DE69822960T2 - Verfahren zur Herstellung von L-Leucin - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Leucin, genauer ein Verfahren zur Herstellung von L-Leucin unter Verwendung eines Bakteriums der Gattung Escherichia. L-Leucin ist eine essentielle Aminosäure, die als Nahrungsmittelzusatz für Lebensmittel oder Futtermittel, Reagens oder Material für die medizinische Behandlung, pharmazeutische oder chemische Industrie oder als Wachstumsfaktor, der für die Herstellung weiterer Aminosäuren, wie Lysin, verwendet wird, verwendet werden kann.
  • Hintergrund
  • Früher wurde L-Leucin durch ein Fermentationsverfahren hergestellt, bei dem hauptsächlich Mikroorganismen der Gattung Brevibacterium, Corynebacterium oder Serratia oder L-Leucin herstellende Mutanten davon verwendet wurden (Amino acid fermentation, JAPAN SCIENTIFIC SOCIETY'S PRESS, S. 397–422, 1986).
  • Zum Beispiel offenbart US 3,970,519 Mikroorganismen der Gattung Brevibacterium oder Corynebacterium, die resistent gegen Rückkopplungshemmung durch Leucin oder seine Analoga sind, und die mindestens eines von Isoleucin, Threonin oder Methionin als Wachstumsnahrungsmittel benötigen und die L-Leucin unter aeroben Kulturbedingungen produzieren.
  • Die größte L-Leucin-Akkumulation wurde erreicht, wenn Brevibacterium flavum VKPM B-2736 verwendet wurde: Dieser Stamm produziert L-Leucin in einer Konzentration bis zu 26 g/L auf einem Saccharose enthaltenden Medium bei 72 Std. Fermentation in einem Laborfermentator(USSR Author Certificate 1394711). Brevibacterium lactofermentum 34 produziert L-Leucin bis zu 34 g/L auf einem Glucosemedium (Appl. Environ. Microbiol., 51, S. 1024 (1986)).
  • Wie oben beschrieben, wurde die L-Leucin-Produktivität zu einem gewissen Teil verbessert, jedoch wird die Entwicklung eines effizienteren und kosteneffektiveren Verfahrens zur Herstellung von L-Leucin erforderlich, um die zunehmende Nachfrage nach L-Leucin in der Zukunft zu befriedigen.
  • Andererseits werden Mikroorganismen der Gattung Escherichia aufgrund ihrer raschen Wachstumsrate, wichtigen Daten aus genetischen Analysen und der im Überfluss vorhandenen genetischen Materialien potenziell als potente L-Leucin produzierende Bakterien verwendet. Jedoch gibt es wenige Berichte, die die Herstellung von L-Leucin offenbaren, wobei Bakterien der Gattung Escherichia verwendet werden.
  • Als L-Leucin produzierende Bakterienstämme der Gattung Escherichia sind ein Stamm, der gegen β-Thienylalanin resistent ist, ein Stamm, der gegen β-Thienylalanin und β-Hydroxyleucin resistent ist (japanische Patentveröffentlichung Nr. 62– 34397, für beide) und ein Stamm, der gegen 4-Azaleucin oder 5,5,5-Trifluorleucin resistent ist (japanische der Offenlegungsschrift Nr. 8-70879), bekannt.
  • Jedoch ist weder ein L-Leucin resistentes Bakterium der Gattung Escherichia noch eine Beziehung zwischen der L-Leucin-Resistenz und der L-Leucin-Produktivität bekannt.
  • Jedoch offenbart EP-A-0 698 668 ein Verfahren zur Herstellung von L-Leucin, welches das Kultivieren eines Mikroorganismus der Gattung Escherichia, der resistent gegen ein L-Leucin-Analogon ist und L-Leucin produzieren kann, umfasst.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung wurde unter den zuvor erwähnten Gesichtspunkten gemacht, wobei eine Aufgabe der Erfindung ist, die L-Leucin-Produktivität von Bakterien der Gattung Escherichia zu verbessern und ein effizientes und kosteneffektives Verfahren zur Herstellung von L-Leucin bereitzustellen.
