DE69802413T3

DE69802413T3 - LACTOBACILLI ZUR ERHöHUNG DER MINERALIENABSORPTION DURCH DARMZELLEN

Info

Publication number: DE69802413T3
Application number: DE69802413T
Authority: DE
Inventors: Dominique Brassart; Elisabeth Vey
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 1997-07-05
Filing date: 1998-06-26
Publication date: 2009-07-16
Anticipated expiration: 2018-06-27
Also published as: HUP0003995A2; ES2168785T5; AU743914B2; CZ300387B6; CN1269724A; KR20010015563A; US20020127211A1; JP2002507997A; IL133412A0; RU2214258C2; CZ200023A3; TR200000021T2; BR9810547B1; PL337967A1; WO1999002170A1; AU8804598A; PT1003532E; DE69802413T2; ZA985893B; MY122501A

Description

Diese Erfindung betrifft die Verwendung von probiotischen Lactobacilli-Mikroorganismen bei der Zubereitung einer enteralen Zusammensetzung für die Erleichterung oder Steigerung der Absorption von Mineralien aus der gewöhnlichen Nahrung bei Säugetieren.
Mineralien sind Schlüsselelemente zentraler physiologischer Prozesse. Calcium ist beispielsweise von vitaler Bedeutung für die Bildung von Knochen und Zähnen, für die Muskelkontraktion und die Synthese von Hormonen. Calcium ist auch ein wichtiger sekundärer Botenstoff bei den meisten Phänomenen der Zellaktivierung.
Mineralien, für die die Nahrung die primäre Quelle darstellt, werden vom Körper assimiliert, indem sie die Darmschleimhaut passieren um dann in den Blutstrom zu gelangen. Das Ausmaß der Assimilation (oder der Absorption) von Mineralien durch den Körper hängt sowohl von ihrer Löslichkeit im Darmmedium als auch von der Fähigkeit der Darmzellen ab, sie zu assimilieren und in den Blutstrom weiter zu leiten (R. Wasserman et al., In: Mineral Absorption in the Monogastric Gl Tract. Advances in Experimental Medicine and Biology, 249, 45-65, Plenum Press, N.Y., 1989).
Der Ort, die Effizienz und der Mechanismus der Calcium-Absorption entlang des Darms sind an Ratten und Hühnern viele Jahre untersucht worden (Bronner F., J. Nutr. 122, 641-643, 1992; Schachter D., Am. J. Physiol., 196, 357-362, 1959). Aus offensichtlichen ethischen und technischen Gründen gibt es nur beschränkt Untersuchungen am Menschen (Hylander E. et al., Scand. J. Gastroenterol., 25, 705, 1990), und es wurden nur wenige In-vitro-Untersuchungen durchgeführt (Elsherydah A. et al., Gastroenterol., 109, 876, 1995; Feher J. J., Am. J. Physiol., 244, C303, 1983; Feher J. J., Cell Calcium, 10, 189, 1989).
Einer der am intensivsten untersuchten Aspekte der Absorption von Mineralien ist die Bioverfügbarkeit der Mineralien in Abhängigkeit von der Zusammensetzung der täglichen Nahrung (Bronner F., J. Nutr., 123, 797, 1993). Jedoch sind viele Mineralien, die sehr bioverfügbar sind, auch instabil und nicht für eine Verwendung in der Nahrung geeignet. Die einfache Supplementierung der Nahrung mit größeren Mengen der Mineralien hat außerdem häufig negative Auswirkungen auf die organoleptischen Eigenschaften der Nahrung.
Eine mögliche Lösung für dieses Problem besteht darin, die Absorption von Mineralien aus der Nahrung zu erleichtern oder zu verbessern. Allerdings wurden nur wenige Untersuchungen über Verfahren zur Erleichterung oder Erhöhung der Absorption von Mineralien aus der Nahrung durchgeführt, und die Ergebnisse waren nicht konsistent.
Rasic et al. berichteten, dass die in Milchprodukten enthaltenen Mineralien besser assimiliert werden, wenn diese Produkte vergoren sind. Dieser Effekt wird dem Vorkommen von Säuren in den vergorenen Milchprodukten zugeschrieben (XP002052238: In: Fermented Fresh Milk Product, Band 1, S. 114-115, 1978).
Kürzlich haben Yaeshima et al. bei Ratten auch eine Erhöhung der Absorption von Calcium aus einer mit Calcium versetzten Molke gezeigt, wenn eine Kombination von Oligosacchariden und Bifidobacteria konsumiert wird (XP002052237: Bulletin of the International Dairy Fermentation, Nr. 313, 1996).
Jedoch berichteten Kot et al., dass Lactobacillus acidophilus natürlicherweise Fe²⁺ internalisiert und es zu Fe³⁺ oxidiert. Das ist eine unlösliche Form, die schwerer zu assimilieren ist (J. Agric. Food Chem., 43, 1276-1282, 1995).
Es besteht deshalb immer noch ein Bedarf an einem Verfahren zur Erhöhung der Absorption von Mineralien, die in der Nahrung vorkommen.
Dementsprechend stellt diese Erfindung die Verwendung von probiotischen Lactobacilli gemäß Anspruch 1 bereit.
Es wurde überraschenderweise mittels eines In-vitro-Modells gefunden, dass probiotische Lactobacilli im Stande sind, die Absorption von Mineralien, von Calcium, Magnesium und/oder Zink durch menschliche Darmzellen direkt zu erleichtern oder zu verbessern. Ohne sich auf eine Theorie festlegen zu wollen wird angenommen, dass dieses auf einer Ansäuerung der Mikroumgebung um die Darmzellen und die Bakterien, die sich in Kontakt mit den Darmzellen befinden, beruht. Sowohl die Bakterien als auch die Darmzellen können an der Induktion der Ansäuerung beteiligt sein. Diese lokalisierte Ansäuerung könnte somit eine aktive Rolle bei der Solubilisierung von Mineralien, und damit für die Fähigkeit des Körpers, sie zu assimilieren, spielen.
