DE69802411T2

DE69802411T2 - Verfahren zum behandeln von eiern

Info

Publication number: DE69802411T2
Application number: DE69802411T
Authority: DE
Inventors: Robert Ivarie; Gordon Speksnijder
Original assignee: University of Georgia Research Foundation Inc
Current assignee: University of Georgia Research Foundation Inc
Priority date: 1997-08-04
Filing date: 1998-08-04
Publication date: 2002-07-11
Anticipated expiration: 2018-08-05
Also published as: US5897998A; EP1001673A1; DE69802411D1; ATE208132T1; WO1999013709A1; EP1001673B1; AU8772398A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

a) Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Eiern, insbesondere von fruchtbaren Eiern.
b) Beschreibung des Standes der Technik
Die harte Eierschale und das große Eidotter des Vogelembryos stellen ein bedeutendes Hindernis bei der Behandlung des Embryos dar. Wenn es gelegt wird, besteht das Vogelembryo aus einem Blastoderm von 30.000-60.000 Zellen an der Spitze des Eidotters und es wird von einer harten kalzifizierten Eierschale ummantelt. Direkt unterhalb der Schale befindet sich die Eierschalenmembran, welche das Eiweiß, den Eidotter und das sich entwickelnde Embryo umschließt. Viele Arbeitsweisen, einschließlich der transgenen Modifikation des Vogelgenoms, erfordern den Zutritt zu dem Inneren des Eis. Um beispielsweise das genetische Material eines Kükens zu modifizieren, muß ein kleines Volumen einer Flüssigkeit, die Retroviren übermittelnde Partikel oder transfizierte Donorzellen enthält, in die subgerminale Höhlung des empfangenden Embryos injiziert werden. Es kann zusätzlich wünschenswert sein, das sich entwickelnde Embryo Antigenen, Viren, Vakzinen oder Wachstumsfaktoren auszusetzen.
Um einen Zugang zum Inneren des Eis und zum Embryo zur Verfügung zu stellen, wird üblicherweise ein Loch oder "Fenster" in der Eierschale angebracht. Petite et al. (Development 108: 185-89(1990)) und Bosselmann et al. (Science 243: 533-35 (1989); US-A 5.162.215) verwenden ein Schleifgerät, z. B. einen Dremel, um ein Loch von 5-8 mm in die Eierschale zu schleifen. Die darunter liegende Eierschalenmembran wird dann mit einem Skalpell weggeschnitten und 2-10 Mikroliter der experimentellen Lösung werden in das Embryo injiziert. Das Loch wird dann gemäß einem von verschiedenen Verfahren abgedichtet. Gewöhnlich wird das Loch mit frischer Eierschalenmembran von einem Donorei bedeckt, wobei die Membran mit der gleichen Orientierung wie in dem Ei, nämlich mit der Albuminseite nach unten, angebracht wird. Wenn die Membran trocknet, wird sie mit plastischem Modellierzement oder mit einer gasdurchlässigen chirurgischen Wundmembran dauerhaft verschlossen. Siehe auch Carsience et al. (Development 117: 669-75 (1993)), und Fraser et al. (Int. J. Dev. Biol. 37: 381-85 (1993)).
