DE69825580T2

DE69825580T2 - Neurotrophischer faktor nnt-1

Info

Publication number: DE69825580T2
Application number: DE69825580T
Authority: DE
Inventors: Ming-Shi Chang; S. Gary ELLIOT; Giorgi Senaldi; Ulla Sarmiento
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1997-02-03
Filing date: 1998-02-02
Publication date: 2005-09-29
Anticipated expiration: 2018-02-03
Also published as: HK1025125A1; DE69825580D1; JP2002514067A; HUP0001969A3; CN1251134A; ES2226097T3; WO1998033922A1; AU718882B2; CA2279999C; CA2279999A1; EP0977859B1; HU225307B1; EP0977859A1; PT977859E; HUP0001969A2; ATE273391T1; CN1195853C; IL154543A0; DK0977859T3; AU6149598A

Description

Hintergrund
Bereich der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein als NNT-1 bezeichnetes Polypeptid und verwandte Polypeptide, die neurotrophe Aktivität aufweisen, neue Nukleinsäuremoleküle, die für solche Polypeptide kodieren, und andere damit zusammenhängende Aspekte.
Beschreibung des verwandten Stands der Technik
Eine Zahl von neurologischen Abweichungen und Erkrankungen werden mindestens zum Teil durch die Degeneration oder den Tod von besonderen Klassen von Neuronen verursacht. Z.B. ist die Parkinsonsche Erkrankung durch eine Verlangsamung der bewußten Muskelbewegung, muskuläre Versteifung und Tremor gekennzeichnet. Solche Symptome werden zumindest teilweise der fortschreitenden Degenerierung von Dopamin-produzierenden Neuronen zugeordnet, die in einer spezifischen Region des Hirns lokalisiert sind, die die Substantia nigra genannt wird. Degenerierung dieser Neuronen ("dopaminergen Neuronen") führt zu einer Abnahme von Dopaminspiegeln in einer angrenzenden Region des Hirns, die das Striatum genannt wird. Das Striatum enthält Neuronen, die Rezeptoren für Dopamin exprimieren; diese Neuronen sind an der Kontrolle der motorischen Aktivität beteiligt. Die Ursache der Degenerierung von dopaminergen Neuronen ist unbekannt, wurde jedoch freien Radikalen, überschüssigem Eisengehalt, Umwelttoxinen, exzitatorischer Aminosäure-Neurotoxizität und möglicherweise einem Mangel an bestimmten neurotrophen Faktoren zugeordnet (Jenner, Neurology, Suppl. 3: S6-S12 [1995]; Adams and Victor, eds. Principles of Neurology, Chapter 42: Degenerative Diseases of the Nervous System, McGraw Hill, NY [1993]).
Erkrankungen, wie zum Beispiel die amyotrophe Lateralsklerose (ALS; auch als Lou Gehrig's Erkrankung bekannt), die progressive muskuläre Atrophie und die vererbliche motorische und sensorische Neuropathie (Charcot-Marie-Tooth Erkrankung) stammen alle zumindest teilweise von einer Verringerung von motorischen Neuronen ab, die im ventralen Horn des Rückenmarks lokalisiert sind.
Der Hippocampus, eine gut definierte Struktur, die ein Teil des zerebralen Kortex des Hirns ist, ist für die Bildung des Langzeitgedächtnisses wichtig. Zerstörung des Hippocampus, z.B. durch Ischämie, kann zu einer Unfähigkeit führen, neue Erinnerungen zu bilden. Die Degenerierung von pyramidalen CA1-Neuronen, die in der CA1-Region des Hippocampus lokalisiert sind, ist ein Charakteristikum der Alzheimer-Erkrankung. Dieselben Neuronen sind selektiv anfällig für ischämische und anoxische Beschädigung, die in Zuständen, wie z.B. Schlaganfall und Kopftrauma, auftreten. Zusätzlich werden die CA1 pyramidalen hippocampalen Neuronen, sowie die in der CA3-Region des Hippocampus lokalisierten pyramidalen Neuronen, selektiv bei der Epilepsie verletzt.
Das Striatum ist die Innervierungsregion der Nervenenden von dopaminerg-enthaltenen Neuronen aus der Substantia nigra. Die Hauptzahl der striatalen Neuronen verwendet GABA (4-Aminobuttersäure) als ihren Neurotransmitter. Das Striatium ist das hauptsächliche Ziel der fortschreitenden Neurodegeneration, die in Morbus Huntington auftritt, wobei der hauptsächliche Neuronenverlust derjenige der striatalen GABA-verwendenden Neuronen ist.
Die Serotonin-enthaltenden Neuronen sind in Gruppen um die Mittellinie des Rautenhirns versammelt. Diese Neuronen sind an der Kontrolle der Körpertemperatur, des Gemütszustandes und des Schlafes beteiligt. Erkrankungen des Serotonin-enthaltenen Neuronensystems schließen z.B. Depressionen, andere Gemütszustandsstörungen und Schlafstörungen ein.
Photorezeptorzellen sind eine spezialisierte Untergruppe von Retinaneuronen und sind für das Sehen verantwortlich. Verletzung und/oder Tod von Photorezeptorzellen kann zur Erblindung führen. Degenerierungen der Retina, wie z.B. durch Retinitis Pigmentosa, altersbedingte makulare Degeneration und stationäre Nachtblindheit, werden alle durch die fortschreitende Atrophie und den Verlust der Funktion von Photorezeptor-Außensegmenten charakterisiert, die spezialisierte Strukturen sind, die die visuellen Pigmente enthalten, die einen Lichtstimulus in elektrische Aktivität transformieren.
Während einige Therapien erhältlich sind, um die Symptome und das Ausmaß der Schwere von solchen Erkrankungen zu behandeln (z.B. L-Dopa, um Morbus Parkinson zu behandeln), existiert augenblicklich keine effektive Behandlung, um die Degenerierung der meisten der oben genannten Klassen von beeinträchtigten Neuronen zu verhindern oder zu verringern, oder ihre Reparatur zu unterstützen.
Kürzlich wurden mehrere natürlich auftretende proteinöse Moleküle identifiziert, basierend auf ihrer trophischen Aktivität an verschiedenen Neuronen. Diese Moleküle werden als "neurotrophe Faktoren" bezeichnet. Neurotrophe Faktoren sind endogene lösliche Proteine, die das Überleben, das Wachstum und/oder die morphologische Plastizität von Neuronen stimulieren oder regulieren können (siehe Fallon und Laughlin, Neurotrophic Factors, Academic Press, San Diego, CA [1993]).
Die bekannten neurotrophen Faktoren gehören zu mehreren verschiedenen Proteinsuperfamilein von Polypeptid-Wachstumsfaktoren, basierend auf ihrer Aminosäuresequenz-Homologie und/oder ihrer dreidimensionalen Struktur (MacDonald und Hendrikson, Cell, 73:481-424 [1993]). Eine Familie von neurotrophen Faktoren ist die Neutrophin-Familie. Diese Familie besteht augenblicklich aus NGF (Nervenwachstumsfaktor), BDNF (Hirn-abgeleiteter neurotropher Faktor), NT-3 (Neurotrophin-3), NT-4 (Neurotrophin-4) und NT-6 (Neurotrophin-6).
CNTF (ziliarer neurotropher Faktor) und LIF (Leukämie inhibitorischer Faktor) sind Cytokin-Polypeptide, die neurotrophe Aktivität aufweisen. Durch ihre strukturellen Eigenschaften und Rezeptorkomponenten sind diese Polypeptide mit einer Familie von hämatopoietischen Cytokinen verwandt, die IL-6 (Interleukin-6), IL-11 (Interleukin-11), G-CSF (Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor) und Onkostatin-M einschließt. NNT-1 der vorliegenden Erfindung zeigt eine signifikante Ähnlichkeit gegenüber verschiedenen Mitgliedern dieser Familie von neurotrophen Faktoren. Siehe 6.
GDNF (Glia-abgeleiteter neurotropher Faktor) ist ein neurotropher Faktor, der zur TGF-beta (transformierender Wachstumsfaktor beta)-Superfamilie gehört. GDNF zeigt potente Überlebens- und Differenzierungs-unterstützende Wirkungen für dopaminerge und motorische Neuronen (Lin et al., Science, 260:1130-1132 [1993]; Yan et al., Nature, 373:341-344 [1995]).
Während von diesen neurotrophen Faktoren bekannt ist, daß sie das Wachstum und/oder das Überleben von Neuronen erhöhen, ist weniger über die Moleküle bekannt, die in Verbindung mit diesen Faktoren wirken. Eine Weise, auf die zusätzliche Neutrophine und verwandte Moleküle identifiziert werden können, ist es, an ein Tier eine oder mehrere Verbindungen zu verabreichen, von denen bekannt ist, daß sie einen Effekt auf das Nervensystem haben, und dann Gewebe auf die Induktion von Genen hin zu analysieren, die an den neuralen Antworten auf die Verbindungen beteiligt sind. Z.B. kann man Gene screenen, die in bestimmten Gewe ben des Nervensystems induziert werden, wie z.B. der hippocampalen Region des Hirns. Diese Technik wurde von Nedivi et al. verwendet (Nature, 363:718-722 [1993]; Nedivi et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 93:2048-2053 [1996]), um neue Gene zu identifizieren, die im Gyrus dentatus-Teil des Hippocampus in Antwort auf die Verabreichung eines Neurotransmitters-Analogons von Glutamat, genannt Kainat (Kaininsäure), induziert werden.
Die Expression von vielen neurotrophen Faktoren, wie z.B. NGF, BDNF, NT3, GDNF, bFGF, IGF-1 und TGF-beta wird durch afferente neuronale Aktivität und/oder durch neuronale Verletzung reguliert. Die starke Induktion von einigen dieser Gene kann im Hippocampus Gyrus dentatus in Antwort auf das Glutamat-Analogon Kainat (Isackson, Current Opinions in Neurobiology 5:50-357 [1995]) beobachtet werden. Die Kainat-Behandlung scheint die Freisetzung von neuen Verbindungen aus dem Hippocampus von alarmierten Ratten zu erhöhen, und diese Aktivität scheint verschieden von den Wirkungen bekannter neurotropher Faktoren zu sein (Humpel, et al., Science, 269:552-554 [1995]).
Im Hinblick auf die Tatsache, daß es für viele Nervensystem-Erkrankungen und -Abweichungen keine bekannte Heilung gibt, besteht ein Bedarf im Stand der Technik, neue Verbindungen zur Behandlung von neurologischen Zuständen und Erkrankungen, wie z.B. Morbus Parkinson, amyotropher Lateralsklerose (ALS), Morbus Alzheimer, Schlaganfall und verschiedenen degenerativen Erkrankungen, die die Sehkraft beeinträchtigen, zu identifizieren.
Es gibt weitere Hinweise, wie hier präsentiert, daß NNT-1-Verbindungen eine biologische Aktivität zur Modulation des Immunsystems aufweisen können, insbesondere durch Verursachen eines Anstiegs in der B-Zell- und T-Zell-Produktion.
Demzufolge ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die bei der Unterstützung der Neuronenregeneration und der Wiederherstellung von neuralen Funktionen brauchbar sein können.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Behandlung von neurologischen Erkrankungen, wie z.B. denjenigen wie hier angegeben, zur Verfügung zu stellen.
Es ist eine noch weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Behandlung von immunologischen Erkrankungen zur Verfügung zu stellen, wie z.B. denjenigen, wie hier angegeben. Diese und andere Aufgaben werden dem Durchschnittsfachmann aus der vorliegenden Beschreibung ersichtlich werden.
Zusammenfassung der Erfindung
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Nukleinsäuremolekül zur Verfügung, das für ein Polypeptid kodiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(a) dem Nukleinsäuremolekül nach SEQ ID Nr. 1;
(b) dem Nukleinsäuremolekül nach SEQ ID Nr. 3;
(c) einem Nukleinsäuremolekül, das für das Polypeptid nach SEQ ID Nr. 2 oder ein biologisch aktives Fragments davon kodiert;
(d) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das zu mindestens 70 Prozent identisch zu dem Polypeptid nach SEQ ID Nr. 2 ist;
(e) einem Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen an Eines von (a)-(d) oben hybridisiert; und
(f) einem Nukleinsäuremolekül, das das Komplement von Einem von (a)-(e) oben ist.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Nukleinsäuremolekül zur Verfügung, das für ein Polypeptid kodiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(a') dem Nukleinsäuremolekül nach SEQ ID Nr. 4;
(b') einem Nukleinsäuremolekül, das für das Polypeptid nach SEQ ID Nr. 5 oder ein biologisch aktives Fragment davon kodiert;
(c') einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das zu mindestens 70 Prozent identisch zu dem Polypeptid nach SEQ ID Nr. 5 ist;
(e') einem Nukleinsäuremolekül, das das Komplement von Einem von (a')-(c') oben ist.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung Vektoren, die diese Nukleinsäuremoleküle umfassen, und Wirtszellen zur Verfügung, sowohl prokaryontische als auch eukaryontische, die die Vektoren umfassen.
Die Erfindung stellt weiterhin ein NNT-1 Polypeptid zur Verfügung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) dem Polypeptid nach SEQ ID Nr. 2;
(b) dem Polypeptid, das Aminosäuren 1-198 nach SEQ ID Nr. 2 ist;
(c) einem Polypeptid, das zu mindestens 70 Prozent zu dem Polypeptid von (a) oder (b) identisch ist; und
(d) einem biologisch aktiven Fragment von Einem von (a)-(c).

Die Erfindung stellt weiterhin ein NNT-1 Polypeptid zur Verfügung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a') dem Polypeptid von SEQ ID Nr. 5;
(b') dem Polypeptid, das Aminosäuren 1-198 nach SEQ ID Nr. 5 ist;
(c') einem Polypeptid, das zu mindestens 70 Prozent identisch zu dem Polypeptid von (a') oder (b') ist; und
(d') einem biologisch aktiven Fragment von Einem von (a')-(c').

Gegebenenfalls kann das NNT-1 Polypeptid ein aminoterminales Methionin aufweisen oder nicht aufweisen.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines NNT-1 Polypeptids zur Verfügung, wobei das Polypeptid SEQ ID Nr. 2 oder ID NR. 5, Aminosäuren 1-198 von SEQ ID Nr. 2, Aminosäuren 1-198 von SEQ ID Nr. 5 oder ein biologisch aktives Fragment davon sein kann, und wobei das Verfahren umfaßt:

(a) Exprimieren eines Polypeptids, das durch ein NNT-1 Nukleinsäuremolekül kodiert wird, in einem geeigneten Wirt; und
(b) Isolieren des Polypeptids.

Die Erfindung stellt weiterhin anti-NNT-1-Antikörper zur Verfügung.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt die Nukleinsäuresequenz der cDNA dar, die für menschliches NNT-1 (SEQ ID Nr. 1) kodiert.
2 zeigt die Nukleinsäuresequenz der menschlichen genomischen DNA für NNT-1 (SEQ ID Nr. 3).
3 stell die Aminosäuresequenz für menschliches NNT-1 (SEQ ID Nr. 1) dar, wie von der cDNA (SEQ ID Nr. 2) translatiert. Die ersten 27 Aminosäuren können eine Signalpeptidsequenz darstellen, so daß die reife Form von NNT-1 an dem als Nr. 1 bezeichneten Leucin beginnt. Das * zeigt das Stoppcodon an.
4 stellt die Nukleinsäuresequenz der cDNA dar, die für Maus NNT-1 (SEQ ID Nr. 4) kodiert.
5 stellt die Aminosäuresequenz für Maus NNT-1 (SEQ ID Nr. 5) dar, wie von der cDNA (SEQ ID Nr. 4) translatiert. Die ersten 27 Aminosäuren können eine Signalpepdidsequenz darstellen, so daß die reife Form des Maus NNT-1 an dem als Nr. 1 bezeichneten Leucin beginnt. Das * zeigt das Stoppcodon an.
6 stellt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen von NNT-1, IL-11 (SEQ ID Nr. 8), IL-6 (SEQ ID Nr. 9), G-CSF (SEQ ID Nr. 10), Cardiotrophin (SEQ ID Nr. 11), CNTF (SEQ ID Nr. 12), Onkostatin (SEQ ID Nr. 13) und LIF (SEQ ID Nr. 14) dar. In jedem Fall wird das menschliche Molekül verglichen.
