid (1,1 g, 29 mmol) wurde in drei Portionen zu einer gerührten Mischung von rohem 1-Benzyl-4-chlor-5-formyl-2-(4-nitrophenyl)imidazol (54,2 g, 88 mmol) in Methanol (250 ml) bei Raumtemperatur gegeben. Nach zwei Stunden wurde mehr Natriumborhydrid (0,51 g, 15 mmol) zugegeben und die Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt und das Methanol wurde verdampft. Der Rückstand wurde mit Wasser (250 ml) gemischt und mit Methylenchlorid (200 ml, 3 × 50 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Lösungen wurden mit Wasser (2 × 50 ml) gewaschen und über Nacht getrocknet (NaSO₄).
Die Mischung wurde filtriert und verdampft, was einen Rückstand von 20,9 g hinterließ. Die Titelverbindung, Verbindung 8, wurde durch Flash-Chromatographie (150 × 65 mm Silicagel 60 Säule, eluiert mit Ethylacetat/Hexanen (1:1)) gereinigt. Die Fraktionen, die die Titelverbindung enthielten, wurden verdampft.
Ausbeute: 12,75 g (42%).
Rf = 0,4 (Silica, Ethylacetat/Hexane (1:1)).
1-Benzyl-4-chlor-5-(chlormethyl)-2(4-nitrophenyl)-imidazol (Verbindung 9)
Thionylchlorid (0,9 ml, 1,48 g, 12,4 mmol) wurde tropfenweise zu einer gerührten Suspension von 1-Benzyl-4-chlor-5-(hydroxymethyl)-2(4-nitrophenyl)imidazol (18,5 g, 5,4 mmol) in Chloroform (15 ml) bei Raumtemperatur zugegeben. Die braune Lösung wurde 2,5 Stunden lang gerührt und dann zum Trockenen verdampft. Toluol (12 ml) wurde zu dem Rückstand gegeben und zum Trockenen verdampft. Der Rückstand wurde in Chloroform (20 ml) aufgelöst und im nächsten Schritt zum Einführen der funktionellen Cyano-Gruppe verwendet.
1-Benzyl-4-chlor-2(4-nitrophenyl)-5-imidazolylacetonitril (Verbindung 10)
Eine Lösung von Natriumcyanid (1,60 g, 32,7 mmol) und Tetrabutylammoniumbromid (0,2 g) in Eiswasser (10 ml) wurde tropfenweise zu einer kräftig gerührten Lösung von 1-Benzyl-4-chlor-5-(chlormethyl)2-(4-nitrophenyl)-imidazol (5,4 mmol) in Chloroform bei 0°C gegeben. Die Mischung wurde bei 0°C zwei Stunden lang gerührt und man ließ sie dann auf Raumtemperatur erwärmen, sie wurde mit Wasser verdünnt (10 ml), die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen (10 ml). Die kombinierten wässrigen Schichten wurden mit Chloroform (2 × 2 ml) extrahiert. Die kombinierten or ganischen Lösungen wurden getrocknet (NaSO₄), filtriert und verdampft, was 4,3 g ergab. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt (170 × 25 mm, Silicagel 60 Säule, eluiert mit Ethylacetat/Hexanen 1:1). Ausbeute: 2,1 g.
Rf = 0,7 (Silica, Ethylacetat/Hexane 1:1)
NMR bestätigte die Struktur der Titelverbindung, Verbindung 10.
1-Benzyl-2-(4-nitrophenyl)-5-imidazol-essigsäure (Verbindung 11)
Eine gerührte Mischung von 1-Benzyl-4-chlor-2-(4-nitrophenyl)-5-imidazolylacetonitril (2,0 g, 5,4 mmol) in 6 M HCl (20 ml) wurde vier Stunden lang unter Rückfluss erwärmt. Die Mischung wurde mit Wasser verdünnt (100 ml). Ein gelbes Öl fiel aus, das sich bei Kühlen auf Raumtemperatur verfestigte. Eine Filtration ergab 2,2 g festes Material, das aus 96% Ethanol (15 ml) und Wasser (10 ml) umkristallisiert wurde.
Eine Filtration ergab 2,24 g feuchten Rückstand. NMR bestätigte die Struktur der Titelverbindung, Verbindung 11. Das Produkt wurde im nächsten Schritt verwendet.
