DE69738419T2

DE69738419T2 - Testverfahren zur suche heteroduplexer dna (hta) für die genotypisierung von hcv

Info

Publication number: DE69738419T2
Application number: DE69738419T
Authority: DE
Inventors: Amy J. Benicia WEINER
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1996-04-19
Filing date: 1997-04-11
Publication date: 2008-12-18
Anticipated expiration: 2017-04-12
Also published as: ATE382093T1; JP2007068542A; EP0904406A1; JP2000508907A; ES2297857T3; CA2251673C; JP2012080890A; WO1997040190A1; DE69738419D1; JP2008228736A; EP0904406B1; CA2251673A1; US5851759A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Genotypisierung von Hepatitis C-Viren (HCV). Insbesondere betrifft diese Erfindung spezifische Primer, vorzugsweise aus der Kern- bzw. Nucleocapsid-(„core") und Hüllregion von HCV, und ein Verfahren zur Bestimmung von HCV-Genotypen mit einem Heteroduplex-Mobilitäts- oder -Tracking-Assay, der wiederum spezifische Primer verwendet.
Hintergrund der Erfindung
Es ist bekannt, dass Virushepatitis durch fünf verschiedene Viren verursacht wird, die als Hepatitis A, B, C, D und E bekannt sind. HAV ist ein RNA-Virus und führt nicht zu lange anhaltenden klinischen Symptomen. HBV ist ein DNA-Virus. HDV ist ein abhängiges Virus, das in Abwesenheit von HBV unfähig ist, Zellen zu infizieren. HEV ist ein wasserbürtiges Virus. HCV wurde zunächst als eine Ursache für Nicht-A-Nicht-B-Hepatitis, NANBH, identifiziert und charakterisiert (Houghton et al., EPA-Veröffentlichungs-Nrn. 388,232 und 318,216 ). Dies führte zur Entdeckung einer Anzahl von allgemeinen und spezifischen Polypeptiden, die als immunologische Reagenzien bei der Identifizierung von HCV verwendbar sind. Siehe z. B. Choo et al., (1989) Science, 244: 359–262; Kuo et al., (1989) Science 244: 362–364 und Hougthon et al., (1991) Hepatology 14: 381–388.
HCV ist ein einzelsträngiges RNA-Virus, entfernt verwandt mit dem Pestivirus und Flavivirus, ist das auslösende Agens der großen Mehrheit von (Fällen der) Transfusionsassoziierten Hepatitis und der meisten Fälle von ambulant erworbener („community-acquired") Nicht-A-Nicht-B-Hepatitis weltweit. Das HCV-Genom besteht aus 5'- und 3'-nichtcodierenden (NC) Regionen, die einen einzelnen langen offenen Leserahmen (ORF) flankieren. Dieser ORF codiert für drei Strukturproteine am aminoterminalen Ende und für sechs Nichtstruktur (NS)-Proteine am Carboxy-terminalen Ende. Die Strukturproteine werden von bzw. ab den Nucleocapsid(Kern bzw. „core"; C)-Proteinen und zwei Glycoproteinen, Envelope 1 (E1) und Envelope 2 (E2), wiedergegeben. Die Nichtstrukturproteine werden mit NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b bezeichnet. Die 5'-NCR ist der am stärksten konservierte Teil des HCV-Genoms, wohingegen die Sequenz der zwei Hüllproteine (E1 und E2) zwischen unterschiedlichen HCV-Isolaten in hohem Maße variabel ist. Der höchste Variationsgrad ist in einer Region innerhalb von E2 beobachtet worden, die nun üblicherweise als hypervariable Region 1 (HVR1) oder E2HV bezeichnet wird. Eine zweite variable Region, als die HVR2 bezeichnet, existiert auch in einer Teilmenge der Isolate. Typischerweise ist die genetische Heterogenität von HCV unter den zwei Überschriften Quasispezies und Gentypen klassifiziert worden. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Quasispezies" auf die genetische Heterogenität der HCV-Population innerhalb eines infizierten Individuums. Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe „Genotyp" und „Subtyp” auf die Genomheterogenität, die zwischen unterschiedlichen HCV-Isolaten beobachtet wird. Die Analyse der Nucleinsäuresequenzvariation des HCV-Genoms, ein positivsträngiges RNA-Molekül mit einer Größe von näherungsweise 9,4 kb, legt nahe, dass die genetische Variabilität mit wichtigen virologischen und klinischen Auswirkungen assoziiert ist.
Das Prototyp-Isolat von HCV wurde in den EP-Veröffentlichungs Nrn. 318,261 und 388,232 charakterisiert. Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff „HCV" neu isolierte NANBH-Virusarten. Der Begriff „HCV-1" bezieht sich auf das in den oben genannten Druckschriften beschriebene Virus.
Seit der anfänglichen Identifikation von HCV sind wenigstens sechs unterschiedliche Hauptvirustypen identifiziert (Volllängengenome beschrieben) und als Typ 1, 2, 3, 4, 5 und 6 bezeichnet worden. Innerhalb dieser Typen gibt es zahlreiche Subtypen. Der Virustyp, mit dem ein Patient infiziert ist, kann die klinische Prognose und auch die Reaktion auf verschiedene Behandlungen beeinflussen. Siehe Yoshioke et al., (1992) Hepatology 16: 293–299. Angesichts dessen, dass das ernsteste klinische Ergebnis einer HCV-Infektion ein Leberzellkarzinom ist, wäre es nützlich, festzustellen, mit welchem Typ oder welchen Typen von HCV ein Patient infiziert ist. Es ist somit von besonderer Bedeutung, einen genauen, zuverlässigen Assay zur HCV-Genotypisierung und -Subtypisierung zu entwickeln, der ohne das Erfordernis der Sequenzierung auch die genetische Divergenz zwischen Subtypen („intra-subtype") ausgeben könnte. Mehrere Klassifikationen sind für die HCV-Genotypisierung auf der Basis der Analyse von verschiedenen Regionen vorgeschlagen worden, da das ideale Nucleotidsequenz-basierte System, bei dem das komplette Virusgenom verwendet wird, nicht praktisch ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfasst Primer und Verfahren zur Charakterisierung der HCV-Genotypisierung und der Variation zwischen Subtypen, basierend auf dem Heteroduplex-Tracking-Assay (HTA). Die bevorzugten Sonden/Primer waren einzelsträngig, abgeleitet vom Carboxyterminus der Kern- und einem Teil der E1-Region von HCV.
Der HTA ist ein Hybridisierungs-basiertes Verfahren zur Bestimmung der genetischen Verwandtschaft bzw. Beziehung zwischen zwei oder mehr viralen Genomen. Die Basis des Verfahrens ist, dass sich verwandte DNA-Produkte, coamplifiziert ausgehend von divergierenden Matrizen, zufällig unter Bildung von Heteroduplexen reassoziieren bzw. wiederanlagern, die mit verringerter Mobilität in Systemen, die zum Auftrennen von Molekülen auf Grundlage der Größe konzipiert sind, wie neutrale Polyacrylamidgele, wandern. Der HTA wurde ursprünglich verwendet, um HIV-1 zu genotypisieren und um die in vivo-Evolution von HIV-1 in Patienten und Populationen zu verfolgen. Siehe z. B. Delwart et al., (1993) Science 262: 1757–1261 und Delwart et al., (1994) J. Virol. 68: 6772–6883.
Wilson et al., J. Gen. Virol. (1995) 76: 1763–71, beschreiben die Verwendung einer Heteroduplex-Gelshift-Analyse (GSA) von HVR1-Sequenzen, direkt amplifiziert aus den Seren von Patienten, zum Charakterisieren von HCV-Quasispezies.