  • Als Ergebnis sorgfältiger Untersuchungen zum Erreichen der zuvor erwähnten Aufgabe haben die Erfinder herausgefunden, dass, die L-Leucin-Produktivität verbessert wird, wenn einem Bakterium der Gattung Escherichia Resistenz gegen L-Leucin verliehen wird, und haben die vorliegende Erfindung vervollständigt.
  • In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Selektion eines L-Leucin produzierenden Bakteriums der Gattung Escherichia bereit, welches das Selektieren eines Stammes eines Bakteriums der Gattung Escherichia, das L-Leucin produzieren kann, und das Selektieren eines Stammes dieses Bakteriums umfasst, der in einem Medium wachsen kann, das 15 g/L L-Leucin enthält.
  • In einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Bakterium bereit, das durch ein Verfahren nach dem ersten Aspekt erhältlich ist.
  • In einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Bakterien mit den Hinterlegungsnummern VKPM-7386, VKPM-7387 und VKPM-7388 bereit.
  • In einem vierten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von L-Leucin bereit, welches die Stufe des Kultivierens eines Bakteriums nach dem ersten Aspekt umfasst.
  • In einem fünften Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von L-Leucin bereit, welches folgende Stufen umfasst:
    • a) Selektieren eines Bakteriums durch ein Verfahren, wie im ersten Aspekt definiert,
    • b) Kultivieren des Bakteriums, welches in Stufe a) erhalten wurde, und
    • c) Gewinnen des L-Leucins aus dem Medium.
  • Bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen definiert.
  • Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend genauer erklärt.
  • <1> Erfindungsgemäßes Bakterium der Gattung Escherichia
  • Ein erfindungsgemäßes Bakterium ist ein Bakterium der Gattung Escherichia, das L-Leucin produzieren kann und resistent gegen L-Leucin ist. Das Bakterium der Gattung Escherichia kann beispielsweise durch Escherichia coli (E. coli) dargestellt werden. Das Bakterium der Gattung Escherichia, das L-Leucin produzieren kann, wird zum Beispiel durch Bakterien mit einer Resistenz gegen L-Leucin-Analoga, wie β-2-Thienylalanin, 3-Hydroxyleucin, 4-Azaleucin und 5,5,5-Trifluorleucin, die in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 62-34397 und der japanischen Patentoffenlegungsschrift Nr. 8-70879 beschrieben sind, und durch ein Bakterium beispielhaft dargestellt, das mittels gentechnischen Verfahren gezüchtet werden kann, wie in WO 96/06926 beschrieben. Das erfindungsgemäße Bakterium der Gattung Escherichia kann aus Bakterien der Gattung Escherichia, die L-Leucin produzieren können, durch Selektieren eines Stammes erhalten werden, der gegen L-Leucin resistent ist. Alternativ kann das erfindungsgemäße Bakterium der Gattung Escherichia ebenso aus Bakterien der Gattung Escherichia, die gegen L-Leucin resistent sind, durch Selektieren eines Stammes erhalten werden, der L-Leucin produzieren kann. Die am stärksten bevorzugte Ausführungsform ist ein Bakterium der Gattung Escherichia, das außerdem gegen Leucin-Analoga resistent ist.
  • In einem Bakterium der Gattung Escherichia wird L-Leucin im Biosyntheseweg hergestellt, der eigentümlich für L-Leucin ist, und der sich vom Biosyntheseweg des L-Valins im letzten Zwischenprodukt (2-Ketoisovalerat) unterscheidet.
  • In einem Bakterium der Gattung Escherichia werden die letzten Schritte der Biosynthese des L-Valins und der Biosynthese, die eigentümlich für das L-Leucin ist, durch eine Gruppe von Enzymen ausgeführt, die durch das ilvGMEDA-Operon bzw. die durch das leuABCD-Operon codiert werden.