7 zeigt einen Graphen mit den Ergebnissen eines motorischen Hühner-Neuronenaktivitäts-Tests für menschliches NNT-1, verglichen mit menschlichem CNTF.
8 zeigt einen Graphen mit den Ergebnissen eines sympathischen Hühner-Neuronenaktivitäts-Tests für menschliches NNT-1, verglichen mit menschlichem CNTF.
9 zeigt eine normale Milz einer negativen Kontrollmaus (# 22), 20x Objektiv, H&E Färbung.
10 zeigt eine Milz von einer NNT-1 transgenen Maus (# 62) mit lymphoider Hyperplasie (Pfeil).
11 zeigt eine normale Leber von einer Kontrollmaus, 10x Objektiv, H&E Färbung.
12 zeigt eine Leber von einer NNT-1 transgenen Maus (# 60) mit lymphoiden Aggregaten in Sinusoiden (Pfeil) und um die Gefäße herum, H&E Färbung.
13 stellt Daten dar, die zeigen, daß NNT-1 Serum-SAA induzierte (p<0,001). Es waren fünf Mäuse pro Gruppe.
14 stellt Daten dar, die zeigen, daß NNT-1 die Induktion von Corticosteron durch IL-1 in Serum potenzierte (p<0,01) und den Serumspiegel von Corticosteron auch unabhängig von IL-1 erhöhte (p<0,001). Es waren fünf Mäuse pro Gruppe.
15 stellt Daten dar, die zeigen, daß NNT-1 die Induktion von IL-6 durch IL-1 in Serum potenzierte (p<0,001). Es waren fünf Mäuse pro Gruppe.
16 stellt Daten dar, die zeigen, daß NNT-1 den LPS-induzierten Anstieg von Serum TNF-Spiegeln blockierte (p<0,001). Es waren zehn Mäuse in der LPS-behandelten Gruppe, fünf in den anderen.
17 stellt Daten dar, die zeigen, daß NNT-1 die Zahlen von Gesamt- (p<0,04) und CD45-positiven Zellen in peripheren Lymphknoten in Mäusen erhöhte (p<0,001).
Genaue Beschreibung der Erfindung
Im Umfang dieser Erfindung eingeschlossen sind NNT-1 Polypeptide, wie z.B. die Polypeptide von SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 5, und verwandte biologisch aktive Polypeptidfragmente und Derivate davon. Weiter innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung enthalten sind Nukleinsäuremoleküle, die für diese Polypeptide kodieren, und Verfahren zur Herstellung der Polypeptide.
I. NNT-1 Proteine/Polypeptide, Fragmente und Derivate davon
Der Ausdruck "NNT-1 Protein" oder "NNT-1 Polypeptid", wie hier verwendet, betrifft jedes Protein oder Polypeptid, das die für NNT-1 hierin beschriebenen Eigenschaften aufweist. Das NNT-1 Polypeptid kann ein aminoterminales Methionin aufweisen oder nicht aufweisen, in Abhängigkeit von z.B., der Weise, auf die es hergestellt ist. Zur Verdeutlichung betrifft NNT-1 Protein oder NNT-1 Polypeptid:

(1) eine Aminosäuresequenz, die durch ein NNT-1 Nukleinsäuremoleküle kodiert wird, wie in einem der folgenden Punkte definiert: (a) dem Nukleinsäuremolekül der SEQ ID Nr. 1; (b) dem Nukleinsäuremolekül der SEQ ID Nr. 3; (c) einem Nukleinsäuremolekül, das für das Polypeptid von SEQ ID Nr. 2 kodiert oder ein biologisch aktives Fragment davon; (d) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das mindestens 70 Prozent identisch zu dem Polypeptid von SEQ ID Nr. 2 ist; (e) einem Nukleinsäuremolekül, das das Komplement von einem von (a)-(d) oben ist; und (a') dem Nukleinsäuremolekül von SEQ ID Nr. 4; (b') einem Nukleinsäuremolekül, das für das Polypeptid von SEQ ID Nr. 5 oder ein biologisch aktives Fragment davon kodiert; (c') einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das mindestens 70 Prozent identisch zu dem Polypeptid von SEQ ID Nr. 5 ist; (d') einem Nukleinsäuremolekül, das das Komplement von einem von (a')-(c') oben ist;
(2) natürlich auftretende allelische Varianten des NNT-1-Gens, die zu einer oder mehreren Aminosäure-Substitutionen, Deletionen und/oder Insertionen führen, verglichen mit dem NNT-1 Polypeptid von SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 5 und/oder
(3) chemisch modifizierte Derivate.

Die NNT-1 Polypeptide, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können natürlich auftretende Vollängen-Polypeptide oder verkürzte Polypeptide oder Peptide (d.h. "Fragmente") sein.
Die Polypeptide können in reifer Form vorliegen oder sie können an ein natives oder heterogenes Signalpeptid angebracht sein. Z.B. weisen menschliches und Maus-NNT-1 Signalpeptide von jeweils Aminosäuren –27 bis –1 von SEQ ID Nr. 2 bzw. 5 auf.
Die Polypeptide oder Fragmente können chemisch modifiziert sein, d.h. glykosyliert, phosphoryliert und/oder an ein Polymer, wie unten beschrieben, gebunden sein, und sie können ein aminoterminales Methionin aufweisen, in Abhängigkeit davon, wie sie hergestellt wurden. Zusätzlich können die Polypeptide oder Fragmente Varianten des natürlich auftretenden NNT-1 Polypeptids sein (d.h. können eine oder mehrere Aminosäure-Deletionen, Insertionen und/oder Substitutionen enthalten, verglichen mit natürlich auftretendem NNT-1).
Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck "NNT-1 Fragment" ein Peptid oder Polypeptid, das weniger als die Vollängen-Aminosäuresequenz von natürlich auftretendem NNT-1 Protein ist, das jedoch qualitativ einen im wesentlichen ähnlichen Typ an biologischer Aktivität wie NNT-1 Polypeptid oder NNT-1 Protein, wie oben beschrieben, aufweist. Solch ein Fragment kann am Aminoterminus, dem Carboxyterminus oder beiden verkürzt sein und kann chemisch modifiziert sein. Solche NNT-1 Fragmente können mit oder ohne einem aminoterminalen Methionin präpariert werden. Die Aktivität der Fragmente kann größer, dieselbe oder weniger als die des Vollängen-(reifen) NNT-1 Peptids sein.
Bevorzugterweise ist die Aktivität des Fragments > 50 %, weiter bevorzugt ≥ 65 %, am meisten bevorzugt ≥ 80 % der Aktivität des Vollängen-Polypeptids, wie durch einen Standardaktivitätstest gemessen, wie z.B. denjenigen, der im Beispielteil hier beschrieben ist. Einige beispielhafte Fragmente dieser Erfindung schließen die Polypeptide ein, wobei von 1-20 Aminosäuren von entweder dem C-Terminus, dem N-Terminus oder beiden Termini des NNT-1 Polypeptids entfernt wurden.
Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck "NNT-1 Derivat" oder "NNT-1 Variante" ein NNT-1 Polypeptid, Protein oder Fragment, das 1) chemisch modifiziert wurde, wie z.B. durch die Hinzufügung von einem oder mehreren Polyethylenglycol-Molekülen, Zuckern, Phosphaten oder andern solchen Molekülen, die nicht natürlicherweise am Wildtyp NNT-1 Polypeptid angebracht sind und/oder 2) eine oder mehrere Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz-Substitutionen, Deletionen und/oder Insertionen enthält, verglichen mit der NNT-1 Aminosäuresequenz, wie in 3 (Mensch) oder 5 (Maus) angegeben.
Wie hier verwendet; betreffen die Ausdrücke "biologisch aktives Polypeptid" und "biologisch aktives Fragment" ein Peptid oder Polypetid in Übereinstimmung mit der oben angegebenen Beschreibung für NNT-1, wobei das NNT-1 als ein Wachstumsfaktor für (a) Neuronen (z.B. motorische Neuronen und/oder sympathische Neuronen) oder (b) immunologische Zellen, wie z. B. B-Zellen und T-Zellen, wirkt.
Fragmente und/oder Derivate von NNT-1, die nicht selbst aktiv in Aktivitätstests sind, können als Modulatoren (z.B. Inhibitoren oder Stimulatoren) der NNT-1 Rezeptoren in vitro oder in vivo brauchbar sein, oder um Antikörper gegen NNT-1 Polypeptide herzustellen.
Die Aminosäurevarianten von NNT-1 dieser Erfindung sind bevorzugterweise mindestens 70% identisch mit entweder SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 5, weiter bevorzugt mindestens ungefähr 80% identisch, noch weiter bevorzugt mindestens ungefähr 90% identisch.
Die Prozent der Sequenz-Identität können durch Standardverfahren bestimmt werden, die herkömmlich verwendet werden, um die Ähnlichkeiten in den Positionen der Aminosäuren von zwei Polypeptiden zu vergleichen. Als Beispiel werden die zwei Polypeptide, für die die Prozent der Sequenz-Identität bestimmt werden sollen, unter der Verwendung eines Computerprogramms, wie z. B. BLAST oder FASTA, für eine optimale Übereinstimmung ihrer jeweiligen Aminosäuren angeordnet (die "passende Spanne", die die volle Länge von einer oder beiden Sequenzen oder einen vorbestimmten Teil einer oder beider Sequenzen einschließen kann). Jedes Computerprogramm stellt eine "voreingestellte" Öffnungs-Penalty und eine "voreingestellte" Lücken-Penalty und eine Wertematrix, wie z. B. PAM 250, zur Verfügung. Eine Standart-Wertematrix (siehe Dayhoff et al., in: Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 [1978] ) kann in Zusammenhang mit dem Computerprogramm verwendet werden. Die Prozent Identität können dann unter der Verwendung eines in einem Programm wie z. B. FASTA enthaltenden Algorhythmus berechnet werden, wie:

Polypetide, die mindestens 70% identisch sind, werden typischerweise eine oder mehrere Aminosäure-Substitutionen, Deletionen und/oder Insertionen aufweisen, wenn mit Wildtyp NNT-1 verglichen. Gewöhnlich werden die Substitutionen konservativ sein, um wenig oder keinen Effekt auf die Gesamtnettoladung, Polarität oder Hydrophobizität des Proteins zu haben, werden jedoch gegebenenfalls die Aktivität von NNT-1 erhöhen. Konservative Substitutionen sind in Tabelle I unten angegeben. Tabelle I Konservative Aminosäure-Substitutionen

Basis:	Arginin Lysin Histidin
Sauer:	Glutaminsäure Asparaginsäure
Polar:	Glutamin Asparagin
Hydrophob:	Leucin Isoleucin Valin
Aromatisch:	Phenylalanin Tryptophan Tyrosin
Klein:	Glycin Alanin Serin Threonin Methionin

Die Erfindung umfaßt auch Spezieshomologe von NNT-1, z.B. NNT-1-Homologe von einer Säugerspezies, z.B. sind Hund, Katze, Maus, Ratte, Affe, Pferd, Schwein, Ziege, Kaninchen, Schaf und ähnliches zusätzlich zum Menschen vorgesehen. Die Sequenzen von Maus-cDNA und Protein werden als SEQ ID Nr. 4 und 5 zur Verfügung gestellt.
Die Erfindung faßt weiterhin chimäre Polypeptide ein, wie z. B. NNT-1 angebracht an alles oder einen Teil eines weiteren Polypeptids. Bevorzugterweise umfaßt das chimäre Polypeptid NNT-1, angebracht an alles oder einen Teil eines weiteren neurotrophen Faktors, wie zum Beispiel BDNF, GDNF, NT-3, NT-4, NT-5, NT-6 und ähnliches. Die Polypeptide können an den N- zu C-Terminus, C- zu C-Terminus oder N- zu N-Terminus angebracht sein.
II. Nukleinsäuren
Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck "NNT-1", wenn dazu verwendet, um einen Nukleinsäuremolekül zu beschreiben, ein Nukleinsäuremolekül oder Fragment davon, wie oben angegeben.
Der Ausdruck "stringente Bedingungen" betrifft die Hybridisierung und das Waschen unter Bedingungen, die nur eine Bindung eines Nukleinsäuremoleküls, wie zum Beispiel eines Oligonukleotis oder cDNA-Molekülsonde, an hochhomologe Sequenzen erlauben. Eine stringente Waschlösung ist 0,015 M NaCl, 0,005 M Natriumcitrat und 0,1 Prozent SDS, verwendet bei einer Temperatur von 55°C bis 65°C. Eine andere stringente Waschlösung ist 0,2 × SSC und 0,1 Prozent SDS, verwendet bei einer Temperatur von zwischen 50°C-65°C. Wo Oligonukleotidsonden verwendet werden, um cDNA oder genomische Bibliotheken zu screenen, können die folgenden stringenten Waschbedingungen verwendet werden. Ein Protokoll verwendet 6 × SSC mit 0,05 Prozent Natriumpyrophosphat bei einer Temperatur von 35-62°C, in Abhängigkeit von der Länge der Oligonukleotidsonde. Zum Beispiel werden 14-Basenpaar-Sonden bei 35-40°C gewaschen, 17-Basenpaar-Sonden werden bei 45-50°C gewaschen, 20 Basenpaar-Sonden werden bei 52-57°C gewaschen und 23 Basenpaar-Sonden werden bei 57-63°C gewaschen. Die Temperatur kann um 2-3°C erhöht werden, wenn die nicht-spezifische Hintergrund-Bindung hoch erscheint. Ein zweites Protokoll verwendet Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) zum Waschen von Oligonukleotidsonden. Eine stringente Waschlösung ist 3 M TMAC, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 0,2 Prozent SDS. Die Waschtemperatur unter der Verwendung dieser Lösung ist eine Funktion der Länge der Sonde. Zum Beispiel wird eine 17-Basenpaar-Sonde bei ungefähr 45-50°C gewaschen.
NNT-1-Nukleinsäuremoleküle, Fragmente und/oder Derivate, die nicht selber Polypeptide kodieren, die in Aktivitätstests aktiv sind, können als Hybridisierungssonden in diagnostischen Tests brauchbar sein, um entweder qualitativ oder quantitativ auf die Anwesenheit von NNT-1 DNA oder RNA in Säugergewebe oder Körperflüssigkeitsproben zu testen.
NNT-1 Nukleinsäuremoleküle, die für NNT-1 Polypeptide kodieren, angebracht an native oder heterogene Signalpeptide und/oder chimäre Polypetide, wie hier oben beschrieben, sind ebenfalls innerhalb des Bereichs dieser Erfindung eingeschlossen.