Die Erfindung stellt ein Oligonucleotid bereit, bestehend aus einer der Sequenzen der SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 und 9.
Die Erfindung stellt auch ein PCR-Primerpaar bereit, worin der Senseprimer aus SEQ ID NO: 1 besteht und der Antisenseprimer aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5, ausgewählt ist.
Die Erfindung stellt auch ein PCR-Primerpaar bereit, worin der Antisenseprimer aus SEQ ID NO: 6 besteht und der Senseprimer aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9, ausgewählt ist.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Bestimmung des HCV-Genotyps eines HCV-Stammes bereit, wobei das Verfahren die Stufen umfasst:

(a) Unterwerfen des HCV-Stammes einer oder mehreren Stufe(n) von PCR, wobei die eine oder mehrere Stufe(n) von PCR eine Sensesonde aus der Kern- bzw. Nucleocapsid- oder E1-Region des HCV-Genoms und eine Antisensesonde aus der Kern- bzw. Nucleocapsid- oder E1-Region des HCV-Genoms verwendet bzw. verwenden;
(b) Bilden einer Heteroduplex durch Denaturieren der reassoziierenden Gemische („reannealing mixtures") des amplifizierten Produkts, das in Stufe (a) erhalten wurde, mit DNA- oder RNA-Fragmenten eines bekannten HCV-Genotyps;
(c) Vergleichen der Mobilität der Heteroduplex auf einem System, das nach Größe trennt, mit der Mobilität einer Homoduplex aus den DNA- oder RNA-Fragmenten eines bekannten Genotyps, um den Gentyp des HCV-Stammes zu bestimmen.

Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Vorhersage der Antwort auf eine Arzneimitteltherapie für einen HCV-Stamm in einem Patienten, der mit dem HCV-Stamm infiziert ist, bereit, wobei das Verfahren die Bestimmung der Empfindlichkeit der bekannten HCV-Genotypen gegenüber der Arzneimitteltherapie, die Bestimmung des HCV-Gentyps des HCV-Stammes durch das erfindungsgemäße Verfahren und den Vergleich des HCV-Genotyps des Stammes vor der Arzneimitteltherapie mit der Empfindlichkeit der bekannten HCV-Genotypen gegenüber der Arzneimitteltherapie umfasst.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Vorhersage der Antwort bzw. Reaktion auf einen therapeutischen Impfstoff gegen einen HCV-Stamm aus einem mit dem HCV-Stamm infizierten Patienten bereit, wobei das Verfahren die Bestimmung der Empfindlichkeit der bekannten HCV-Genotypen gegenüber dem therapeutischen Impfstoff, die Bestimmung des HCV-Genotyps des HCV-Stammes durch das erfindungsgemäße Verfahren und den Vergleich des HCV-Genotyps des Stammes vor der Verabreichung des therapeutischen Impfstoffs mit der Empfindlichkeit bekannter HCV-Gentypen gegenüber dem therapeutischen Impfstoff umfasst.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Vorhersage der Eignung einer prophylaktischen Impfstoffzusammensetzung für eine gegebene Probenpopulation bereit, wobei das Verfahren die Bestimmung des Genotyps des prophylaktischen Impfstoffs, die Bestimmung des Vorherrschens von bekannten HCV-Genotypen in der Probenpopulation durch das erfindungsgemä ße Verfahren und das Vergleichen des HCV-Genotyps des prophylaktischen Impfstoffstammes mit dem bestimmten vorherrschenden Genotyp vor der Verabreichung des prophylaktischen Impfstoffs an die Probenpopulation umfasst.
Ein Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Genotypisierung von HCV, umfassend die Stufen des Denaturierens und Reassoziierens von partiell komplementären DNA- oder RNA-Strängen und des Detektierens der Sequenzvariation durch Feststellung der elektrophoretischen Mobilität der DNA-Heteroduplexe auf einem System, das zum Auftrennen von Molekülen auf der Basis der Größe konzipiert ist, wie durch verfolgende Elektrophorese durch ein Polyacrylamid oder MDE-Gel.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Sonden, die in der Genotypisierung verwendet wurden, die aus der Kern- bzw. Nucleocapsid- und E1-Region des HCV-Genoms ausgewählt wurden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vorhersage der Antwort auf eine Arzneimitteltherapie für einen Patienten, der mit einem HCV-Stamm infiziert ist, durch Bestimmung der Empfindlichkeit von verschiedenen bekannten Gentypen gegenüber der Arzneimitteltherapie, Bestimmung des Gentyps des HCV-Stammes, mit dem der Patient infiziert ist, und Vergleichen des Genotyps mit seiner Arzneimitteltherapie-Empfindlichkeit, um die Antwort des Patienten auf die Arzneimitteltherapie vorherzusagen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft therapeutische Impfstoffe und die Vorhersage, welcher therapeutische Impfstoff verwendet werden sollte, indem der Genotyp für einen Patienten, der mit einem HCV-Stamm infiziert ist, bestimmt und ein therapeutischer Impfstoff des gleichen Genotyps verabreicht wird.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft prophylaktische Impfstoffe und die Vorhersage, welcher Impfstoff einer bestimmten Populationsprobe verabreicht werden sollte, indem die vorherrschenden Genotypen in einer derartigen Probe bestimmt werden und der Populationsprobe ein prophylaktischer Impfstoff eines Genotyps, für den wahrscheinlich ist, dass er der vorherrschende Genotyp ist, verabreicht wird.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Befähigung zum Entdecken neuer HCV-Genotypen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die 1A–1E sind Autoradiogramme, die Homoduplexe und Heteroduplexe der Proben zeigen, die mit den Sonden der bekannten Gentypen zu typisieren sind (einzelsträngige Sonden („ss grobes") haben in den 1A–1E jeweils die Genotypen 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, Bahn weit links auf dem MDE-Gel). Die Homoduplex (h) (einzelsträngige Sonde zum doppelsträngigen RT-PCR-Produkt bekannten Genotyps, von der sie abgeleitet wurde) ist neben der Sonde gezeigt. Die Heteroduplexe der RT-PCR-Produkte aus den 15 Dialysepatienten (Nrn. 1, 2, 3, 4, 7, 18, 20, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 33, 35), hybridisiert mit der einzelsträngigen Sonde, sind über der entsprechenden Bahn in jeder Figur bezeichnet.
Die 2A–2C sind Dendrogramme, d. h. phylogenetische Stammbäume, die die Verwandtschaft bzw. den Verwandtschaftsgrad von jeder partiellen E1-Nucleotidsequenz, gebildet durch Vergleichen von partiellen E1-Sequenzen, erhalten durch Sequenzieren von Isolaten des mutmaßlichen Typs 1 (nt 625–930), Typs 2 (nt 583–915) oder Typs 3 (nt 558–834) aus den Dialysepatienten, hierin beschrieben, mit publizierten Genotypsequenzen für Typ 1a (HCV-1) (Choo, et al., PNAS (1991) 88: 2451–2455, alle Nucleotide, „nt", Bezeichnungen gemäß dieser Druckschrift), 1b (HCV-J) (Kato et al., PNAS (1990) 87: 9524–2528), 2a (HC-J6) (Okamoto et al., Virol. (1992) 188: 331–341), 2b (HC-J8) (Okamoto et al., Virol. (1992) 188: 331–341), 2c (Bukh, et al., PNAS (1993) 90: 8234–8239) und 3a (NZL-1) (Sakamoto, et al., J. Gen. Virol. (1994) 75: 1761–1768), für die gleiche Region des Genoms zeigen.
2D ist ein Dendrogramm, ein phylogenetischer Stammbaum, gebildet durch Vergleichen von jeder der partiellen 5'-UTR-Sequenzen der Isolate 23, 30 und 33, erhalten mittels direkter Sequenzierung, mit publizierten Genotypsequenzen von Typ 1, 2 und 3 (nt –274 bis –81), für die gleiche Region des Genoms.