2-(4-Aminophenyl)-1-benzyl-4-chlor-imidazol-5-essigsäurehydrochlorid (Verbindung 12)
Eine Mischung aus 1-Benzyl-2-(4-nitrophenyl)-5-imidazolessigsäure (2,1 g, 5,0 mmol), 10% Palladium auf Kohlenstoff (0,10 g), 12 M HCl (3,0 ml), 96% Ethanol (50 ml) und Wasser (50 ml) wurde bei 55 psi 1,5 Stunden lang auf einem Parr-Schüttler-Hydriergerät hydriert. Die Mischung wurde durch eine Celite-Schicht und dann durch ein zur Flöte gefaltetes Filterpapier filtriert. Verdampfen hinterließ die Titelverbindung, Verbindung 12, als 1,0 g orangefarbenen Feststoff.
Rf = 0,1 (Silica, Ethylacetat/Hexane 1:1)
Tc-Chelat von 2-(4-N-(MAG-3)-Aminophenyl)-1-benzyl-4-chlor-imidazol-5-essigsäurehydrochlorid (Verbindung 13)
Die Titelverbindung, Verbindung 13, wurde hergestellt, wie im oben gezeigten Schema dargelegt, gemäß der Beschreibung in Nuclear Medicine Communications 16, (1995) 942–957.
Markierungsausbeute: > 95%.
BEISPIEL 6
¹³¹I-markiertes 2-(4-Aminophenyl)-1-benzyl-4-chlorimidazol-5-essigsäurehydrochlorid
Verbindung 12 des Beispiels 5 wurde mit ¹³¹I unter Verwenden der Chloramin T-Methode wie beschrieben in Radioisotopes in Biology, A Practical Approach. (1990) und in Nature 194, (162) 495 markiert.
Markierungsausbeute: 56%
BEISPIEL 7
Tc-markiertes, Angiotensin-Rezeptor bindendes Kontrastmittel für Szintigraphie: Tc-Chelat von 2-(4-N-(MAG-3)-Aminophenyl)-1-benzyl-4-chlor-5-hydroxymethylimidazol
2-(4-Aminophenyl)-1-benzyl-4-chlor-5-(hydroxymethylimidazolhydrochlorid (Verbindung 14)
Eine Mischung von 1-Benzyl-4-chlor-5-(hydroxymethyl)-2-(4-nitrophenyl)imidazol (1,0 g, 2,8 mmol, Verbindung 8 von Beispiel 5), 10% Palladium auf Kohlenstoff (0,10 g, 12 M HCl (1,0 ml) 96% Ethanol (50 ml) und Wasser (50 ml) wurde bei 55 psi für 1,5 h auf einem Parr-Schüttler-Hydriergerät hydriert. Die Mischung wurde durch eine Celite-Schicht und dann durch ein zur Flöte gefaltetes Filterpapier filtriert. Verdampfen hinterließ 1,5 g bernsteinfarbenes Öl.
Rf = 0,2 (Silica, Ethylacetat/Hexane 1:1)
Tc-Chelat von 2-(4N-(MAG-3)-Aminophenyl)-1-benzyl-4-chlor-5-hydroxymethylimidazol (Verbindung 15)
Die Titelverbindung, Verbindung 15, wurde hergestellt wie beschrieben in Beispiel 5, Verbindung 13.
Markierungsausbeute: 89%.
BEISPIEL 8
¹³¹I-markiertes N-Benzyl-Losartan
N-Benzyl-Losartan (Verbindung 16)
Losartan (100 mg/2,22 mmol) wurde in 3 ml Acetonitril aufgelöst. Benzylbromid (38 mg) wurde zugegeben und die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde in vacuo verdampft und der Rückstand in Chloroform wieder aufgelöst, filtriert und gereinigt durch Säulen-Chromatographie. Das Produkt wurde durch MALDI-Massenspektrometrie identifiziert und ohne weitere Reinigung verwendet.
¹³¹I-markiertes N-Benzyl-Losartan (Verbindung 17)
Die Verbindung wurde unter Verwenden einer Austausch-Markierungs-Technik markiert, wie beschrieben in Radioisotopes in Biology, A practical Approach. (1990) und in Nature 194, (1962) 495. Markierungsausbeute: 98%.