III. Verfahren zur Herstellung von NNT-1-Polypeptiden
A. Rekombinante Verfahren
Das Vollängen-NNT-1-Polypeptid oder Fragment davon kann unter der Verwendung von gut bekannten rekombinanten DNA-Technologieverfahren hergestellt werden, wie denjenigen beschrieben in Sambrook et al. (Molekular Cloning: A Labtatory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]) und/oder Ausubel et al., eds, (Current Protocols in Molekular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, NY [1994]). Ein Gen oder cDNA, die das NNT-1 Protein oder ein Fragment davon kodiert, kann zum Beispiel durch Screenen einer genomischen oder cDNA-Bibliothek oder durch PCR-Amplifikation erhalten werden. Alternativ kann ein Gen, das für das NNT-1-Polypetid oder ein Fragment davon kodiert, durch chemische Synthese unter der Verwendung von dem Fachmann gut bekannten Verfahren hergestellt werden, wie zum Beispiel denjenigen, beschrieben durch Engels et al. (Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734 [1989]). Diese Verfahren schließen unter anderem die Phosphotriester, Phosphoramidit und H-Phosphonat-Verfahren für die Nukleinsäuresynthese ein. Ein bevorzugtes Verfahren für solche chemische Synthese ist die polymerunterstützte Synthese unter der Verwendung von Standard-Phosphoramidit-Chemie. Typischerweise wird die DNA, die für das NNT-1 Polypeptid kodiert, mehrere hundert Nukleotide lang sein. Nukleinsäuren, die größer als ungefähr 100 Nukleotide sind, können in mehreren Fragmenten unter der Verwendung dieser Verfahren synthetisiert werden. Die Fragmente können dann zusammen ligiert werden, um das Vollängen-NNT-1-Polypetid zu bilden. Typischerweise wird das DNA-Fragment, das für den Aminoterminus des Polypeptids kodiert, ein ATG aufweisen, das für einen Methioninrest kodiert. Dieses Methionin kann oder kann nicht in der reifen Form des NNT-1-Polypetids vorhanden sein, in Abhängigkeit davon, ob das in der Wirtszelle produzierte Polypeptid aus dieser Zelle sekretiert wird.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, Nukleinsäure- und/oder Aminosäure-Varianten von natürlich auftretendem NNT-1 herzustellen. Nukleinsäure-Varianten (wobei ein oder mehrere Nukleotide so aufgebaut sind, um sich vom Wildtyp oder natürlich auftretendem NNT-1 zu unterscheiden) können unter der Verwendung von ortsgerichteter Mutagenese oder PCR-Amplifikation hergestellt werden, wobei der/die Primer die gewünschten Punktmutationen aufweisen (siehe Sambrook et al., supra, und Ausubel et al., supra, für Beschreibungen von Mutagenesetechniken). Die chemische Synthese unter Verwendung von durch Engels et al., supra, beschriebenen Verfahren kann auch dazu verwendet werden, um solche Varianten herzustellen. Andere dem Fachmann bekannte Verfahren können auch verwendet werden. Bevorzugte Nukleinsäurevarianten sind diejenigen, die Nukleotid-Substitutionen enthalten, die die Codon-Preferenz der Wirtszelle berücksichtigen, die verwendet werden soll, um NNT-1 herzustellen. Andere bevorzugte Varianten sind diejenigen, die für konservative Aminosäre-Austausche kodieren, wie oben beschrieben (z. B. wobei die Ladung oder Polarität der natürlich auftretenden Aminoäureseitenkette nicht wesentlich durch Substitution mit einer unterschiedlichen Aminosäure verändert ist), im Vergleich zum Wildtyp, und/oder diejenigen, die so aufgebaut sind, daß sie entweder eine neue Glykosylierungs- und/oder Phosphorylierungsstelle an NNT-1 erzeugen, oder diejenigen, die so aufgebaut sind, daß sie eine existierende Glykosilierungs und/oder Phosphorylierungsstelle an NNT-1 deletieren.
Das NNT-1-Gen oder cDNA kann in einem geeigneten Expressionsvektor zur Expression in einer Wirtszelle inseriert werden. Der Vektor ist so ausgewählt, um in der bestimmten verwendeten Wirtszelle funktionell zu sein (d. h. der Vektor ist kompatibel mit der Wirtzellmaschinerie, so daß die Amplifikation des NNT-1-Gens und/oder die Expression des Gens stattfinden kann). Das NNT-1-Polypeptid oder Fragment davon kann in prokaryontischen, Hefe-, Insekten- (Baculovirus-Systeme) und/oder eukaryontischen Wirtszellen amplifiziert/exprimiert werden. Die Auswahl der Wirtszelle wird zumindestens teilweise davon abhängen, ob das NNT-1-Polypeptid oder ein Fragment davon glykosyliert werden soll. Falls dies so ist, sind Hefe-, Insekten- oder Säugerwirtszellen bevorzugt; Hefezellen werden das Polypeptid glycosylieren und Insekten- und Säugerzellen können das Polypeptid so glykosylieren und/oder phosphorylieren wie es natürlicherweise am NNT-1-Polypeptid auftritt (d.h. "native" Glykolysierung und/oder Phosphorylierung).
Typischerweise werden die in einer der Wirtszellen verwendeten Vektoren 5' flankierende Sequenzen (auch als ein "Promotor" bezeichnet) sowie andere regulatorische Elemente enthalten, wie z.B. Enhancer, einen Ursprung des Replikationselements, ein transkriptionelles Terminationselement, eine vollständige Intronsequenz, die eine Donor- und Akzeptor-Splicestelle aufweist, eine Signalpeptidsequenz, eine Ribosomen-Bindungsstellen-Sequenz, eine Polyadenylierungs-Sequenz, eine Polylinkerregion zur Einfügung der Nukleinsäure, die für das zu exprimierende Polypeptid kodiert, und ein selektierbares Markerelement. Jedes dieser Elemente wird unten diskutiert. Gegebenenfalls kann der Vektor eine "tag"-Sequenz enthalten, d. h. eine Oligonukleotidsequenz, die am 5' oder 3' Ende der NNT-1 kodierenden Sequenz lokalisiert ist, die für PolyHis (wie zum Beispiel HexaHis) oder eine andere kleine immunogene Sequenz kodiert. Dieser "tag" wird gemeinsam mit dem Protein exprimiert und kann als ein Affinitätstag zur Reinigung des NNT-1-Polypeptids aus der Wirtszelle dienen. Gegebenenfalls kann der "tag" anschließend durch verschiedene Mittel vom gereinigten NNT-1-Polypetids entfernt werden, wie zum Beispiel unter der Verwendung einer ausgewählten Peptidase.
Die 5' flankierende Sequenz kann homolog sein (d. h. aus der selben Spezies und/oder Stamm wie die Wirtszelle), heterolog (d. h. von einer anderen Spezies als Wirtszellenspezies oder Stamm), Hybrid (d. h. eine Kombination von 5' flankierenden Sequenzen aus mehr als einer Quelle), synthetisch oder sie kann die native NNT-1 5' flankierende Sequenz sein. Als solches kann die Quelle der 5' flankierenden Sequenz jeder einzelzellige prokaryontische oder eukaryontische Organismus sein, jeder vertebrate oder invertebrate Organismus oder jede Pflanze sein, unter der Voraussetzung, daß die 5' flankierende Sequenz funktionell ist in und aktiviert werden kann durch die Wirtszellmaschinerie.
Die in den Vektoren dieser Erfindung brauchbaren 5' flankierenden Sequenzen können durch jedes der verschiedenen Verfahren erhalten werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Typischerweise werden hier brauchbare 5' flankierende Sequenzen anders als die NNT-1 5' flankierende Sequenz sein, die vorher durch Kartieren und/oder durch Restriktionsendonuklease-Verdau identifiziert werden, und können daher aus der geeigneten Gewebequelle unter der Verwendung der geeigneten Restriktionsendonukleasen isoliert werden. In einigen Fällen kann die vollständige Nukleotidsequenz der 5' flankierenden Sequenz bekannt sein. Hierbei kann die 5' flankierende Sequenz unter der Verwendung der oben für die Nukleinsäuresynthese oder die Klonierung beschriebenen Verfahren synthetisiert werden.
Wo alles oder nur ein Teil der 5' flankierenden Sequenz bekannt ist, kann sie unter der Verwendung von PCR und/oder durch Screening einer genomischen Bibliothek mit einem geeigneten Oligonukleotid und/oder 5' flankierenden Sequenzfragmenten aus der selben oder einer anderen Spezies erhalten werden.
Wo die 5' flankierende Sequenz nicht bekannt ist, kann ein Fragment an DNA, das eine 5'flankierende Sequenz enthält, aus einem größeren Stück an DNA isoliert werden, das z. B. eine kodierende Sequenz oder sogar ein anderes Gen oder Gene enthält. Die Isolierung kann durch Restriktionsendonuklease-Verdau unter der Verwendung von einem oder mehreren sorgfältig ausgewählten Enzymen erreicht werden, um das geeignete DNA-Fragment zu isolieren. Nach dem Verdau kann das gewünschte Fragment durch Agarosegel-Reinigung, Quiagen^®-Säulen oder andere dem Fachmann bekannte Verfahren isoliert werden. Die Auswahl von geeigneten Enzymen, um diesen Zweck zu erreichen, wird dem Durchschnittsfachmann leicht ersichtlich sein.
Der Ursprung des Replikationselements ist typischerweise ein Teil von prokaryotischen Expressionsvektoren, die käuflich erhalten wurden, und hilft bei der Amplifikation des Vektors in eine Wirtszelle. Die Amplifikation des Vektors bis zu einer bestimmten Kopienzahl kann in einigen Fällen wichtig für die optimale Expression des NN7-1-Polypeptids sein. Falls der ausgewählte Vektor keinen Ursprung der Replikationsstelle enthält, kann einer basierend auf einer bekannten Sequenz chemisch synthetisiert und in den Vektor ligiert werden.
Das Transkriptions-Terminations-Element ist typischerweise am 3' Ende der NNT-1-Polypeptid-kodierenden Sequenz lokalisiert und dient dazu, die Transkription des NNT-1-Polypeptids zu beenden. Gewöhnlicherweise ist das Transkriptions-Terminations-Element in prokaryontischen Zellen ein G-C-reiches Fragment, gefolgt von einer Poly-T-Sequenz. Während das Element leicht aus einer Bibliothek kloniert oder sogar käuflich als ein Teil eines Vektors erworben werden kann, kann es auch unter der Verwendung von Verfahren für die Nukleinsäuresynthese, wie denjenigen, wie oben beschrieben, synthetisiert werden.
Ein selektierbares Markergenelement kodiert für ein Protein, das für das Überleben und das Wachstum einer Wirtszelle erforderlich ist, die in einem selektiven Kulturmedium angezogen wird. Typische Selektionsmarkergene kodieren für Proteine, die (a) eine Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen übertragen, z. B. Ampicillin, Tetracyclin oder Kanamycin für prokaryontische Wirtszellen (b) die auxotrophe Defizienzen der Zelle komplementieren oder (c) kritische Nährstoffe zuführen, die nicht aus dem komplexen Medium erhältlich sind. Bevorzugte selektierbare Marker sind das Kanamycin-Resistenzgen, das Ampicillin-Resistenzgen und das Tetracyclin-Resistenzgen.
Das Ribosom-Bindungs-Element, herkömmlich als die Shine-Dalgarno-Sequenz (Prokaryonten) oder die Kozak-Sequenz (Eukaryonten) bezeichnet, ist für die Translationsinitiation der mRNA erforderlich. Das Element ist typischerweise 3' zum Promoter und 5' zu der kodierenden Sequenz des NNT-1-Polypeptids, das synthetisiert werden soll; lokalisiert. Die Shine-Dalgarno-Sequenz ist variiert, ist jedoch typischerweise ein Polypurin (d. h. weist einen hohen A-G-Gehalt auf). Viele Shine-Dalgarno-Sequenzen wurden identifiziert, von denen jede leicht unter der Verwendung der oben angegebenen Verfahren synthetisiert und in einem prokaryontischen Vektor verwendet werden kann.
In denjenigen Fällen, wo es wünschenswert ist, daß NNT-1 aus der Wirtszelle sekretiert wird, kann eine Signalsequenz verwendet werde, um das NNT-1-Polypeptid aus der Wirtszelle, wo es synthetisiert wird, heraus zu leiten, und der carboxy-terminale Teil des Proteins kann deletiert werden, um eine Membranverankerung zu verhindern. Typischerweise wird die Signalsequenz in der kodierenden Region der NNT-1-Nukleinsäuresequenz oder direkt am 5' Ende der NNT-1-kodierenden Region positioniert. Viele Signalsequenzen wurden identifiziert und jede von diesen, die funktionell in der ausgewählten Wirtszelle ist, kann in Verbindung mit dem NNT-1-Gen verwendet werden. Daher kann die Signalsequenz homolog oder heterolog zum NNT-1-Polypeptid und homolog oder heterolog zum NNT-1-Polypeptid sein. Zusätzlich kann die Signalsequenz chemisch unter der Verwendung der oben angegebenen Verfahren synthetisiert werden. In den meisten Fällen wird die Sekretion des Polypeptids aus der Wirtszelle über die Anwesenheit eines Signalpeptids zur Entfernung des aminoterminalen Methionins vom Polypetid führen. Beispiele für sekretorische Sequenzen, die zur Durchführung der Expression und Sekretion von NNT-1-Polypeptiden brauchbar sind, sind ausgewählt aus tPA Leadersequenzen (siehe zum Beispiel Rickles et al., J. Biol. Chem. 263: 1563-1560 [1988] und Feng et al., J. Biol. Chem. 265: 2022-2027 [1990]), EPO Leadersequenzen und Cardiotrophin-Leadersequenzen.
In vielen Fällen wird die Transkription des NN7-1-Polypetids durch die Anwesenheit von einem oder mehreren Introns auf dem Vektor verstärkt, dies gilt besonders dann, wenn NNT-1 in eukaryontischen Wirtszellen produziert wird, insbesondere in Säugerwirtszellen. Die verwendeten Introns können innerhalb der NNT-1-Nukleinsäuresequenz natürlich auftreten, insbesondere wenn die verwendete NNT-1-Sequenz eine vollängen-genomische Sequenz oder ein Fragment davon ist. Wo das Intron nicht natürlich innerhalb der NNT-1-DNA-Sequenz auftritt (wie für die meisten cDNAs), können das/die Intron(s) von einer anderen Quelle erhal ten werden. Die Position des Introns im Hinblick auf die 5' flankierende Sequenz und die NNT-1 kodierende Sequenz ist wichtig, da das Intron transkribiert werden muß, um effektiv zu sein. Als solches ist die bevorzugte Position für das Intron, wenn die NNT-1-Nukleinsäure-Sequenz eine cDNA-Sequenz ist, 3' zur Transkriptionsstartstelle und 5' zur PolyA-Transkriptions-Terminations-Sequenz. Bevorzugt wird das Intron für NNT-1 cDNAs auf der einen oder der anderen Seite (d. h. 5' oder 3') der NNT-1 kodierenden Sequenz lokalisiert, so daß es die kodierende Sequenz nicht unterbricht. Jedes Intron aus jeder Quelle, einschließlich jedes viralen, prokaryontischen und eukaryontischen (Pflanzen oder Tiere) Organismus kann dazu verwendet werden, um diese Erfindung durchzuführen, unter der Voraussetzung, daß es mit der Wirtszelle/den Wirtszellen kompatibel ist, in das es eingeführt wird. Auch hier eingeschlossen sind synthetische Introns. Gegebenenfalls kann mehr als ein Intron im Vektor verwendet werden.
Wo eines oder mehrere der oben angegebenen Elemente nicht bereits im Vektor, der verwendet werden soll, vorhanden sind, können sie einzeln erhalten und in den Vektor ligiert werden. Verfahren, die zum Erhalten jeder dieser Elemente verwendet werden, sind dem Fachmann gut bekannt und sind den oben angegebenen Verfahren (d. h. Synthese der DNA, Bibliotheks-Screening und ähnliches) vergleichbar.
Die zur Durchführung dieser Erfindung verwendeten finalen Vektoren werden typischerweise aus einem Ausgangsvektor, wie zum Beispiel einem käuflich erhältlichen Vektor, konstruiert. Solche Vektoren können oder können nicht einige der Elemente enthalten, die im vollständigen Vektor enthalten sein sollen. Wenn keines der gewünschten Elemente im Ausgangsvektor vorhanden ist, kann jedes Element einzeln in den Vektor ligiert werden, durch Schneiden des Vektors mit dem geeigneten Restriktionsenzymen, so daß die Enden des Elements, daß hineinligiert werden soll, und die Enden des Vektors kompatibel für die Ligation sind. In einigen Fällen kann es erforderlich sein, daß die Enden, die zusammenligiert werden sollen, "stumpf' gemacht werden müssen, um eine zufriedenstellende Ligation zu erhalten. Das Stumpfmachen wird durch zuerst Auffüllen von "überhängenden Enden" unter der Verwendung von Klenow-DNA-Polymerase oder T4-DNA-Polymerase in Anwesenheit von allen 4 Nukleotiden erreicht. Dieses Verfahren ist im Stand der Technik gut bekannt und ist zum Beispiel in Sambrook et al., supra, beschrieben.
Alternativ können zwei oder mehrere der Elemente, die in den Vektor eingefügt werden sollen, zuerst zusammenligiert (falls sie aneinander angrenzend positioniert werden sollen) und dann in den Vektor ligiert werden.
Ein anderes Verfahren zur Konstruktion des Vektors ist es, alle Ligationen der verschiedenen Elemente gleichzeitig in einem Reaktionsgemisch durchzuführen. Hierbei werden viele nonsense oder nicht-funktionelle Vektoren aufgrund ungeeigneter Ligation oder Insertion der Elemente erzeugt werden, jedoch kann der funktionelle Vektor durch Restriktions-Endonukleaseverdau identifiziert und selektiert werden.
