DE69737659T2 - Peptide aus t-zellepitopen - Google Patents

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Description

  • Technischer Bereich
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide aus T-Zellepitopen von Pollen-Allergenen und eine Zusammensetzung für eine auf Peptid basierende Immuntherapie, umfassend die Peptide als einen wirksamen Bestandteil. Diese Zusammensetzung ist für das Behandeln und/oder Vorbeugen einer Pollinose im Frühling nützlich.
  • Hintergrundgebiet
  • Etwa 10% der japanischen Bevölkerung leiden an einer Pollinose, die sich im Frühling entwickelt, wie Zedern-Pollinose. Dieser Zustand ist im Steigen gewesen und zieht die öffentliche Aufmerksamkeit auf sich.
  • Der Zeitraum, in dem sich eine Pollinose entwickelt, entspricht im Allgemeinen dem Zeitraum, in dem sich Pollen verbreiten. In vielen Fällen bleiben die Symptome einer Pollinose noch nach der Saison bestehen, in der sich die Zedernpollen verbreiten, weil die meisten Patienten mit Zedern-Pollinose auch mit den japanischen Zypressenpollen (Hiroki-Zypressenpollen) sensibilisiert sind, die gleich nach dem Zedernpollen-Verbreitungszeitraum beginnen, sich zu verbreiten. Daher leiden Patienten, die auch gegen die japanischen Zypressenpollen empfindlich sind, für einen signifikanten Teil des Jahres an den Symptomen der Pollinose.
  • Zedernpollen und japanische Zypressenpollen besitzen eine gemeinsame Antigenität (Takeshi Ide et al., Allergy Clinic 11, 174-178, 1991). Die Kreuzreaktivität der IgE-Antikörper zwischen Zedernpollen und japanischen Zypressenpollen ist etabliert worden (Taniai M. et al., Mol. Immunol. 30, 183-189, 1993). Der Positivitäts-Index von Patienten mit Frühlings-Pollinose für ihre Allergen-spezifischen IgE-Antikörper ist 83,5% für Zedernpollen, 80,0% für japanische Zypressenpollen und 76,4% für beide Pollen (Mitsuhiro Okano et al., Allergy 43, 1179-1184, 1994). Zusätzlich besitzen 60% der Patienten mit Zedern-Pollinose für japanische Zypressenpollen spezifische IgE-Antikörper (Yozo Saito, Chiryo (Therapy) 78, 1571- 1576, 1996). Basierend auf diesen Berichten ist es allgemein anerkannt, dass Zedern-Pollinose-Patienten eine Pollinose gegen japanische Zypressenpollen entwickeln können und umgekehrt.
  • Pollinose ist eine typische Allergie vom Soforttyp I, die durch eine Antigen-Antikbrper-Reaktion zwischen einem Pollen-Allergen (das ein Antigen ist, das eine Allergie verursacht, und im Wesentlichen dasselbe wie ein Antigen ist) und einem IgE-Antikörper, der spezifisch für das Allergen ist, induziert wird. Deshalb wird eine Pollinose zur Zeit unter Verwendung von Verfahren, die theoretisch auf dem Mechanismus basieren, durch den sich Typ I-Allergien entwickeln, verhindert und behandelt. Dieser Mechanismus wird unten kurz beschrieben.
  • Ein Antigen, das in den Körper eingedrungen ist, wird den T-Helferzellen durch antigenpräsentierende Zellen präsentiert. Als ein Ergebnis reifen B-Zellen zu antikörperproduzierenden Zellen. Die antikörperproduzierenden Zellen produzieren einen Antigen-spezifischen IgE-Antikörper, der an die Oberfläche von Mastzellen bindet. Ein danach eingedrungenes Antigen bindet an den IgE-Antikörper auf den Mastzellen. Diese Stimulierung setzt chemische Mediatoren wie Histamin von den Mastzellen frei, wodurch ein allergisches Symptom verursacht wird.
  • Die folgenden drei Verfahren werden hauptsächlich verwendet, um Allergien, die auf dem obigen Mechanismus basieren, zu verhindern und zu behandeln: 1) Meiden eines Antigens, das eine Allergie verursacht, 2) Chemotherapie, typischerweise unter Verwendung eines Antihistaminikums und 3) De-Sensibilisierungstherapie unter Verwendung eines Allergens. Das Verfahren 1) ist jedoch schwer, praktisch auszuführen, und das Verfahren 2) ist lediglich eine symptomatische Therapie. Vom Verfahren 3) wird erwartet, dass es die einzige Behandlung ist, die die Wurzel des Problems bekämpft, aber es ist nicht immer wirksam und kann möglicherweise schwere Nebenwirkungen wie anaphylaktischen Schock verursachen.
  • Aus diesen Gründen ist in letzter Zeit eine auf einem Peptid basierende Immuntherapie unter Verwendung von Peptiden aus T-Zellepitopen des Allergens versucht worden, um Allergien zu verhindern und zu behandeln. T-Zellepitope nehmen am Iniziieren und Beibehalten einer Immunantwort gegen ein Protein-Allergen, das klinische Symptome von Allergien verursacht, teil. Diese T-Zellepitope binden an Moleküle der HLA-Klasse II auf der Oberfläche von antigen- präsentierenden Zellen, um die verwandte T-Zell-Subpopulation zu stimulieren. Von der Stimulierung wird angenommen, dass sie eine anfängliche Antwort auf dem T-Helferzellen-Niveau auslöst. Diese anfängliche Antwort verursacht die Proliferation von T-Zellen, die Sekretion von Lymphokinen, eine lokalisierte Entzündungsantwort, die Migration von proliferierten Immunzellen zu den Entzündungsstellen und die Aktivierung der B-Zell-Kaskade, die der Antikörperproduktion vorausgeht. IgE-Antikörper, die Isotypen dieser Antikörper sind, sind kritisch für die Entwicklung und Aufrechterhaltung von Allergien. Darüber hinaus wird ihre Produktion durch die Eigenschaften von Lymphokinen, die durch T-Helferzellen am Beginn der oben beschriebenen Kaskade sezerniert werden, beeinflusst. Das T-Zellepitop ist ein grundlegendes Element oder die Minimaleinheit, um durch einen T-Zellrezeptor erkannt zu werden. Dieses Epitop enthält die Aminosäuresequenz, die nötig ist, um den Rezeptor zu erkennen. Eine allergische Entzündung kann durch Kontrollieren der Antwort der Helfer-T-Zelle, die eine Schlüsselrolle in der Immunsuppression spielt, unter Verwendung des Peptids aus T-Zellepitopen behandelt werden.