Die 3A–3D zeigen die Nucleotidsequenzen für die Dendrogramme, die in den 2A–2D dargestellt sind.
Beschreibung der Erfindung
Die Ausführung der vorliegenden Erfindung wird, sofern nicht anders angegeben, herkömmliche Techniken der Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanten DNA-, Polypeptid- und Nucleinsäure-Synthese und der Immunologie einsetzen, die innerhalb der Fähigkeiten auf dem Fachgebiet liegen. Derartige Techniken sind in der Literatur vollständig erläutert. Siehe z. B. Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, ZWEITE AUSGABE (1989); DNA CLONING, BÄNDE I UND II (D.N Glover, Hrsg., 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M.J. Gait, Hrsg., 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B.D. Hames & S.J. Higgins, Hrsg., 1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (B.D. Hames & S.J. Higgins, Hrsg., 1984); ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, Hrsg., 1986); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); die Reihen METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J.H. Miller und M.P. Calos, Hrsg., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Bd. 154 und Bd. 155 (Wu und Grossman bzw. Wu, Hrsg.), Mayer und Walker, Hrsg. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London), Scopes, (1987), PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICS, Zweite Ausgabe (Springer-Verlag, N.Y.) und HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, BÄNDE I-IV (D.M. Weir und C.C. Blackwell, Hrsg, 1986).
In dieser Beschreibung werden Standardabkürzungen für Nucleotide und Aminosäuren verwendet.
Der Begriff „rekombinantes Polynucleotid", wie hierin verwendet, meint ein Polynucleotid mit genomischer, cDNA-, semisynthetischer oder synthetischer Herkunft, das aufgrund seiner Herkunft oder Manipulation:

(1) nicht mit dem gesamten oder einem Teil eines Polynucleotids, mit dem es in der Natur assoziiert ist, assoziiert ist, (2) mit einem anderen Polynucleotid verknüpft ist, außer dem, mit dem es in der Natur verknüpft ist, oder (3) nicht in der Natur vorkommt.

Der Begriff „Polynucleotid", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine polymere Form von Nucleotiden von beliebiger Länge, entweder Ribonucleotide oder Desoxyribonucleotide. Dieser Begriff bezieht sich nur auf die Primärstruktur des Moleküls. Somit umfasst dieser Begriff doppel- und einzelsträngige DNA und RNA. Er umfasst auch bekannte Typen von Modifikationen, zum Beispiel Markierungen bzw. Label, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, Methylierung, „Caps", Substitution von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nucleotide durch ein Analogon, Internucleotidmodifikationen, wie z. B. die mit ungeladenen Verknüpfungen (z. B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoamidate, Carbamate usw.) und mit geladenen Verknüpfungen (z. B. Phosphorothioate, Phosphorodithioate usw.), die, die Seitengruppierungen enthalten, wie z. B. Proteine (einschließlich z. B. Nucleasen, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, Poly-L-Lysin usw.), die mit Interkalatoren (z. B. Acridin, Psoralen usw.), die, die Chelatbildner enthalten (z. B. Metalle, radioaktive Metalle, Bor, oxidative Metalle usw.), die, die Alkylierungsmittel enthalten, die mit modifizierten Verknüpfungen (z. B. alpha-anomere Nucleinsäuren usw.) sowie nichtmodifizierte Formen des Polynucleotids.
Mit „PCR" ist hierin die Polymerasekettenreaktions(PCR)-Technik gemeint, die von Mullis in den U.S. Patenten Nrn. 4,683,195 (Mullis et al.) und 4,683,202 beschrieben wurde. Bei der PCR-Technik werden kurze Oligonucleotidprimer hergestellt, die mit gegenüberliegenden Enden einer gewünschten DNA-Sequenz übereinstimmen. Die Sequenz zwischen den Primern muss nicht bekannt sein. Eine DNA-(oder RNA-)Probe wird extrahiert und denaturiert (vorzugsweise durch Hitze). Anschließend werden Oligonucleotidprimer in molarem Überschuss zusammen mit dNTPs und einer Polymerase (vorzugsweise Tag-Polymerase, die gegenüber Hitze stabil ist) zugegeben. Die DNA wird repliziert, anschließend wieder denaturiert. Dies resultiert in zwei „langen" Produkten, die mit den jeweiligen Primern beginnen und den zwei Originalsträngen (pro Duplex-DNA-Molekül). Das Reaktionsgemisch wird dann wieder auf Polymerisierungsbedingungen gebracht (z. B. durch Senkung der Temperatur, Inaktivierung eines Denaturierungsmittels oder Zugabe von mehr Polymerase) und ein zweiter Zyklus wird begonnen. Der zweite Zyklus liefert die zwei Originalstränge, die zwei langen Produkte aus Zyklus 1, zwei neue lange Produkte (repliziert ausgehend von den Originalsträngen) und zwei „kurze" Produkte, repliziert ausgehend von den langen Produkten. Die kurzen Produkte besitzen die Sequenz der Zielsequenz (Sense oder Antisense) mit einem Primer an jedem Ende. Bei jedem zusätzlichen Zyklus werden zwei zusätzliche lange Produkte erzeugt und eine Zahl an kurzen Produkten, die gleich der Zahl an langen und kurzen Produkten, die am Ende des vorigen Zyklus zu rückbleiben, ist. Somit wächst die Zahl an kurzen Produkten exponentiell mit jedem Zyklus. Diese Amplifikation einer spezifischen Analytensequenz ermöglicht die Detektion von extrem kleinen DNA-Mengen.
Der Begriff „3SR", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Verfahren zur Zielnucleinsäure-Amplifikation, das auch als das System der „selbst-fortsetzenden Sequenzreplikation" bekannt ist, wie im Europäischen Patent, Veröffentlichungs-Nr. 373,960 , (veröffentlicht am 20. Juni 1990) beschrieben.
Der Begriff „LCR", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Verfahren zur Zielnucleinsaure-Amplifikation, das auch als die „Ligasekettenreaktion" bekannt ist, wie von Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1991) 88: 189–193 beschrieben.
Ein „offener Leserahmen" (ORF) ist eine Region einer Polynucleotidsequenz, die für ein Polypeptid codiert; diese Region kann einen Teil einer codierenden Sequenz oder eine gesamte codierende Sequenz darstellen.
Eine „codierende Sequenz" ist eine Polynucleotidsequenz, die in ein Polypeptid translatiert wird, üblicherweise über mRNA, wenn sie unter die Kontrolle von geeigneten Regulationssequenzen gestellt ist. Die Grenzen der codierenden Sequenz werden durch ein Translationsstartcodon am 5'-Terminus und ein Translationsstoppcodon am 3'-Terminus bestimmt. Eine codierende Sequenz kann cDNA- und rekombinante Polynucleotidsequenzen umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Polypeptid" auf ein Polymer aus Aminosäuren und bezieht sich nicht auf eine spezifische Länge des Produkts; somit sind Peptide, Oligopeptide und Proteine in die Definition von Polypeptid eingeschlossen. Dieser Begriff bezieht sich auch nicht auf nach der Expression erfolgende Modifikationen des Polypeptids, z. B. Glycosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und dergleichen, oder schließt diese aus. In die Definition eingeschlossen sind z. B. Polypeptide, die ein Analogon oder mehrere Analoga einer Aminosäure (einschließlich z. B. nicht-natürliche Aminosäuren usw.) enthalten, Polypeptide mit substituierten Verknüpfungen, sowie andere Modifikationen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, sowohl natürlich auftretende als auch nicht-natürlich auftretende.