Es werden nun Ausführungsformen der Erfindung, die lediglich als Beispiele dienen sollen, beschrieben, wobei auf die folgenden Zeichnungen Bezug genommen wird:
1 stellt die basale Absorption von Calcium durch Caco-2-Darmzellen in Abwesenheit von Lactobacilli dar;
2 stellt den Einfluss von ungefähr 6,7 × 10⁷ KBE/ml verschiedener Lactobacilli-Stämme auf die Absorption von Calcium durch Caco-2-Darmzellen dar;
3 stellt den Einfluss von ungefähr 3,4 × 10⁸ KBE/ml verschiedener Lactobacilli-Stämme auf die Absorption von Calcium durch Caco-2-Darmzellen dar.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von probiotischen Lactobacilli bei der Zubereitung einer Ernährungszusammensetzung für eine enterale Verabreichung zur Erleichterung oder Verbesserung der Absorption von Mineralien, die der täglichen Nahrung vorkommen. Die Mineralien sind Calcium, Magnesium, und/oder Zink. Die Aufnahme von probiotischen Lactobacilli mit der Nahrung erhöht die Bioverfügbarkeit der Mineralien, das heißt sie macht die Mineralien, die häufig im Darm nicht sehr löslich sind, zugänglicher für die Darmzellen.
Es können beliebige, für Nahrungsmittel geeignete probiotische Lactobacillus-Stämme verwendet werden. Beispielsweise können die folgenden probiotischen Lactobacilli verwendet werden: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri und Lactobacillus johnsonii; Lactobacillus paracasei; Lactobacillus reuteri; Lactobacillus brevis; Lactobacillus fermentum; Lactobacillus plantarum; Lactobacillus casei, insbesondere L. casei Subsp. casei und L. casei Subsp. rhamnosus; Lactobacillus delbrueckii, insbesondere L. delbrueckii Subsp. lactis, L. delbrueckii Subsp. helveticus und L. delbrueckii Subsp. bulgaricus; und Leuconostoc mesenteroides, insbesondere L. mesenteroides Subsp. cremoris, z. B. (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Band 2, 1986; Fujisawa et al., Int. Syst. Bact., 42, 487-491, 1992).
Die probiotischen Lactobacilli können im Stande sein, sich an die Darmzellen anzuheften, aber sie müssen es nicht. Jedoch verhalten sich die probiotischen Lactobacilli vorzugsweise so, dass wenigstens 50 Bakterien, insbesondere wenigstens 80 Bakterien, sich in vitro an 100 Darmzellen anheften können. Um einen derartigen adhärenten Bakterientyp auszuwählen kann man eine Bakterienkultur auf einer konfluenten Zellkultur aus immortalisierten Epithelzellen des Darmes verteilen ( EP 0802257 ), die konfluente Kultur waschen und die Zahl der Bakterien, die an den Zotten der Linie anhaften, bestimmen.
Einige Stämme sind tatsächlich fähig, sich an menschliche Zellen anzuheften, pathogene Bakterien, die auf menschlichen Darmzellen vorkommen, zu verdrängen und/oder auf das menschliche Immunsystem einzuwirken, indem sie es ihm ermöglichen, stärker auf Angriffe von außen zu reagieren (Fähigkeit zur Immunmodulation), beispielsweise, indem sie die Fähigkeit der Granulozyten aus dem menschlichen Blut zur Phagozytose erhöhen (J. Dairy Science, 78, 491-197, 1995; immunmodulatorische Fähigkeit des Stammes La-1, der durch die Nestec SA mit dem Budapester Vertrag in der Collection Nationale de Culture de Microorganisme (CNCM), 25 Rue Docteur Roux, 75724 Paris, am 30. Juni 1992 hinterlegt wurde, wo er die Nummer CNCM 1-1225 erhielt). Dieser Stamm wird im EP 0577904 beschrieben.
Es ist z. B. möglich, den probiotischen Stamm Lactobacillus acidophilus CNCM 1-1225 zu verwenden. Dieser Stamm wurde kürzlich nach der neuen Taxonomie, die von Fujisawa et al. vorgeschlagen wurde und jetzt auf dem Gebiet der Taxonomie acidophiler Lactobacilli maßgeblich ist (Int. J. Syst. Bad., 42, 487-791, 1992), unter die Lactobacillus-johnsonii- Bakterien eingeordnet. Es stehen auch andere probiotische Bakterien zur Verfügung, beispielsweise die in der EP 0199535 (Gorbach et al.), US 5296221 (Mitsuoka et al.), US 556785 (Institut Pasteur) oder US 5591428 (Probi AB) beschriebenen.
Die Ernährungszusammensetzungen weisen vorzugsweise eine für die erleichterte Absorption von Mineralien durch die Darmzellen ausreichende Menge an lebenden probiotischen Lactobacilli auf, beispielsweise wenigstens 10⁶ KBE/ml, insbesondere 10⁷–10¹¹ KBE/ml und vorzugsweise 10⁸–10¹¹ KBE/ml („KBE" bedeutet „Kolonie-bildende Einheiten").
Die Ernährungszusammensetzung kann gegebenenfalls auch andere Bakterien enthalten; beispielsweise andere probiotische Bakterien.