Andere ähnliche Verfahren wurden für den Zugang zu dem sich entwickelnden Embryo verwendet. Thoraval et al. (Transgenic Res. 4: 369-76(1995)) entfernen ein dreieckiges Stück der Schale, injizieren 10 ul der experimentellen Lösung durch die Öffnung in das Embryo, decken dann das Ei durch Ersatz des Stücks der Schale ab und überziehen es mit einem Klebeband. Marzullo (Nature 225: 72-3 (1970)) schneidet ein Loch in die Schale, deckt es mit einem Abdeckstreifen aus Glas ab und überzieht es mit Paraffinwachs.
Die Ausbrütungsquote von lebensfähigen Küken nach der Behandlung der Eier ist eine wichtige Angelegenheit, denn es ist oft das Ziel der Behandlung der Eier, ein genetisch verändertes Küken zu erzeugen. Beispielsweise können transgene Vögel erzeugt werden, indem man Retroviren übermittelnde Partikel oder transfizierte Donorzellen in das Embryo injiziert und das Embryo sich normal bis zum Ausschlüpfen entwickeln läßt. Wie unten erwähnt wird, ist es auf diesem Gebiet wohlbekannt, daß weniger als 10% der fruchtbaren Eier nach den Behandlungen, die das Öffnen der Schale erfordern, ausgebrütet werden. Im Gegensatz hierzu werden mehr als 90% von nicht behandelten Eiern ausgebrütet, wenn die Eier von Völkern stammen, die sich in der Spitzenproduktion befinden. Arbeiten in verschiedenen Laboratorien zeigen an, daß es das Öffnungsverfahren ist, welches die Ausbrütungsquote verringert, und daß es nicht die Injektionen sind.
Marzullo berichtete zuerst (1970), daß die hohe Sterblichkeit mit dem Öffnen des Eis zusammenhängt, wobei er bemerkte, daß nur 7% der Embryos aus geöffneten und injizierten Eiern den 15. Tag der Bebrütung erreichen. Thoraval et al. (1995; Poultry Sci. 73: 1897-1905 (1994)) fanden ebenfalls, daß 2,3-7,3% von geöffneten und injizierten Eiern ausgebrütet wurden; geöffnete und nicht injizierte Eier hatten eine ähnliche Ausbrütungsquote, was darauf schließen läßt, daß das Öffnungsverfahren die niedrige Ausbrütungsquote verursachte. Petitte et al. berichteten (1990), dass 4 von 53, oder 7,6%, von geöffneten nicht injizierten Eiern ausgebrütet wurden; die Ausbrütungsquote war die gleiche ohne Injektion, was anzeigt, daß der Arbeitsgang des Öffnens per se für die niedrige Ausbrütungsquote verantwortlich war. Obwohl Bosselmann et al. (1989) unter Verwendung der im wesentlichen gleichen Methode wie der von Pettite et al. über eine Ausbrütungsquote von 38% berichteten, bleibt es durchweg problematisch, Ausbrütungsquoten über 10% zu erhalten.