Eine Polypeptid- oder Aminosäuresequenz, die „abgeleitet ist von" bzw. „stammt von" einer bezeichneten Nucleinsäuresequenz, bezieht sich auf ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die zu der eines Polypeptids, das in der Sequenz codiert ist, oder einem Teil davon identisch ist, wobei der Teil aus wenigstens 3–5 Aminosäuren, stärker bevorzugt wenigstens 8–10 Aminosäuren und noch stärker bevorzugt wenigstens 11–15 Aminosäuren besteht, oder das mit einem Polypeptid, das in der Sequenz codiert ist, immunologisch identifizierbar ist. Diese Terminologie umfasst auch ein Polypeptid, das ausgehend von einer bezeichneten Nucleinsäuresequenz exprimiert wird.
Das Protein kann zur Herstellung von Antikörpern, entweder monoklonal oder polyklonal, die für das Protein spezifisch sind, verwendet werden. Verfahren zum Herstellen dieser Antikörper sind auf dem Fachgebiet bekannt.
„Rekombinante Wirtszellen", „Wirtszellen", „Zellen", „Zellkulturen" und andere derartige Begriffe bezeichnen z. B. Mikroorganismen, Insektenzellen und Säugerzellen, die als Empfänger für rekombinante Vektor- oder andere Transfer-DNA verwendet werden können oder verwendet worden sind, und umfassen die Nachkommenschaft der ursprünglichen Zelle, die transformiert worden ist. Es wird verstanden, dass die Nachkommenschaft einer einzelnen Elternzelle nicht notwendigerweise in der Morphologie oder im genomischen oder gesamten DNA-Komplement mit dem ursprünglichen Elter aufgrund natürlicher zufälliger oder absichtlicher Mutation vollständig identisch sein muss. Beispiele für Säugerwirtszellen umfassen Chinesischer-Hamster-Ovar (CHO) und Affennieren(COS)-Zellen.
Mit „cDNA" ist eine komplementäre mRNA-Sequenz gemeint, die mit einem komplementären Strang von mRNA hybridisiert.
Mit „gereinigt" und „isoliert" ist bei Bezugnahme auf eine Polypeptid- oder Nucleotidsequenz gemeint, dass das angegebene Molekül unter wesentlicher Abwesenheit von anderen biologischen Makromolekülen des gleichen Typs vorliegt. Der Begriff „gereinigt", wie hierin verwendet, bedeutet, dass wenigstens 75 Gew.-%, stärker bevorzugt wenigstens 85 Gew.-%, noch stärker bevorzugt wenigstens 95 Gew.-% und am stärksten bevorzugt wenigstens 98 Gew.-% an biologischen Makromolekülen des gleichen Typs vorliegen (jedoch können Wasser, Puffer und andere kleine Moleküle, insbesondere Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 1000, vorliegen).
Mit „pharmazeutisch verträglicher Träger" ist ein beliebiger pharmazeutischer Träger gemeint, der selbst nicht die Produktion von Antikörpern, die für das Individuum, das die Zusammensetzung erhält, schädlich sind, induziert. Geeignete Träger sind typischerweise große, langsam metabolisierte Makromoleküle, wie Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglykolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäurecopolymere und inaktive Viruspartikel. Derartige Träger sind Durchschnittsfachleuten auf dem Gebiet gut bekannt.
Die therapeutischen Zusammensetzungen werden typischerweise pharmazeutisch verträgliche Vehikel, wie Wasser, Salzlösung, Glycerin, Ethanol usw., enthalten. Zusätzlich können Hilfssubstanzen, wie Benetzungsmittel oder Emulgatoren, pH-puffernde Substanzen und dergleichen, in derartigen Vehikeln vorhanden sein.
Typischerweise werden die therapeutischen Zusammensetzungen als injizierbare (Formen), entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, hergestellt; feste Formen, die zur Lösung oder Suspension in flüssigen Vehikeln vor der Injektion geeignet sind, können ebenso hergestellt werden. Die Zubereitung kann für eine verstärkte adjuvante Wirkung auch emulgiert oder in Liposome eingekapselt werden.
Beweise zeigen, dass unterschiedliche HCV-Genotypen unterschiedliche Pathogenitäten sowie verschiedene bzw. ausgeprägte geographische Verteilungen besitzen können und können teilweise unterschiedliche serologische Profile bei infizierten Patienten hervorrufen. Siehe Cammarota, et al., J. Clin. Microb. (1995) 33: 2781–2784. Die Erfindung umfasst Verfahren zur Detektion von HCV und zum Identifzieren einer Infektion durch unterschiedliche Typen von HCV. Die Erfindung umfasst die Genotypisierung von HCV, die Möglichkeit, einen neuen HCV-Genotyp zu entdecken, und die Beurteilung von Viruspopulationen bezüglich der Befähigung, eine Antwort auf eine Arzneimitteltherapie vorherzusagen. Die Erfindung umfasst auch Sonden zur Verwendung bei der Genotypisierung von HCV.
Die Verfahren zur Genotypisierung von HCV umfassen, ohne Beschränkung darauf, einen Heteroduplex-Tracking- oder -Mobilitäts-Assay unter Verwendung von Sonden/Primern aus der Kern-/E1-Region des HCV-Genoms. Die dokumentierten antigenen Unterschiede zwischen HCV-Genotypen würden nicht nur Anwendbarkeit bei der Durchmusterung von Blutspendern und der Vorhersage einer Antwort bzw. Reaktion auf IFN-Behandlung besitzen, sondern auch für die bezeichnete Zusammensetzung von Kandidatenimpfstoffen für HCV in verschiedenen Ländern, die Wahl von therapeutischen Impfstoffen, sowie bei der Identifizierung von neuen Genotypen. Andere Verfahren sind zum Identifizieren der Hauptgenotypen, die Populationen infizieren, vorgeschlagen worden, basierend auf der Analyse von verschiedenen Regionen des Genoms, wie RFLP. Siehe Davidson et al., J. Gen. Virol. (1995) 76: 1197–1204, für eine Diskussion der Genotypisierung von HCV unter Verwendung von RFLP von Sequenzen, amplifiziert aus der 5'-nicht-codierenden Region (NCR).
Die bekannten Nucleinsäure-basierten Verfahren der Genotypisierung erfordern Subtypspezifische RT-PCR(reverse Transkriptase-PCR)-Primer (siehe Okamoto (1992) J. Gen Virol 73: 673–679) ( U.S. Patent 5,427,909 ); (2) spezifische Sonden (G. Maiteen, et al, Line probe assay); (3) Restriktionsschnittstellen-Polymorphismus (eine Funktion der Nucleotidsequenz (nt)) oder (4) direkte Sequenzen zum Bestimmen des Genotyps. Die Analyse der 5'-NC-Sequenz mit RFLP ist leicht durchzuführen, sagt jedoch nicht alle HCV-Genotypen genau vorher, und einige Subtypen können fehlklassifiziert werden. Zum Beispiel ist die Änderung der Sequenz zwischen 1a und 1b, erkannt durch das Restriktionsenzym, nicht absolut und andere Sequenzen als 1a und 1b und 2a und 2b werden fehlklassifiziert. Beispielsweise würde Typ 1c als Typ 1a erscheinen, Typ 2c als entweder Typ 2a oder 2b. Siehe Cammarota et al., J. Clin. Microb., (1995) 33: 2781-2784. Aus diesem Grund ist RFLP nicht dazu fähig, „flüchtende" Arten, neue divergierende Arten oder epidemiologische Trends zu detektieren. Es ist wahrscheinlich, dass ein Typisierungsverfahren, wie RFLP, kontinuierlich modifiziert werden muss, um die rasch wachsende Information, die bezüglich der HCV-Sequenzheterogenität bereitgestellt wird, zu berücksichtigen.