Die Ernährungszusammensetzung kann auch eine geeignete Quelle für Proteine enthalten, beispielsweise eine Quelle für tierisches der pflanzliches Protein. Geeignete Proteinquellen sind Milchproteine, Sojaproteine, Reisproteine, Weizenproteine, Sorghumproteine und dergleichen. Die Proteine können in intakter oder in hydrolysierter Form vorliegen.
Die Ernährungszusammensetzung kann auch eine geeignete Quelle für Kohlenhydrate aufweisen, beispielsweise Saccharose, Fructose, Glucose, Maltodextrin und dergleichen.
Die Ernährungszusammensetzung kann auch eine geeignete Quelle für Lipide aufweisen, beispielsweise eine geeignete Quelle für tierische der pflanzliche Lipide. Zu geeigneten Quellen für Lipide gehören Milchfette, Sonnenblumenöl, Rapssamenöl, Olivenöl, Lacksafloröl und dergleichen.
Die Ernährungszusammensetzung kann auch mit Mineralien und Vitaminen angereichert werden. Es wird besonders bevorzugt, die Ernährungszusammensetzung mit Calcium anzureichern.
Die Ernährungszusammensetzung kann auch in Form von Nahrungsmittelzusammensetzungen zubereitet werden, die für den menschlichen oder tierischen Verzehr vorgesehen sind. Geeignete Nahrungsmittelzusammensetzungen können in Form von Flüssigkeiten, Pulvern und Feststoffen bereit gestellt werden.
Die Ernährungszusammensetzung kann auch vergoren werden, um eine ausreichende Menge an probiotischen Lactobacilli zu erhalten. Vergorene Zusammensetzungen auf Milchbasis sind somit besonders geeignet. Der Begriff Milch bezieht sich nicht nur auf die Milch von Tieren, sondern auch auf das, was gewöhnlich als pflanzliche Milch bezeichnet wird, d. h. auf einen Extrakt behandelter oder unbehandelter pflanzlicher Materialien, wie Hülsenfrüchten (Soja, Kichererbsen, Linsen und dergleichen) oder Ölsamen (Raps, Soja, Sesam, Baumwolle und dergleichen), wobei der Extrakt Proteine in Lösung oder in kolloidaler Suspension, die durch chemische Prozesse, durch Säurefermentierung und/oder durch Hitze koagulierbar sind, enthält. Es ist möglich, diese Arten pflanzlicher Milch Hitzebehandlungen zu unterziehen, die denen für tierische Milch ähnlich sind. Es ist auch möglich, sie Behandlungen zu unterziehen, die für sie spezifisch sind, wie einer Entfärbung, einer Geruchsentfernung sowie Behandlungen zur Unterdrückung eines unerwünschten Geschmacks. Schließlich bezeichnet der Begriff Milch auch Mischungen der Milch von Tieren mit pflanzlichen Milcharten.
Es ist auch möglich, der Ernährungszusammensetzung während ihrer Zubereitung eine geeignete Menge einer probiotischen Lactobacillus-Kultur in flüssiger, konzentrierter, trockener oder verkapselter Form, je nach Bedarf, zuzugeben oder die Ernährungszusammensetzung mit ihr zu vermischen oder mit ihr zu überziehen.
Es wurde gefunden, dass die Mikroverkapselung der probiotischen Lactobacilli Vorteile für die Therapie besitzt. Zunächst erhöht die Mikroverkapselung signifikant das Überleben der probiotischen Lactobacilli und damit die Zahl lebender probiotischer Lactobacilli, die im Darm ankommen. Noch wichtiger ist, dass die probiotischen Lactobacilli allmählich in den Darm abgegeben werden, was eine verlängerte Wirkung der probiotischen Lactobacilli auf die Absorption von Mineralien durch die Darmzellen ermöglicht.
Vorzugsweise werden zur Verkapselung der probiotischen Lactobacilli die probiotischen Lactobacilli gefriergetrocknet oder sprühgetrocknet ( EP 0818529 ), und sie werden in ein Gel eingearbeitet, das beispielsweise aus einer verfestigten Fettsäure, einem Natriumalginat, polymerisierter Hydroxypropylmethylcellulose oder polymerisiertem Vinylpyrrolidon besteht. Für diesen Zweck wird der Inhalt der FR 2 443 247 mit der entsprechenden Quellenangabe aufgenommen.
Die Ernährungszusammensetzungen müssen keine Kohlenhydrate, die für die aktive Vergärung durch die probiotischen Lactobacilli im Medium des Darms erforderlich sind, enthalten. Im Gegenteil, die erleichterte Absorption von Mineralien ist nicht von der vergärenden Aktivität der probiotischen Lactobacilli abhängig, sondern sie resultiert anscheinend aus dem direkten Kontakt zwischen den Lactobacilli und den Darmzellen. Es wird angenommen, dass dieser eine Ansäuerung der Mikroumgebung und dadurch eine bessere Solubilisierung der Mineralien bewirkt.
Es kann jedoch wünschenswert sein, die Erneuerung oder spezifische Vermehrung der probiotischen Lactobacilli im Darmmedium zu ermöglichen, um dadurch die Wirkung einer erleichterten Absorption der Mineralien zu verlängern. Das kann durch den Zusatz von Fasern, die die spezifische Vermehrung von probiotischen Lactobacilli im Darmmedium erleichtern, zur Ernährungszusammensetzung erreicht werden. Diese Fasern sind löslich und vergärbar.
Diese Fasern können beispielsweise aus Pflanzenpektinen, Chito-, Fructo-, Gentio-, Galacto-, Isomalto-, Manno- oder Xylo-Oligosacchariden oder beispielsweise Oligosacchariden aus Soja ausgewählt werden (Playne er al., Bulletin der IDF 313, Gruppe B42, Jahrestagung September 95, Wien).