Verfahren mit Schalenersatzmaterial wurden entwickelt, um einen Zugang zu den Embryos zu ermöglichen und um die Ausbrütungsquoten zu verbessern. Sich entwickelnde Embryos, mit oder ohne genetische Behandlung, werden in verschiedenem Alter gesammelt und in "ex ovo"-Behälter überführt. Im allgemeinen sind zwei oder drei Übertragungen erforderlich, während sich das Embryo entwickelt, und die letzte Übertragung besteht darin, dass das Embryo in eine frische Donoreischale mit einem großen Loch, das in das stumpfe Ende geschnitten wird, gelegt wird. Unter Verwendung dieser Methoden beobachteten Perry (Nature 331: 70-73 (1988); US-A-5.011.780) und Ono et al. (Dev. Biol. 161: 126-30 (1994)) Ausbrütungsquoten über 25% für Küken- und Wachtelembryos. Leider ist diese Methode arbeitsintensiv und sie kann sich als durchsatzbegrenzend erweisen, wenn eine große Anzahl von Injektionen erforderlich ist, um lebensfähige transgene Küken zu erzeugen.
Das Verfahren mit Schalenersatzmaterial ist auch mit den Standardverfahren zur Öffnung des Eis kombiniert worden. Nach dem Öffnen und Injizieren, wie von Petitte et al. (1990) beschrieben, werden die Eier drei Tage in Standardinkubatoren bebrütet und das Embryo wird in ein Schalenersatzmaterial überführt, welches mit einem gasdurchlässigen Film abgedichtet ist, wie es im US-A- 5.011.780 beschrieben wird. Diese Methode ergibt Ausbrütungsquoten von mehr als 25%; ist aber ebenfalls arbeitsintensiv.
Es würde wünschenswert sein, ein verbessertes Verfahren zur Erhöhung der Ausbrütungsquote von einer Behandlung unterworfenen Eiern zur Verfügung zu stellen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung des Inhalts von Eiern zur Verfügung. Eine Öffnung wird in der Eierschale angebracht, ohne die darunter liegende Eierschalenmembran zu zerreissen, und eine wässrige Flüssigkeit wird über die Öffnung in der Weise aufgetragen, dass die Öffnung vollständig bedeckt ist. Die darunter liegende Eierschalenmembran wird dann weggeschnitten. Die Einführung von Luftblasen in das Innere des Eis nach dem Wegschneiden der darunter liegenden Eierschalenmembran wird durch Einziehen der wässrigen Lösung in die Öffnung verhindert. Eine gewünschte Lösung kann dann durch die Öffnung injiziert und die Öffnung abgedichtet werden.
Ein Vorteil der Erfindung ist die verbesserte Ausbrütungsquote von fruchtbaren Eiern nach der Behandlung. Das Ei wird wie oben beschrieben behandelt und bebrütet, um die Entwicklung des Embryos zu ermöglichen. Die Bebrütung wird fortgesetzt, bis das Embryo aus dem Ei ausgeschlüpft ist.
Geeignete Eier sind Vogeleier, umfassend, aber nicht beschränkt darauf, Eier von Ratite, Huhn, Truthahn, Wachtel, Ente, Fasan und Gans. Das Ei kann ein Embryo enthalten.
Die Erfindung ist für jede kommerzielle Anwendung, welche die Injektion einer Lösung erfordert, geeignet. Es können beispielsweise genetisch modifizierte Zellen, abgeschwächte Viren, Antigene, Wachstumsfaktoren und Cytokine injiziert werden. Die Erfindung liefert eine verbesserte Ausbrütungsquote anschließend an die Bebrütung von behandelten fruchtbaren Eiern. Dieser Aspekt kann von Nutzen sein, wenn eine große Anzahl von Injektionen benötigt wird, beispielsweise bei der Erzeugung von genetisch behandelten und transgenen Tieren,