Bevorzugte Vektoren zur Durchführung dieser Erfindung sind diejenigen, die mit Bakteriellen-, Insekten- und/oder Säugerwirtszellen kompatibel sind. Solche Vektoren schließen, unter anderem, pCRII (Invitrogen Company, San Diego, CA) pBSII (Stratagene Company, La Jolla, CA) und pETL (B1ueBacII; Invitrogen) ein.
Nachdem der Vektor konstruiert und eine NNT-1 Nukleinsäure in die geeignete Stelle des Vektors eingeführt wurde, kann der vollständigte Vektor in eine geeignete Wirtszelle zur Amplifikation und/oder NNT-1 Polypeptid-Expression eingeführt werden.
Wirtszellen können prokaryontische Wirtszellen (wie z.B. E. coli) oder eukaryontische Wirtszellen (wie z.B. eine Hefezelle, eine Insektenzelle oder eine Vertebratenzelle) sein. Wenn die Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird, kann sie NNT-1 Protein synthetisieren, das anschließend aus dem Kulturmedium (wenn es die Wirtszelle in das Medium sekretiert) oder direkt aus der Wirtszelle, die es herstellt (falls es nicht sekretiert wird) gesammelt werden kann. Nach der Sammlung kann das NNT-1 Protein unter der Verwendung von Methoden, wie z.B. Molekularsieb-Chromatographie, Affinitätschromatographie oder ähnlichem, gereinigt werden.
Die Auswahl der Wirtszelle wird teilweise davon abhängen, ob das NNT-1 Protein glycosyliert oder phosphoryliert (wobei in diesem Falle eukaryontische Wirtszellen bevorzugt sind) werden soll und von der Art, in der die Wirtszelle in der Lage ist, das Protein in seine native Tertiärstruktur (z.B. die geeignete Orientierung von Disulfidbrücken, usw.) zu „falten", so daß ein biologisch aktives Protein durch die Zelle hergestellt wird. Wenn die Wirtszelle jedoch kein biologisch aktives NNT-1 synthetisiert, kann das NNT-1 nach der Synthese unter der Verwendung von geeigneten chemischen Bedingungen, wie unten diskutiert, „gefaltet" werden.
Geeignete Zellen oder Zellinien können Säugerzellen, wie z.B. chinesische Hamster-Ovarzellen (CHO) oder 3T3 Zellen sein. Die Auswahl von geeigneten Säugerwirtszellen und Verfahren zur Transformation, Kultur, Amplifizierung, Screening und Produktherstellung und Reinigung sind im Stand der Technik bekannt. Andere geeignete Säugerzellinien sind die Affen COS-1 und COS-7 Zellinien und die CV-1 Zellinie. Weitere exemplarische Säugerwirtszellen schließen Primaten-Zellinen und Nager-Zellinien ein, einschließlich transformierten Zellinien. Normale diploide Zellen, Zellstämme, abgeleitet von in vitro Kultur von Primärgewebe, sowie primäre Explantate sind ebenfalls geeignet. Kandidatenzellen können genotypisch in dem Selektionsgen defizient sein oder können ein dominant wirkendes Selektionsgen enthalten. Andere geeignete Säugerzellinien schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf He-La, Maus L-929 Zellen, 3T3 Linien abgeleitet von Swiss, Balb-c oder NIH Mäusen, BHK oder HaK Hamsterzellinien.
Wirtszellen, die ähnlich geeignet für die vorliegende Erfindung sind, sind bakterielle Zellen. Z.B. sind die verschiedenen Stämme von E. coli (z.B. HB101, DHSα, DH10 und MC1061) als Wirtszellen im Bereich der Biotechnologie gut bekannt. Verschiedene Stämme von B. subtilis, Pseudomonas spp. anderen Bacillus spp., Streptomyces spp. und ähnliche, können auch in diesem Verfahren verwendet werden.
Viele Stämme von Hefezellen, die dem Fachmann bekannt sind, sind ebenfalls als Wirtszellen für die Expression der Polypeptide der vorliegenden Erfindung erhältlich. Zusätzlich können, wo gewünscht, Insektenzellen als Wirtszellen im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden (Miller et al., Genetic Egineering 8:277-298 [1986]).
Die Insertion (auch als „Transformation" oder „Transfektion" bezeichnet) des Vektors in die ausgewählte Wirtszelle kann unter der Verwendung solcher Verfahren wie z.B. Kalziumchlorid, Elektroporation, Mikroinjektion, Lipofektion oder dem DEAE-Dextranverfahren erreicht werden. Das gewählte Verfahren wird teilweise eine Funktion des Typs der Wirtszelle, die verwendet werden soll, sein. Diese Verfahren und andere geeignete Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt und sind z.B. in Sambrook et al., supra, beschrieben.
Die Wirtszellen, die den Vektor enthalten (d.h. transformiert oder transfiziert sind), können unter der Verwendung von Standardmedien, die dem Fachmann gut bekannt sind, kultiviert werden. Die Medien werden gewöhnlicher Weise alle Nährstoffe enthalten, die für das Wachstum und Überleben der Zellen erforderlich sind. Geeignete Medien zur Kultivierung von E. coli Zellen sind z.B. Luria Broth (LB) und/oder Terrific Broth (TB). Geeignete Medien zur Kultivierung von euykaryontischen Zellen sind RPMI 1640, MEM, DMEM, die alle mit Serum und/oder Wachstumsfaktoren ergänzt werden können, wie es von der besonderen kultivierten Zellinie benötigt wird. Ein geeignetes Medium für Insektenkulturen ist Grace's Medium, ergänzt mit Hefeolat, Lactalbuminhydrolysat und/oder fötalem Kälberserum, wie erforderlich.
Typischerweise wird ein Antibiotikum oder eine andere Verbindung, die für das selektive Wachstum der transformierten Zellen brauchbar ist, nur als eine Ergänzung zu dem Medium hinzugefügt. Die zu verwendende Verbindung wird durch das selektierbare Markerelement vorgeschrieben, das auf dem Plasmid vorhanden ist, mit dem die Wirtszelle transformiert wurde. Wenn z.B. das selektierbare Markerelement Kanamycin-Resistenz ist, wird die zu dem Kulturmedium hinzugefügte Verbindung Kanamycin sein.
Die Menge an NNT-1 Polypeptid, die in der Wirtszelle produziert wird, kann unter der Verwendung von Standardverfahren abgeschätzt werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Solche Verfahren schließen ohne Einschränkung Western-Blot-Analyse, SDS-Polyacrylamid-Gelelektophorese, nicht-denaturierende Gelelektroporese, HPLC-Auftrennung, Immunpräzipitation und/oder Aktivitätstests, wie z.B. DNA-Bindungs-Gelshift-Tests, ein.
Falls das NNT-1 Polypeptid so konstruiert wurde, daß es aus den Wirtszellen sekretiert wird, kann der Hauptteil an Polypeptid im Zellkulturmedium gefunden werden. Auf diese Weise präparierte Polypeptide werden typischerweise kein aminoterminales Methionin besitzen, da es während der Sekretion aus der Zelle entfernt wird. Falls jedoch das NNT-1 Polypeptid nicht aus den Wirtszellen sekretiert wird, wird es im Cytoplasma (für eukaryontische, Grampositive Bakterien und Insektenwirtszellen) oder im Periplasma (für Gram-negative Bakterienwirtszellen) vorhanden sein und kann ein aminoterminales Methionin aufweisen.
Für intrazelluläres NNT-1 Protein werden die Wirtszellen typischerweise zuerst mechanisch oder osmotisch aufgebrochen, um die cytoplasmatischen Inhalte in eine gepufferte Lösung freizusetzen. NNT-1 Polypeptid kann dann aus dieser Lösung isoliert werden.
Die Reinigung von NNT-1 Polypeptid aus einer Lösung kann unter der Verwendung einer Vielzahl von Techniken erreicht werden. Wenn das Polypeptid so synthetisiert wurde, daß es einen Tag, wie z.B. Hexahistidin (NNT-1/hexaHis) oder ein anderes kleines Peptid an seinem Carboxyl- oder Amino-Terminus aufweist, kann es im Wesentlichen in einem Ein-Schrittverfahren durch Passieren der Lösung über eine Affinitätssäule gereinigt werden, wobei die Säulenmatrix eine hohe Affinität für den Tag oder direkt für das Polypeptid aufweist (d.h. ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch NNT-1 erkennt). Zum Beispiel bindet Polyhistidin mit großer Affinität und Spezifität an Nickel, daher kann eine Affinitätssäule von Nickel (wie zum Beispiel die Quiagen-Nickel-Säulen) zur Reinigung von NNT-1/polyHis verwendet werden. (Siehe zum Beispiel, Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Section 10.11.8, John Wiley & Sons, New York [1983]).
Wenn das NNT-1-Polypeptid keinen Tag aufweist und keine Antikörper erhältlich sind, können andere gut bekannte Verfahren zur Reinigung verwendet werden. Solche Verfahren schließen ohne Begrenzung Ionenaustausch-Chromatographie, molekulare Siebchromatoisographie, HPLC, native Gelelektrophorese in Kombination mit Gelelution und präparatives isoelektrisches Fokussieren („Isoprime" Maschine/Technik, Hoefer Scientific) ein. In einigen Fällen können zwei oder mehr dieser Techniken kombiniert werden, um eine erhöhte Reinheit zu erreichen. Bevorzugte Verfahren für die Reinigung schließen Polyhistidin-Tagging und Ionenaustausch-Chromatographie in Kombination mit präparativer isoelektrischer Fokussierung ein.
Wenn es erwartet wird, daß das NNT-1-Polypeptid vorherrschend im periplasmatischen Raum der Bakterien oder im Cytoplasma von eukaryontischen Zellen gefunden wird, können die Inhalte des Periplasma oder Cytoplasma, einschließlich Einschlußkörpern (z.B. Gramnegative Bakterien), wenn das prozessierte Polypeptid solche Komplexe geformt hat, aus der Wirtszelle unter der Verwendung jeder Standardtechnik, die dem Fachmann bekannt ist, extrahiert werden. Zum Beispiel können die Wirtszellen durch French-Press, Homogenisierung und/oder Beschallung lysiert werden, um die Inhalte des Periplasmas freizusetzen. Das Homogenat kann dann zentrifugiert werden.
Wenn das NNT-1-Polypeptid Einschlußkörper im Periplasma gebildet hat, können die Einschlußkörper oft an die inneren und/oder äußeren zellulären Membranen binden und werden daher vorherrschend im Pelletmaterial nach der Zentrifugation gefunden. Das Pelletmaterial kann dann mit einem chaotrophen Mittel, wie z.B. Guanidin oder Harnstoff, behandelt werden, um die Einschlußkörper freizusetzen, aufzubrechen und in Lösung zu bringen. Das NNT-1-Polypeptid in seiner nun löslichen Form kann darin unter der Verwendung von Gelelektrophorese, Immunpräzipitation oder ähnlichem analysiert werden. Falls es gewünscht ist, das NN7-1-Polypeptid zu isolieren, kann die Isolierung durch die Verwendung von Standardverfahren, wie denjenigen unten und in Mason et al. (Meth. Enz., 182:264-275 [1990]) beschrieben, erreicht werden.
Falls NNT-1-Polypeptid Einschlußkörper nicht in einem signifikanten Ausmaß im Periplasma der Wirtszelle gebildet werden, wird das NNT-1-Polypeptid vorherrschend im Überstand nach Zentrifugation des Zellhomogenats gefunden werden, und das NNT-1-Polypeptid kann aus dem Überstand unter der Verwendung von Methoden, wie z.B. denen unten beschrieben, isoliert werden.
In den Situationen, wo es bevorzugt ist, das NNT-1-Polypeptid teilweise oder vollständig zu isolieren, kann die Reinigung unter der Verwendung von Standardverfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, erreicht werden. Solche Verfahren schließen ohne Begrenzung Auftrennung durch Elektrophorese, gefolgt von Elektroelution, verschiedene Arten von Chromatographie (Immunaffinität, molekulares Sieb und/oder Ionenaustausch) und/oder Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie ein. In einigen Fällen kann es bevorzugt sein, für eine vollständige Reinigung mehr als eines dieser Verfahren zu verwenden.
B. Chemische Syntheseverfahren
Zusätzlich zur Präparation und Reinigung von NN7-1-Polypeptid unter der Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken können die NNT-1-Polypeptide, Fragmente oder Derivate davon durch chemische Syntheseverfahren (wie z.B. Festphasen-Peptidsynthese) unter der Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie zum Beispiel denen beschrieben in Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc., 85:2149 [1964]), Houghten et al. (Proc Natl Acad. Sci. USA, 82:5132 [1985]), und Stewart und Young (Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem Co, Rockford, IL [1984]), hergestellt werden. Solche Polypeptide können mit oder ohne einem Methionin am Aminoterminus synthetisiert werden. Chemisch synthetisierte NNT-1-Polypeptide oder Fragmente können unter der Verwendung von in diesen Referenzen beschriebenen Verfahren oxidiert werden, um Disulfidbrücken zu bilden. Die NNT-1-Polypeptide oder Fragmente können als biologisch aktive oder immunologische Ersatzstoffe für natürliche, gereinigte NNT-1-Polypeptide in therapeutischen und immunologischen Prozessen verwendet werden.
IV. Chemisch modifizierte NNT-1-Derivate
Chemisch modifizierte NNT-1-Zusammensetzungen (d.h. „Derivate"), wobei das NNT-1-Polypeptid an ein Polymer gekoppelt ist („NNT-1-Polymere") sind innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Das gewählte Polymer ist typischerweise wasserlöslich, so daß das Protein, an das es angebracht ist, nicht in einer wäßrigen Umgebung ausfällt, wie zum Beispiel einer physiologischen Umgebung. Das ausgewählte Polymer wird gewöhnlicherweise modifiziert, um eine einzelne reaktive Gruppe aufzuweisen, wie zum Beispiel einen aktiven Ester für die Acylierung oder ein Aldehyd für die Alkylierung, so daß der Grad der Polymerisation kontrolliert werden kann, wie in den vorliegenden Verfahren vorgesehen. Das Polymer kann von jedem Molekulargewicht und verzweigt oder unverzweigt sein. Vom Bereich der NNT-1-Polymere eingeschlossen ist ein Gemisch von Polymeren. Bevorzugterweise wird für die therapeutische Verwendung der Endprodukt-Präparation das Polymer pharmazeutisch akzeptabel sein.
Das wasserlösliche Polymer oder ein Gemisch davon kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus, zum Beispiel Polyethylenglykol (PEG), Monomethoxypolyethylenglykol, Dextran, Zellulose oder anderen Kohlenwasserstoff-basierten Polymeren, Poly-(N-Vinylpyrrolidon)polyethylenglykol, Propylenglykolhomopolymeren, einem Polypropylenoxid/ethylenoxid Co-Polymer, Polyoxyethylierten Polyolen (z.B., Glycerin) und Polyvinylalkohol.
Für die Acylierungsreaktionen sollten die ausgewählten Polymer(e) eine einzelne reaktive Estergruppe aufweisen. Für die reduktive Alkylierung sollten die ausgewählten Polymer(e) eine einzelne reaktive Aldehydgruppe aufweisen. Ein bevorzugtes reaktives Aldehyd ist Polyethylenglykolpropionaldehyd, das wasser-stabil ist, oder Mono-C1-C10 Alkoxy- oder Aryloxy-Derivate davon (siehe U.S.-Patent 5,252,714).
Die Pegylierung von NNT-1 kann durch jede im Stand der Technik bekannte Pegylierungsreaktion durchgeführt werden, wie zum Beispiel in den folgenden Referenzen beschrieben: Focus on Growth Factors 3: 4-10 (1992); EP 0 154 316 ; und EP 0 401 384 . Bevorzugterweise wird die Pegylierung über eine Acylierungsreaktion oder eine Alkylierungsreaktion mit einem reaktiven Polyethylenglykolmolekül (oder einem analogen reaktiven wasserlöslichen Polymer) wie unten beschrieben durchgeführt.