Die bevorzugten Pektine sind Polymere von α-1,4-D-Galacturonsäure mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung von 10 bis 400 Kilo-Dalton, die z. B. aus Karotten oder Tomaten gereinigt werden können ( JP 60164432 ). Die bevorzugten Galacto-Oligosaccharide weisen einen Saccharidteil auf, der aus 2 bis 5 sich wiederholenden Einheiten mit der Struktur [-α-D-Glu-(1 → 4)-β-D-Gal-(1 → 6)-] (Yakult Honsa Co., Japan) besteht. Die bevorzugten Fructo-Oligosaccharide sind Inulin-Oligofructosen, die aus Chicoree extrahiert werden und z. B. 1 bis 9 sich wiederholende Einheiten der Struktur [-β-D-Fru-(1 → 2)-β-D-Fru-(1 → 2)-] aufweisen können ( WO94/12541 ; Raffinerie Tirlemontoise S.A., Belgien), oder Oligosaccharide, die aus Saccharose-Einheiten synthetisiert werden und z. B. einen Saccharidteil aufweisen können, der aus 2 bis 9 sich wiederholenden Einheiten mit der Struktur [-α-D-Glu-(1 → 2)-β-D-Fru-(1 → 2)-] besteht (Meiji Seika Kasiha Co., Japan). Die bevorzugten Malto-Oligosaccharide weisen einen Saccharidteil auf, der aus 2 bis 7 sich wiederholenden Einheiten mit der Struktur [-α-D-Gal-(1 → 4)-] besteht (Nihon Shokuhin Kako Co., Japan). Die bevorzugten Isomaltosen weisen einen Saccharidteil auf, der aus 2 bis 6 sich wiederholenden Einheiten mit der Struktur [-α-D-Glu-(1 → 6)-] besteht (Shows Sangyo Co., Japan). Die bevorzugten Gentio-Oligosaccharide weisen einen Saccharidteil auf, der aus 2 bis 5 sich wiederholenden Einheiten mit der Struktur [-β-D-Glu-(1 → 6)-] besteht (Nihon Shokuhin Kako Co., Japan). Und die bevorzugten Xylo-Oligosaccharide weisen schließlich einen Saccharidteil auf, der z. B. aus 2 bis 9 sich wiederholenden Einheiten mit der Struktur [-β-Xyl-(1 → 4)-] besteht (Suntory Co., Japan).
Die Menge der Fasern in der Ernährungszusammensetzung hängt von ihrer Fähigkeit zur Förderung der Entwicklung von probiotischen Lactobacilli ab. Als allgemeine Regel kann gelten, dass die Ernährungszusammensetzung 1 bis 50% Gew.-% derartiger Fasern (bezogen auf die Trockensubstanz) enthalten kann. Die Konzentration der probiotischen Lactobacilli kann wenigstens bei 10³ KBE der probiotischen Lactobacilli pro g Fasern liegen, vorzugsweise bei 10³ bis 10⁷ KBE/g Fasern.
Ein weiterer durch die Fasern bewirkter Vorteil liegt in der Tatsache, dass die Passage durch den Darm durch die Fasern verzögert wird. Das ist besonders dann der Fall, wenn die Menge der Fasern hoch ist, d. h. in der Größenordnung von 20 bis 50 Gew.-% der Zusammensetzung liegt. Da die probiotischen Lactobacilli als Folge der Passage durch den Darm allmählich eliminiert werden, ist es auf diese Weise möglich, die günstige Wirkung der probiotischen Lactobacilli auf die Absorption von Mineralien durch den Darm zu verlängern.
Die Ernährungszusammensetzungen können die Form jeder beliebigen enteral verabreichten Nahrung haben. Beispielsweise kann die Ernährungszusammensetzung in Form vergorener Milch vorliegen ( EP 0577904 ), einer Babynahrung ( EP 0827697 ), eines Frischkäses ( PCT/EP 97/06947 ), eines gereiften Käses, einer Eiscreme ( WO 98/09535 ), eines mit einer Creme gefüllten Kekses ( EP 704164 ; EP 666031 ), einer trockenen Wurst und/oder einer Pastete ( EP 689769 ).
Die Ernährungszusammensetzungen können auch in einer Form vorliegen, die für Personen geeignet ist, die keine Milchprodukte vertragen. Diese Ernährungszusammensetzungen enthalten keine allergenen Milchderivate. Beispielsweise kann die Ernährungs zusammensetzung für Kinder, die auf Milchproteine allergisch sind, so formuliert sein, dass sie hypoallergene Milchderivate enthält. Diese Milchderivate können der Europäischen Direktive 96/4/EC entsprechen, die feststellt, dass in einer hypoallergenen Milch die allergenen Proteine mittels immunologischer Verfahren wenigstens 100-mal weniger nachweisbar sein sollten als in nicht hydrolysierter Milch (Off. J. Europ. Comm. Nr. L49/12, Annex-Punkt 5.a., 1996; Fritsche et al., Int. Arch. Aller. Appl. Imm., 93, 289-293, 1990).
Die Ernährungszusammensetzungen sind besonders für die Behandlung oder Prophylaxe von bzw. bei Personen mit Mineralienmangelerscheinungen geeignet oder für eine Kompensierung physiologischer Mängel als Folge einer Ernährung, die arm an Mineralien ist, oder zur Abdeckung des Mineralienbedarfs bei Kindern, schwangeren Frauen, stillenden Frauen oder älteren Menschen.
Diese Erfindung wird nun anhand spezifischer Ausführungsformen weiter beschrieben. Die Prozentangaben beziehen sich auf Gewichtsprozente, es sei denn, es ist etwas anderes angegeben. Diese Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und schränken die Erfindung auf keine Weise ein.
Beispiel 1