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

a) Definitionen und allgemeine Parameter
Die folgenden Fachausdrücke werden aufgezählt, um die Bedeutung und den Umfang der verschiedenen Fachausdrücke, die zur Beschreibung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, zu erläutern und zu definieren.
"Vogel-" bezieht sich auf jede Vogelspezies einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Ratite, Huhn, Truthahn, Wachtel, Gans, Fasan und Ente.
"Ausbrütungsquote" bezieht sich auf den Bruchteil der fruchtbaren Eier, aus denen ein lebensfähiges Küken ausgebrütet wird.
"Blastoderm" bezieht sich auf die Scheibe von Zellen, die über der subgerminalen Höhlung liegt und gewöhnlich 30.000-60.000 Zellen an der Eiposition enthält.
b) Behandlung des Eis
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Behandeln des Inhalts von Eiern zur Verfügung. Die Behandlung des Eis umfaßt das Erhalten eines Eis, Anbringen einer Öffnung in der Eierschale, ohne die darunter liegende Eierschalenmembran zu zerreissen, Auftragen einer wässrigen Flüssigkeit über der Öffnung, so dass die Öffnung vollständig bedeckt ist, Schneiden einer Öffnung in die Eierschalenmembran, Injizieren einer Lösung durch die Öffnung und Abdichten der Öffnung nach der Injektion, wobei keine Luftblasen in das Innere eingeführt werden, wenn die darunter liegende Eierschalenmembran zerschnitten wird.
Das zu behandelnde Ei kann ein Embryo in der Blastodermphase oder in einer späteren Phase sein. Das Ei kann ein Vogelei sein, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Ratite, Huhn, Wachtel, Ente, Fasan und Gans besteht. Bevorzugt ist das Ei ein Hühnerei.
Die wässrige Lösung kann jede geeignete wässrige Lösung sein, einschließlich einer wässrigen Lösung mit einem pH von 6 bis 9 und einer Osmolarität von etwa 50 bis etwa 400 mOsm/kg H&sub2;O. Die wässrige Lösung kann eine Vogelalbuminlösung, eine phoshatgepufferte physiologische Kochsalzlösung, Gewebekulturmedien oder destilliertes Wasser sein, sie ist aber nicht darauf beschränkt. Die Vogelalbuminlösung umfasst Albumin von einem vergleichbar alten Donorei, welches mit Wasser oder einer geeigneten Salzlösug weiter verdünnt sein kann. Beispiele für Gewebskulturmedien umfassen Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (DMEM) und Medium M199, sie sind aber nicht darauf beschränkt. Der erfahrene Praktiker wird erkennen, welches Medium geeignet ist. Die wässrige Lösung kann ferner ein Antibiotikum enthalten. Zur Zeit bevorzugte Antibiotika sind 100 Internationale Eiheiten von Penicillin oder 100 ug/ml von Streptomycin.
Die Injektion durch die Öffnung eines ein Embryo enthaltenden Eis kann in den Bereich rund um das Embryo und in dessen unmittelbare Nähe erfolgen.,
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine verbesserte Ausbrütungsquote anschließend an die oben beschriebene Behandlung eines Eis, welches ein Embryo enthält. Das abgedichtete injizierte Ei wird bebrütet, um das Embryo sich entwickeln zu lassen. Die Bebrütung wird fortgesetzt, bis das Embryo lebensfähig aus dem Ei ausschlüpft.
Eine Ausführungsform der Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Behandlung eines ein Blastoderm enthaltenden Hühnereis. Das Verfahren umfaßt Erhalten eines gelegten Vogeleis, welches bei 6ºC gewöhnlich nicht mehr als zwei Tage gelagert wurde und ein Blastoderm enthält, Anbringen einer Öffnung in der Eierschale, ohne die darunter liegende Eierschalenmembran zu zerreissen, Auftragen einer wirksamen Menge einer wässrigen Flüssigkeit über die Öffnung, so dass die Öffnung völlig bedeckt ist, Schneiden einer Öffnung in die Eierschalenmembran, Injizieren einer Lösung durch die Öffnung in den Bereich rund um das Blastoderm oder in dessen unmittelbare Nähe und Abdichten der Öffnung nach der Injektion. Keine Luftblasen werden in das Innere eingeführt, wenn die darunter liegende Eierschalenmembran zerschnitten wird, da die wässrige Flüssigkeit in die Öffnung eingezogen wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfaßt die Stufe, in der das Ei einer Gammastrahlung vor der Öffnung der Schale ausgesetzt wird.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist die verbesserte Ausbrütungsquote anschließend an die oben beschriebene Behandlung eines Vogeleis, das ein Blastoderm enthält. Das abgedichtete injizierte Ei wird bebrütet, um das Embryo sich entwickeln zu lassen. Die Bebrütung wird aufrechterhalten, bis das Embryo aus dem Ei lebensfähig ausgeschlüpft ist
c) Beispiele
Die folgenden speziellen Beispiele sollen die Erfindung erläutern und sollten nicht so ausgelegt werden, daß sie den Schutzumfang der Patentansprüche begrenzen.