  • Das leuABCD-Operon umfasst die leuA-, leuB-, leuC- und leuD-Gene. Davon codiert leuA für die α-Isopropylmalat-Synthase, leuB für die β-Isopropylmalat-Dehydrogenase, leuC und leuD für die α-Isopropylmalat-Isomerase. Von diesen Enzymen katalysiert die α-Isopropylmalat-Synthase die synthetische Umsetzung des α-Ketoisovalerats zu α-Isopropylmalat, die α-Isopropylmalat-Isomerase die Isomerisierungsreaktion des α-Isopropylmalats zu β-Isopropylmalat und die β-Isopropylmalat-Dehydrogenase die Dehydrierungsreaktion des β-Isopropylmalats zu α-Ketoisocapronsäure, die das letzte Zwischenprodukt der L-Leucin-Biosynthese ist. Die Aminierungsreaktion der α-Ketoisocapronsäure zum Endprodukt, L-Leucin, wird hauptsächlich durch die Transaminase katalysiert. Bakterien der Gattung Escherichia weisen vier Arten an Transaminsasen auf, die Transaminase A (Aspartat-Glutamat-Aminotransferase), die durch das aspC-Gen codiert wird, die Transaminase B (BCAA-Aminotransferase), die durch das ilvE-Gen codiert wird und die im ilvGMEDA-Operon enthalten ist, die Transaminase C (Alanin-Valin-Aminotransferase), die durch das avtA-Gen codiert ist, und die Transaminase D (Tyrosine-Aminotransferase), die durch das tyrB-Gen codiert ist. Diese Enzyme sind an verschiedenen Aminierungsreaktionen beteiligt. Von diesen Enzymen katalysieren die Transamainase B und die Transaminase D die oben erwähnte Aminierungsreaktion der α-Ketoisocapronsäure zu L-Leucin. Die Transaminase C und die Transaminase D katalysieren den letzten Schritt des Biosynthesewegs von L-Valin, der einen gewöhnlichen Syntheseweg innerhalb der Biosynthese des L-Valins und des L-Leucins beinhaltet.
  • Von den oben erwähnten Umsetzungen im Biosyntheseweg des L-Leucins ist die synthetische Umsetzung des α-Ketoisovalerats zu α-Isopropylmalat, die durch die α-Isopropylmalatsynthase katalysiert wird, die der Rückkopplungshemmung durch L-Leucin unterliegt, der geschwindigkeitsbestimmende Schritt. Ebenso wird die Expression des leuABCD-Operons durch L-Leucin gehemmt. Die Expression des ilvBN-Gens, das für die Acetohydroxysäure-Synthase I codiert, wird gemeinsam durch L-Valin und L-Leucin gehemmt, die Expression des ilvGM-Gens, das für die Acetohydroxysäure-Synthase II codiert, wird gemeinsam durch L-Isoleucin, L-Valin und L-Leucin gehemmt und die Expression des ilvIH-Gens, das für die Acetohydroxysäure-Synthase III codiert, wird durch L-Leucin gehemmt.
  • Die α-Isopropylmalat-Synthase, die ebenso wie das unterdrückte leuABCD-Operon gehemmt ist, betrifft nur die Biosynthese des L-Leucins. Daher verursacht die oben genannte Hemmung und Unterdrückung keine Unterbrechung des Zufuhrweges für Nährstoffe, sogar wenn ein Überschuss an L-Leucin vorhanden ist. Obwohl die Expression des ilvIH-Gens gehemmt ist, wird die Expression des ilvBN-Gens und des ilvGM-Gens, die für die anderen Isozyme codieren, nicht beeinflusst. Daher wird angenommen, dass ein Überschuss an L-Leucin das Zellwachstum nicht beeinflusst. Jedoch haben die Erfinder unerwartet entdeckt, dass das Zellwachstum in Gegenwart eines Überschusses an L-Leucin gehemmt war. Außerdem konnten die Erfinder die L-Leducin-Produktivität eines Bakteriums der Gattung Escherichia durch Verleihen von L-Leucin-Resistenz verbessern.
  • Das Verfahren, bei dem Bakterien der Gattung Escherichia erhalten werden, die gegen L-Leucin resistent sind, und Bakterien der Gattung Escherichia, die gegen Leucin-Analoga resistent sind, wird nachfolgend erklärt.