– Materialien: ⁴⁵CaCl₂ wird von Amersham bezogen, Lucifer Yellow von Sigma, Collagen I von Centrix Pharmaceuticals, PBS, HEPES und die Komponenten des Zellkulturmediums von Gibco und die Kulturgefäße von Falcon.
– Zellkultur: Die menschliche Zelllinie Caco-2, die aus einem Colon-Adenokarzinom isoliert wurde, wird von der American Type Culture Collection bezogen (Passage 41). Die Zellen werden in einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² in DMEM, das 4,5 g/l Glucose, 20% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum, 1 mg/ml Fungizon, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin, 200 μg/ml Gentamycin und 1% nichtessentielle Aminosäuren enthält, in Kultur gebracht. Die Zellen werden in regelmäßigen Abständen trypsiniert und in einem Verhältnis von 1:20 wieder ausgesät. Die in den Experimenten zum Calciumtransport eingesetzten Zellen werden in einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen/cm² in permeablen Einsätzen, die zuvor mit 50 μg/ml Collagen I beschichtet worden waren, in Kultur gebracht. In allen Fällen werden die Zellen bei 37° in einem Inkubator mit 10% CO₂/90% Luft gehalten, und das Medium wird alle zwei Tage gewechselt.
– Vitalität der Caco-2-Zellen: Um die Möglichkeit auszuschließen, dass die Potenzierung der Calcium-Absorption durch die Darmzellen in Gegenwart der Lactobacilli auf einer Schädigung der Zellen beruht, wurde ein Teil jeder Probe für die Calcium-Bestimmung zur Messung der Hexosaminidase-Aktivität herangezogen (Landegren er al., J. Immunol. Method., 67, 379-388, 1984). Dieser kolorimetrische Test ermöglicht es, die Zelllyse und/oder den Zelltod durch die Messung der in den Überstand des Cytosols geschädigter Zellen freigesetzten Hexosaminidase-Aktivität zu quantifizieren. Die Ergebnisse zeigen, dass in allen Experimenten die Hexosaminidase-Aktivität in Gegenwart der Lactobacilli gleich ist.
– Permeabilität des Zellrasens: Die Integrität des von den Caco-2-Zellen am Ende ihres Wachstums gebildeten Zellrasens und ihrer Differenzierung wird anhand der Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands („transepithelial electrical resistance", TEER) unter Verwendung einer Voltmeter/Ohmmeter-Millicell-ERS bestimmt. Die Experimente zur Calcium-Absorption werden durchgeführt, wenn dieser Widerstand wenigstens 700 Ohm × cm² erreicht hat. Die Permeabilität des Zellrasens während der Experimente zur Calcium-Absorption wird durch die Messung des Ausmaßes der Diffusion (in %) von Lucifer Yellow, einem Molekül, das die Zellmembran nicht passiert, ermittelt.
– Calcium-Transport: Die Caco-2-Zellen werden auf Einsätzen 3 bis 5 Wochen kultiviert. Am Tag des Experiments wird der Zellrasen zweimal mit PBS gewaschen, und dann werden zum unteren Kompartiment des Einsatzes, der die Serosa (den basolateralen Pol der Zellen) inkorporiert hat, 2,5 ml Trägerpuffer gegeben (140 mM NaCl, 5,8 mM KCl, 0,34 mM NaH₂PO₄, 0,44 mM KH₂PO₄, 0,8 mM MgSO₄, 20 mM HEPES, 4 mM Glutamin, 25 mM Glucose, pH 7,4), der zusätzlich 2,5 mM CaCl₂ enthält, während zum oberen Kompartiment des Einsatzes, das das Darmlumen (den apikalen Pol der Zellen) inkorporiert hat, 1,5 ml Trägerpuffer gegeben werden, der zusätzlich 10 mM CaCl₂ und Spuren von ⁴⁵CaCl₂ sowie Lucifer Yellow enthält. Die Einsätze werden dann bei 37°C eingesetzt, und es werden in regelmäßigen Abständen 50-μl-Proben aus dem oberen und dem unteren Kompartiment entnommen.