BEISPIEL 1

Behandlung der Eier

Die Eier wurden wie folgt behandelt: Frisch gelegte, fruchtbare Hühnereier von "White Leghorn" und "Barred Rock" wurden einen Tag oder zwei Tage bei 6ºC aufbewahrt: Einige Eier wurden vor der Behandlung einer Gammastrahlung von 500 Rad ausgesetzt. Die gesamte Eieroberfläche wurde mit 70%igem Ethanol abgerieben, um sie zu sterilisieren. Das Ei wurde mit seiner Längsachse horizontal 3 Stunden lang bei Raumtemperatur in einen Eihalter gelegt, um das Blastoderm an die Spitze rotieren zu lassen. In der Spitze der Schale wurde ein 5-8 mm rundes Loch angebracht, indem mit einem Bohrgerät, das mit einer schleifenden rotierenden Spitze ausgerüstet war, die in die Eierschale ein Loch bohren kann, ohne die darunter liegende Eierschalenmembran zu beschädigen, eine Öffnung gebohrt wurde. Ein Dremel-Motogerät (MiniMite #750), ausgerüstet mit einem kugelförmigen Schleifstein aus Aluminiumoxid (Dremel, #925) wurde verwendet. Es wurde darauf geachtet, dass die darunter liegende Eierschalenmembran nicht zerrissen wurde. Nach dem Bohren wurde das runde Loch mit 70%igem Ethanol abgerieben und trocknen gelassen. Etwa 0,5-1 ml einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung oder ein Gewebekulturmedium wurden in Form kleiner Tropfen um das Loch herum und oberhalb hiervon aufgetragen, so dass die freigelegte Eiweißmembran vollständig bedeckt war. Als Vorsichtsmaßnahme gegen Infektionen enthielt die phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung oder das Gewebekulturmedium 100 internationale Einheiten von Penicillin und 100 ug/ml von Streptomycin. Die Schalenmembran wurde sauber frei von der inneren Kante des Lochs unter Verwendung einer #11-Skalpellklinge geschnitten. Zackige Kanten wurden vermieden, indem genau unterhalb der Kante der Eierschale geschnitten wurde. Sobald die Eierschalenmembran durchbohrt war, wurde ein Teil der darüber liegenden Flüssigkeit vollständig in das Ei hineingezogen, wodurch der Eintritt von Luftblasen verhindert wurde. Die Lösung wurde an der Stelle während des restlichen Verfahrens belassen, so dass niemals Luftblasen in das Innere des Eis eindrangen. Nach der Injektion einer kleinen Menge der experimentellen Lösung in den Bereich rund um das Blastodem und in dessen unmittelbare Nähe wurde das Loch abgedichtet, indem das Loch mit etwa 1 cm² einer frischen Eierschalenmembran von einem Donorei bedeckt wurde. Es wurde darauf geachtet, sicherzustellen, daß die Orientierung der Schalenmembran mit der Albuminseite nach unten und der Schalenseite nach oben war. Sobald die Eierschalenmembran soweit getrocknet war, daß sie weiß wurde, wurde die Stelle vollkommen mit Duco-Zement (Devcon®) oder einem chirurgischen Verbandstoff (TegaDerm®) bedeckt.

BEISPIEL 2

Erhöhte Ausbrütungsquote nach der Behandlung des Eis

Die Ausbrütungsquote wurde kontrolliert, indem die behandelten Eier bebrütet und der prozentuelle Anteil der sich normal zum Ausschlüpfen entwickelnden Eier bestimmt wurde. Die wie im Beispiel 1 behandelten Eier wurden mit dem schmalen Ende nach unten in einen befeuchteten Inkubator gelegt und bis zum Ausschlüpfen bebrütet. Die Feuchtigkeit wurde zwischen 51-53% gehalten und die Temperatur war 37,8ºC. Drei verschiedene Inkubatoren wurden verwendet: ein neuer Jamesway AVN, ein moderner NatureForm NOM 125 und ein alter Jamesway 252.
Anschließend an die Bebrütung wurden im Mittel 29,6% der behandelten Eier (ein unterer Wert von 25% und ein oberer Wert von 34%, 504 Versuche) ausgebrütet. Die Ausbrütungsquote war für die behandelten Eier mit und ohne Injektion und mit und ohne Gammabestrahlung nicht signifikant verschieden. Außerdem wurden keine signifikanten Unterschiede unter den Inkubatoren gefunden. Im Gegensatz hierzu wurden im Mittel 61,2% von nicht behandelten Kontrolleiern (ein unterer Wert von 45% und ein oberer Wert von 69%, 407 Versuche) ausgebrütet. Zu beachten ist, dass diese Zahlen relativ niedrig liegen, da das für die Experimente verwendete Volk nahe dem Ende seines Eier legenden Zyklus war.