Die Pegylierung durch Acylierung schließt im allgemeinen das Reagieren eines aktiven Esterderivats von Polyethylenglykol (PEG) mit einem NNT-1-Protein ein. Jedes bekannte oder in Zukunft entdeckte reaktive PEG-Molekül kann dazu verwendet werden, die Pegylierung von NNT-1 durchzuführen. Ein bevorzugter aktivierter PEG-Ester ist N-Hydroxysuccinimid („NHS") verestertes PEG. Wie hier verwendet, schließt „Acylierung" ohne Begrenzung die folgenden Typen von Verbindungen zwischen NNT-1 und einem wasserlöslichen Polymer, wie zum Beispiel PEG, ein: Amid, Carbamat, Urethan und ähnliches, wie beschrieben in Bioconjugate Chem. 5: 133-140. Die Reaktionsbedingungen können aus allen auf dem Gebiet der Pegylierung bekannten oder aus denjenigen, die anschließend entwickelt werden, ausgewählt sein, unter der Voraussetzung, daß Bedingungen, wie zum Beispiel Temperatur, Lösungsmittel und pH, vermieden werden, die die zu modifizierende NNT-1-Spezies inaktivieren würden.
Die Pegylierung durch Acylierung führt gewöhnlicherweise zu einem Poly-pegylierten NNT-1-Produkt, wobei die Lysin-ε-Aminogruppen über eine Acyl-verbindende Gruppe pegyliert werden. Bevorzugterweise wird die verbindende Brücke ein Amid sein. Ebenso bevorzugt wird das sich ergebende Produkt zumindestens ungefähr 95% mono-, di- oder tri-pegyliert sein. Jedoch werden einige Spezies mit höheren Ausmaßen an Pegylierung (bis zur maximalen Zahl von Lysin-ε-Aminogruppen von NNT-1 plus eine α-Aminogruppe am Aminoterminus des NNT-1) normalerweise in Mengen gebildet, die von den spezifischen verwendeten Reaktionsbedingungen abhängen. Wenn gewünscht, können weitere gereinigte pegylierte Spezies aus dem Gemisch abgetrennt werden, insbesondere unreagierte Spezies, durch Standardreinigungstechniken, einschließlich, unter anderem, Dialyse, Aussalzen, Ultrafiltration, Ionenaustausch-Chromatographie, Gelfiltrations-Chromatographie und Elektrophorese.
Die Pegylierung durch Alkylierung schließt im allgemeinen das Reagieren eines terminalen Aldehydderivats von PEG mit einem Protein, wie z.B. NNT-1, in der Anwesenheit eines Re duktionsmittels ein. Unabhängig vom Grad der Pegylierung werden die PEG-Gruppen bevorzugterweise an das Protein über eine -CH₂-NH-Gruppe angebracht. Mit besonderer Bezugnahme auf die -CH₂-Gruppe wird dieser Typ von Brücke hier als „Alkyl"-Verbindung bezeichnet.
Die Derivatisierung über reduktive Alkylierung, um ein mono-pegyliertes Produkt zu produzieren, nutzt die unterschiedliche Reaktivität der verschiedenen Typen von primären Aminogruppen (Lysin versus den N-terminalen) aus, die für die Derivatisierung in NNT-1 zur Verfügung stehen. Typischerweise wird die Reaktion bei einem pH (siehe unten) durchgeführt, der es einem ermöglicht, Vorteile aus den pKa-Unterschieden zwischen den ε-Aminogruppen der Lysinreste und demjenigen der α-Aminogruppe am N-terminalen Rest des Proteins zu ziehen. Durch solche selektive Derivatisierung wird die Anbringung eines wasserlöslichen Polymers, das eine reaktive Gruppe enthält, wie zum Beispiel ein Aldehyd, an ein Protein kontrolliert: die Konjugation mit dem Polymer tritt vorherrschend am N-Terminus des Proteins auf, ohne signifikante Modifikation von anderen reaktiven Gruppen, wie zum Beispiel den Lysin-Seitenketten-Aminogruppen. Die vorliegende Erfindung stellt eine im wesentlichen homogene Präparation von NNT-1-Monopolymer-Konjugatmolekülen zur Verfügung, was ein NNT-1-Protein bedeutet, an das im wesentlichen ein Polymermolekül (d.h. mindestens ungefähr 95%) an nur einer einzigen Stelle am NNT-1-Protein angebracht wurde. Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung auch pegyliertes NNT-1-Protein zur Verfügung, dem mögliche antigene Brückengruppen fehlen und bei dem das Polyethylenglykolmolekül direkt an das NNT-1-Protein gekoppelt vorliegt, wenn Polyethylenglykol verwendet wird.
Ein besonders bevorzugtes wasserlösliches Polymer zur Verwendung hierbei ist Polyethylenglykol, abgekürzt PEG. Wie hier verwendet, soll Polyethylenglykol jede der Formen von PEG umfassen, die dazu verwendet wurden, um andere Proteine zu derivatisieren, wie zum Beispiel Mono(C1-C10)alkoxy- oder Aryloxy-Polyethylenglykol.
Im allgemeinen kann die chemische Derivatisierung unter allen geeigneten Bedingungen durchgeführt werden, die dazu verwendet werden, um eine biologisch aktive Substanz mit einem aktivierten Polymermolekül zu reagieren. Verfahren zur Herstellung von pegyliertem NNT-1 werden im allgemeinen die Schritte von (a) Reagieren eines NNT-1-Polypeptids mit Polyethylenglykol (wie zum Beispiel einem reaktiven Ester oder Aldehydderivat von PEG) unter Bedingungen, bei denen NNT-1 an eine oder mehrere PEG-Gruppen angebracht wird und (b) Erhalten des/der Reaktionsprodukts/e umfassen. Im allgemeinen werden die optimalen Reaktionsbedingungen für die Acylierungsreaktionen basierend auf bekannten Parametern und dem gewünschten Ergebnis bestimmt werden. Zum Beispiel, je größer das Verhältnis von PEG:Protein, desto größer der Prozentsatz von polypegyliertem Produkt.
Die reduktive Alkylierung zur Produktion einer im wesentlichen homogenen Population von Mono-Polymer/NNT-1-Protein-Konjugat-Molekül, wird im allgemeinen die Schritte von: (a) Reagieren eines NNT-1-Proteins mit einem reaktiven PEG-Molekül unter reduktiven Alkylierungsbedingungen bei einem pH, der dazu geeignet ist, um eine selektive Modifikation der α-Aminogruppe am Aminoterminus des NNT-1-Proteins zu ermöglichen und (b) Erhalten des/der Reaktionsprodukts/e umfassen.
Für eine im wesentlichen homogene Population von Mono-Polymer/NNT-1-Protein-Konjugat-Molekülen sind reduktive Alkylierungs-Reaktionsbedingungen diejenigen, die die selektive Anbringung der wasserlöslichen Polymergruppe an den N-Terminus von NNT-1 ermöglichen. Solche Reaktionsbedingungen stellen im allgemeinen pKa-Unterschiede zwischen den Lysin-Aminogruppen und der α-Aminogruppe am N-Terminus (wobei der pKa der pH ist, bei dem 50% der Aminogruppen protoniert sind und 50% nicht) zur Verfügung. Der pH beeinträchtigt auch das Verhältnis von Polymer zu verwendetem Protein. Im allgemeinen wird, wenn der pH niedriger ist, ein größerer Überschuß von Polymer zu Protein wünschenswert sein (d.h. je weniger reaktiv die N-terminale α-Aminogruppe ist, desto mehr Polymer ist erforderlich, um optimale Bedingungen zu erreichen). Wenn der pH höher ist, muß das Polymer:Protein-Verhältnis nicht so groß sein (d.h. mehr reaktive Gruppen sind erhältlich, also werden weniger Polymermoleküle benötigt). Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der pH im allgemeinen innerhalb des Bereichs von 3-5, bevorzugt 4-5, liegen.
Eine weitere wichtige Berücksichtigung ist das Molekulargewicht des Polymers. Im allgemeinen gilt, je höher das Molekulargewicht des Polymers, desto geringer die Anzahl von Polymermolekülen, die an das Protein angebracht werden können. Ähnlich sollte die Verzweigung des Polymers berücksichtigt werden, wenn diese Parameter optimiert werden sollen. Im allgemeinen gilt, je höher das Molekulargewicht (oder je mehr Verzweigung), desto höher das Polymer:Protein-Verhältnis. Im allgemeinen liegt für die hier vorgesehenen Pegylierungsreaktionen das bevorzugte durchschnittliche Molekulargewicht bei ungefähr zwei 2 kDa bis ungefähr 100 kDa (wobei der Ausdruck „ungefähr" ± 1kDa anzeigt). Das bevorzugte durch schnittliche Molekulargewicht ist ungefähr 5 kDA bis ungefähr 50 kDa, besonders bevorzugt ungefähr 12 kDa bis ungefähr 25 kDa. Das Verhältnis von wasserlöslichem Polymer zu NNT-1-Protein wird im allgemeinen von 1:1 bis 100:1, bevorzugt (für Polypegylierung) 1:1 bis 20:1 und (für Monopegylierung) 1:1 bis 5:1 betragen.
Unter den oben angegebenen Bedingungen wird die reduktive Alkylierung eine selektive Anbringung des Polymers an jedes NNT-1-Protein zur Verfügung stellen, das eine α-Aminogruppe am Aminoterminus aufweist, und eine im Wesentlichen homogene Präparation von Monopolymer/NNt-1-Proteinkonjugat zur Verfügung stellen. Der Ausdruck „Monopolymer/NNT-1-Proteinkonjugat" wird hier verwendet, um eine Zusammensetzung zu meinen, die aus einem einzelnen Polymermolekül zusammengesetzt ist, das an ein NNT-1-Proteinmolekül angebracht ist. Das Monopolymer/NNT-1-Proteinkonjugat wird bevorzugterweise ein Polymermolekül aufweisen, das am N-Terminus lokalisiert ist, jedoch nicht an Lysinaminoseitengruppen. Die Präparation wird bevorzugterweise mehr als 90% Monopolymer/NNT-1-Proteinkonjugat sein und weiter bevorzugt mehr als 95% Monopolymer/NNT-1-Proteinkonjugat, wobei der Rest von beobachtbaren Molekülen unreagiert ist (d. h., Protein, dem die Polymergruppe fehlt). Die unten stehenden Beispiele stellen eine Präparation zur Verfügung, die zu mindestens ungefähr 90% Monopolymer/Proteinkonjugat ist und ungefähr 10% unreagiertes Protein. Das Monopolymer/Proteinkonjugat weist eine biologische Aktivität auf.
Für die vorliegende reduktive Alkylierung sollte das Reduktionsmittel in wäßriger Lösung stabil sein und bevorzugterweise in der Lage sein, nur die im anfänglichen Prozeß der reduktiven Alkylierung gebildete Schiff'sche Base zu reduzieren. Bevorzugte Reduktionsmittel können auch ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Natriumborhydrid, Natriumcyanborhydrid, Dimethylaminboran, Trimethylaminboran und Pyridinboran. Ein besonders bevorzugtes Reduktionsmittel ist Natriumcyanborhydrid.
Andere Reaktionsparameter, wie zum Beispiel Lösungsmittel, Reaktionszeiten, Temperaturen, und so weiter, und Mittel zur Reinigung von Produkten können basierend auf den publizierten Informationen im Hinblick auf die Derivatisierung von Proteinen mit wasserlöslichen Polymeren bestimmt werden.
Ein Gemisch von Polymer-NNT-1-Proteinkonjugat-Molekülen kann durch Acylierung und/oder Alkylierungsverfahren, wie oben beschrieben, präpariert werden und man kann das Verhältnis von Monopolymer/Proteinkonjugat auswählen, das in dem Gemisch enthalten sein soll. Daher, wo gewünscht, kann ein Gemisch von verschiedenen Proteinen mit verschiedener Anzahl an angebrachten Polymermolekülen (d. h. di-, tri-, tetra-, usw.) hergestellt werden und mit dem Monopolymer/NNT-1-Proteinkonjugatmaterial, hergestellt unter der Verwendung der vorliegenden Verfahren, kombiniert werden.
Im allgemeinen schließen Bedingungen, die durch die Verabreichung des vorliegenden Polymer/NNT-1 gelindert oder moduliert werden sollen, diejenigen ein, die hier für NNT-1-Moleküle im allgemeinen beschrieben werden. Jedoch können die hier beschriebenen Polymer/NNT-1-Moleküle weitere Aktivitäten, verstärkte oder reduzierte Aktivitäten oder andere Charakteristika aufweisen, wenn mit nicht-derivatisierten Molekülen verglichen.
V. Kombinationen
Die NNT-1-Polypeptide und Fragmente davon, ob chemisch modifiziert oder nicht, können allein oder in Kombination mit anderen pharmazeutischen Zusammensetzungen, wie zum Beispiel neurotrophen Faktoren, Cytokinen, Interferonen, Interleukinen, Wachstumsfaktoren, Antibiotika, anti-entzündlichen Mitteln, Neurotransmitter-Rezeptor-Agonisten oder Antagonisten und/oder Antikörpern bei der Behandlung von neurologischen oder immunologischen systemischen Erkrankungen verwendet werden.
VI. Antikörper
Die NNT-1-Polypeptide, Fragmente und/oder Derivate davon können dazu verwendet werden, um Antikörper durch Standardverfahren herzustellen. Daher werden Antikörper, die mit den NNT-1-Polypeptiden reagieren, sowie reaktive Fragmente von solchen Antikörpern als innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung liegend angesehen. Die Antikörper können polyklonal, monoklonal, rekombinant, chimär, Einzelketten- und/oder bispezifisch sein. Typischerweise wird der Antikörper oder das Fragment davon „humanisiert" sein, d. h. so hergestellt, um eine Immunreaktion auf den Antikörper zu verhindern oder zu minimieren, wenn an einen Patienten verabreicht. Das Antikörperfragment kann jedes Fragment sein, das mit dem NNT-1 der vorliegenden Erfindung reaktiv ist, wie zum Beispiel F_ab, F_ab', usw. Auch durch diese Erfindung zur Verfügung gestellt werden die Hybridome, die durch Präsentieren von NNT-1 oder einem Fragment davon als ein Antigen gegenüber einem ausgewählten Säuger erzeugt werden, gefolgt von der Fusionierung von Zellen (z. B. Milzzellen) des Säugers mit bestimmten Krebszellen, um immortalisierte Zellinien durch bekannte Techniken herzustellen. Die zur Erzeugung solcher Zellinien verwendeten Verfahren und Antikörper gerichtet gegen die Gesamtheit oder Teile eines menschlichen NNT-1-Polypeptids der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls von dieser Erfindung umfaßt.
Die Antikörper können therapeutisch verwendet werden, um z.B. die Bindung von NNT-1 an seinen Rezeptor zu inhibieren. Die Antikörper können weiterhin für in vivo und in vitro diagnostische Zwecke verwendet werden, wie zum Beispiel in markierter Form, um die Anwesenheit des NNT-1 in einer Körperflüssigkeit zu detektieren.
VII. Therapeutische Zusammensetzungen und Verabreichung davon
Wie hier verwendet, betreffen die Ausdrücke „effektive Menge" und „therapeutisch effektive Menge" die Menge von NNT-1, die erforderlich ist, um eine oder mehrere biologische Aktivitäten von NNT-1 zu unterstützen, wie oben beschrieben.
Therapeutische Zusammensetzungen zur Behandlung von verschiedenen neurologischen Abweichungen oder Erkrankungen liegen innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung. Solche Zusammensetzungen können eine therapeutisch effektive Menge eines NNT-1-Polypeptids oder Fragments davon (wobei jedes der beiden chemisch modifiziert sein kann) im Gemisch mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen. Das Trägermaterial kann Wasser für die Injektion sein, bevorzugterweise ergänzt mit anderen Materialien, die in Lösungen zur Verabreichung an Säuger herkömmlich sind. Typischerweise wird eine NNT-1-therapeutische Verbindung in der Form einer Zusammensetzung verabreicht werden, die gereinigtes NNT-1-Polypetid oder Fragment (das chemisch modifiziert sein kann) in Verbindung mit einem oder mehreren physiologisch akzeptablen Trägern, Hilfsstoffen oder Verbindungsmitteln umfaßt. Neutral gepufferte Kochsalzlösung oder Kochsalzlösung gemischt mit Serumalbumin sind beispielhafte, geeignete Träger. Bevorzugterweise wird das Produkt als ein Lyophilisat unter der Verwendung von geeigneten Hilfsstoffen (z. B. Saccharose) formuliert. Andere Standardträger, Verdünnungsmittel und Hilsstoffe können wie gewünscht einge schlossen werden. Eine beispielhafte Zusammensetzung umfaßt Citratpuffer von ungefähr pH 4,0-4,5, der weiterhin NaCl einschließen kann.