Die in diesen Proben enthaltene Radioaktivität wird mittels Flüssig-Szintillationszählung bestimmt und ermöglicht es, auf die Menge des kalten absorbierten CaCl₂ zu extrapolieren. Der basale Calcium-Transport wird als nmol Calcium, das in das untere Kompartiment des Einsatzes transportiert wird, ausgedrückt. Die Diffusion von Lucifer Yellow wird fluorimetrisch im unteren Kompartiment nachgewiesen und als % der ins obere Kompartiment gegebenen Menge ausgedrückt.

– Einfluss der Lactobacilli: Die Stämme Lactobacillus johnsonii La1 (CNCM 1-1225), La17, La22, La31, Lactobacillus acidophilus La10, La18, La31, Lactobacillus bulgaricus Lfi5, YL8, Lactobacillus paracasei ST11, Lactobacillus gasseri LGA7, Lactobacillus reuteri LR7 und Streptococcus thermophilus Sfi20, YS4 (Nestle Collection, Lausanne, Schweiz) werden unter anaeroben Bedingen in MRS-Nährlösung für Lactobacillus oder in M17 für Streptococcus zweimal 24 h in Kultur gebracht, mit PBS gewaschen und in Trägerpuffer resuspendiert, ehe sie in das obere Kompartiment der Einsätze gegeben werden. Das Verhältnis Caco-2-Zellen:Bakterien liegt dann nach den Ergebnissen der Tests bei ungefähr 1:100 (6,7 × 10⁷ oder 3,4 × 10⁸ KBE/ml im oberen Kompartiment der Einsätze für die in den 2 und 3 dargestellten Tests). Die Calcium-Absorption wird nach dem oben erwähnten Protokoll bestimmt.
– Ergebnisse zum basalen Calcium-Transport: Es wurde ein Calcium-Gradient in den Einsätzen etabliert, indem 2,5 mM CaCl₂ in das untere Kompartiment, was der normalen Plasmakonzentration beim Menschen entspricht, und ungefähr 10 mM CaCl₂ in das obere Kompartiment, was dem Calcium-Gehalt einer Nahrung entspricht, eingeführt wurden. Wie die Ergebnisse eines repräsentativen Experiments, die in der 1 dargestellt sind, zeigen, steigt die basale Absorption von Calcium durch die Caco-2-Zellen mit der Zeit an, wodurch nach 4 h 600 nmol/Einsatz, der ungefähr 3 × 10⁶ Zellen aufweist, erreicht werden. Als Kontrolle für die Intaktheit des Zellrasens während des Experiments wurde die Diffusion von Lucifer Yellow gemessen, und es zeigte sich, dass sie bei unter 2% lag.
– Messung des Einflusses der Lactobacilli: In den 2 und 3 ist die Absorption von Calcium durch die Caco-2-Zellen bei Anwesenheit der adhärenten Lactobacillus johnsonii-Stämme La1 und La22, bei Anwesenheit der nicht-adhärenten Lactobacillus-acidophilus-Stämme La10 und La18 und bei Anwesenheit der Stämme L. paracasei (ST11), L. gasseri (LGA7) und L. reuteri (LR7) signifikant erhöht.