  • Bekannte Therapeutika für Allergien unter Verwendung von Peptiden aus T-Zellepitopen schließen eine therapeutische Zusammensetzung, umfassend ein Peptid aus T-Zellepitopen eines Allergens vom cat-Ursprung (eine PCT-Anmeldung, veröffentlicht in Japan (JP-WA) Nr. Hei 7-505365), eine therapeutische Zusammensetzung, umfassend ein Peptid aus T-Zellepitopen des Zedernpollens Cry j 1 (JP-WA-Hei 8-502163), und ein Multiepitop-Peptid, erhalten durch das Verbinden von T-Zellepitopen von Zedernpollen Cry j 1 und Cry j 2 (japanische Patentanmeldung Nr. Hei 8-80702), ein. Vom Hauptallergen des japanischen Zypressenpollens, Cha o 1, wird berichtet, dass es Molekulargewichte von 45 KD oder 50 KD hat. Jedes Molekül hat denselben isoelektrischen Punkt von 6,8 und besteht aus einem Protein, das 5% Kohlenhydrate enthält (Takeshi Ide, et al., Nippon Kafun Gakkaishi (Journal of the Japanese Pollen Association) 34, 39, 1988). Ihre Primärstrukturen sind jedoch unbekannt, und dementsprechend ist noch keine T-Zellepitop-Stelle auf den Allergen-Molekülen identifiziert worden. Vor kurzem waren die vorliegenden Erfinder erfolgreich im Clonieren des japanischen Zypressenpollen-Allergengens und klärten auf, dass zusätzlich zu Cha o 1 ein anderer Typ des Allergens, Cha o 2, vorhanden war. Darüber hinaus wurden die Primärstrukturen von Cha o 1 und Cha o 2 bestimmt (japanische Patentanmeldung Nr. Hei 6-335089).
  • Offenbarung der Erfindung
  • Der Zeitraum, wenn sich die Zedernpollen-Verbreitung mit jenem der japanischen Zypressenpollen überschneidet, wird als der gemischte Pollen-Verbreitungszeitraum bezeichnet. Diese zwei Pollenarten besitzen eine gemeinsame Antigenität, die es schwer macht, die Symptome, die durch Zedernpollen verursacht werden, von jenen zu unterscheiden, die durch die japanischen Zypressenpollen verursacht werden. Manchmal halten die Symptome an oder entwickeln sich sogar nach dem Zedernpollen-Verbreitungszeitraum. Da die Pollen, die während dieses Zeitraums in der Luft gefunden werden, vorwiegend japanische Zypressenpollen sind, scheinen diese Symptome durch die japanischen Zypressenpollen verursacht zu werden. Da mehr japanische Zypressenbäume als Zedernbäume gepflanzt werden, steigt die Menge der verbreiteten japanischen Zypressenpollen Jahr für Jahr und wird in nächster Zukunft jene der Zedernpollen übersteigen. Es ist daher wünschenswert, ein Verfahren für das Verhindern und Behandeln von Allergien, das auf der Wurzel der Gesamtpollinose aufbaut, die durch Baumpollen im Frühling verursacht wird, einschließlich japanischer Zypressen-Pollinose und Zedern-Pollinose, zu etablieren. Von einer auf Peptid basierenden Immuntherapie unter Verwendung von Peptiden aus T-Zellepitopen wird erwartet, dass sie zu einer Allergiebehandlung, die auf der Wurzel der Pollinose aufbaut, führt. Wie oben beschrieben, sind einige Verfahren für eine solche Immuntherapie für Zedern-Pollinose bekannt. Dennoch ist nichts über japanische Zypressen-Pollinose oder über Pollinose, die durch Baumpollen im Frühling, einschließlich Zedern- und japanische Zypressenpollen, verursacht wird, berichtet worden.
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Peptide aus T-Zellepitopen bereit zu stellen, die für eine auf dem Peptid basierende Immuntherapie für japanische Zypressen-Poilinose nützlich ist. Die vorliegende Erfindung beschreibt auch Peptide aus T-Zellepitopen, die für eine auf Peptid basierende Immuntherapie für Patienten mit Pollinose, die durch Baumpollen im Frühling verursacht wird, einschließlich Patienten mit Zedern-Pollinose, die eine Kreuzreaktivität mit japanischen Zypressenpollen zeigen, nützlich ist.
  • Die hier genannten Erfinder haben durch Stimulieren einer T-Zelllinie, die von Patienten mit japanischer Zypresse-Pollinose etabliert wurde, mit synthetischen überlappenden Peptiden, die die gesamte Primärstruktur der japanischen Zypressenpollen-Allergene abdecken, eine T-Zellepitop-Stelle auf den Allergenmolekülen des japanischen Zypressenpollen identifiziert, was somit die obigen Probleme löst.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst die Erfindungen, die in jedem Anspruch beschrieben sind, und wird unten detaillierter beschrieben.
  • Die hier genannten Erfinder bestimmten die Aminosäuresequenz (beschrieben in der japanischen Patentanmeldung Nr. Hei 6-335089) des Hauptallergens Cha o 1 (reifes Protein) des japanischen Zypressenpollen-Allergens, die als SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, und jene von Cha o 2, die als SEQ ID NO: 2 gezeigt ist. Die Aminosäuresequenz von Cha o 1 hat 80% Homologie zum Zedernpollen-Allergen Cry j 1, und jene von Cha o 2 hat 75% Homologie zum Zedernpollen-Allergen Cry j 2.
  • Eine Anzahl von Aminosäure-Substitutionen wird in den Allergenen beobachtet, die von Pollen, Milben und Bienengift stammen. Diese Allergen-Arten werden Isoallergene genannt. Zum Beispiel sind elf Isoallergene von Birkenbaumpollen Bet v I isoliert worden, und ihre Aminosäuresequenzen unterscheiden sich von einander in einem Bereich von 2 bis 15% (Swoboda, I. et al., J. Biol. Chem. 270: 2607-2613, 1995). Derzeit sind zwei Isoallergene, in denen sechs Aminosäurereste in einer reifen Proteinregion substituiert sind, in Cry j 2 gefunden worden (ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldungen (JP-A) Nr. Hei 8-47392 und Nr. Hei 7-170986). Ein Fachmann kann begründeterweise erwarten, dass Isoallergene auch in Cha o 1 und Cha o 2 vorhanden sein würden. Solche Isoallergene sind auch in Cha o 1 und Cha o 2 eingeschlossen, auf die sich die vorliegende Erfindung bezieht.