BEISPIEL 3

Vergleichsbeispiel

Die Ausbrütungsquote wurde auch mit jener bei Verwendung des Verfahrens das Standes der Technik verglichen, wie er von Petitte et al. (1990) und Bosselmann et al. (1989) beschrieben wurde. Kurz gesagt wurden die Eier wie im Beispiel 1 behandelt, mit der Ausnahme, daß die Stufe, bei der eine kleine Menge einer Lösung über das Loch und darum herum aufgetragen wurde, weggelassen wurde. Statt dessen wurde die Eierschalenmembran direkt durchstochen, nachdem das Loch in die Eierschale gebohrt war. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden im Mittel 2,8% der Eier ausgebrütet (424 Versuche).
In diesen Experimenten wurde gezeigt, dass das neue Verfahren die Ausbrütungsquote der behandelten Eier um den Faktor 10 erhöht.

Claims

1. Verfahren zur Behandlung eines Eis, umfassend

a) Erhalten eines Eis,

b) Anbringen einer Öffnung in der Eierschale, ohne die darunter liegende Eierschalenmembran zu zerreissen,

c) Auftragen einer wässrigen Flüssigkeit über der Öffnung, so dass die Öffnung vollständig bedeckt ist,

d) Schneiden einer Öffnung in die Eierschalenmembran,

e) Injizieren einer Lösung durch die Öffnung, und

f) Abdichten der Öffnung nach dem Injizieren.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Ei ein Embryo enthält.

3. Verfahren zur Erhöhung der Ausbrütungsquote nach dem Behandeln eines ein Embryo enthaltenden Eis, umfassend

a) Erhalten eines Eis,

c) Auftragen einer wässrigen Flüssigkeit über der Öffnung, so dass die Öffnung vollständig bedeckt ist.

d) Schneiden einer Öffnung in die Eierschalenmembran,

e) Injizieren einer Lösung durch die Öffnung,

f) Abdichten der Öffnung nach dem Injizieren,

g) Bebrüten des abgedichteten injizierten Eis, um ein Embryo sich entwickeln zu lassen, und

h) Aufrechterhalten des Bebrütens, bis das Embryo lebensfähig aus dem Ei ausschlüpft.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, worin das Ei ein Vogelei ist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Ratite, Huhn, Wachtel, Ente, Fasan und Gans besteht.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, worin das Vogelei ein Hühnerei ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, worin das Embryo sich in der Blastodermphase oder in einer späteren Phase befindet.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, worin der pH-Wert der wässrigen Flüssigkeit zwischen etwa 6 bis etwa 9 und die Osmolarität zwischen etwa 50 bis etwa 400 mOsm/kg H&sub2;O liegen.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, worin die wässrige Flüssigkeit aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Vogelalbuminlösung, einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung, einem Gewebekulturmedium und aus Wasser besteht.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, worin die wässrige Flüssigkeit ferner ein Antibiotikum enthält.

10. Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, worin die Injektion durch die Öffnung in den Bereich rund um das Embryo und in dessen unmittelbare Nähe erfolgt.

11. Verfahren zum Behandeln eines ein Embryo enthaltenden Eis, welches Verfahren das Schneiden eines Lochs in die Eierschale erfordert, umfassend das Auftragen einer wässrigen Flüssigkeit über dem Loch nach Schneiden eines Lochs in die Eierschale und vor Eindringen in die Eierschalenmembran.