  • Die Bakterien der Gattung Escherichia, die gegen L-Leucin resistent sind, können durch Kultivieren von Bakterien der Gattung Escherichia in einem Minimalmedium, das L-Leucin in einer Konzentration enthält, die eine Hemmung des Wachstums verursacht, erhalten werden. Als Wachstumshemmung wird hier ein langsames Wachstum oder eine Beendigung des Wachstums verstanden. Die Selektion der Mutanten kann einmal oder mehrmals durchgeführt werden. Die L-Leucin-Konzentration im Medium beträgt 15 g/L. Das Bakterium der Gattung Escherichia kann vor der Selektion mutiert werden. Die Mutation kann durch Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen oder durch Behandlung mit einem Mutagen, das gewöhnlich zur künstlichen Mutagenese verwendet wird, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) oder Salpetrigesäure und dergleichen, durchgeführt werden.
  • Das Bakterium der Gattung Escherichia, das gegen L-Leucin resistent ist und, wie oben erwähnt, erhalten wird, kann in Gegenwart einer L-Leucin-Konzentration wachsen, bei der der Ursprungsstamm nicht wachsen kann.
  • Wie oben erwähnt, ist das L-Leucin an mehreren Regulierungsstufen der L-Leucin-Biosynthese beteiligt. Daher beeinflussen einzelne Mutationen, die die L-Leucin-Resistenz verursachen, die L-Leucin-Produktivität, jedoch wird bevorzugt, dass mehrere Regulierungen durch doppelte oder dreifache Mutationen ausgeschaltet werden. Ein Bakterium der Gattung Escherichia mit einer einfachen Mutation kann als Ausgangsquelle zur Aufzucht von L-Leucin produzierenden Stämmen verwendet werden, auch wenn seine L-Leucin-Produktivität gering ist.
  • Die Bakterien der Gattung Escherichia, die gegen Leucin-Analoga resistent sind, können durch Kultivieren von Bakterien der Gattung Escherichia in einem Minimalmedium, das ein Leucin-Analogon in einer wachstumshemmenden Konzentration enthält, und Selektieren der wachsenden Stämme erhalten werden. Das Leucin-Analogon wird beispielhaft durch 4-Azaleucin, 3-Hydroxyleucin, α-Thienylalanin und 5,5,5-Trifluorleucin und dergleichen, vorzugsweise durch 4-Azaleucin und 3-Hydroxyleucin, dargestellt.
  • Die Selektion der Mutanten, die gegen Leucin-Analoga resistent sind, kann mit einer Art von Leucin-Analogon, alternativ mit mehreren Arten von Leucin-Analoga, durchgeführt werden. Die Selektion der Mutanten kann einmal oder mehrfach für eine Art an Leucin-Analoga durchgeführt werden.
  • Die Menge an Leucin-Analogon, das dem Medium zugegeben werden soll, hängt von der Art des Leucin-Analogons ab, ist aber im Fall von 4-Azaleucin oder 3-Hydroxyleucin vorzugsweise mindestens 0,1 g/L. Die Bakterien der Gattung Escherichia können vor dem Selektieren in der selben Weise, wie oben beschrieben, einer Mutation unterzogen werden.
  • Werden Bakterien der Gattung Escherichia, die sowohl gegen L-Leucin-Analoga als auch gegen L-Leucin resistent sind, selektiert, ist jede Reihenfolge der Selektion für jede der Resistenzen annehmbar und die Reihenfolge nicht beschränkt.