  • Die Familie von Zedernbäumen wird in neun Gattungen und die Familie der japanischen Zypressen in sieben Gattungen klassifiziert. Es wird berichtet, dass Allergene von Cryptomeria, Rotholz und Metasequoia, die zu der Zedern (Taxodiaceae)-Familie gehören, und der Schirm-Pinie, von der angenommen wird, dass sie entweder zu einer unabhängigen Familie, der Zedernfamilie oder der Pinienfamilie gehört, eine Reaktivität mit jenen der japanischen Zypresse, der Sawara-Zypresse, des orientalischen Lebensbaums, des Nadel-Wacholders und des chinesischen Wacholders, die zu der Familie der Cupressaceae gehören, zeigen (Takeshi Ide, et al., Allergy Clinic, 11, 174-178, 1991). In Anbetracht dieses Berichts sind Zedern-Allergene breit kreuzreaktiv mit den Allergenen der japanischen Zypresse. Daher sind die Peptide der vorliegenden Erfindung im Allgemeinen nicht nur für die japanische Zypressen-Pollinose, sondern auch für eine Zedern-Pollinose wirksam.
  • Um die Peptide aus T-Zellepitopen der vorliegenden Erfindung zu erhalten, wurden überlappende Peptide, die die gesamten Primärstrukturen von Cha o 1 und Cha o 2 abdecken, synthetisiert; jedes Peptid besteht aus der adäquaten Anzahl von Aminosäureresten (12 bis 20 Reste). Das Peptid der vorliegenden Erfindung stimuliert und/oder unterdrückt die Aktivität von T-Zellen, die von Patienten mit einer japanischen Zypressen-Pollinose stammen. Mit anderen Worten, das Peptid der vorliegenden Erfindung kann die Proliferation von T-Zellen oder die Antworten von T-Zellen wie die Sekretion von Lymphokinen induzieren und/oder kann eine T-Zellanergie (nicht reagierend) induzieren. T-Zellepitop-Stellen auf den Allergen-Molekülen können unter Verwendung des T-Zell-Wachstums als einen Index in Übereinstimmung mit dem Verfahren, das in JP-A-Hei 8-47392 beschrieben ist, identifiziert werden. Insbesondere werden T-Zelllinien oder T-Zellclone, die spezifisch mit Cha o 1 und Cha o 2 reaktiv sind, für jeden Patienten von peripheren Lymphocyten eines Patienten mit japanischer Zypressen-Pollinose etabliert. Die T-Zelllinien oder T-Zellclone werden in der Anwesenheit von jedem Peptid der überlappenden Peptide kultiviert. Die Epitop-Stellen werden durch Messen der Proliferation von T-Zellen in der Anwesenheit des Peptids (z.B. Aufnahme von [3H]Thymidin in die Zellen) und Berechnen eines Stimulierungs-Index identifiziert. Der hierin verwendete Stimulierungs-Index (SI) wird durch Teilen der radioaktiven Menge von [3H]Thymidin (ZpM; „cpm" Zerfälle pro Minute), die in die Zellen in der Anwesenheit des Peptids aufgenommen wird, durch die Menge von [3H]Thymidin (ZpM), die in die Zellen in der Abwesenheit des Peptids aufgenommen wird (Kontrolle), erhalten. Basierend auf den so erhaltenen Daten wird ein mittlerer Stimulierungs-Index für jedes Peptid für jede Patientengruppe berechnet. Die Peptide, von denen gefunden wurde, dass sie die T-Zellantwort induzieren und/oder eine T-Zellanergie induzieren, werden definiert, dass sie eine T-Zell-stimulierende Aktivität aufweisen. Die bevorzugten Peptide aus T-Zellepitopen der vorliegenden Erfindung besitzen eine T-Zell-stimulierende Aktivität und enthalten daher mindestens ein T-Zellepitop. Beispiele des Peptids aus T-Zellepitopen von Cha o 1, die in 1 gezeigt sind (insbesondere, die in 2, 3 und SEQ ID NO: 3 bis SEQ ID NO: 37 gezeigt sind), schließen Peptid #1-2 (SEQ ID NO: 4), Peptid #1-4 (SEQ ID NO: 6), Peptid #1-5 (SEQ ID NO: 7), Peptid #1-6 (SEQ ID NO: 8), Peptid #1-7 (SEQ ID NO: 9), Peptid #1-8 (SEQ ID NO: 10), Peptid #1-10 (SEQ ID NO: 12), Peptid #1-11 (SEQ ID NO: 13), Peptid #1-12 (SEQ ID NO: 14), Peptid #1-14 (SEQ ID NO: 16), Peptid #1-15 (SEQ ID NO: 17), Peptid #1-16 (SEQ ID NO: 18), Peptid #1-19 (SEQ ID NO: 21), Peptid #1-20 (SEQ ID NO: 22), Peptid #1-21 (SEQ ID NO: 23), Peptid #1-22 (SEQ ID NO: 24), Peptid #1-23 (SEQ ID NO: 25), Peptid #1-24 (SEQ ID NO: 26), Peptid #1-25 (SEQ ID NO: 27), Peptid #1-26 (SEQ ID NO: 28), Peptid #1-27 (SEQ ID NO: 29), Peptid #1-30 (SEQ ID NO: 32), Peptid #1-31 (SEQ ID NO: 33), Peptid #1-32 (SEQ ID NO: 34), Peptid #1-33 (SEQ ID NO: 35) und Peptid #1-34 (SEQ ID NO: 36) ein (4). Beispiele des Peptids aus T-Zellepitopen von Cha o 2, die in 5 gezeigt sind (insbesondere, die in 6, 7 und SEQ ID NO: 38 bis SEQ ID NO: 88 gezeigt sind), schließen Peptid #2-5 (SEQ ID NO: 42), Peptid #2-7 (SEQ ID NO: 44), Peptid #2-8 (SEQ ID NO: 45), Peptid #2-9 (SEQ ID NO: 46), Peptid #2-10 (SEQ ID NO: 47), Peptid #2-11 (SEQ ID NO: 48), Peptid #2-12 (SEQ ID NO: 49), Peptid #2-13 (SEQ ID NO: 50), Peptid #2-14 (SEQ ID NO: 51), Peptid #2-15 (SEQ ID NO: 52), Peptid #2-16 (SEQ ID NO: 53), Peptid #2-17 (SEQ ID NO: 54), Peptid #2-18 (SEQ ID NO: 55), Peptid #2-19 (SEQ ID NO: 56), Peptid #2-20 (SEQ ID NO: 57), Peptid #2-21 (SEQ ID NO: 58), Peptid #2-22 (SEQ ID NO: 59), Peptid #2-23 (SEQ ID NO: 60), Peptid #2-24 (SEQ ID NO: 61), Peptid #2-25 (SEQ ID NO: 62), Peptid #2-26 (SEQ ID NO: 63), Peptid #2-27 (SEQ ID NO: 64), Peptid #2-30 (SEQ ID NO: 67), Peptid #2-31 (SEQ ID NO: 68), Peptid #2-32 (SEQ ID NO: 69), Peptid #2-33 (SEQ ID NO: 70), Peptid #2-34 (SEQ ID NO: 71), Peptid #2-35 (SEQ ID NO: 72), Peptid #2-36 (SEQ ID NO: 73), Peptid #2-37 (SEQ ID NO: 74), Peptid #2-38 (SEQ ID NO: 75), Peptid #2-40 (SEQ ID NO: 77), Peptid #2-41 (SEQ ID NO: 78), Peptid #2-42 (SEQ ID NO: 79) und Peptid #2-43 (SEQ ID NO: 80) ein (8). Bevorzugter haben die Peptide aus T-Zellepitopen einen mittleren Stimulierungs-Index