Wie oben erwähnt, erhält man bei Verwendung der Nucleinsäure-basierten Verfahren der Genotypisierung ein Ergebnis von entweder einem Typ oder Subtyp oder ein negatives Ergebnis, das ein „nicht-typisierbares" Ergebnis ist. Siehe z. B. Cammarota et al., J. Clin. Microb., (1995) 33: 2781–2784; Isolate, die durch Genotyp-spezifische PCR nicht-typisiert blieben, wurden auf der Basis der Sequenzanalyse von PCR-Amplifikationen, erhalten aus den Kern- und NS5-Genen, als Subtyp 2c klassifiziert. Diese Schwierigkeit wird durch Verwendung der gegenwärtig beanspruchten Erfindung zum Bestimmen von HCV-Genotypen vermieden, indem RT-PCR-Primer im C-Terminus oder Kern bzw. „core"/mid 273 von E1 gewählt werden. Zusätzlich kann der Subtyp des Isolats unter Verwendung der vorliegenden Erfindung der HCV-Gentypisierung genau bestimmt werden und Isolate können detektiert werden, selbst die, die in weniger als näherungsweise 30% divergieren, was die Charakterisierung von neuen Subtypen ohne Sequenzierung ermöglicht.
Heteroduplex-Tracking- oder -Mobilitäts-Assays
Das Verfahren zur Bestimmung des HCV-Genotyps in der vorliegenden Erfindung verwendet geringe bzw. minore Varianten in komplexen Quasispezies. Eine derartige Technik ist der Heteroduplex-Tracking-Assay (HTA). Der HTA, im Fachgebiet zur Verwendung mit HIV gut bekannt (siehe z. B. Delwart, et al., J. Virol. (1994) 68: 6672–6683; Delwart, et al., Science (1993) 262: 1257–1261; Delwart, et al., PCR Methods and Applications 4: S202–S216 (19950 Cold Spring Harbor; und Delwart, et al., Protokoll zum „Heteroduplex Mobility Analysis HIV-1 env Subtyping Kit", Version 3), entstand aus der Beobachtung, dass bei Amplifikation von Sequenzen mittels nested bzw. geschachtelter PCR aus peripheren mononukleären Blutzellen von infizierten Individuen verwandte DNA-Produkte, coamplifiziert, ausgehend von divergierenden Matrizen, zufällig reassoziieren konnten, wodurch Heteroduplexe gebildet wurden, die mit verringerter Mobilität in neutralen Polyacrylamidgelen wandern. Unter Verwendung dieser Techniken kann man genetische Beziehungen zwischen mehreren Virus-DNA-Matrizenmolekülen etablieren.
Insbesondere verwendet der HTA ein erstes PCR-Produkt als eine markierte Sonde, sie kann radioaktiv sein, die mit einem Überschuss (Treiber) eines nicht-markierten PCR-Produkts aus einer unterschiedlichen Quelle, d. h. der Quelle, für die eine Typisierung gewünscht wird, gemischt wird. Die Sondensequenzen werden dann vollständig mit dem Treiber in Heteroduplexe getrieben und werden auf der Basis der Größe aufgetrennt. Ein Autoradiogramm, beispielsweise des resultierenden Polyacrylamidgels, offenbart nur diese Heteroduplexe und ergibt eine sichtbare Anzeige der Beziehung zwischen den zwei untersuchten Viruspopulationen. Die Tatsache, dass Heteroduplexe mit unterschiedlichen Mobilitäten wandern, zeigt, dass die Strangspezifische Zusammensetzung von fehlgepaarten und ungepaarten Nucleotiden deren Mobilität beeinflusst.
Anschließend wird eine Exponentialgleichung, die in Delwart et al. beschrieben ist, verwendet, um eine Kurve, die an die Versuchsdaten aus der paarweisen Analyse von Genen bekannter Sequenz angepasst ist, zu beschreiben. In der vorliegenden Erfindung wird die Gleichung verwendet, um den genetischen Abstand zwischen den bekannten Genotypen der Sonden und den unbekannten Genotypen der Patientenproben abzuschätzen.
Primer zur Verwendung im HTA
Es wurde festgestellt, dass die E1- oder Kernregion die beste Region zum Untersuchen der HCV-Heterogenität sein könnte, wodurch die E1-Region die Wahl für Primer in der vorliegenden Erfindung wurde. Die Verwendung der partiellen E1-Sequenz, der am stärksten heterogenen Region des Genoms für die vorliegende Erfindung, sowie eines längeren Fragments, d. h. 400 nt, obgleich es 1000 nt hätte lang sein können, ermöglichte die Konzeption von Sonden, die nicht zwischen Subtypen/Typen kreuzhybridisieren und somit eine genaue Genotypisierung erlauben. Durch Flankierung der heterogenen Region wurden konservierte nt-Sequenzen für Sense- und Antisenseprimer identifiziert. Vorzugsweise wurde eine Kombination aus universellen Sense- und Typ-spezifischen Antisenseprimern für den ersten PCR-Durchgang und ein universeller Antisenseprimer und Typ-spezifische Senseprimer wurden für den zweiten Durchgang verwendet. Die PCR muss nicht aus zwei Durchgängen bestehen und die Primer sind nicht auf die oben beschriebene Kombination beschränkt. Die bevorzugte Kombination ermöglichte jedoch die Herstellung von einzelsträngigen Sonden und minimierte die Zahl der PCR-Primer-Kombinationen.
Bevorzugte Sonden sind Sequenzen in den Kern- und E1-Regionen, deren Sequenzen für einen breiten Bereich von Genotypen publiziert sind und in wenigstens 12 verschiedene Genotypen und Subtypen gruppiert werden: I/1a, II/1b, III/2a, IV/2b, 2c, 3a, 4a, 4b, 4c, 4d, 5a, 6a. Die Nucleotidsequenzidentitäten des E1-Gens zwischen HCV-Isolaten des gleichen Genotyps reicht von 88,0% bis 99,9%, wohingegen die von HCV-Isolaten von unterschiedlichen Genotypen von 53,5 bis 78,6% reichen. Der Grad der Variation für eine gute Unterscheidung der Heteroduplex in neutralen Polyacrylamidgelen liegt angenehmerweise im Bereich von 3-20%, so dass es wahrscheinlich ist, dass divergierende Matrizen unter Bildung einer Heteroduplex reassoziieren, falls sie vom gleichen Subtyp sind. Aus diesem Grund wurde eine einzelsträngige ³²P-markierte DNA-Sonde verwendet, so dass, falls die Bildung der Heteroduplex unmöglich ist, die einzelsträngige DNA-Sonde („ss-DNA probe") wahrscheinlich nicht reassoziieren und eine Homoduplex-Bande bilden konnte. Ohne direkte Sequenzierung kann die vorliegende Erfindung nicht nur schnell eine gewisse Identifizierung der Subtypen, sondern auch der genetischen Beziehungen in den gleichen Subtypen ergeben. Beispielsweise zeigten die analysierten Genotypen, d. h. 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, keine Überlappung zwischen unterschiedlichen Subtypen.
Da ferner Isolate, die näherungsweise zu 30% divergieren, auf dem Gel sichtbar gemacht werden können, können neue Subtypen sichtbar gemacht werden und die Verteilung von Isolaten in einer Population könnte charakterisiert werden und Populationen oder individuelle Isolate können in einer Population oder in Individuen in epidemiologischen Studien verfolgt werden.