Die Fähigkeit der Bakterien, an den Darmzellen zu haften, korreliert demnach anscheinend nicht direkt mit der Fähigkeit der gleichen Zellen, die Absorption von Calcium zu erhöhen. In allen diesen Experimenten wird die Diffusion von Lucifer Yellow auf ähnliche Weise moduliert, bleibt aber vernachlässigbar.

Eine Abnahme des pH im oberen Kompartiment der Einsätze wird ebenfalls beobachtet, wenn sich die Caco-2-Zellen in Gegenwart von Lactobacilli befinden, und zwar unabhängig vom Stamm, mit Ausnahme des Sfi20-Stammes (Tabelle 1). Es besteht deshalb keine Korrelation zwischen der Zunahme der Absorption von Calcium und dieser Abnahme des pH. Jedoch sind verschiedene Bakterienstämme, die in der Lage sind, die Calcium-Absorption zu erhöhen, nicht in der Lage, das experimentelle Medium in Abwesenheit der Caco-2-Zellen anzusäuern. Das bedeutet, dass die Ansäuerung in Gegenwart von Caco-2-Zellen und von Bakterien ein Zusammenwirken der beiden Organismustypen erfordert und auf den Caco-2-Zellen beruhen könnte. Tabelle 1: Einfluss von Lactobacilli auf den pH des experimentellen Mediums in Abwesenheit und in Anwesenheit von Caco-2-Zellen

Bakterien	Zahl der Tests	pH ohne Caco-2-Zellen	pH mit Caco-2-Zellen
keine	4	7 + 0	7 ± 0
La1	3	6,75 ± 0,3	3,75 ± 0,3
La10	3	4,65 + 0,3	4,15 ± 0,3
La17	2	7 ± 0	3,5 ± 0,7
La18	2	7 ± 0	3,5 ± 0,5
La22	2	7 ± 0	3,25 ± 0,35
La29	2	4,25 ± 0,35	3,5 + 0
La31	2	7 ± 0	3,75 ± 0,35
Sfi20	1	7	7
YS4	1	5	4
Lfi5	1	4	3
YL8	1	4	3

Beispiel 2
Es wurden Tests durchgeführt, die den im Beispiel 1 durchgeführten Tests ähnelten, um den Einfluss von Lactobacilli auf die Calcium-Absorption durch die Darmzellen in Gegenwart von markiertem Inulin (³H-Inulin, Amersham; als Tracer dienende probiotische Faser) zu bestimmen. Die Ergebnisse bestätigen, das probiotische Lactobacilli in vitro die Absorption von Mineralien durch die Darmzellen erhöhen.
Beispiel 3
Es wurden Tests durchgeführt, die den im Beispiel 1 durchgeführten Tests ähnelten, um den Einfluss von Lactobacilli auf die Absorption von Magnesium, Eisen und Zink durch die Darmzellen zu bestimmen. Die Ergebnisse bestätigen, das probiotische Lactobacilli in vitro die Absorption von Mineralien durch die Darmzellen erhöhen.
Beispiel 4
In einem 100-l-Tank werden 80 l Kulturmedium mit der folgenden Zusammensetzung, in %, hergestellt:

Hefeextrakt 0,25%

Trypticase 1,00%

Phyton 0,50%

Glucose 1,50%

L-Cystein-HCl 0,05%

K₂HPO₄ 0,25%

ZnSO₄ 0,025%

FeCl₃ Spur

Wasser Rest ad 100%
Das Animpfen erfolgt mit 1 l einer 20-h-Kultur von Lactobacillus johnsonii La1 (CNCM 1-1225). Das Medium wird 12 h bei 30°C inkubiert. Die Kultur-Nährlösung wird zentrifugiert, und es werden 240 g Zellen erhalten. Sie werden in 250 ml Magermilch, die mit 7% Lactose versetzt ist, verdünnt. Die Mischung wird unter Verwendung von flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Gefriertrocknung erfolgt bei 40°C über Nacht. Eine 5%ige Dispersion des erhaltenen Pulvers wird in hydriertem Pflanzenfett mit einem Schmelzpunkt von 42°C zubereitet und bei 45°C verflüssigt. Die Dispersion wird bei 45°C unter einem Druck von 4 bar gleichzeitig mit flüssigem Stickstoff, in einer Menge von 1 Teil der Dispersion pro 5 Teile Stickstoff, auf die Oberseite eines vertikalen Zylinders von 1,5 m Durchmesser und 10 m Höhe gespritzt. Es wird ein Behälter mit flüssigem Stickstoff, in dem die die Bakterien enthaltenden Mikrokügelchen, deren Durchmesser zwischen 0,1 und 0,5 um variiert, gesammelt werden, an die Unterseite des Zylinders gestellt. Die Mikrokügelchen werden dann in ein Fließbett gegeben, und es wird eine alkoholische Lösung, die 8% Zein enthält, über das Bett gesprüht, und zwar in einer Menge, dass die um die Mikrokügelchen gebildete Zeinschicht 5% ihres Gewichts ausmacht.
Die Mikrokügelchen werden dann in eine Ernährungszusammensetzung eingearbeitet, die die Absorption von Mineralien durch die Darmzellen erleichtern soll.
Beispiel 5