von 2.0 oder mehr. Beispiele schließen Peptid #1-2 (SEQ ID NO: 4), Peptid #1-7 (SEQ ID NO: 9), Peptid #1-8 (SEQ ID NO: 10), Peptid #1-20 (SEQ ID NO: 22), Peptid #1-22 (SEQ ID NO: 24), Peptid #1-24 (SEQ ID NO: 26), Peptid #1-26 (SEQ ID NO: 28), Peptid #1-32 (SEQ ID NO: 34), Peptid #1-33 (SEQ ID NO: 35) und Peptid #1-34 (SEQ ID NO: 36), die in 1 gezeigt sind, und Peptid #2-10 (SEQ ID NO: 47), Peptid #2-20 (SEQ ID NO: 57), Peptid #2-21 (SEQ ID NO: 58), Peptid #2-40 (SEQ ID NO: 77), Peptid #2-41 (SEQ ID NO: 78), Peptid #2-42 (SEQ ID NO: 79) und Peptid #2-43 (SEQ ID NO: 80) ein, die in 5 gezeigt sind. Am meisten bevorzugt hat das Peptid aus T-Zellepitopen einen minimalen Positivitäts-Index von 100. Beispiele davon schließen Peptid #1-7 (SEQ ID NO: 9), Peptid #1-22 (SEQ ID NO: 24), Peptid #1-32 (SEQ ID NO: 34) und Peptid #1-33 (SEQ ID NO: 35), die in 1 gezeigt sind, und Peptid #2-10 (SEQ ID NO: 47), Peptid #2-20 (SEQ ID NO: 57), Peptid #2-40 (SEQ ID NO: 77), Peptid #2-41 (SEQ ID NO: 78), Peptid #2-42 (SEQ ID NO: 79) und Peptid #2-43 (SEQ ID NO: 80) ein, die in 5 gezeigt sind. Der hierin verwendete „Positivitäts-Index" wird durch Multiplizieren eines mittleren Stimulierungs-Index eines Peptids durch die Erscheinungs-Häufigkeit (%) von Patienten, die eine T-Zellantwort auf das Peptid zeigen, erhalten.
  • Um das Epitop genau zu identifizieren, kann ein Peptid, das die T-Zell-stimulierende Aktivität hat und daher mindestens ein T-Zellepitop enthält, durch Deletieren von irgendwelchen der Aminosäurereste am Amino-Terminus oder am Carboxy-Terminus des Peptids modifiziert werden. Das modifizierte Peptid kann dann auf jegliche Änderung in der T-Zell-stimulierenden Aktivität untersucht werden. Wenn zwei oder mehrere Peptide, die die überlappende Region teilen, die T-Zell-stimulierende Aktivität zeigen, wird ein neues Peptid aus T-Zellepitopen, das die vollständigen oder einen Teil der überlappenden Peptide enthält, hergestellt, und seine T-Zell-stimulierende Aktivität wird auf dieselbe Weise gemessen.
  • Das Peptid aus T-Zellepitopen der vorliegenden Erfindung kann möglicherweise immunologisch mit Cry j 1 oder Cry j 2 in der T-Zell-Kreuzreaktivität assoziiert sein. Genaugesagt 1) hat die Aminosäuresequenz von Cha o 1 80% Homologie zu jener von Cry j 1, und die Aminosäuresequenz von Cha o 2 hat 75% Homologie zu jener von Cry j 2; 2) ist die Aminosäuresequenz des Peptids #1-2 aus T-Zellepitopen von Cha o 1 (entsprechend der Aminosäuresequenz SEQ ID NOS: 11-30 des Cha o 1 vom reifen Typ), die in Beispiel 5 der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde, identisch mit der Aminosäuresequenz des Peptids CJI-1 aus T-Zellepitopen von Cry j 1 (entsprechend der Aminosäuresequenz SEQ ID NOS: 11-30 des Cry j 1 vom reifen Typ; siehe 13 von JP-A-Hei 8-502163), mit der Ausnahme von zwei Aminosäureresten (Ala an Position 12 von Cha o 1 entspricht Ser von CJI-1, und Asp an Position 15 von Cha o 1 entspricht Ala von CJI-1); und 3) haben sowohl Zedernpollen als auch japanische Zypressenpollen eine gemeinsame Antigenität.
  • In dem Peptid aus T-Zellepitopen der vorliegenden Erfindung können die Aminosäurereste, die am Erkennen des T-Zellrezeptors teilnehmen, durch ein bekanntes Verfahren (zum Beispiel Messen der Änderung in der T-Zell-stimulierenden Aktivität, die aufgrund der Substitution von Aminosäureresten erfolgen könnte) bestimmt werden. Die Aminosäurereste, von denen gefunden wurde, dass sie für eine Interaktion mit dem T-Zellrezeptor wesentlich sind, werden durch andere Aminosäurereste substituiert, um die T-Zell-stimulierende Aktivität Antigen-spezifisch zu kontrollieren, so dass eine allergische Entzündung unterdrückt werden kann (Erhöhen der Reaktivität von T-Zellen, Verändern des Lymphokin-produzierenden Musters, Anergie usw.). Es ist berichtet worden, dass, wenn in einem menschlichen Allergie-Modell ein Aminosäurerest an der T-Zell-Erkennungsstelle des Peptids aus T-Zellepitopen des Zedernpollen-Cry j 1 durch einen anderen Aminosäurerest substituiert wurde (Substituieren von Thr an Position 399 durch Val), das resultierende analoge Peptid im Wesentlichen dasselbe T-Zellwachstum und dieselbe IL-4-Produktion wie jene eines Wildtyp-Peptids, aber eine erhöhte Produktion von IFN-γ zeigte, das die Produktion der IgE-Antikörper unterdrückt (Ikagawa, S. et al., J. Aller. Clin. Immunol. 97, 54-64, 1996). Es ist darüber hinaus offenbart worden, dass ein Bindungsmotiv der HLA-Klasse II-Moleküle aus drei bis fünf Aminosäureresten besteht, die durch einen oder zwei zwischengeschaltete Aminosäurereste angeordnet sind. Wenn diese Reste aus mehreren Arten von festgelegten Aminosäuren bestehen, bindet das Peptid an die HLA-Klasse II-Moleküle (Matsushita, S. et al., J. Exp. Med. 180: 877-883, 1994). Daher kann eine allergische Entzündung durch Bestimmen der Aminosäurereste des Peptids aus T-Zellepitopen der vorliegenden Erfindung, die für die Interaktion mit den HLA-Klasse II-Molekülen wesentlich sind, durch ein bekanntes Verfahren und Substituieren der so bestimmten Aminosäurereste durch andere Aminosäurereste verhindert werden. Darüber hinaus kann das Peptid aus T-Zellepitopen der vorliegenden Erfindung modifiziert werden, um seine Löslichkeit zu verbessern, wodurch seine therapeutischen oder vorbeugenden Wirkungen oder die Stabilität erhöht werden. Eine solche Modifikation schließt eine Substitution, Deletion und Addition der Aminosäurereste ein.