HCV-Genotypisierungskits
Ein Kit zur Bestimmung des HCV-Genotyps liegt im Rahmen dieser Erfindung. Wie für HIV in Delwart et al., Protokoll zum „Heteroduplex Mobility Analysis HIV-1 env Subtyping Kit", Version 3, beschrieben, würde ein derartiger Kit die spezifischen Primer umfassen. Bevor zugte Primer sind aus der Kern- und E1-Region des HCV-Genoms. Falls zwei PCR-Stufen gewünscht werden, könnten die Primer für den ersten Durchgang z. B. eine universelle Sensesonde, vorzugsweise lokalisiert in der Kern-/E1-Region des HCV-Genoms, umfassen. Ein derartiger universeller Primer ist von Nucleotid 508 bis Nucleotid 529 von HCV-1 lokalisiert und ist in Tabelle 1 gezeigt. Mit dem universellen Primer könnte ein Typ-spezifischer Antisenseprimer, ebenso vorzugsweise in der Kern-/E1-Region des HCV-Genoms lokalisiert, gekoppelt werden. Beispiele für diese Primer sind von Nucleotid 1032 bis Nucleotid 1012 für Typ 1, Typ 2a, Typ 2b und Typ 3a der HCV-Genome und sind ebenfalls in Tabelle 1 gezeigt.
Falls ein zweiter PCR-Durchgang gewünscht wird, könnten die Primer des zweiten Durchgangs gleichermaßen aus der Kern-/E1-Region des HCV-Genoms sein. Bevorzugte Primer des zweiten Durchgangs könnten einen universellen Antisenseprimer von Nucleotid 978 bis 958 des HCV-1-Genoms umfassen, dieser Primer ist in Tabelle 1 gezeigt. Zusätzlich könnten die Primer des zweiten Durchgangs einen Typ-spezifischen Senseprimer aus der Kern-/E1-Region umfassen. Bevorzugte Typ-spezifische Senseprimer des zweiten Durchgangs sind von Nucleotid 536 bis 557 der HCV-Genome vom Typ 1, Typ 2 oder Typ 3 und sind in Tabelle 1 gezeigt.
Der erste oder zweite Durchgang der Primer kann hinreichend sein, um die Virus-RNA ohne Verwendung eines zweiten PCR-Durchgangs zu amplifizieren, falls die Viruskonzentration hinreichend hoch ist, d. h. nested PCR ist nicht notwendigerweise erforderlich, was erforderlich ist, sind PCR-Produkte im 100fachen Überschuss zur Sonde.
Ein HCV-Genotypisierungskit der vorliegenden Erfindung würde auch Subtyp-Referenzen umfassen, die ausgetauscht werden können, wenn neue Subtypen entdeckt und hinsichtlich einer Verwendung in dem Kit bewertet werden. Die Verwendung von mehr als einer Referenz aus einem gegebenen Subtyp wird empfohlen, da ein Vergleich mit einer einzelnen Referenz nicht immer ein eindeutiges Ergebnis ergibt.
Die vorangehende Diskussion und die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung lediglich, Fachleute auf dem Gebiet werden einschätzen, dass die Erfindung auf andere Weisen implementiert werden kann und dass die Erfindung nur durch Bezugnahme auf die Ansprüche definiert ist.
Beispiel 1
Patientenproben
35 Hämodialysepatienten, die sich einer regelmäßigen Hämodialyse unterzogen, wurden untersucht: 20 Männer (57%) und 15 Frauen (43%) mit einem mittleren Alter von 64,8 ± 13 Jahren. Serumproben wurden im August 1995 gesammelt, in Aliquote unterteilt und bei –80°C gelagert. 26 Patienten waren anti-HCV-ELISA-positiv und 9 anti-HCV-ELISA-negativ. 25 der 26 ELISA-Positiven waren auch RIBA III-positiv, während 1 unbestimmt war. Die 9 ELISA-Negativen waren alle RIBA III-negativ. 15 Patienten waren positiv bei PCR auf HCV-RNA-5'-UTR und E1. Eine direkte Sequenzierung von 15 5'-NCR-Produkten ergab 5 Patienten mit Typ 1, 3 Patienten mit Typ 2 und 7 Patienten mit Typ 3.
Beispiel 2
cDNA und PCR
HCV-RNA wurde wenigstens zwei unterschiedliche Male unter Verwendung eines Stratagene-Reagenses aus einem RNA-Isolationskit von Stratagene (Verfahren nach Chomezynsky und Sacchi) extrahiert.
RNA, extrahiert aus 20 µl Plasma, wurde in 25 µl eines cDNA-Gemisches revers transkribiert (BRL-cDNA-Synthesekit, 8085SB), wobei 100 prol der PCR-Primer verwendet wurden. Das cDNA-Gemisch wurde für 5 Minuten gekocht, auf Eis schnell gekühlt und zu den PCR-cDNA-Reagenzien mit Endkonzentrationen gemäß der Spezifikation des Perkin-PCR-Kits (N801-0055) gegeben. 40 PCR-Zyklen (94°C für 10 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 30 Sekunden) wurden durchgeführt. Zehn µl des ersten PCR-Reaktionsgemisches wurden zu einem zweiten PCR-Reaktionsgemisch gegeben, das die nested PCR-Primer enthielt, und es wurde für 40 Zyklen wie oben angegeben amplifiziert.
Die erste Extraktion wurde für die nested PCR-Reaktion mit Primern, die für die 5'-NCR spezifisch sind, wie früher in Shimizu et al., PNAS (1992) 5477–5481 beschrieben, verwendet und dieses Produkt wurde direkt sequenziert und für RFLP verwendet. RNA aus der gleichen Extraktion wurde für den HTA unter Verwendung von Kern-/E1-Primern verwendet. Eine zweite RNA-Extraktion wurde für RFLP und/oder HTA zum Bestätigen der Ergebnisse durchgeführt. Die für den HTA verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgelistet. Die geschachtelten PCR-Primerpaare, die zum Erhalten dieser E1-Produkte verwendet wurden, waren für die Typen 1, 2a, 2b und 3a unterschiedlich. Die universelle Sensesonde für den ersten Durchgang der Amplifikation entspricht 5'–3' nt 508–529, Aminosäuren 170–176 von Choo, et al., PNAS, 1991, während der universelle Antisenseprimer für den zweiten Durchgang der Amplifikation nt 978–958, Aminosäuren 320–326 von Choo, et al., PNAS, 1991, entspricht.