  • Wird E. coli K-12 oder seine Derivate als Bakterium der Gattung Escherichia verwendet, ist es bevorzugt, neben der Resistenz gegen L-Leucin- und/oder L-Leucin-Analoga, Resistenz gegen L-Valin zu verleihen. Der K-12-Stamm exprimiert kein aktives Isozym II der Acetohydroxysäure-Synthase, da eine „Frameshift-Mutation" im ilvG-Gen, das für eine große Untereinheit des Isozyms II, das eines der Acetohydroxysäure-Synthaseisozyme im verzweigten Aminosäurebiosyntheseweg ist, codiert, auftritt (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 922–925, 1981). Das Isozym II unterliegt keiner Rückkopplungshemmung durch L-Valin, jedoch die anderen Isozyme, Isozym I und Isozym III. Daher kann der K-12-Stamm in Gegenwart eines Überschusses an L-Valin nicht in einem Minimalmedium wachsen, da die Biosynthese von L-Isoleucin, L-Valin and L-Leucin gehemmt ist. Folglich ist es bevorzugt, einen Stamm mit einer reversen Mutation (engl.: „reverse mutation") des ilvG-Gens zu verwenden, in dem der Leserahmen (engl.: „frame") so wiederhergestellt ist, wie es für die Wiedergewinnung der Aktivität der Acetohydroxysäure-Synthase notwendig ist, um einen L-Leucin produzierenden Stamm zu erhalten, der aus einem K-12-Stamm gewonnen wurde. Solch ein Stamm mit einer reversen Mutation des ilvG-Gens wird Resistenz gegen L-Valin aufweisen (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78,922–925, 1981). Ein K-12-Stamm, der resistent gegen L-Valin ist, kann durch Kultivieren des Stammes in einem Minimalmedium, das L-Valin enthält, und Selektieren der wachsenden Kulturen in der selben Weise, wie für die L-Leucin-Resistenz oder L-Leucin-Analogon-Resistenz, erhalten werden.
  • Wird zur Aufzucht eines Bakteriums der Gattung Escherichia, das gegen L-Leucin resistent ist, ein Bakterium der Gattung Escherichia verwendet, das eine Acetohydroxysäure-Synthase besitzt, die keine Rückkopplungshemmung durch L-Valin aufweist, ist es jedoch nicht notwendig, einem Bakterium der Gattung Escherichia Resistenz gegen L-Valin zu verleihen, im Gegensatz zu dem oben beschriebenen K-12-Stamm.
  • Die Aktivität eines oder mehrerer Enzyme des L-Leucin-Biosynthesewegs kann in einem erfindungsgemäßen Bakterium der Gattung Escherichia durch gewöhnliche Mutation oder gentechnische Verfahren verbessert sein. Solch eine Verbesserung der Aktivität des Enzyms kann durch Einbringen einer rekombinanten DNA, die durch Einbringen eines DNA-Fragments mit dem gesamten ilvGMEDA-Operon oder einem Teil davon und/oder leu-ABCD-Operons in ein Plasmid, einen Phagen oder ein Transposon erhalten wurde, in ein Bakterium der Gattung Escherichia erreicht werden.
  • Die Analyse der Nukleotidsequenz des leuABCD-Operons wurde in Nucleic Acid Res., 20, 3305–3308 (1992) beschrieben. Die gesamte Sequenz des leuABCD-Operons wurde in der Datenbank registriert (DDBJ Hinterlegungsnummer D10483, Internet-Adresse DDBJ: http://www.ddbj.nig.ac.jp). Ein DNA-Fragment mit dem leuABCD-Operon kann durch Amplifizieren des DNA-Fragments mittels PCR erhalten werden (Polymerase-Kettenreaktion, nach White,T.J. et al., Trends Genet., 5,185 (1989)), wobei Oligonucleotide auf der Basis der oben beschriebenen Sequenzen als Primer verwendet werden und chromosomale DNA eines Bakteriums der Gattung Escherichia als Templat für die PCR verwendet wird. Alternativ kann das leuABCD-Operon ebenso durch Screening einer chromosomalen DNA-Bibliothek eines Bakteriums der Gattung Escherichia mittels Hybridisierung unter Verwendung einer Oligonucleotidsonde erhalten werden, die auf der Basis der oben beschriebenen Sequenzen hergestellt wurde.
  • Diese gesamte Nucleotidsequenz des ilvGMEDA-Operons und die Nucleotidsequenz der Hinstrangregion des Operons sind in Nucleic Acid Res., 15, 2137-2155 (1987) bzw. Gene, 97, 21-27 (1991) beschrieben. Ein DNA-Fragment mit dem ilvGMEDA-Operon kann durch PCR oder Hybridisierung unter Verwendung von Oligonucleotidsonden oder Primern erhalten werden, die auf der Basis der oben beschriebenen Sequenz hergestellt werden. Wird Escherichia coli K-12 oder seine Derivate verwendet, um das ilvGMEDA-Operon zu erhalten, ist es außerdem bevorzugt, einen Stamm mit einer reversen Mutation des ilvG-Gens zu verwenden, in dem der Leserahmen so wiederhergestellt ist, wie es für die Wiedergewinnung der Aktivität der Acetohydroxysäure-Synthase notwendig ist. Die Verfahren, bei denen das ilvG-MEDA-Operon erhalten wird, und das Verfahren zum Amplifizieren des Operons in einer Zelle eines Bakteriums der Gattung Escherichia, sind vollständig in WO 96/06926 bzw. FR 2627508 beschrieben.