  • In der vorliegenden Erfindung bindet das Peptid aus T-Zellepitopen vorzugsweise nicht an IgE-Antikörper. Sogar wenn es an die IgE-Antikörper bindet, ist der Grad der Bindung wesentlich niedriger als jener der Bindung des Allergens der natürlichen japanischen Zypressenpollen, von denen das Peptid abstammt, an die Antikörper.
  • Das Peptid aus T-Zellepitopen der vorliegenden Erfindung enthält vorzugsweise mindestens sieben Aminosäurereste. Diese Regionen können durch einen Linker wie Arg-Arg oder Lys-Lys, der empfindlich gegenüber einer Spaltung mit einem Enzym wie Cathepsin oder Trypsin ist, verbunden sein, um die Empfindlichkeit gegenüber dem Bearbeiten durch antigenpräsentierende Zellen zu verstärken. Daher kann eine Peptid-Region produziert werden, um ein oder mehrere T-Zellepitope zu enthalten. Das Peptid aus T-Zellepitopen der vorliegenden Erfindung kann in Kombination mit anderen Peptiden wie einem Peptid aus T-Zellepitopen von Cry j 1 (JP-WA-Hei 8-502163) und/oder einem Peptid aus T-Zellepitopen von Cry j 2 (JP-WA-Hei 8-47392) verwendet werden.
  • Wenn ein Peptid, das mindestens ein Peptid aus T-Zellepitopen der vorliegenden Erfindung enthält, an ein Individuum verabreicht wird, das empfindlich auf japanische Zypressenpollen ist, kann das Peptid die allergische Antwort des Individuums auf das (die) Allergen(e) kontrollieren. Solch ein Peptid ist daher wirksam für eine auf Peptid basierende Immuntherapie. Insbesondere ist das Peptid aus T-Zellepitopen der vorliegenden Erfindung in Kombination mit dem Peptid aus T-Zellepitopen von Zedernpollen wirksamer für eine auf Peptid basierende Immuntherapie für einen Patienten mit einer Pollinose, die durch Baumpollen im Frühling, die durch japanische Zypressenpollen repräsentiert werden, verursacht wird.
  • Das Peptid aus T-Zellepitopen der vorliegenden Erfindung kann als ein diagnostisches Mittel für Pollinose, die durch japanische Zypressenpollen-Allergene verursacht wird, verwendet werden. In einer solchen Anwendung wird das Peptid aus T-Zellepitopen der vorliegenden Erfindung in einer Menge von etwa 0,1 μg/ml bis etwa 1 mg/ml und vorzugsweise etwa 1 bis etwa 300 μg/ml zu den peripheren Lymphocyten zugefügt, die von einem Patienten gesammelt wurden. Nach Inkubation des Gemisches für eine Woche wird die Aufnahme von [3H]Thymidin in die Lymphocyten getestet und für die Diagnose der Pollinose bewertet. Das Peptid aus T-Zellepitopen der vorliegenden Erfindung kann auch verwendet werden, um entweder die Funktion von T-Zellen oder die Proliferation von T-Zellen oder beides zu bewerten.
  • Wenn das Peptid aus T-Zellepitopen der vorliegenden Erfindung unter Verwendung einer rekombinanten DNA-Technologie synthetisiert wird, werden die Wirtszellen, die mit einer Nucleinsäure transformiert wurden, die eine das Peptid codierende Sequenz enthält, in einem Medium gezüchtet, das für das Züchten der Wirtszellen geeignet ist. Das Peptid kann vom Kulturüberstand oder von den Wirtszellen durch ein Verfahren geerntet werden, das auf dem Fachgebiet bekannt ist. E. coli, Hefen oder Sängerzellen können als solche Wirtszellen verwendet werden.
  • Wenn das Peptid aus T-Zellepitopen der vorliegenden Erfindung in einer auf dem Peptid basierenden Immuntherapie für Patienten mit Pollinose verwendet wird, kann das Peptid zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmitteln oder Trägern verabreicht werden. Wie hierin verwendet, schließt der „Patient mit Pollinose" Patienten mit einer Zedern-Pollinose ein, die eine immunologische Kreuzreaktivität mit dem Allergen der japanischen Zypressenpollen zeigen. Das Peptid aus T-Zellepitopen der vorliegenden Erfindung kann auf einfache Weise zum Beispiel durch Injektion (subcutan oder intravenös), Einflößen, Rhinenchysis, orale Verabreichung, Inhalation oder percutane Verabreichung verabreicht werden. Im Fall der Injektion ist eine einzelne Dosis des Peptids vorzugsweise im Bereich von etwa 1 μg bis etwa 30 mg und mehr bevorzugt von etwa 20 μg bis etwa 10 mg.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt Peptide aus T-Zellepitopen des japanischen Zypressenpollen-Allergens Cha o 1 und einen Positivitäts-Index von jedem Peptid.
  • 2 zeigt überlappende Peptide (#1-1 bis #1-28) von Cha o 1.
  • 3 zeigt überlappende Peptide (#1-29 bis #1-35) von Cha o 1.
  • 4 zeigt Peptide, die T-Zellepitope von Cha o 1 enthalten.
  • 5 zeigt Peptide aus T-Zellepitopen des japanischen Zypressenpollen-Allergens Cha o 2 und einen Positivitäts-Index von jedem Peptid.
  • 6 zeigt überlappende Peptide (#2-1 bis #2-27) von Cha o 2.
  • 7 zeigt überlappende Peptide (#2-28 bis #2-51) von Cha o 2.
  • 8 zeigt Peptide, die T-Zellepitope von Cha o 2 enthalten.