Als die ssDNA-DNA-Sonden für die Verwendung im HTA hergestellt wurden, wurde einer der Primer für die nested PCR biotinyliert. Siehe z. B. SEQ ID NO: 6 in Tabelle 1. Tabelle 1

HCV-1	5' → 3', nt	3' → 5', nt	~ Aminosäure	Primertyp
(SEQ ID NO:1) Gereinigt, C170S	508–529	529–508	170–176	Universelle Sensesonde, PCR I
(SEQ ID NO:2) Gereinigt, E338A1	1032–1012	1012–1032	338–344	Typ 1, Antisense, PCR I
(SEQ ID NO:3) Gereinigt, E338A2a	1032–1012	1012–1032	338–344	Typ 2a, Antisense, PCR I
(SEQ ID NO:4) Gereinigt, E338A2b	1032–1012	1012–1032	338–344	Typ 2b, Antisene, PCR I
(SEQ ID NO:5) Gereinigt, E338A3a	1032–1012	1012–1032	338–344	Typ 3a, Antisense, PCR I
(SEQ ID NO:6) Gereinigt, E320A	978–958	958–978	320–326	Universell, Antisense, PCR II
(SEQ ID NO:7) Gereinigt, C179S1	536–557	958–978	179–186	Typ 1, Sense, PCR II
(SEQ ID NO:8) Gereinigt, C179S2	536–557	958–978	179–186	Typ 2, Sense, PCR II
(SEQ ID NO:9) Gereinigt, C179S3	536–557	958–978	179–186	Typ 3, Sense, PCR II

Beispiel 3
HTA
Die einzelsträngigen Sonden wurden mittels RT-PCR aus HCV-ELISA- und RIBA-positiven Seren bekannter Genotypen mit den gleichen beschriebenen Primern wie oben hergestellt, abgesehen davon, dass einer der Primer, 320 A, biotinyliert war. ssDNA-Sonden wurden mit den Dynabeads vom Typ M-280 Streptavidin nach dem Protokoll von Heng Pan und Eric Delwart erzeugt. Der Nicht-Biotinyl-Einzelstrang wurde aus der Magnetkügelchen/Streptavidin-Säule eluiert. Sonden wurden ausgehend von 20 ng ssDNA der unterschiedlichen Genotypen erzeugt und unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase (Gibco BRL) und 100 microCi 32P-ATP endständig markiert und anschließend über eine Säule gereinigt. Die Kinasesonde wurde dann, ausgehend von 32P-ATP, unter Verwendung einer Säule vom Typ Pharmacia Bio Sepharose abgetrennt. Die 32P-markierten Einzelstrangsonden wurden mit einem 100fachen Überschuss Treiber gemischt und die PCR-Produkte wurden, ausgehend von den Patientenproben oder dem Kontrollserum/-plasma, erzeugt. Eine Hybridisierung erfolgte in 2 × SSC. Die Gemische wurden für 3 Minuten auf einen Heizblock mit 94°C gegeben. Sie wurden dann für wenigstens 2 Stunden auf einen Heizblock mit 55°C überführt. Das gesamte Reaktionsvolumen wurde auf ein 1 mm dickes 6%iges Polyacrylamid-MDE-Gel (Baker) geladen und für 16 h einer Elek trophorese bei 500 V unterworfen. Das Gel wurde bei 80°C auf Filterpapier vakuumgetrocknet und zur Belichtung eines Röntgenfilms verwendet („exposed to X-ray film"). Die Gentypen von jeder Probe wurden, basierend auf dem Delwart-Verfahren, bestimmt. Tabelle 2 stellt die Genotyp-Ergebnisse, die unter Verwendung des HTA bestimmt wurden, dar.
Die 1A–1E sind Autoradiogramme, die jede der Einzelstrangsonden in Tabelle 1 zeigen, d. h. die Sonden, die für die Genotypen 1a, 1b, 2a, 2b, 3a spezifisch bekannt sind, jeweils in den 1A–1E, siehe die Bahn weit links auf dem MED-Gel. Die Heteroduplex (h) (einzelsträngige bzw. ss-Sonde zum doppelsträngigen RT-PCR-Produkt, aus dem sie abgeleitet wurde) ist neben der Sonde gezeigt. RT-PCR-Produkte aus den 15 Dialysepatienten (Nrn. 1, 2, 3, 4, 7, 18, 20, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 33, 35), hybridisiert mit der Sonde, sind auch als die entsprechende Bahn in jeder Figur bezeichnet.
Wie in den 1A–1E ersichtlich ist, waren einzelsträngige Typ 1-Subtypensonden („Type 1 ss subtypes grobes") für jeden Typ 1-Subtyp spezifisch und kreuzhybridisierten nicht mit den anderen Subtypen 1b, 2a, 2b, 3a (2a, 2b nicht gezeigt). Die einzelsträngige Typ 3a-Subtyp-spezifische Sonde war ebenso für den Subtyp 3a spezifisch und kreuzhybridisierte nicht mit 1a-, 2c- oder 2a-, 2s-Isolaten (Daten nicht gezeigt). Einzelsträngige Subtyp 2-Sonden kreuzhybridisierten nicht miteinander (Daten nicht gezeigt), kreuzhybridisierten jedoch mit Subtyp 2c-Isolaten; jedoch zeigt der Abstand zwischen der Homoduplex und den 2c-Isolaten einen hohen Grad der Divergenz, was nahe legt, dass die Patienten 23, 30 und 33 unterschiedliche Subtypen hatten. Mittels Sequenzierung der partiellen E1 wurde bestätigt, dass das Virus in den Seren 23, 30 und 33 am engsten mit Subtyp 2c verwandt ist (siehe 2b), war jedoch bei 51 UTR-Sequenzierung nicht eindeutig, siehe 2D.
Die Isolate 23, 30 und 33 hybridisierten mit der 2a-Sonde, während nur 30 und 33 mit der 2b-Sonde hybridisierten. Die Gele zeigen auch, dass das Isolat 30 mit 2a enger verwandt ist als mit 2b. Daher sind, während alle drei Seren eindeutig vom Typ 2-nicht-a-nicht-b-Subtyp sind, sie nicht alle gleichermaßen von den Typen 2a und 2b divergierend. Wie in den 1B und 1D ersichtlich ist, scheint Patient 4 mit dem Typ 1b und einem nicht-a-nicht-b-Typ-Subtyp co-infiziert zu sein.
Die 1b-Sonde stammte von einem Patienten (JK 16) und schien zwei virale Genome zu besitzen, was sich in der Homoduplexbahn (h) widerspiegelt und daher besitzt jeder 1b-Patient zwei Banden.
Die ss-Sonde 3a war von einem Plasmidklon von einem RT-PCR-Produkt aus einem Typ 3a-Individuum (JK3a) abgeleitet, siehe 1E, Bahn h, daher spiegeln mehrfache Banden in Bahn 22 höchstwahrscheinlich zwei eng verwandte Viren in diesem Patienten wider.
Es schien, dass Patienten äußerst häufig einzigartige virale Isolate hatten. Es ist möglich, dass die Patienten 3 und 18 identische oder eng verwandte Virusisolate hatten. Gleichermaßen hatten die Patienten 20 und 26 das gleiche Typ 3a-Virusisolat und die Patienten 2 und 4 hatten das gleiche Typ 1b-Isolat, basierend auf der Co-Migration der Banden auf MDE-Gelen.
Die 2a–2c stellen phylogenetische Stammbäume, Dendrogramme, dar, die die genetische Verwandtschaft bzw. den Verwandheitsgrad von jeder der partiellen E1-Nucleotidsequenzen zeigen. Diese Dendrogramme wurden mittels paarweiser progressiver Anordnung der Nucleotidsequenzen aneinander konstruiert, wobei das Computer-Softwareprogramm Gene Works mit ungewichteten Paargruppierungsverfahren mit arithmetischem Mittelwert („Gene Workss Unweighted Pair Group Methods with Arithmetic mean"), wie in Weiner, et al., J. Virol. 67: S. 4365–4368 (1993) beschrieben, verwendet wurde. Die Dendrogramme in den 2a–2c wurden erstellt, indem partielle E1-Sequenzen von Isolaten des mutmaßlichen Typs 1 (nt 625–93), Typs 2 (nt 583–915) oder Typs 3 (nt 558–834) aus den Dialysepatienten, wie mittels Sequenzanalyse bestimmt, mit publizierten Genotypsequenzen für den Typ 1a (HCV-1) (Choo, et al., PNAS 1991); 1b (HCV-J) (Kato et al.); 2a (HC-J6) (Okamoto, et al. (1992)); 2b (HC-J8) (Okamoto, et al., 1992); 2c (Bukh, et al., PNAS 1993) und 3a (NZL-1) (Sakamoto, et al., 1994) über der gleichen Region des Genoms verglichen wurden.
2D ist ein Dendrogramm, erstellt wie oben beschrieben, in dem jede der partiellen 5'-UTR-Sequenzen der Isolate 23, 30 und 33 mit publizierten Genotypsequenzen für Typ 1, 2 und 3 (nt –274 bis –81) für die gleiche Region des Genoms verglichen wurden.