  • <2> Verfahren zur Herstellung von L-Leucin
  • L-Leucin kann effizient durch Kultivieren des Bakteriums, das wie oben beschrieben erhalten werden kann, in einem Kulturmedium, Herstellen und Akkumulieren des L-Leucins in dem Medium und Gewinnen des L-Leucins aus dem Medium, hergestellt werden.
  • In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Kultivieren des Bakteriums der Gattung Escherichia, das Gewinnen und das Reinigen des L-Leucins aus dem flüssigen Medium in einer ähnlichen Weise durchgeführt werden, wie die herkömmlichen Fermentationsverfahren, bei denen L-Leucin unter Verwendung eines Bakteriums hergestellt wird, durchgeführt werden. Ein Medium, das in der Kultur verwendet wird, kann entweder ein künstliches oder ein natürliches Medium sein, solange das Medium eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, Mineralien und, falls notwendig, eine geeignete Menge an Nährstoffen, die das Bakterium zum Wachstum benötigt, enthält. Die Kohlenstoffquelle kann ein oder mehrere verschieden Kohlenhydrate, wie Glucose und Saccharose, und verschiedene organische Säuren enthalten. Bezüglich der Art der Aufnahme durch das verwendete Bakterium kann ein Alkohol, der Ethanol und Glycerin umfasst, verwendet werden. Es ist möglich, Als Stickstoffquelle verschiedene Ammoniumsalze, wie Ammoniak und Ammoniumsulfat, andere Stickstoffverbindungen, wie Amine, eine natürliche Stickstoffquelle, wie Pepton, Sojabohnenhydrolysat oder aufgeschlossene fermentative Mikroben, zu verwenden. Als Mineralien können Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(II)sulfat, Mangansulfat oder Calciumcarbonat verwendet werden.
  • Das Kultivieren wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen, wie einer Schüttelkultur, und einer Belüftungs- und Rührkultur, bei einer Temperatur von 20 bis 40°C, vorzugsweise 30 bis 38°C, durchgeführt. Der pH-Wert der Kultur liegt gewöhn lich zwischen 5 und 9, vorzugsweise 6,5 und 7,2. Der pH-Wert der Kultur kann mit Ammoniak, Calciumcarbonat, verschiedenen Säuren, verschiedenen Basen und Puffern eingestellt werden. Gewöhnlich führt eine Kultivierung über 1 bis 3 Tage zur Akkumulation des Ziel-L-Leucins in dem Flüssigmedium.
  • Nach der Kultivierung werden unlösliche Substanzen, wie Zellen, durch Zentrifugation und Membranfiltration von dem Flüssigmedium abgetrennt und dann kann das Ziel-L-Leucin gesammelt und durch Innenaustausch, Einengung und Fällung gereinigt werden.
  • Ein erfindungsgemäßes Bakterium der Gattung Escherichia kann als L-Leucin produzierender Stamm oder als Ausgangsquelle zur Aufzucht von L-Leucin produzierenden Stämmen verwendet werden. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, unter Verwendung eines Bakteriums der Gattung Escherichia effizienter L-Leucin herzustellen, verglichen mit bisher bekannten Verfahren zur Herstellung von L-Leucin.
  • Beste Ausführungsform der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele genauer beschrieben.
  • Beispiel 1: Konstruktion des L-Leucin-resistenten Stammes aus Escherichia coli.
  • <1> Selektion des L-Leucin-resistenten Stamms
  • Die Escherichia coli-Stämme mit Resistenz gegen L-Leucin und Leucin-Analoga wurden durch schrittweises Selektieren aus dem Standard-Labor-Wild-Typ-Stamm E. coli K-12 konstruiert, wie nachfolgend beschrieben. Der Mutantenstamm mit jeder Resistenz wurde durch Selektieren von spontanen Mutanten, die die Resistenz besitzen, erhalten. Genauer wurde E. coli K-12 oder seine Mutantenstämme, die selektiert werden sollen, auf eine Agar-Platte aufgetragen, die L-Leucin oder (ein) L-Leucin-Analoga(on) in verschiedenen Konzentrationen enthält, wie unten angezeigt. Dann wurde der gewachsene Stamm selektiert.