BEISPIEL 9
Tc-markiertes Losartan-Derivat für Szintigraphie: Tc-chelat von N-(N-MAG-3-Glycyl)-Losartan
FmocGlycyl-Losartan (Verbindung 18)
Fmoc-Gly (300 mg/1 mmol) wurde in 10 ml THF aufgelöst. DCC (110 mg, 0,55 mmol), aufgelöst in 5 ml THF, wurde zugegeben und die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt. DCC wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel in vacuo entfernt. TLC zeigte einen UV + Spot, und die Struktur wurde durch MALDI-Massenspektrometrie bestätigt.
Das rohe Produkt wurde in 10 ml THF aufgelöst und 100 mg Losartan wurde zugegeben. Das Rühren wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur fortgesetzt. TLC zeigte eine volle Umwandlung des Ausgangsmaterials. Das Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt. Das rohe Produkt wurde in Chloroform aufgelöst und durch Säulen-Chromatographie gereinigt. TLC zeigte einen UV + Spot, und die Struktur wurde durch MALDI-Massenspektrometrie bestätigt.
Glycyl-Losartan (Verbindung 19)
100 mg FmocGlycyl-Losartan (Verbindung 18) wurde in 5 ml 10%-igem Piperidin/DMF aufgelöst und 30 min lang gerührt. TLC zeigte eine volle Umwandlung des UV + -Ausgangsmaterials zu einem neuen UV + Ninhydrin + -Spot. Das Lösungsmittel wurde in vacuo verdampft. Die Struktur wurde durch MALDI-Massenspektrometrie bestätigt und das rohe Produkt wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
Tc-Chelat von N-(N-MAG-3-Glycyl)-Losartan (Verbindung 20)
Die Titelverbindung, Verbindung 20, wurde hergestellt, wie beschrieben in Beispiel 5, Verbindung 13.
Markierungsausbeute: 80%
BEISPIEL 10
Mehrfach spezifische, Gas enthaltende Mikroblasen, die mit Phosphatidylserin und Biotin-PEG₃₄₀₀-alanycholesterin eingekapselt sind und mit Streptavidin/Biotinyl-Endothelin-1-Peptid (Biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.OH) und Biotinyl-Fibrin-anti-polymerisierendes Peptid (Biotin-GPRPPERHQS.NH₂) funktionalisiert sind
Dieses Beispiel ist gerichtet auf die Herstellung von gezielten Ultraschall-Mikroblasen, wobei Streptavidin als ein Linker zwischen biotinylierten Reporter(n) und Vektor(en) verwendet wird.
a) Synthese von Biotin-PEG₃₄₀₀-β-alanincholesterin
Zu einer Lösung von Cholesteryl-β-alaninhydrochlorid (15 mg, 0,03 mmol) in 3 ml Chloroform/nassem Methanol (2,6:1) wurde Triethylamin (42 ml, 0,30 mmol) gegeben. Die Mischung wurde 10 min lang bei Raumtemperatur gerührt und eine Lösung von Biotin/PEG₃₄₀₀-NHS (100 mg, 0,03 mmol) in 1,4-Dioxan (1 ml) wurde tropfenweise zugegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 3 h wurde die Mischung zum Trocknen verdampft und der Rückstand durch Flash-Chromatographie gereinigt, um weiße Kristalle zu ergeben, Ausbeute 102 mg (89%). Die Struktur wurde durch MAL-DI-MS und NMR verifiziert.
b) Synthese von biotinyliertem Endothelin-1-peptid (Biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.OH).
Das Peptid wurde auf einem automatischen ABI 433 A-Peptidsynthetisierer synthetisiert, ausgehend von Fmoc-Trp(Boc)-Wang-Harz (Novabiochem) in einem 0,1 mmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol-Aminosäure-Kartuschen. Alle Aminosäuren wurden voraktiviert, unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln. Die gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und der Seitenketten-Schutzgruppen wurde in TFA, das 5% Anisol und 5% H₂O enthielt, 2 h lang ausgeführt, was eine Rohprodukt-Ausbeute von 75 mg ergab. Die Reinigung durch präparative HPLC (Vydac 218TP1022-Säule) einer aliquoten Menge von 20 mg rohen Materials wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 30 bis 80% B über 40 min (A = 0,1 TFA/Wasser und B = 0,1% TFA(Acetonitril) und einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/min. Nach der Lyophilisierung der reinen Fraktionen wurde 2 mg reines Material erhalten (analytische HPLC; Gradient, 30–80% B, wobei B = 0,1% TFA/Acetonitril, A = 0.01% TFA/Wasser: Säule – Vydac 218TP54; Detektion – UV 214 nm – Produkt-Retentionszeit = 12,6 min).