  • Beste Art und Weise für das Umsetzen der Erfindung
  • Beispiele der vorliegenden Erfindung werden unten beschrieben werden, sollen aber nicht ausgelegt werden, um den Rahmen der vorliegenden Erfindung einzuschränken.
  • Beispiel 1
  • Synthese von überlappenden Peptiden
  • Basierend auf der Aminosäuresequenz der japanischen Zypressenpollen-Allergene Cha o 1 (SEQ ID NO: 1) und Cha o 2 (SEQ ID NO: 2) wurden überlappende Peptide, die aus 20 Aminosäureresten (14 Reste in Peptid #1-35 (SEQ ID NO: 37) und Peptid #2-51 (SEQ ID NO:88) bestehen, wobei jedes 10 überlappende Reste enthält) durch das Fmoc-Verfahren unter Verwendung eines Peptid-Synthesegeräts (PSSM-8, Shimadzu Seisakusho Ltd.) synthetisiert. 35 Arten von überlappenden Peptiden wurden für Cha o 1 (1, SEQ ID NO: 3 bis SEQ ID NO: 37) und 51 Arten für Cha o 2 (5, SEQ ID NO: 38 bis SEQ ID NO: 88) hergestellt. Die so synthetisierten Peptide wurden alle durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer ODS-Säule gereinigt. Die Reinheit in allen Peptiden war 90% oder höher. Die Molekulargewichte der gereinigten Peptide wurden durch Verwendung eines LASERMAT 2000 (Finnigan MAT Ltd.) identifiziert.
  • Beispiel 2
  • Expression der rekombinanten Proteine in E. coli
  • Unter Verwendung einer PCR-Technik wurde cDNA von Plasmid-DNA amplifiziert, in die Cha o 1-cDNA oder Cha o 2-cDNA, die ein japanisches Zypressenpollen-Allergen codiert, cloniert worden war (japanische Patentanmeldung Nr. Hei 6-335089). Eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle wurde an den Terminus von jeder cDNA angeheftet. Dieses DNA-Fragment wurde in einen Histidin-markierten Protein-Expressionsvektor, pQE9, inseriert, und der resultierende Vektor wurde verwendet, um E. coli M15 (pREP4) zu transformieren. Die Expression des transformierten Gens wurde für Ampicillin-resistente Clone durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestätigt. Das exprimierte Protein wurde unter Verwendung einer Ni-NTA-Agarose-Affinitätsäule gereinigt.
  • Beispiel 3
  • Etablierung einer T-Zelllinie
  • Eine T-Zelllinie auf Cha o 1 wurde wie folgt etabliert. Periphere Lymphocyten, die von 19 Patienten gewonnen wurden, von denen unter Verwendung von Ala STAT (Nippon DPC Corporation) oder CAP-RAST (Pharmacia) gefunden wurde, dass sie positiv für japanische Zypressen-Pollinose sind, wurden durch spezifische Schwerkraftzentrifugation unter Verwendung von Ficoll-Paque aufgetrennt. Die Lymphocyten (2 × 106 Zellen) wurden in RPMI 1640-Medium (GIBCO, Inc.), ergänzt mit 2 ml Plasma von demselben Patienten (10%) oder menschlichem Serum vom Typ AB (20%, Banpoh Tsusho Co., Ltd.), suspendiert. Die Suspension wurde auf einer Platte mit 24 Vertiefungen für 3 bis 10 Tage (37°C, CO2-Brutschrank, TABAI, Inc.) zusammen mit 10 bis 30 μg/ml des rekombinanten Cha o 1, das in Beispiel 2 erhalten wurde, oder mit einem Gemisch der überlappenden Peptide (0,01 bis 1 μM), die in Beispiel 1 erhalten wurden, inkubiert. Wenn T-Zellen, die durch Cha o 1-Stimulierung aktiviert wurden, mikroskopisch bestätigt wurden, wurden 5 E/ml IL-2 (Boehringer Mannheim) zu dem System zugefügt, gefolgt von einer Inkubation über Nacht. Am nächsten Tag wurde das Medium durch frisches RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 20 E/ml IL-2, 10% oder 20% menschlichem Serum vom Typ AB, ersetzt. Die Inkubation wurde für etwa 10 Tage fortgesetzt, wobei das Medium jeden Tag auf dieselbe Weise ersetzt wurde. Die proliferierte T-Zelllinie wurde auf ihre Spezifität untersucht, und ein Teil der T-Zelllinie wurde eingefroren und gelagert. Eine durch Cha o 2 stimulierte T-Zelllinie wurde auch von 20 Patienten mit japanische Zypressen-Pollinose auf dieselbe Weise etabliert.
  • Beispiel 4
  • Etablierung von antigenpräsentierenden Zellen
  • Eine lymphoblastoide Zelllinie (B-Zelllinie), die durch Infektion von B-Lymphocyten mit EB-Virus (Epstein-Barr-Virus, EBV) transformiert wurde, wurde etabliert, um als antigenpräsentierende Zelle zu dienen. Zuerst wurden EBV-produzierende B-95-8-Zellen (Krallenaffe, ATCC CRL 1612) in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 20% inaktiviertem fötalem Kälberserum (FKS, GIBCO Inc.) kultiviert. Der Kulturüberstand wurde durch einen sterilen 0,22 μm-Filter gefiltert. Das Filtrat wurde eingefroren und bei –80°C gelagert. Als Nächstes wurde 1 ml der EBV-Lösung zu Lymphocyten (2 × 106 Zellen) eines Patienten mit japanische Zypressen-Pollinose zugefügt, und das Gemisch wurde für die Infektion bei 37°C für 30 min belassen. Die EBV-infizierten Zellen wurde zweimal gewaschen, dann für etwa 20 Tage in 20% FKS-RPMI 1640-Medium, ergänzt mit einer Endkonzentration von 200 ng/ml Cyclosporin (Sandoz Pharmaceutical Co., Ltd.), inkubiert. Nachdem die Zellmasse mit dem bloßen Auge sichtbar war, wurde die Inkubation in 20% FKS-RPMI 1640-Medium für weitere 20 Tage fortgesetzt. Die resultierenden Zellen wurden eingefroren und gelagert, bis sie verwendet wurden.