Die NNT-1-Zusammensetzungen können systemisch parenteral verabreicht werden. Alternativ können die Zusammensetzungen intravenös oder subkutan verabreicht werden. Wenn systemisch verabreicht, können die therapeutischen Zusammensetzungen zur Verwendung in dieser Erfindung in Form einer pyrogen-freien, parenteral akzeptablen wäßrigen Lösung vorliegen. Die Präparation von solchen pharmazeutisch akzeptablen Proteinlösungen, unter Berücksichtigung von pH, Isotonizität, Stabilität und ähnllichen liegt innerhalb des Könnens des Fachmanns.
Therapeutische Formulierungen von NNT-1-Zusammensetzungen, die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, können zur Lagerung durch Mischen der ausgewählten Zusammensetzung, die den gewünschten Grad an Reinheit aufweist, mit gegebenenfalls physiologisch akzeptablen Trägern, Hilfsstoffen oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company [1990]) in der Form eines lyophilisierten Kuchens oder einer wäßrigen Lösung präpariert werden. Akzeptable Träger, Hilfsstoffe oder Stabilisatoren sind gegenüber den Rezipienten nicht toxisch und sind bevorzugterweise bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen inert und schließen Puffer, wie zum Beispiel Phosphat, Citrat oder andere organische Säuren; Antioxidantien, wie zum Beispiel Ascorbinsäure; Peptide niedrigen Molekulargewichts; Proteine, wie zum Beispiel Serumalbumin, Gelatin oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie zum Beispiel Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie zum Beispiel Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenwasserstoffe, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner, wie zum Beispiel EDTA; Zukkeralkohole, wie zum Beispiel Mannitol oder Sorbitol; salz-bildende Gegenionen, wie zum Beispiel Natrium; und/oder nichtionische oberflächenaktive Mittel, wie zum Beispiel Tween, Pluronics oder Polyethylenglycol (PEG), ein.
Die für die in vivo Verabreichung zu verwendende NN7-1-Zusammensetzng muß steril sein. Dies wird leicht durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen erreicht. Wenn die NNT-1-Zusammensetzung lyophilisiert ist, kann eine Sterilisation unter der Verwendung dieser Verfahren entweder vor oder im Anschluß an die Lyophilisierung und Rekonstitution durch geführt werden. Die Zusammensetzung für die parenterale Verabreichung wird gewöhnlicherweise in einer lyophilisierten Form oder in Lösung gelagert.
Therapeutische Zusammensetzungen werden im allgemeinen in einem Behälter gegeben, der eine sterile Zugangsöffnung aufweist, zum Beispiel einen intravenösen Lösungsbeutel oder Gefäß, die einen Verschluß aufweist, der durch eine hypodermische Injektionsnadel durchstoßbar ist.
Der Weg der Verabreichung der Zusammensetzung findet in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren, z. B. oral, Injektion oder Infusion durch intravenöse, intraperitoneale, intracerebrale (intraparenchymale), intracerebroventriculare, intramuskuläre, intraoculare, intraarterielle oder intralesionale Routen oder durch Systeme mit verzögerter Freisetzung oder implantierbare Vorrichtungen statt, was gegebenenfalls die Verwendung eines Katheters einschließt. Wenn gewünscht, können die Zusammensetzungen kontinuierlich durch Infusion, Bolusinjektion oder durch implantierbare Vorrichtungen verabreicht werden. Alternativ oder zusätzlich kann NNT-1 lokal über Implantation in den betroffenen Bereich einer Membran, eines Schwammes oder anderer geeigneter Materialien, auf die NNT-1 absorbiert wurde, verabreicht werden.
Wenn eine implantierbare Vorrichtung verwendet wird, kann die Vorrichtung in jedes geeignete Gewebe oder Organ, wie z. B. in einen cerebralen Ventrikel oder in das Hirnparenchym, implantiert werden, und die Zuführung von NNT-1 kann direkt durch die Vorrichtung über Bolus- oder kontinuierliche Verabreichung oder über einen Katheter unter Verwendung von kontinuierlicher Infusion durchgeführt werden.
NNT-1-Polypeptid kann in einer Formulierung oder Präparation mit verzögerter Freisetzung verabreicht werden. Geeignete Beispiele von Präparationen mit verzögerter Freisetzung schließen semipermeable Polymermatrices in Form von geformten Artikeln, z. B. Filmen oder Mikrokapseln, ein. Matrices mit verzögerter Freisetzung schließen Polyester, Hydrogele, Polylactide ( U.S. 3,773,919 , EP 58,481 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-Glutamin (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 [1983]), Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 [1981] und Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 [1982]), Ethylenvinylacetat (Langer et al., supra) oder Poly-D(-)-3-Hydroxybuttersäure ( EP 133,988 ) ein. Zusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung kön nen auch Liposomen einschließen, die durch jedes der mehreren Verfahren präpariert werden können, die im Stand der Technik bekannt sind (z. B. DE 3,218,121 ; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 [1985]; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 [1980]; EP 52,322 ; EP 36,676 ; EP 88,046 ; EP 143,949 ).
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, NNT-1-Zusammensetzungen auf eine ex vivo Weise zu verwenden, d. h., um Zellen oder Gewebe zu behandeln, die aus dem Patienten entfernt wurden und die dann anschließend zurück in den Patienten implantiert werden.
In anderen Fällen kann Patienten NNT-1 durch Implantieren bestimmter Zellen, die genetisch verändert wurden, um NNT-1-Polypeptid zu exprimieren und zu sekretieren, zugeführt werden. Solche Zellen können tierische oder menschliche Zellen sein und können aus dem eigenen Gewebe des Patienten oder aus einer anderen Quelle abgeleitet sein, entweder menschlich oder nicht-menschlich. Gegebenenfalls können die Zellen immortalisiert sein. Die Zellen können in das Gehirn, die Nebenniere oder in andere geeignete Körpergewebe oder Organe des Patienten implantiert werden.
In bestimmten Situationen kann es wünschenswert sein, Gentherapieverfahren zur Verabreichung von NNT-1 an Patienten zu verwenden, die an bestimmten neurologischen oder immunologischen Erkrankungen leiden. In diesen Situationen kann genomische DNA, cDNA und/oder synthetische DNA, die für NNT-1 oder ein Fragment oder eine Variante davon kodiert, operativ mit einem konstitutiven oder induzierbaren Promotor verbunden werden, der in dem Gewebe aktiv ist, in das das Konstrukt injiziert werden wird. Dieses NNT-1-DNA-Konstrukt, entweder in einen Vektor inseriert oder allein ohne einen Vektor, kann direkt in das Hirn- oder anderes Gewebe, neuronal oder nicht-neuronal, injiziert werden.
Alternativ kann ein NNT-1-DNA-Konstrukt direkt in Muskelgewebe injiziert werden, wo es in die Zellen aufgenommen und in den Zellen exprimiert werden kann, unter der Vorraussetzung, daß die NNT-1-DNA operativ mit einem Promotor verbunden ist, der in Muskelgewebe aktiv ist, wie zum Beispiel Cytomegalovirus (CMV) Promoter, Rous-Sarcoma-Virus (RSV) Promoter oder Muskelkreatinkinasepromoter. Typischerweise kann das DNA-Konstrukt (zusätzlich zu der NNT-1-DNA und einem Promoter) Vektorsequenz einschließen, die von Vektoren erhalten wird, wie zum Beispiel Adenovirusvektor, adeno-asoziierter Virusvektor, ei nem retroviralen Vektor und/oder einem Herpesvirusvektor. Das Vektor/DNA-Konstrukt kann mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger/Trägern für die Injektion gemischt sein.
Eine effektive Menge der NNT-1-Zusammensetzung(en), die therapeutisch verwendet werden soll, wird zum Beispiel von den therapeutischen Zielen abhängig sein, wie zum Beispiel der Indikation, für die NNT-1 verwendet wird, der Route der Verabreichung und dem Zustand des Patienten. Demzufolge wird es für den therapierenden Arzt erforderlich sein, die Dosierung zu bestimmen und die Route der Verabreichung wie erforderlich zu modifizieren, um den optimalen therapeutischen Effekt zu erhalten. Eine typische tägliche Dosierung kann von ungefähr 0,1 μg/kg bis zu ungefähr 10 mg/kg oder mehr in Abhängigkeit von den oben genannten Faktoren reichen. Typischerweise wird ein Kliniker die NNT-1-Zusammensetzung verabreichen, bis eine Dosierung erreicht wird, die den gewünschten Effekt bewirkt. Die NNT-1-Zusammensetzung kann daher als eine einzelne Dosis oder als zwei oder mehrere Dosen (die dieselbe Menge von NNT-1 enthalten oder nicht enthalten können) über eine Zeit hinweg oder als eine kontinuierliche Infusion über implantierbare Vorrichtung oder Katheter verabreicht werden.
Wenn weitere Studien durchgeführt werden, wird Information im Hinblick auf geeignete Dosierungsspiegel zur Behandlung von verschiedenen Zuständen von verschiedenen Patienten entstehen und der Durchschnittsfachmann wird in der Lage sein, unter Berücksichtigung des therapeutischen Kontexts, des Typs der zu behandelnden Erkrankung, des Alters und des allgemeinen Gesundheitszustands des Empfängers, eine geeignete Dosierung zu ermitteln.
VIII. Mit NNT-1 zu behandelnde Zustände
Die NNT-1-Proteine, Fragmente und/oder Derivate davon können dazu verwendet werden, um Erkrankungen und Abweichungen des zentralen oder peripheren Nervensystems zu behandeln, die mit Veränderungen im Muster der NNT-1-Expression assoziiert sind oder bei denen ein Aussetzen gegenüber NNT-1 oder Anti-NNT-1 Antikörpern Vorteile bewirkt.
NNT-1-Protein und/oder Fragmente oder Derivate davon können dazu verwendet werden, um Patienten zu behandeln, in denen verschiedene Zellen des zentralen, autonomen oder peripheren Nervensystems degeneriert sind und/oder durch kongenitale Erkrankung, Trauma, mechanische Beschädigung, Operation, Schlaganfall, Ischämie, Infektion, Stoffwechselerkrankung, Mangelernährung, Malignizität und/oder toxische Mittel beschädigt wurden. Genauer gesagt können die NNT-1-Proteinspiegel (herauf- oder herab-reguliert) für solche Indikationen wie zum Beispiel Alzheimer, Parkinson, amyotrophe Lateralsklerose, Charcot-Marie-Tooth-Syndrom, Morbus Huntington, periphere Neuropathie induziert durch Diabetes oder andere Stoffwechselerkrankungen und/oder Dystrophien oder Degeneriation der neuralen Retina, wie zum Beispiel Retinitis Pigmentosa, Wirkstoff-induzierte Retinopatien, stationäre Formen von Nachtblindheit, fortschreitende Zapfenstab-Degenerierung und ähnliches moduliert werden. Da NNT-1 in Zellen des Immunsystems exprimiert wird (siehe Beispiel V unten) kann es auch brauchbar sein, um Erkrankungen zu behandeln, die durch Immunerkrankungen verursacht werden. Da NNT-1 auch in hämatopoietischen Zellen exprimiert wird (siehe Beispiel V unten), kann es weiterhin dazu brauchbar sein, Erkrankungen zu behandeln, die durch Abweichungen des hämatopoietischen Systems verursacht werden.
Zusätzlich können die NNT-1-Proteine, Fragmente und/oder Derivate davon dazu verwendet werden, um Erkrankungen und Abweichungen des immunologischen Systems zu behandeln, einschließlich B-Zellen und/oder T-Zellen, bevorzugterweise B-Zellen. Wie in Beispielen IX-XI hierin gezeigt, weist NNT-1 eine Aktivität zur Stimulierung von B-Zell- und, in einem geringeren Ausmaß, der T-Zell-Produktion auf.
Es gibt verschiedene primäre humorale Immundefizienzen, die potentielle Ziele für diesen Faktor sind. Obwohl ein wenig selten, sind diese Erkrankungen alle chronisch und würden eine Langzeitbehandlung erforderlich machen. Die erste ist herkömmliche variable Immundefizienz oder CVID, die durch irgendwie normale Spiegel von zirkulierenden B-Zellen charakterisiert ist, denen jedoch die Kapazität fehlt, sich geeignet in immunglobulinproduzierende Zellen zu differenzieren. Individuen mit CVID sind gegenüber wiederauftretenden bakteriellen Infektionen empfänglich.
Eine weitere NNT-1 Ziel-Erkrankung ist IgA-Defizienz, die auch zu wiederholten Infektionen führt, die gewöhnlicherweise auf die Lunge, den gastrointestinalen und urogenitalen Trakt begrenzt sind. Die selektive IgA-Defizienz ist eine der geläufigeren dieser Erkrankungen, die ein Auftreten zwischen 0,03%-0,97% in der Population aufweist.
Andere NNT-1 Zielerkrankungen schließen verschiedene Formen von Hypogammaglobulinämie, X-gekoppelter Aggammaglobulinämie und/oder Zuständen, die mit einer dieser Er krankungen zusammenhängen, wie z. B. wiederauftretende Infektionen, Nierendefizienzen oder Giardiasis ein. Siehe, Clin. Immunol. And Immunopath., 40(1) : 13-24 (1986).
Ein Verstärken der humoralen Immunantwort auf bestimmte Vakzine kann eine weitere Verwendung für NNT-1-Polypeptide sein. Zum Beispiel ist die Antikörperproduktion im Anschluß an die Verabreichung von oralen Vakzinen oft schlecht und daher schützt sie nur für eine begrenzte Zeitdauer. Die Verwendung von NNT-1 als ein Adjuvans, um die Antikörperproduktion nach Vakzinierung zu verstärken, ist vorgesehen.
Aufgrund seiner Fähigkeit zur Inhibierung von LPS-induzierter TNF-α Produktion kann NNT-1 Verwendung bei der Behandlung von Sepsis finden. Obwohl sich viele Ansätze basierend auf den Modifikatoren biologischer Antworten für die Lösung dieses sehr wichtigen klinischen Problems als von nicht überzeugender Gültigkeit erwiesen haben, verbleibt die Möglichkeit, daß NNT-1 da erfolgreich ist, wo andere therapeutische Kandidaten versagt haben. Die Jarish-Schwarzmann-Reaktion ist ein klinischer Zustand, der Ähnlichkeiten mit der Sepsis aufweist und streng genommen eine Konsequenz von TNF-toxischer Wirkung ist. Die Verwendung eines anti-TNF-Antikörpers hat sich als ein klinisch erfolgreicher Ansatz für die Behandlung dieses Zustands erwiesen. Dies ist ein Zustand, bei dem NNT-1 klinischen Wert im Hinblick auf seine anti-TNF und anti-entzündlichen Eigenschaften zeigen kann.
IX. Tests, um auf Inhibitoren von NNT-1 zu screenen
In einigen Situationen kann es wünschenswert sein, die Spiegel von NNT-1-Aktivität zu inhibieren oder signifikant zu verringern. Verbindungen, die NNT-1-Aktivität inhibieren könnten entweder auf eine ex vivo Weise oder auf eine in vivo Weise durch lokale oder iv-Injektion oder durch orale Zuführung, implantierbare Vorrichtung, oder ähnliches verabreicht werden. Die unten beschriebenen Tests stellen Beispiele von Verfahren zur Verfügung, die zur Identifizierung von Verbindungen brauchbar sind, die die NNT-1-Aktivität inhibieren könnten.
Zur Erleichterung beim Lesen wird die folgende Definition hierin zur Beschreibung der Testsysteme verwendet:
„Testmolekül(e)" bezieht sich auf das (die) Molekül(e), das als ein Inhibitor von NNT-1 evaluiert wird, typischerweise aufgrund seiner potentiellen Fähigkeit, die Interaktion von NNT-1 mit seinem Rezeptor zu blockieren.
Der NNT-1 Rezeptor kann isoliert werden, z.B. durch Expressionsklonierung unter der Verwendung von markiertem (z.B. jodiertem) NNT-1.
Verschiedene Typen von in vitro Assays unter der Verwendung von gereinigtem Protein können vorgenommen werden, um diejenigen Verbindungen zu identifizieren, die die NNT-1 Aktivität unterbrechen. Diese Unterbrechung kann durch eine Verbindung erreicht werden, die typischerweise die Interaktion von NNT-1 mit seinem Rezeptor inhibiert.