Eine weitere Produkt-Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie; erwartet M + H bei 1077, gefunden 1077.
c) Synthese von Biotinyl-Fibrin-anti-polymerisierendes Peptid (Biotin-GPRPPERHOS.NH₂)
Dieses Peptid wurde synthetisiert und gereinigt unter Verwenden von Protokollen, die jenen ähnlich sind, die oben in Abschnitt b) beschrieben sind. Das reine Produkt wurde durch HPLC und MALDI-MS charakterisiert.
d) Herstellung von mehrfach-spezifischen, Gas-gefüllten Mikroblasen, die mit Phosphatidylserin und Biotin-PEG₃₄₀₀-β-Alanin-Cholesterin eingekapselt sind
DSPS (Avanti, 4,5 mg) und Biotin-PEG₃₄₀₀-β-Alanin-Cholesterin aus dem Abschnitt a) (0,5 mg) wurde in ein Glasfläschchen eingewogen und 0,8 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerol wurde zugegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 min lang erwärmt (die Glasfläschchen wurden während des Erwärmens geschüttelt).
Die Probe wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Das Glasfläschchen wurde in einem Kappenmischer für 45 sek geschüttelt und die Mikroblasen über Nacht rollend geschwenkt. Die Mikroblasen-Suspension wurde mehrere Male mit entionisiertem Wasser gewaschen und mit einem Coulter-Zähler und einer akustischen Dämpfung analysiert.
e) Konjugation mit Fluorescein-markiertem Streptavidin und biotinylierten Peptiden aus Abschnitt b) und c)
Zum Mikroblasen-Präparat von d) wurde mit Fluorescein konjugiertes Streptavidin (0,2 mg) gegeben, das in PBS (1 ml) aufgelöst war. Die Mikroblasen wurden auf einem Rollertisch 3 h lang bei Raumtemperatur angeordnet. Nach ausführlichem Waschen mit Wasser und Analyse durch Fluoreszenzmikroskopie wurden die Mikroblasen in 1 ml PBS, das Biotinyl-Endothelin-1-Peptid (0,5 mg) und Biotinyl-Fibrin-antipolymerisierendes Peptid (0,5 mg) von den Abschnitten b) bzw. c) enthielt, 2 h lang inkubiert. Ausführliches Waschen der Mikroblasen wurde ausgeführt, um nicht konjugiertes Peptid zu entfernen.
BEISPIEL 11
Mehrfach-spezifische, mit Gas gefüllte Mikroblasen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und einem biotinylierten Lipopeptid, das zum Herstellen eines Streptavidin-„Sandwichs" mit einer Mischung von Biotinyl-Endothelin-1-Peptid (Biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.OH) und Biotinyl-Fibrin-anti-polymerisierendes Peptid (Biotin-GRPPERHQS.NH2)
a) Synthese von Lipopeptid Dipalmitoyl-lysinyl-tryptophanyl-lysinyl-Iysinyl-lysinyl(biotin)-glycin
Das Lipopeptid wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer ausgehend von Fmoc-Gly-Wang-Harz (Novabiochem) in einem 0,1 mmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol Aminosäure-Kartuschen synthetisiert. Alle Aminosäuren und Palmitinsäure wurden unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln voraktiviert.