  • Vor der Selektion des Stammes mit L-Leucin- und L-Leucin-Analogon-Resistenz wurde als erstes ein Mutantenstamm aus E. coli K-12 selektiert, der gegen 5 g/L L-Valin resistent war, wobei der Stamm B-5(Valr) erhalten wurde. Aus dem Stamm B-5 wurde ein Mutantenstamm, der gegen 1 g/L L-Leucin resistent war, selektiert und als Nr. 325 (Valr, Leur) benannt. Dann wurde ein Mutantenstamm, der gegen 0,1 g/L 4-Aza-D,L-Leucin (im Folgenden als "4-Azaleucine" bezeichnet) aus dem Stamm Nr. 325 selektiert und der Stamm Nr. 244 (Valr, Leur, ALr) erhalten. Aus dem Stamm Nr. 244 wurde ein Stamm, der gegen 2 g/L 4-Azaleucin resistent war, selektiert und der Stamm Nr. 70 (Valr, Leur, ALrr) erhalten. Das Symbol "Valr", "Leur" oder "ALr" stellt den Stamm dar, dem Resistenz gegen L-Valin, L-Leucin bzw. Azaleucin verliehen wurde. Das Symbol ALrr stellt den Stamm dar, dem zweimal Resistenz gegen Azaleucin verliehen wurde.
  • 2. Die Beziehung zwischen der L-Leucin-Resistenz und der L-Leucin-Herstellung
  • Um die Beziehung zwischen der L-Leucin-Resistenz und der L-Leucin-Herstellung zu untersuchen, wurde aus dem Stamm Nr. 70, der wie oben beschrieben erhalten wurde, der spontane Mutantenstamm ausgewählt, der gegen 15 g/L L-Leucin resistent war.
  • Sieben zufällig isolierte Kolonien des Stamms Nr. 70 und 10 zufällig ausgewählte Mutanten der L-Leucin-resistenten Mutanten wurden von dem Stamm Nr. 70 erhalten und auf L-Leucin-Produktion untersucht. Als Ergebnis zeigte sich, dass jeder der Leucin-resistenten Mutanten, der aus dem Stamm Nr. 70 erhalten wurde, eine höhere Produktivität als der Ausgangsstamm aufwies. Die Zunahme der Produktion betrug im Durchschnitt 60 %.
  • Beispiel 2: Aufzucht von L-Leucin produzierenden Stämmen aus Escherichia coli K-12
  • Die L-Leucin produzierenden Stämme wurden aus E. coli K-12 durch schrittweise Selektion von Stämmen konstruiert, die gegen L-Valin, Azaleucin, Hydroxyleucin und L-Leucin resistent waren, wie nachfolgend beschrieben. Genauer wurden E. coli-Stämme, die selektiert werden sollten, auf einer Agar-Platte aufgetragen, die L-Valin, ein Leucin-Analogon oder L-Leucin in verschiedenen Konzentrationen enthält, wie nachfolgend angezeigt. Dann wurde der gewachsene Stamm selektiert.
  • Aus E. coli K-12 wurde ein Mutantenstamm selektiert, der gegen 5 g/L L-Valin resistent war, und der Stamm Nr. 101 (Valr) ausgewählt, der kein L-Leucin produzierte. Aus dem Stamm Nr. 101 wurde ein Mutantenstamm, der gegen 1,3 g/L Azaleucin resistent war, ausgewählt. Der erhaltene Stamm, Nr. 51 (Valr, ALr), produzierte etwa 0,05 bis 0,1 g/L L-Leucin. Dann wurde ein Stamm mit Resistenz gegen 2 g/L 3-Hydroxy-D,L-Leucin (im Folgenden als Hydroxyleucin bezeichnet) aus dem Stamm Nr. 51 selektiert und der Stamm Nr. 4 (Varr, ALr, Hleur) erhalten. Das Symbol "Hleu" stellt den Stamm dar, der gegen Hydroxyleucin resistent war. Der Stamm Nr. 4 produzierte mehr Leucin (etwa 0.4 – 0.6 g/L).