Es wird eine konzentrierte Basis für eine Eiscreme zubereitet, indem bei 60–65°C 20 min lang ungefähr 11% Milchfett, 8,8% Milchfeststoffe (Feststoffe, kein Fett), 25% Saccharose, 5% Glucosesirup und 0,6% Emulstab^® SE30 gemischt werden. Die Basis wird bei 72–75°C und 210 bar (2 Schritte bei 250/50 bar) homogenisiert, 22 Sekunden bei 85°C pasteurisiert (AVP-Pasteurisierapparat, Evreux, Frankreich, 400 l/h), auf 4°C abgekühlt, und es werden 40% durch Lactobacillus johnsonii La-1 (5 × 10⁸ KBE/ml) und Bifidobacterium longum BH6 (3 × 10⁸ KBE/ml) angesäuerte Milch zugegeben. Die Zusammensetzung dieser konzentrierten Basis ist in der Tabelle unten angegeben.

Zutaten	Zusammensetzung (kg)	Fett (%)	Feststoffe, kein Fett (%)	Saccharose (%)	trockener Extrakt (%)
Sahne (35%)	31,43	11,00	1,57		12,57
Magermilchpulver	7,60		7,30		7,30
Saccharose	36,77			25,00	25,00
Glucosesirup	5,27				5,00
Emulstab^® SE30	0,67				0,63
Wasser	18,26
gesamte Sahnebasis	100	11,00	8,87	25,00	50,50
Sahnebasis (60%)	60,00	6,60	5,32	15,00	30,30
gesäuerte Milch (40%)	40,00	1,40	4,68		6,08
gesamte Sahnebasis + gesäuerte Milch	100,00	8,00	10,00	15,00	36,38

Nach der Reifung der Creme für 12 h bei 5°C wird sie mit einem Aufschlag von 95 Vol.-% eingefroren (Crepaco-Gefrierapparat, Evreux, Frankreich; 160 l Produkt/h).

Es wird ein Waffelteig, der 10% Fructo-Oligosaccharid Raftilose^® L30 (Raffinerie Tidemontoise S.A., Belgien) enthält, nach dem unten wiedergegebenen Rezept hergestellt. Nach dem Backen wird die Waffel auf herkömmliche Weise zu einer Tüte geformt. Nach dem Abkühlen wird die Innenseite der Tüten mit einem Fettfilm Sprüh-beschichtet, und dann werden die Tüten mit der oben beschriebenen geschlagenen Eiscreme gefüllt. Für eine Waffeltüte von 11,5 g werden auf diese Weise 130 ml geschlagene Eiscreme (ungefähr 65 g) und 5 g Schokolade (über die Creme gesprüht) verwendet.

Zutaten	Gewicht (g)	Hersteller
gewöhnliches Weizenmehl 55	52
Stärke	0,2
Fructo-Oligosaccharid Raftilose^® L30	10	Raffinerie Tirlemontoise S.A., Belgien
Zucker	27,8
Fett	8
Emulgator	1,5
Salz	0,5
gesamtes Waffelrezept	100

Somit werden pro Eistüte 1,1 g Fasern und ungefähr 10⁸ KBE/g Lactobacilli bereit gestellt. Die Fasern fördern, indem sie die spezifische Entwicklung von Lactobacilli in Darmtrakt fördern, somit die Assimilation von Mineralien.

Claims

Verwendung probiotischer Milchsäurebakterien bei der Herstellung einer enteralen Ernährungszusammensetzung für die Behandlung oder Verbeugung von Calcium-, Magnesium- und Zink-Mangelzuständen.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der die Milchsäurebakterien solche von den Milchsäurebakterien sind, die in der Lage sind, an Darmzellen zu adhärieren.
Verwendung nach Anspruch 2, bei der die Milchsäurebakterien der Lactobacillus johnsonii CNCM I-1225 Stamm ist.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der die enterale Ernährungszusammensetzung 10⁷ bis 10¹¹ KBE von Milchsäurebakterien beinhaltet.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der die enterale Ernährungszusammensetzung Milchproteine beinhaltet.
Verwendung nach Anspruch 5, bei der die enterale Ernährungszusammensetzung eine Säuglingsnahrungszubereitung ist, die hypoallergene Milchproteinhydrolysate umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der die enterale Ernährungszusammensetzung weiterhin präbiotische Fasern umfasst.