Die gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und der Seitenketten-Schutzketten wurde ausgeführt in TFA, das 5% Phenol, 5% EDT, 5% Anisol und 5% H₂O enthielt, für 2 h, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 150 mg ergab. Die Reinigung durch präparative HPLC (Vydac 218TP1022-Säule) einer aliquoten Menge von 40 mg des rohen Materials wurde ausgeführt, unter Verwenden eines Gradien ten von 70 bis 100% B über 30 min (A = 0,1% TFA/Wasser und B = MeOH) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/min. Nach der Lyophilisierung 14 mg rohes Material (analytische HPLC; Gradient, 70–100% B, wobei B = MeOH, A = 0,01 TFA/Wasser: Säule – Vydac 218TP54: Detektion – UV 260 und Fluoreszenz, Ex 280, Ein 350 – Produkt-Retentionszeit = 22 Minuten). Weitere Produkt-Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektometrie; erwartet M + H bei 1478, gefunden 1471.
b) Herstellung von Gas enthaltenden Mikroblasen auf DSPS, die mit der biotinylierten Lipopeptid-Sequenz des Abschnitts a) „dotiert" sind
DSPS (Avanti, 4,5 mg) und Lipopeptid von a) (0,5 mg) wurden in jedes von zwei Glasfläschchen eingewogen und 0,8 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerol wurde in jedes Glasfläschchen gegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 min lang erwärmt (die Glasfläschchen wurden während des Erwärmens geschüttelt). Die Proben wurden auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Die Glasfläschchen wurden in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die gebildeten Mikroblasen über Nacht gerollt. Die Mikroblasen wurden mehrere Male mit entionisiertem Wasser gewaschen und durch einen Coulter-Zähler und eine akustische Dämpfung analysiert.
MALDI-Massenspektralanalyse wurde verwendet, um den Einbau in DSPS-Mikroblasen zu bestätigen.
c) Herstellung von mehrfach-spezifischen, Gas-gefüllten Mikroblasen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und einem biotinylierten Lipopeptid und funktionalisiert mit Streptravidin/Biotinyl-Endothelin-1-Peptid (Biotin-D-Trp-Len-Asp-Ile-Ile-Trp.OH)/Biotinyl-Fibrin-anti-polymerisierendes Peptid (Biotin-GPRPPERHOS.NH₂)
Das Mikroblasenpräparat von b) oben wurde in einer zu jener in Beispiel 10, Abschnitt e) analogen Weise behandelt.

Claims

Stoffzusammensetzung der Formel I V-L-R (I)wobei V eine organische Gruppe mit einer Bindungsaffinität für einen Angiotensin II-Rezeptorort und folgendes ist: [Losartan], der Rest der Formel II,
wobei R₁ und R₂ für Carboxy-Gruppen oder C_1-6-Alkyl-Gruppen stehen, die gegebenenfalls mit Oxa-, Oxo-, Phenyl-, Amino-, Carboxyl- oder Hydroxy-Gruppen substituiert sind, oder R₁ zusätzlich eine Oxo-Gruppe repräsentieren kann, und R₃ und R₄ für Methyl-biphenyl-carboxyl- oder Methyl-biphenyl-tetrazol-Gruppen oder C_1-6-Alkyl-Gruppen stehen, die gegebenenfalls mit Oxa-, Oxo-, Phenyl-, Amino-, Carboxyl- oder Hydroxy-Gruppen substituiert sind, wobei R₄ nur vorhanden ist, wenn R₁ für Oxo steht, wobei bevorzugt eine der Gruppen R₃ und R₄ eine Biphenyl-enthaltende Gruppe repräsentiert und eine der Gruppen R₁, R₂, R₃ und R₄ eine Alkyl-Gruppe repräsentieren, die mit Oxa-, Oxo-, Phenyl-, Amino-, Carboxyl- oder Hydroxy-Gruppen substituiert sind,