In einem Assay kann gereinigtes NNT-1 Protein oder ein Fragment davon (hergestellt z.B. durch Verfahren wie oben beschrieben) durch Anlagerung an den Boden der Wells einer Mikrotiterplatte immobilisiert werden.
Radiomarkierter NNT-1 Rezeptor sowie das Testmoleküle) können danach entweder einzeln oder simultan zu den Wells hinzugefügt werden. Nach der Inkubation können die Wells gewaschen und gezählt werden unter der Verwendung eines Szintillationszählers für Radioaktivität, um den Grad der NNT-1/Rezeptorbindung in der Anwesenheit des Testmoleküls zu bestimmen. Typischerweise wird das Molekül über einen Konzentrationsbereich getestet und eine Reihe von Kontroll-„Wells", die eines oder mehrere Elemente des Testassays nicht aufweisen, können für die Genauigkeit in der Evaluierung der Ergebnisse verwendet werden. Eine Veränderung dieses Assays beinhaltet das Anlagern des Rezeptors an die Wells und addieren von radiomarkiertem NNT-1 zusammen mit den Testmolekülen zu den Wells. Nach der Inkubation und dem Waschen können die Wells auf Radioaktivität gezählt werden.
Verschiedene Mittel einschließlich Radiomarkierung sind erhältlich, um NNT-1 zu „markieren". Z.B. kann das NNT-1 Protein unter der Verwendung von 125-I oder 35-5 radiomarkiert werden.
Alternativ dazu gibt es ein Fusionsprotein von NNT-1, worin die DNA, die für NNT-1 kodiert, mit der kodierenden Sequenz eines Peptides, wie z.B. des c-myc-Epitops, fusioniert wird. Das NNT-1-myc-Fusionsprotein kann einfach durch kommerziell erhältliche Antikörper, die gegen myc gerichtet sind, detektiert werden.
Eine Alternative zum Typ des Mikrotiterplatten-Bindungsassays beinhaltet das Immobilisieren von entweder NNT-1 oder seines Rezeptors an Agarose-Kügelchen, acrylische Kügelchen oder andere Arten von solchen inerten Substraten. Das inerte Substrat, das NNT-1 oder seinen Rezeptor beinhaltet, kann in eine Lösung gegeben werden, die das Testmolekül zusammen mit der komplementären Komponente (entweder Rezeptor oder NNT-1 Protein) enthält, welches radioaktiv oder Floreszenz- markiert wurde; nach der Inkubation kann das inerte Substrat durch Zentrifugation präzipitiert werden und die Menge an Bindung zwischen NNT-1 und Rezeptor kann durch verschiedene Methoden, die oben beschrieben wurden, bewertet werden. Alternativ dazu kann der inerte Substrat-Komplex an eine Säule immobilisiert und das Testmolekül und komplementäre Komponente über die Säule passiert werden. Die Bildung des NNT-1/Rezeptor-Komplexes kann danach unter der Verwendung einiger der Methoden, die hierin beschrieben werden, z.B. Radiomarkierung, Antikörperbindung oder ähnliches, untersucht werden.
Eine andere Art eines in vitro-Assays, der nützlich zur Identifizierung eines Moleküls ist, das NNT-1 Aktivität inhibiert, ist das Biacor-Assay-System (Pharmacia, Pscataway, NJ) unter der Verwendung eines Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Detektorsystems und unter der Befolgung des Protokolls des Herstellers. Dieser Assay beinhaltet im Wesentlichen die kovaltente Bindung von entweder NNT-1 oder seines Rezeptors an einen Dextran-beschichteten Sensorchip, welcher sich in einem Detektor befindet. Das Testmolekül und die komplementäre Komponente können danach in die Kammer, die den Sensorchip enthält, entweder simultan oder sequenziell iniziert werden und die Menge der Bindung von NNT-1/Rezeptor kann basierend auf der Änderung der molekularen Masse, welche physikalisch mit der Dextran-beschichteten Seite des Sensorchips assoziiert ist, untersucht werden; die Veränderung in der molekularen Masse kann mit dem Detektorsystem gemessen werden.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, zwei oder mehrere Testmoleküle zusammen auf die Verwendung in der Verringerung oder Inhibierung der NNT-1 Aktivität zu evaluieren. In diesen Fällen können die oben beschriebenen Assays einfach durch Addieren solcher zusätzlichen Testmoleküle modifiziert werden, entweder simultan mit dem oder anschließend an das erste Testmolekül. Die verbleibenden Schritte des Assays können wie oben beschrieben sein.
X. Transgene Säugetiere
Ebenso umfaßt vom Umfang der vorliegenden Erfindung sind nicht-humane Säugetiere, wie z.B. Mäuse, Ratten, Kaninchen, Ziegen oder Schafe, in welchen das Gen (oder Gene), das für das humane Äquivalent von NNT-1 kodiert, unterbrochen („knocked out") wurde, so daß der Expressionsspiegel dieses Genes siginifikant verringert oder vollständig aufgehoben ist. Solche Säugetiere können unter der Verwendung von Techniken und Methoden, wie jene beschrieben in U.S. Patent Nr. 5,557,032, hergestellt werden. Die vorliegende Erfindung beinhaltet weiterhin nicht-humane Säugetiere, wie z.B. Mäuse, Ratten, Kaninchen, Ziegen oder Schafe, in welchen das Gen (oder Gene), kodierend das NNT-1 (entweder die native Form von NNT-1 für das Säugetier oder ein heterologes NNT-1 Gen), durch das Säugetier überexpremiert wird, wodurch ein „transgenes" Säugetier geschaffen wird. Solche transgenen Säugetiere können unter der Verwendung gut bekannter Methoden, wie jene, die in U.S. Patent Nr. 5,489,743 und der PCT-Patentanmeldung Nr. WO94/28122, veröffentlicht am 08. Dezember 1994, beschrieben sind, hergestellt werden.
Die folgenden Beispiele dienen nur zu Zwecken der Verdeutlichung und sollten nicht so verstanden werden, daß sie den Umfang der Erfindung in irgendeiner Weise beschränken.
Beispiele
Standardverfahren zur Herstellung von Bibliotheken, DNA-Klonierung und Proteinexpressionen sind in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY [1989]) und in Ausubel et al., eds. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, NY [1995]) dargelegt.
Beispiel I: Klonierung von cDNA und genomischer Klon von NNT-1
A. Konstruktion der cDNA Bibliothek
Humane T-Zell-Lymphoma-Zellen, Jurkat-Zellen wurden bei 37° C unter 5% CO₂ in einem RPMI 400 Medium beinhaltend 10% fötales Rinderserum aufgezogen. Das Medium wurde mit 10mM HEPES, pH 7,5 gepuffert. Nach 8 Passagen wurden die Zellen in zwei Gruppen geteilt. Eine Gruppe wurde bis zur Konfluenz gewachsen (2 × 10⁷ Zellen/Flasche), die RNA, die von diesen Zellen geerntet wurde, diente als die „Treiber"-RNA. Die andere Gruppe war die „Test"-Gruppe und wurde durch die folgende Behandlung aktiviert.
Die Zellen wurden für acht Stunden durch Addition der Superantigene Streptococcen Enterotoxin B und F(TSST) 80 ng/ml; des PKC-Aktivators, PMA 50 ng/ml; Kalzium-Ionophor A21832 125 ng/ml aktiviert. Der Proteintranslations-Inhibitor Cycloheximid wurde ebenso bei einer Konzentration von 1 mg/ml hinzugefügt. RNA wurde von den verschiedenen Gruppen von Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten geerntet.
1. Gesamt RNA-Präparation:
Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 Minuten pelletiert und mit PBS (Phosphat-gepufferte Saline) gewaschen und in Ultraspec II (Biotex, Inc., TX) auf eine Konzentration von 5 × 10 Zellen/ml von Ultraspec II resuspendiert. Die Zellen wurden danach durch vier Passagen durch eine 21-gauge Spritze lysiert. Das Homogenat wurde auf Eis für 15 Minuten inkubiert, 0,2 Volumen Chloroform wurden danach hinzugefügt, gut gemischt und auf Eis für weitere 10 Minuten reinkubiert, bei 12000 × g für 30 Minuten in 30ml Corex-Röhrchen zentrifugiert. Post-Zentrifugation und Überstand wurden zurückbehalten und der Rückstand verworfen. 0,05 Volumen von RNA-bindendem Harz, verkauft von Biotex als Teil des Isolierungskits, wurden nach der Zugabe von 0,5 Volumen Isopropanol addiert. Nach dem Pelletieren des Harzes durch Zentrifugation (300 × g für 5 Minuten) wurde das Harz 2 × mit 75% RNase-freiem Ethanol gewaschen und bei 50°C für 10 Minuten luftgetrocknet. Gesamt-RNA wurde danach durch Resuspendieren des Harzes in 1 Volumen RNase-freiem Wasser, kräftigem Vortexen für eine Minute, danach zentrifugiert bei 13000 × g für 1 Minute vom Harz eluiert. Die Gesamt-RNA wurde danach in ein neues Eppendorf-Röhrchen transferiert und das Harz-Pellet verworfen.
2. Poly (A)⁺-RNA-Isolierung:
Qiagen's Oligotex mRNA Isolations-System wurde verwendet, wie vom Hersteller beschrieben; die Prozedur wurde 2 × wiederholt, um reine Poly(A)⁺ RNA zu erhalten. Dies ist besonders wichtig für eine zufällig-„ge-primed-te" Bibliothek („random primed library"), um die Zahl der Kopien von ribosomaler RNA in der cDNA zu minimieren. Die mRNA-Integrität wurde anschließend durch Spektroskopie und Formamid-denaturierende Gelelektrophorese bestimmt.
Die erste-Strang cDNA wurde durch Befolgen des BRL-cDNA Syntheseprotokolls synthetisiert. Um restliche mRNA von der Target-cDNA zu entfernen, wurde die erste-Strang cDNA-Reaktion mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit 2 M Amoniumacetat und 3 Volumen Ethanol präzipitiert. Die cDNA/mRNA-Hybride wurden danach in 0,3 M NaOH in der Anwesenheit von 2 mM EDTA resuspendiert und bei 68° C für 15 Minuten inkubiert. Die Hydrolyse-Reaktion wurde mit ungefähr 1,5 M Überschuß an reinem Tris HCl neutralisiert. Die cDNA wurde danach mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit 2 M Amoniumacetat und 3 Volumen Ethanol präzepitiert, mit 75% Ethanol gespült und in 7 ml sterilem Wasser resuspendiert. Die Einzelstrang cDNA wurde durch folgendes Protokoll des Boehringer Mannheim tailing-kits „getailed".
3. Treiber mRNA-Präpertation und Photo-Biotinylierung:
Poly(A) RNA wurde, wie oben beschrieben, isoliert. Ungefähr 20 mg wurden danach zweifach mit 20mg Photobiotinacetat (Sigma) photobiotinyliert und bei einer Konzentration von 1 mg/ml in RNase-freiem Wasser rekonstituiert. Überschuß an Photobiotin wurde mit Wassergesättigtem Isobutanol entfernt und mit Ethanol präzipitiert und in 30ml DEPC-behandeltem Wasser resuspendiert.
4. Substraktive Hybridisierungsreaktion:
Die photobiotinylierte Treiber-mRNA wurde mit der Tester-cDNA kopräzipitiert und in 2ml RNase-freiem Wasser resuspendiert. Um es den Nukleinsäuren zu erlauben, in Lösung zu gehen, wurde die Präperation bei Raumtemperatur für einige Stunden belassen, mit periodischem leichtem Rühren, gefolgt von weiteren 20 Stunden Inkubation bei 68°C. Photobiotinylierte Treiber wurden zu einer Endkonzentration von 2 mg/ml gelöst. Im allgemeinen sollte eine Konzentration von Treiber-RNA von mindestens 1 mg/ml verwendet werden.
5. Post-Hybridisierungs-Hybrid-Entfernung:
Nach der Hybridisierung wurde Streptavidin zu einer Endkonzentration von 0,2 mg/ml addiert und bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert. Das Streptavidin wurde danach mit einer Phenol/Chloroform-Extraktion entfernt. Nach der Extraktion wurde die cDNA mit Ethanol präzipitiert.
Ein Paar von Primern: AGCGCTACGGTCGACCCG GCG TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT (ACG) X (SEQ ID NR: 15) (Sal I T21-verankerter Primer) und GGA AGG AAA AAA GCG GCC GCT ACA (SEQ ID NR: 16) (Not I – N9 Primer) wurden in der PCR verwendet, um die cDNA zu amplifizieren. Der „expand PCR Kit" wurde verwendet. 15 Zyklen wurden verwendet, um genügend Material für den Gelfraktionierungs-Ansatz zu generieren, um eine Repräsentation von gleicher Größe in der Bibliothek zu erlauben. Um dem ersten Primer das Anlagern zu erlauben, wurde die Anlagerungstemperatur der initialen fünf Zyklen der PCR bei 35°C für eine Minute durchgeführt. Die cDNA, die verschiedene Größenfraktionen darstellte, wurde auf einem Gel fraktioniert. Sal I-Adapter wurden zur Duplex cDNA addiert, die danach mit Not I verdaut und in pSport-Vektor kloniert wurde.
B. Isolierung des cDNA-Klons
Die Bibliothek wurde mittels exprimierter Sequenz-Tag (Est)-Analyse gescreened. Individuelle Klone dieser Bibliothek wurden zufällig aufgesammelt und an einem Applied Biosystems 373A automatisierten DNA-Sequenzer unter der Verwendung von Vektor Primer und Taq Farbstoff-Terminator-Reaktionen (Applied Biosystems) sequenziert. Die resultierende Nukleotidsequenz, die von dem zufällig gesammelten Klon NNT-1 erhalten wurde, wurde translatiert, danach mit der existierenden Datenbank von bekannten Proteinsequenzen unter der Verwendung einer modifizierten Version des FASTA-Programms verglichen.
Ein Klon (khjl-00008-f2) weist ungefähr 21% Homologie auf dem Level der translatierten Aminosäuresequenz mit CNTF auf. Das Gesamt-Insert des cDNA-Klons wurde sequenziert und es wurde gefunden, daß es für einen Vollängen-Klon kodiert, daß heißt, es enthält Met am 5'-Ende und ein Stopocodon stromaufwärts von Met und ein anderes Stoppcodon am 3'-Ende.
Die Sequenz dieser Vollängen-cDNA ist in 1 gezeigt. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz des Proteins ist in 3 gezeigt. Das putative Signalpeptid reicht von Aminosäure –27 (Met) bis Aminosäure –1 (Ala).
C. Isolierung des genomischen Klons
Die genomische DNA von NNT-1 wurde aus einer humanen genomischen P1-Bibliothek (Genome Systems Inc., St. Louis, MO; Katalog Nr. P1-2535) erhalten. Die Bibliothek wurde unter der Verwendung der NNT-1 cDNA als eine Sonde gescreened. Die cDNA wurde unter der Verwendung des Amersham Rediprime-Kits (Amersham, Arlington Heights, IL; Katalog Nr. RPN-1633) radiomarkiert und die Hybridisierungs- und Rehybridisierungs-Lösung war: 50% Formamid, 5 × SSC, 5 × Denhardt's, 0,05% Natriumpyrophosphat, 0,1% SDS und 100 mg/ml Lachssperma-DNA. Prähybridisierung fand für ungefähr 1 Stunde statt und Hybridisierung für ungefähr 16 Stunden bei 42°C.
Nach der Hybridisierung wurden die Filter in 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 42°C für ungefähr 30 Minuten gewaschen und danach einem Film ausgesetzt. Zwei positive Klone wurden identifiziert und die Plasmide, die diese Klone enthielten, wurden gemäß dem Genome Systems Inc. Protokoll gereinigt. Die Plasmid-DNA wurde danach direkt sequenziert.
Die genomische Sequenz kodierend für NNT-1 ist in 2 gezeigt (SEQ ID Nr. 3). Das Gen besteht aus 3 Exons und 2 Introns. Die kodierenden Regionen werden in Großbuchstaben dargestellt, wohingegen die nicht-kodierenden Regionen, einschließlich 5'-untranslatierter Region, Introns und 3'-untranslatierter Region in Kleinbuchstaben dargestellt sind.