Die Ergebnisse von RFLP und HTA wurden verglichen und sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Vergleich von partielle E1-HTA- und -RFLP-Genotypisierungsergebnissen

Patient	HTA	RFLP
1	1b	1b
2	1b	1b
3	3a	3a
4	1b	1b
7	3a	3a
18	3a	3a
20	3a	3a
22	3a	3a
23	2?*	2a
24	1b	1b
26	3a	3a
28	1b	1b
30	2?*	2a
33	2?*	2a
35	3a	3a
* Probe ist weder 2a noch 2b

Die partiellen E1-Sequenzen, dargestellt in den 3a–3d, bestätigen die HTA-Subtypbezeichnungen, die in Tabelle 2 angegeben sind und zeigen definitiv, dass die Patienten 23, 30 und 33 am engsten mit 2c verwandt sind, wobei 33 am entferntesten mit 2c verwandt ist (18,6% divergierend).
Die RFLP-Ergebnisse unter Verwendung von ScrFI (siehe Davidson, et al., J. Gen. Virol. (1995) 76: 1197–1204) bezeichneten 23, 30 und 33 falsch als Typ 2a. Diese falsche Bezeichnung ist in 2D widergespiegelt, die zeigt, dass, basierend auf der 5'-UTR-nt-Sequenz der Computer HCV 2c aufgrund einer unzureichenden nt-Divergenz in dieser Region des Genoms nicht genau subtypisierte.
Die vorliegende Erfindung eines HTA unter Verwendung von Primern für die Kern- und Hüllregion ermöglichte drei Level der Charakterisierung von HCV-Genomen. Der erste war die Typspezifität in der Wahl von RT-PCR-Primern. Der zweite war die Subtypspezifität, basierend auf der Wahl von Primern in der Kern-/E1-Region und aus einer Region von mehr als 400 nt, was in einem Fehlen von Kreuzhybridisierung zwischen Subtypsonden, z. B. 1 und 3, 2a, 2b, und einem hohen Grad der Heterogenität zum Maximieren von Unterschieden zwischen Genotypen (Fehlen von Kreuzhybridisierung) resultierte. Schließlich wurde die Isolatspezifität durch den Abstand von der Homoduplex, wie in den 1.E–1-E beispielhaft dargelegt, bestimmt. Andere Genotypisierungsverfahren besitzen nicht die Fähigkeit, Unterschiede zwischen Isolaten zu analysieren.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Oligonucleotid bestehend aus der Sequenz SEQ ID NO. 1.
Oligonucleotid bestehend aus der Sequenz SEQ ID NO. 2.
Oligonucleotid bestehend aus der Sequenz SEQ ID NO. 3.
Oligonucleotid bestehend aus der Sequenz SEQ ID NO. 4.
Oligonucleotid bestehend aus der Sequenz SEQ ID NO. 5.
Oligonucleotid bestehend aus der Sequenz SEQ ID NO. 6.
Oligonucleotid bestehend aus der Sequenz SEQ ID NO. 7.
Oligonucleotid bestehend aus der Sequenz SEQ ID NO. B.
Oligonucleotid bestehend aus der Sequenz SEQ ID NO. 9.
PCR-Primerpaar, worin der Senseprimer aus SEQ ID NO. 1 besteht und der Antisenseprimer aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 und SEQ ID NO. 5, ausgewählt ist.
PCR-Primerpaar, worin der Antisenseprimer aus SEQ ID NO. 6 besteht und der Senseprimer aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8 und SEQ ID NO. 9, ausgewählt ist.
Verfahren zur Bestimmung des HCV-Genotyps eines HCV-Stammes, wobei das Verfahren die Stufen umfasst: (a) Unterwerfen des HCV-Stammes einer oder mehreren Stufe(n) von PCR, wobei die eine oder mehrere Stufe(n) von PCR eine Sensesonde aus der Kern- oder E1-Region des HCV-Genoms und eine Antisensesonde aus der Kern- oder E1-Region des HCV-Genoms verwendet bzw. verwenden; (b) Bilden einer Heteroduplex durch Denaturieren und Reassoziieren von Gemischen des amplifizierten Produkts, das in Stufe (a) erhalten wurde, mit DNA- oder RNA-Fragmenten eines bekannten HCV-Genotyps; (c) Vergleichen der Mobilität der Heteroduplex auf einem System, das nach Größe trennt, mit der Mobilität einer Homoduplex aus den DNA- oder RNA-Fragmenten eines bekannten Genotyps, um den Genotyp des HCV-Stammes zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der HCV-Stamm zwei Stufen von PCR unterworfen wird, wobei der erste Satz von Primern eine universelle Sensesonde aus den Kern- oder E1-Regionen des HCV-Genoms und eine typspezifische Antisensesonde aus den Kern- oder E1-Regionen des HCV-Genoms umfasst, und worin der zweite Satz von PCR-Primern eine universelle Antisensesonde aus den Kern- oder E1-Regionen des HCV-Genoms und eine typspezifische Sensesonde aus den Kern- oder E1-Regionen des HCV-Genoms umfasst.
Verfahren nach Anspruch 12, worin der erste Satz von PCR-Primern diejenigen nach Anspruch 10 sind und der zweite Satz von PCR-Primern diejenigen nach Anspruch 11 sind.
Verfahren nach Anspruch 12, worin die DNA- oder RNA-Fragmente eines bekannten Genotyps eine DNA-Sonde umfassen.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die Sonde einzelsträngig ist.
Verfahren nach Anspruch 16, worin die DNA-Sonde radioaktiv markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 16, worin die einzelsträngige DNA-Sonde mittels PCR-Amplifikation erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 18, worin die DNA-Sonde durch eine zweistufige PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer nach Anspruch 10 für die erste Stufe und nach Anspruch 11 für die zweite Stufe erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 12, worin der HCV-Stamm in einem Überschuss in dem Gemisch, das die Heteroduplex bildet, vorhanden ist.
Verfahren zur Vorhersage der Antwort auf eine Arzneimitteltherapie für einen HCV-Stamm in einem Patienten, der mit dem HCV-Stamm infiziert ist, wobei das Verfahren die Bestimmung der Empfindlichkeit der bekannten HCV-Genotypen gegenüber der Arzneimitteltherapie, die Bestimmung des HCV-Genotyps des HCV-Stammes nach dem Verfahren nach Anspruch 12 und den Vergleich des HCV-Genotyps des Stammes vor der Arzneimitteltherapie mit der Empfindlichkeit der bekannten HCV-Genotypen gegenüber der Arzneimitteltherapie umfasst.
Verfahren zur Vorhersage der Antwort auf einen therapeutischen Impfstoff gegen einen HCV-Stamm aus einem mit dem HCV-Stamm infizierten Patienten, wobei das Verfahren die Bestimmung der Empfindlichkeit der bekannten HCV-Genotypen gegenüber dem therapeutischen Impfstoff, die Bestimmung des HCV-Genotyps des HCV-Stammes nach dem Verfahren nach Anspruch 12 und den Vergleich des HCV-Genotyps des Stammes vor der Verabreichung des therapeutischen Impfstoffs mit der Empfindlichkeit bekannter HCV-Genotypen gegenüber dem therapeutischen Impfstoff umfasst.
Verfahren zur Vorhersage der Eignung einer prophylaktischen Impfstoffzusammensetzung für eine gegebene Probenpopulation, wobei das Verfahren die Bestimmung des Genotyps des prophylaktischen Impfstoffs, die Bestimmung des Vorherrschens von bekannten HCV-Genotypen in der Probenpopulation nach dem Verfahren nach Anspruch 12 und das Vergleichen des HCV-Genotyps des prophylaktischen Impfstoffstammes mit dem bestimmten vorherrschenden Genotyp vor der Verabreichung des prophylaktischen Impfstoffs an die Probenpopulation umfasst.