wobei die Doppelbindung, die mit einem Sternchen markiert ist, gegebenenfalls durch eine Einfachbindung ersetzt ist; R₁₀₀ für ein Wasserstoffatom, eine Phenyl-Gruppe, die gegebenenfalls mit mindestens einer Hydroxy- oder Amino-Gruppe substituiert ist, oder eine C_1-6-Alkyl-Gruppe, die gegebenenfalls mit einer Hydroxy-Gruppe substituiert ist oder gegebenenfalls über ein Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatom gebunden ist, steht; R₄₀₀ für eine Arylmethyl-Gruppe steht; R₃₀₀ für eine Carboxymethyl-Gruppe oder eine gegebenenfalls Hydroxy-substituierte C_1-6-Alkyl-Gruppe steht und R₂₀₀ für Chlor steht oder R₃₀₀ und R₂₀₀ zusammen mit den zwischengeschalteten Kohlenstoffen einen kondensierten 6-gliedrigen carbozyklischen oder heterozyklischen aromatischen Ring bilden, der gegebenenfalls an einem Ring-Kohlenstoff mit einer Hydroxy-, Carboxyl-, C_1-6-Alkyl- oder Acyloxy-Gruppe oder an einem Ring-Stickstoff mit einer Acyl-Gruppe substituiert ist,
wobei R₅₀₁ für eine gegebenenfalls fluorierte C_1-6-Alkyl-Gruppe steht, R₅₀₄ für eine gegebenenfalls fluorierte C_1-6-Alkyl-Gruppe steht, R₅₀₂ für eine Carboxy-, Hydroxy-C_1-6-Alkyl- oder CHO-Gruppe steht; oder die Doppelbindung, die mit einem Sternchen markiert ist, durch eine Einfachbindung ersetzt ist und R₅₀₄ für eine =O oder =NR₅₀₅-Gruppe steht, R₅₀₂ für eine gegebenenfalls fluorierte C_1-6-Alkyl-Gruppe steht und R₅₀₃ für eine Carboxyphenyl-Gruppe steht, und R₃₀ für
steht und R₃₁ für COOH, Tetrazol-5-yl, NH₂SO₂CF₃, SO₂NHCO-Phenyl, SO₂NHCO-Cyclopropyl steht, L für eine Linkereinheit oder eine Bindung steht, und R für eine Einheit steht, die bei einer in vivo-Bildgebung eines menschlichen oder tierischen Körpers detektierbar ist.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1, ausgewählt unter: i) einem Tc-Chelat der 2-(4-N-(MAG-3)-Aminophenyl)-1-benzyl-4-chloro-imidazol-5-essigsäure; ii) ¹³¹I-markierter 2-(4-Aminophenyl)-1-benzyl-4-chloro-imidazol-5-essigsäure; iii) einem Tc-Chelat von 2-(4-N-(MAG-3)-Aminophenyl)-1-benzyl-4-chloro-5-hydroxymethylimidazol; iv) ¹³¹I-N-Benzyl-losartan; v) einem Tc-Chelat von N-(N-MAG-3-Glycyl)-losartan; vi) einem Gd-Chelat eines Konjungats von DTPA und 4'-[3-(3-Aminopropyl)-5-butyl-1H-1,2,4-triazol-1-yl)methyl](1,1'-biphenyl]-2-carbonsäure; vii) einem Tc-Chelat eines DTPA-Konjugats von 4'-[3-(3-Aminopropyl)-5-butyl-1H-1,2,4-triazol-1-yl)methyl][1,1'-biphenyl]-2-carbonsäure; viii) ¹³¹1-markierter 4'-(3,5-Dibutyl-1H-1,2,4-triazole-1-yl)methyl][1,1'-biphenyl]-2-carbonsäure; ix) einem Vesikel, das ein Bernsteinsäure-Konjungat von 4'-[3-(3-Aminopropyl)-5-butyl-1H-1,2,4-triazol-1-yl)methyl][1,1'-biphenyl]-2-carbonsäure trägt.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie ¹²³I-Losartan ist.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie ¹³¹I-Losartan ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung mit einer Stoffzusammensetzung der Formel I nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch wirksamen Träger oder Hilfsstoff.
Verwendung einer Stoffzusammensetzung der Formel I nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Kontrastmediums zur Verwendung in einem Diagnoseverfahren, das die Verabreichung des Kontrastmediums an ein lebendes Subjekt und die Erzeugung eines Bildes mindestens eines Teils des Subjektes beinhaltet.
Verfahren zur Herstellung einer Stoffzusammensetzung der Formel I nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Prozess umfasst Konjugieren (i) einer organischen Verbindung mit Bindungsaffinität für einen Angiotensin II-Rezeptor an (ii) eine Verbindung, die in einer diagnostischen Bildgebungsprozedur detektierbar ist, oder eine chelatierende Verbindung, und, falls nötig, Metallieren der chelatierenden Gruppen in dem resultierenden Konjungat mit einem Metallion, das in einer diagnostischen Bildgebungsprozedur detektierbar ist.