  • Der Stamm Nr. 4 wurde mit NTG behandelt und Mutanten mit Resistenz gegen 15 g/L Leucin wurden selektiert. Als Ergebnis wurden zwei Mutantenstämme, Nr. 57 und Nr. 103 (Valr, ALr, Hleur, Leur) erhalten. Die Leucinproduktion dieser Mutanten erreichte 1,5 bis 1,7 g/L.
  • Von den obigen Stämmen wurden die Stämme Nr. 4 (Escherichia coli K-12,4), Nr. 57 (Escherichia coli K-12,57) und Nr. 103 (Escherichia coli K-12,103) in der Russischen Nationalsammlung Industrieller Mikroorganismen (Russian National Collection of Industrial Microorganisms; Russia 113545 Moscow 1 Dorozhny proezd, 1) auf der Grundlage des Budapester Vertrags mit den Hinterlegungsnummern VKPM-7387, VKPM-7386 bzw. VKPM-7388 hinterlegt.
  • Beispiel 3: Die L-Leucin-Produktion der Stämme Nr. 57 und Nr. 103
  • Zellen der Stämme Nr. 57 und Nr. 103 wurden über 30 Stunden bei 37°C auf M9 Agar-Platten kultiviert. Jeweils eine Platinöse voll Kulturmaterial wurde in einen Schüttlerkolben (250 ml) mit 15 mL Fermentationsmedium, das Glucose (6 %), Ammoniumsulfat (1,5 %), Kaliumhydrophosphat (0,15 %), Magnesiumsulfat (0,1 %), Thiamin (0.00001 %) und Calciumcarbonat (2 %) enthält, übertragen. Die Kultivierung erfolgte über 48 Stunden bei 32°C auf einem Rotationsschüttler (250 rpm). Die L-Leucin-Produktion des Stammes Nr. 57 betrug 1,5 g/L, die des Stammes Nr. 103 1,7 g/L.

Claims (13)

  1. Verfahren zur Selektion eines L-Leucin produzierenden Bakteriums der Gattung Escherichia, welches das Selektieren eines Stammes eines Bakteriums der Gattung Escherichia, welcher L-Leucin produzieren kann, und das Selektieren eines Stammes dieses Bakteriums umfasst, welcher in einem Medium wachsen kann, das 15 g/l L-Leucin enthält.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das L-Leucin produzierende Bakterium durch Selektieren eines Stammes, welcher in einem 15 g/l L-Leucin enthaltenden Medium wachsen kann, aus einem Stamm erhalten wird, der L-Leucin produzieren kann.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das L-Leucin produzierende Bakterium durch Selektieren eines Stammes, welcher L-Leucin produzieren kann, aus einem Stamm erhalten wird, welcher in einem 15 g/l L-Leucin enthaltenden Medium wachsen kann.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Stamm ferner gegen ein oder mehrere Leucinanaloga resistent ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Leucinanalogon aus der aus 4-Azaleucin und 3-Hydroxyleucin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  6. Bakterium, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
  7. Bakterium mit der Hinterlegungsnummer VKPM-7386.
  8. Bakterium mit der Hinterlegungsnummer VKPM-7387.
  9. Bakterium mit der Hinterlegungsnummer VKPM-7388.
  10. Verfahren zur Herstellung von L-Leucin, welches die Stufe des Kultivierens eines Bakteriums nach einem der Ansprüche 6 bis 9 umfasst.
  11. Verfahren zur Herstellung von L-Leucin, welches folgende Stufen umfasst: a) Selektieren eines Bakteriums durch ein Verfahren nach Anspruch 1, b) Kultivieren des Bakteriums, welches in Stufe a) erhalten wurde, und c) Gewinnen des L-Leucins aus dem Medium.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Bakterium ferner gegenüber L-Leucinanaloga resistent ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Leucinanalogon aus der aus 4-Azaleucin und 3-Hydroxyleucin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
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