  • Beispiel 5
  • Identifizierung des Peptids aus T-Zellepitopen
  • Die gezüchtete B-Zelllinie, die in Beispiel 4 etabliert wurde, wurde mit 50 μg/ml Mitomycin C (Sandoz Pharmaceutical Co., Ltd.) für 30 Minuten behandelt oder Röntgenstrahlen (50 g Strahlen) ausgesetzt, gefolgt von viermaligem Waschen mit RPMI 1640-Medium. Nachdem eine Platte mit 96 Vertiefungen (10000 Zellen/Vertiefung) mit den B-Zellen beimpft worden war, wurde das rekombinante Cha o 1 oder Cha o 2 in einer Endkonzentration von 10 g/ml hinzugefügt. Zu der Kontrollgruppe wurde ein hämolytisches Streptococcen-Zellwand-Antigen (SCW) in einer Endkonzentration von 10 μg/ml, ein Candida albicans-Antigen (CA) in einer Endkonzentration von 10 μg/ml und ein Tuberculin-Antigen (PPD) in einer Endkonzentration von 1 μg/ml zugefügt. Danach wurde jede Vertiefung mit der T-Zelllinie (20000 Zellen/Vertiefung) von demselben Patienten, dessen B-Zelllinie etabliert worden war, beimpft. Nach 48 Stunden Inkubation wurden 0,5 μCi [3H]Thymidin zu jeder Vertiefung zugefügt, und die Inkubation wurde für weitere 16 Stunden fortgesetzt. Nachdem die Zellen auf einem Glasfilter unter Verwendung eines Zellernters (Berthold) gewonnen worden waren, wurde eine Aufnahme von [3H]Thymidin in die Zellen mit einem Flüssig-Szintillationszähler gemessen, um die Zellwachstums-Antwort zu bestätigen.
  • Nachdem für die T-Zelllinie bestätigt worden war, dass sie spezifisch als Antwort auf Cha o 1 oder Cha o 2 proliferiert hatte, wurde die Wachstums-Antwort der T-Zelllinie auf jedes der überlappenden Peptide (Endkonzentration von 1 μM) auf dieselbe Weise wie oben unter Verwendung der T-Zelllinie, die in Beispiel 3 etabliert wurde, untersucht. Ein mittlerer Stimulierungs-Index der T-Zelllinie als Wachstums-Antwort auf die überlappenden Peptide, eine Erscheinungs-Häufigkeit und ein Positivitäts-Index, der davon berechnet wurde, sind in 1 und 5 gezeigt.
  • Zusätzlich wurde die Wachstums-Antwort der T-Zelllinie (N = 17) auf modifizierte Sequenzen (SEQ ID NO: 89 und NO: 90), die den Aminosäuresequenzen #2-11 und #2-12 entsprachen, in denen ein Aminosäurerest substituiert worden war, untersucht. Diese zwei modifizierten Sequenzen zeigten eine T-Zell-stimulierende Aktivität von 1,6 und 1,2 in Bezug auf den Stimulierungs-Index, 16% und 11% in Bezug auf die Erscheinungs-Häufigkeit und 25,6 und 13,2 in Bezug auf den Positivitäts-Index. Wie oben dargelegt, behielt das Peptid aus T-Zellepitopen der vorliegenden Erfindung seine T-Zell-stimulierende Aktivität sogar, wenn ein oder mehrere Aminosäurereste mutiert waren, und die Aktivität wurde in einigen Fällen verstärkt.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Die vorliegende Erfindung liefert Peptide, die mindestens ein T-Zellepitop von Cha o 1 oder Cha o 2, die Hauptallergene von japanischen Zypressenpollen sind, enthalten. Die vorliegende Beschreibung beschreibt darüber hinaus ein Peptidfragment von anderen Baumpollen, das eine immunologische T-Zell-Kreuzreaktivität mit den Peptiden zeigt. Diese Peptide sind wirksam für eine auf dem Peptid basierende Immuntherapie einer Pollinose, die durch Baumpollen im Frühling, die durch die japanischen Zypressenpollen vertreten werden, verursacht wird.
  • Sequenzprotokoll
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Claims (10)

  1. Peptid, bestehend aus mindestens einem T-Zell-Epitop (a) des japanischen Zypressenpollen-Allergens Cha o 1, wobei jedes der Epitope aus einer Aminosäuresequenz besteht, ausgewählt aus Peptid #1-2 (SEQ ID NO: 4), Peptid #1-4 (SEQ ID NO: 6), Peptid #1-5 (SEQ ID NO: 7), Peptid #1-6 (SEQ ID NO: 8), Peptid #1-7 (SEQ ID NO: 9), Peptid #1-10 (SEQ ID NO: 12), Peptid #1-11 (SEQ ID NO: 13), Peptid #1-12 (SEQ ID NO: 14), Peptide #1-14 (SEQ ID NO: 16), Peptid #1-15 (SEQ ID NO: 17), Peptid #1-16 (SEQ ID NO: 18), Peptid #1-19 (SEQ ID NO: 21), Peptid #1-20 (SEQ ID NO: 22), Peptid #1-21 (SEQ ID NO: 23), Peptid #1-22 (SEQ ID NO: 24), Peptid #1-23 (SEQ ID NO: 25), Peptid #1-24 (SEQ ID NO: 26), Peptid #1-25 (SEQ ID NO: 27), Peptid #1-27 (SEQ ID NO: 29), Peptid #1-30 (SEQ ID NO: 32), Peptid #1-31 (SEQ ID NO: 33), Peptid #1-33 (SEQ ID NO: 35) und Peptid #1-34 (SEQ ID NO: 36) gezeigt in 4, und T-Zell-stimulierende Aktivität auf T-Zellen von Patienten mit japanische Zypresse-Pollinose hat, oder einem Teil dieser Aminosäuresequenz, wobei dieser Teil T-Zell-stimulierende Aktivität auf T-Zellen von Patienten mit japanische Zypresse-Pollinose hat und mindestens sieben Aminosäurereste enthält, wobei dieser Teil nicht ein Teil des Peptids #1-22 (SEQ ID NO: 24) ist; (b) des japanischen Zypressenpollen-Allergens Cha o 2, wobei jedes der Epitope aus einer Aminosäuresequenz besteht, ausgewählt aus Peptid #2-5 (SEQ ID NO: 42), Peptid #2-7 (SEQ ID NO: 44), Peptid #2-8 (SEQ ID NO: 45), Peptid #2-9 (SEQ ID NO: 46), Peptid #2-10 (SEQ ID NO: 47), Peptid #2-11 (SEQ ID NO: 48), Peptid #2-12 (SEQ ID NO: 49), Peptid #2-13 (SEQ ID NO: 50), Peptid #2-14 (SEQ ID NO: 51), Peptid #2-15 (SEQ ID NO: 52), Peptid #2-16 (SEQ ID NO: 53), Peptid #2-17 (SEQ ID NO: 54), Peptid #2-18 (SEQ ID NO: 55), Peptid #2-19 (SEQ ID NO: 56), Peptid #2-20 (SEQ ID NO: 57), Peptid #2-21 (SEQ ID NO: 58), Peptid #2-22 (SEQ ID NO: 59), Peptid #2-23 (SEQ ID NO: 60), Peptid #2-24 (SEQ ID NO: 61), Peptid #2-25 (SEQ ID NO: 62), Peptid #2-26 (SEQ ID NO: 63), Peptid #2-27 (SEQ ID NO: 64), Peptid #2-30 (SEQ ID NO: 67), Peptid #2-31 (SEQ ID NO: 68), Peptid #2-32 (SEQ ID NO: 69), Peptid #2-33 (SEQ ID NO: 70), Peptid #2-34 (SEQ ID NO: 71), Peptid #2-35 (SEQ ID NO: 72), Peptid #2-36 (SEQ ID NO: 73), Peptid #2-37 (SEQ ID NO: 74), Peptid #2-38 (SEQ ID NO: 75), Peptid #2-40 (SEQ ID NO: 77), Peptid #2-41 (SEQ ID NO: 78), Peptid #2-42 (SEQ ID NO: 79) und Peptid #2-43 (SEQ ID NO: 80) gezeigt in 8, und T-Zell-stimulierende Aktivität auf T-Zellen von Patienten mit japanische Zypresse-Pollinose hat, oder einem Teil dieser Aminosäuresequenz, wobei dieser Teil T-Zell-stimulierende Aktivität auf T-Zellen von Patienten mit japanische Zypresse-Pollinose hat und mindestens sieben Aminosäurereste enthält; oder (c) eines Peptids mit der Aminosäuresequenz ausgewählt aus Peptid #1-2 (SEQ ID NO: 4), Peptid #1-4 (SEQ ID NO: 6), Peptid #1-6 (SEQ ID NO: 8), Peptid #1-7 (SEQ ID NO: 9), Peptid #1-10 (SEQ ID NO: 12), Peptid #1-11 (SEQ ID NO: 13), Peptid #1-12 (SEQ ID NO: 14), Peptid #1-14 (SEQ ID NO: 16), Peptid #1-15 (SEQ ID NO: 17), Peptid #1-16 (SEQ ID NO: 18), Peptid #1-19 (SEQ ID NO: 21), Peptid #1-20 (SEQ ID NO: 22), Peptid #1-21 (SEQ ID NO: 23), Peptid #1-23 (SEQ ID NO: 25), Peptid #1-24 (SEQ ID NO: 26), Peptid #1-27 (SEQ ID NO: 29), Peptid #1-30 (SEQ ID NO: 32), Peptid #1-31 (SEQ ID NO: 33), Peptid #1-33 (SEQ ID NO: 35) und Peptid #1-34 (SEQ ID NO: 36) gezeigt in 4, und Peptid #2-5 (SEQ ID NO: 42), Peptid #2-7 (SEQ ID NO: 44), Peptid #2-8 (SEQ ID NO: 45), Peptid #2-9 (SEQ ID NO: 46), Peptid #2-10 (SEQ ID NO: 47), Peptid #2-11 (SEQ ID NO: 48), Peptid #2-12 (SEQ ID NO: 49), Peptid #2-13 (SEQ ID NO: 50), Peptid #2-14 (SEQ ID NO: 51), Peptid #2-15 (SEQ ID NO: 52), Peptid #2-16 (SEQ ID NO: 53), Peptid #2-17 (SEQ ID NO: 54), Peptid #2-18 (SEQ ID NO: 55), Peptid #2-19 (SEQ ID NO: 56), Peptid #2-20 (SEQ ID NO: 57), Peptid #2-21 (SEQ ID NO: 58), Peptid #2-22 (SEQ ID NO: 59), Peptid #2-23 (SEQ ID NO: 60), Peptid #2-24 (SEQ ID NO: 61), Peptid #2-25 (SEQ ID NO: 62), Peptid #2-26 (SEQ ID NO: 63), Peptid #2-27 (SEQ ID NO: 64), Peptid #2-30 (SEQ ID NO: 67), Peptid #2-31 (SEQ ID NO: 68), Peptid #2-32 (SEQ ID NO: 69), Peptid #2-33 (SEQ ID NO: 70), Peptid #2-34 (SEQ ID NO: 71), Peptid #2-35 (SEQ ID NO: 72), Peptid #2-36 (SEQ ID NO: 73), Peptid #2-37 (SEQ ID NO: 74), Peptid #2-38 (SEQ ID NO: 75), Peptid #2-40 (SEQ ID NO: 77), Peptid #2-41 (SEQ ID NO: 78), Peptid #2-42 (SEQ ID NO: 79) und Peptid #2-43 (SEQ ID NO: 80) gezeigt in 8, wobei diese Sequenz durch die Substitution einer Aminosäure modifiziert ist und in der Lage ist, Aktivitäten von T-Zellen von Patienten mit japanische Zypresse-Pollinose zu stimulieren und/oder zu unterdrücken; und gegebenenfalls einem Linker, der sensitiv gegenüber der enzymatischen Spaltung zwischen zwei Epitopen ist.
  2. Peptid nach Anspruch 1, wobei das Peptid von (c) aus einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 89 oder SEQ ID NO: 90 besteht.
  3. Peptid nach Anspruch 1, wobei das Peptid aus mindestens zwei T-Zell-Epitopen besteht, ausgewählt aus den T-Zell-Epitopen wie in Anspruch 1 beschrieben und einem T-Zell-Epitop bestehend aus einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Peptid #1-8 (SEQ ID NO: 10), Peptid #1-26 (SEQ ID NO: 28) und Peptid #1-32 (SEQ ID NO: 34), oder einem Teil dieser Aminosäuresequenz, wobei dieser Teil T-Zell-stimulierende Aktivität auf T-Zellen von Patienten mit japanische Zypresse-Pollinose hat und mindestens sieben Aminosäurereste enthält; und gegebenenfalls einen Linker, der sensitiv gegenüber der enzymatischen Spaltung zwischen den Epitopen ist.
  4. Arzneimittel, umfassend das Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als wirksamen Bestandteil.
  5. Verwendung des Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung einer Zusammensetzung für auf dem Peptid basierende Immuntherapie von japanische Zypresse-Pollinose.
  6. Diagnostikum, umfassend das Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als wirksamen Bestandteil.
  7. Verwendung des Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für die Herstellung eines Reagenzes zur Diagnose von japanische Zypresse-Pollinose.
  8. Nucleinsäure, die das Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert.
  9. Wirtszelle, transformiert mit einer Nucleinsäure nach Anspruch 8.
  10. Verfahren zur Herstellung eines T-Zell-Epitop-Peptids, umfassend das Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 9 und das Ernten des Peptids aus der Kultur. SEQUENZPROTOKOLL
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