Beispiel II: Präparation von rekombinantem Säugetier-Protein NNT-1
Ein Expressions-Vektor, beinhaltend humane NNT-1 cDNA und flag-tag-Peptid wurde durch PCR-Amplifizierung des Fusionsgens konstruiert. Ein Sense-Primer mit Hind III-Stelle am 5'-Ende:
(5'-AGCAAGCTTCACCATGGACCTCCGAGCAGGGGACTC-3') (SEQ ID Nr. 6), welcher Aminosäure –27 (Met) bis Aminosäure –1 (Asp) kodiert und ein Antisense-Primer mit Not I-Stelle am 5'-Ende, welcher für flag-tag-Peptid und die letzten 8 Aminosäuren am 3'-Ende kodiert
(5'AGCGGGGCCGCACTACTTGRCATCGTCGRCGTCCTTGTACTCGAAGCCATGAG CCCCCAGGTGCAG – 3') (SEQ ID Nr. 7)
wurden in der PCR verwendet, um ein Fusionsgen zu amplifizieren. Das Fusionsgen wurde in den pCEP4-Vektor (Invitrogen Inc., San Diego, CA), ligiert. Der Expressions-Vektor wurde in EBNA-1 293-Zellen mit Lipofectin (BRL, Gaithersburg, MD) transfiziert unter der Verwendung der vom Hersteller empfohlenen Methode. 48 Stunden nach Transfektion wurden die 293-Zellen und das konditionierte Medium geerntet und im Western Blot mit einem antiflaq-tag Antikörper (Eastman Kodak, Co., New Haven CT) analysiert. Die Mehrzahl des rekombinanten Proteins wurde im 293 Zell-Lysat gefunden. Daher wurde anti-flag-Antikörper-Gel (Eastman Kodak Co., New Haven CT) verwendet, um das Protein vom 293 Zell-Lysat zu reinigen. Ein 28-30 kd Protein wurde durch Befolgen des Protokolls des Herstellers gereinigt. Dieses rekombinante Protein wurde in der biologischen Funktionsanalyse verwendet (für Motorneuronen und sympathische Neuronen – Überlebensassay). Die N-terminale Aminosäure des Proteins wurde, als Leu (Aminosäure 1) bestimmt, was angezeigt, daß das potentielle Signalpeptid abgespalten war (Aminosäure-27 bis Aminosäure-1).
Beispiel III: Herstellung von rekombinantem E. coli NNT-1-Protein
Ein cDNA-Klon von NNT-1, kodierend für Aminosäuren Leu (1) bis Phe (198) von SEQ ID Nr. 2 wurde in den Vektor pAMG21, welcher ein Derivat von pCFM 1656 (ATCC Accession number 69576) ist und geeignete Restriktionsstellen zur Insertion von Genen stromab von dem lux PR-Promotor (siehe US Patent Nr. 5,169,318 für eine Beschreibung des lux-Expressionssytems) beinhaltet, eingefügt. Die verwendete Wirtszelle war E. coli K12, Stamm CGSC 6159 (Yale University, Genetischer Stamm, New Haven, CT). Die Wirtszellen wurden mit dem Vektor unter der Verwendung von Standard-Transformations-Verfahren transformiert und wurden danach in 2 XYT-Medium, beinhaltend ungefähr 50 μl/ml Kanamycin, bei 30°C inkubiert. Die Induktion des NNT-1-Genprodukts wurde durch Zugabe des Autoinducers N-(3-Oxohexanoyl)-DL-homoserinlacton zu dem Kulturmedium in einer Endkonzentration von ungefähr 30 ng/ml gestartet, und die Kulturen wurden bei entweder 30°C oder 37°C für ungefähr 6 Stunden inkubiert, wonach die Zellen durch Mikroskopie auf Einschlußkörper untersucht wurden.
Die Mehrheit des NNT-1-Proteins wurde in den Einschlußkörpern gefunden. Daher wurde eine Zellpaste durch Pelletieren der Zellen hergestellt. Die Einschlußkörper wurden bei niedrigem pH solubilisiert, und das Protein durch sequentielle Präzipitation gereinigt. Das Protein wurde vor dem Laden einer Probe auf SDS-PAGE, um die Reinheit zu bestimmen, dialysiert. Coomassie-Färbung des Gels zeigte an, daß das Protein zu mindestens 95% rein war.
Beispiel IV: Neurobiologische Funktion von NNT-1
A. Hühner-Motor-Neuronen-Assay
Motorneuronen (MN)-angereicherte Kultur von Lumbar-Rückenmark wurde aus embryonischen Tag E5.5-Hühnchen hergestellt. MN-Neuronen wurden angereichert unter der Verwendung eines 6,8% Metrizamid-Gradienten. Kurz gesagt, wurde lumbares Rückenmark präpariert, von Hirnhaut und DRG befreit. Das Rückenmark wurde in Papain-enthaltendem L15-Medium (Gibco/BRL, Grand Island, NY) für 20 Minuten bei 37°C inkubiert (Worthington Biochemical Corp, Freehold, NJ. Enzymatisch erweichte Rückenmark-Fragmente wurden durch Pipettieren in Einzelzellen dissoziiert. Die Zellsuspension wurde danach auf ein 6,8% Metrizamid (Serva, Feinbiochemicala, Deutschland)-Kissen aufgeschichtet und das Röhrchen wurde bei 500 g für 20 Minuten zentrifugiert. Die Grenzfläche zwischen Metrizamid-Kissen und Zellsuspension wurde gesammelt und in Kulturmedium verdünnt. Die Fraktion wurde danach vorsichtig auf ein 4% BSA-Kissen geschichtet und bei 280 g für 10 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in Kulturmedium, beinhaltend L15-Medium mit 10% fötalem Rinderserum supplementiert mit 3,6 mg/ml Glukose, 5 ng/ml Natriumselenit, 6,25 ng/ml Progesteron, 0,1 mg/ml Conalbumin, 16 mg/ml Putrescin und 5 mg/ml Insulin, resuspendiert. 10.000 Zellen/Well wurden in 96-Well Gewebekulturplatten ausgesät. Reihenverdünnungen des neutrotrophen-Faktors (NNT-1 oder CNTF) wurden zu der Kultur addiert und für 3 Tage inkubiert. Am Tag 3 wurde MTT zu der Kultur für 4,5 Stunden addiert. Das Formazan-Produkt wurde solubilisiert und die Platten bei einer Wellenlänge von 570 mit einer 650 nm Subtraktion für sichtbare Interferenz abgelesen. Der optische Dichte (OD)-Meßwert ist proportional zur Zahl der überlebenden Neuronen in Kultur. Die Absorption bei 570 nm (erhöhtes Neuro nenüberleben) in dreifachen Wells ist als eine Funktion der Endkonzentration von NNT-1 oder CNTF aufgetragen.
Die Ergebnisse der Analyse werden in 7 dargestellt. Die Absorption bei 570 nm ist ausgedrückt als 1.000-fach des eigentlichen Meßwerts. Die Ergebnisse zeigen, daß NNT-1 das Wachstum von Hühner-Motorneuronen unterstützen kann. Seine maximale Aktivität erreicht ungefähr 90% der Aktivität von CNTF.
B. Sympathischer Hühner-Neuronen-Assay
Kulturen von primären Hühnchenembryo-sympathischen Kettenganglien wurden präpariert. Kurz gesagt, wurden sympathische Ganglien von fertilen, pathogen-freien Hühnereiern entfernt, die für 9 Tage bei 37,6°C in einer befeuchteten Atmosphäre inkubiert worden waren. Die Ganglien wurden chemisch dissoziiert durch Aussetzen von Hanks' Balanced Salt Solution ohne divalente Kationen, enthaltend 10 mM HEPES-Puffer pH 7,2 für 10 Minuten bei 37°C und danach durch Aussetzen einer Lösung von 0,125% Bactotrypsin 1:250 (Difco, Detroit, Michigan) in Hanks' Balanced Salt Solution, modifiziert wie oben, für 12 Minuten bei 37°C. Trypsinisierung wurde gestoppt durch die Addition von fötalem Kalbsserum auf eine Endkonzentration von 10%.
Nach dieser Behandlung wurden Ganglien in eine Lösung bestehend aus Dulbecco's hohem Glukose-modifizierten Eagle's Medium mit Bicarbonat beinhaltend 10% fötales Kalbserum und 10 mM/l HEPES, pH 7,2 transferiert und wurden mechanisch durch ungefähr 14 × Trituration durch eine 20-Gauge, 1'' doppelt-aufgesetzte (double-hubbed) rostfreie Stahlnadel mechanisch dissoziiert.
Die dissoziierten Ganglien wurden danach in Kulturmedium (Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium, supplementiert mit 10% fötalem Kalbserum, 4 mM Glutamin, 60 mg/l Penicillin-G, 25 mM HEPES, pH 7,2) in 100 mm Durchmesser-Gewebekulturschalen (ungefähr 40 dissoziierte Ganglien pro Schale), für 2 bis 3 Stunden ausplattiert. Dieses Prä-Ausplattieren wurde durchgeführt, um die nicht-neuronalen Zellen, die an die Schale anhaften, von den Nervenzellen, die nicht anhaften, zu separieren. Nach dem Prä-Ausplattieren wurden die nicht-adhärenten Nervenzellen durch Zentrifugation gesammelt, in Kulturmedium resuspendiert und 50 ml/Well auf Halbflächen-96-Well Mikrotiter-Gewebekulturplatten in einer Dichte von 2.500 Nervenzellen pro Well ausplattiert. Die Mikrotiter-Wells wurden zuvor einer 1 mg/ml Lösung von Poly-L-Ornithin in 10 mM Natriumborat, pH 8,4, über Nacht bei 4°C ausgesetzt, in sterilem gereinigtem Wasser gewaschen und luftgetrocknet.
Endkonzentrationen von neutrophen Faktoren, welchen die Zellen ausgesetzt wurden, waren wie folgt: 1) für den CNTF-Standard, die Reihenverdünnungskurven mit neun Punkten reichten von 100 ng/ml bis 6 pg/ml; 2) für das NNT-1, die Reihenverdünnungskurven mit neun Punkten reichten von 100 ng/ml bis 0,12 pg/ml. 25 ml einer Serienverdünnung der Probe, die auf neurotrophe Aktivität untersucht werden sollte, wurde zu jedem Well addiert und die Schalen wurden für 38 bis 46 Stunden bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre, beinhaltend 7,5% CO₂, inkubiert. Danach wurden pro Well 18 ml einer 1,5 mg/ml Lösung des Tetrazolium-Farbstoffs MTT in Dulbecco's hohem Glukose-modifiziertem Eagle Medium mit Bicarbonat, beinhaltend 10 mM HEPES, pH 7,2, addiert und die Kulturen in den 37°C Inkubator für 4,5 Stunden gegeben. Danach wurden 75 ml einer Lösung von 50% N,N-Dimethylformamid, beinhaltend 20% Natriumdodecylsulfat, pH 4,7, addiert, um das kristalline Formazan-Produkt zu lösen, und die Platten wurden im 37°C Inkubator für ein Minimum von 12 Stunden inkubiert. Die Absorption bei 579 nm wurde relativ zu einer 650 nm Referenz für jedes Well bestimmt unter der Verwendung eines automatischen Mikrotiter-Plattenlesers. Die resultierende Absorption ist proportional zur Zahl der lebenden Zellen in jedem Well, definiert als diejenigen Nervenzellen, die fähig sind, den Farbstoff zu reduzieren.
Die Ergebnisse der Analyse sind in 8 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, daß NNT-1 das Wachstum von sympathischen Hühnerneuronen unterstützt.
Beispiel V: Northern Blot-Analyse der Gewebeverteilung
Northern Blots von humanen Geweben wurden von Clontech (Palo Alto, CA) gekauft. Die Northern Blots wurden mit einer humanen NNT-1 cDNA-Sonde untersucht. Zwei cDNA-Fragmente, die die 5'- und 3'-kodierende Region von NNT-1 umfassen, wurden markiert und als eine Sonde verwendet, um Gewebeexpression des NNT-1-Gens zu analysieren. Das Ergebnis zeigte, daß NNT-1 als ein 2,2 kb Transkript in den Geweben von Milz, Lymphknoten und peripheren Blutlymphozyten, Knochenmark und fötaler Leber, Niere, Lunge, kolorektalen Adenocarcinoma-Zellen SW480, Helazellen S3, Lungenkarcinom A549, chronische myelogene Leukämie-K-562-Zellen, Burkitts Lymphoma Raji-Zellen exprimiert wird. Die Gewe beverteilung des Genes läßt vermerken, daß das Gen auch in die Entwicklung des Immunsystems oder von hämatopoietischen Zellen involviert ist.
Beispiel VI: Chromosomenlokalisierung des NNT-1-Gens
Die Chromosomenlokalisierung des Gens wurde durch FISH durchgeführt. Ein 14 kb genomisches Fragment wurde mit dATP unter der Verwendung des BRL BioNick Labelingkit biotinyliert (15°C 1 Stunde). Das Verfahren von FISH wurde gemäß Heng et al., Proc Nat Acad Sci USA 89:9509-9513, 1992 durchgeführt. Das Ergebnis zeigt, daß das Gen auf Chromosom 11 q13 lokalisiert ist, was nah zum humanen CNTF Genlocus (Chromosom 11q12) ist.
Beispiel VII: Isolierung des Maus-cDNA-Klons
Ein Maus-Teil-cDNA-Klon wurde durch PCR-Amplifizierung der Maus 11 Tageembryonalen cDNA (Clontech, Palo Alto, CA) unter der Verwendung des humanspezifischen Primers isoliert. Der Vollängen-cDNA-Klon wurde weiterhin durch 5'-RACE und 3'-RACE erhalten. Die Maus-cDNA Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz wird in 4 beziehungsweise 5 gezeigt. Das Mausprotein teilt 96% Identität mit dem humanen Protein, was anzeigt, daß das Protein während der Evolution hoch konserviert ist. Wie das humane Protein enthält auch das Mausprotein eine potentielle N-verknüpfte Glykosylierungsstelle an Aminosäure 2 (Asn).
Beispiel VIII: Vergleich von NNT-1 mit anderen Mitgliedern der Familie
Die Aminosäuresequenz von NNT-1 deutet an, daß das Protein zur Familie von CNTF (SEQ ID Nr. 12) gehört, welche IL-11 (SEQ ID Nr. 8), IL-6 (SEQ ID Nr. 9), Cardiotrophin (SEQ ID Nr. 11), Oncostatin (SEQ ID Nr. 13) und Granulozytenkolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF) (SEQ ID Nr. 10) beinhaltet. Wir haben die Aminosäuresequenz von NNT-1 mit allen Mitgliedern der Familie mit dem Computerprogramm PILEUP verglichen, und die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Wie für alle anderen Mitglieder dieser Familie wurde für die sekundäre Struktur des NNT-1-Proteins vorhergesagt, daß es vier anti-parallele alpha-Helices enthält.
Beispiel IX: Phänotyp von NNT-1-transgenen Mäusen
A. Phänotyp von NNT-1-transgenen Mäusen
Das Protein kodiert durch das NNT-1-Gen weist einige Homologie zu CNTF und in vitro Aktivität im Knochenmark und Nervenzell-Assays auf. Studien von Mäusen, die mit NNT-1-transfiziertem Knochenmark transplantiert wurden, zeigten milde Lymphoproliferation in Gastrointestinal-assoziierten lymphoiden Geweben, aber keine anderen offensichtlichen phänotypischen Veränderungen.
Material und Methoden
Behandlungsgruppen
Es wurden keine offensichtlichen Abnormalitäten in den beiden Gruppen detektiert.
Die oberflächliche Necropsie) wurde mit ausgewählten Geweben durchgeführt, fixiert in gepuffertem Zink-Formalin für die histopathologische Untersuchung (Gehirn, Herz, Nieren, Nebennieren, Duodenum, Pankreas, Blase, Leber, Lungen, Milz, jegliche grobe Läsionen). Die Gewebe wurden über Nacht vor dem histologischen Routine-Verfahren fixiert. Die Daten wurden unter der Verwendung des JMP-Softwareprogramms (SAS Institute, Cary, NC) analysiert.
Tests: Organgewicht, Körpergewicht, Histopathologie, Immunohistologie, Northern Blot.
Die folgenden Behandlungs-zugehörigen Veränderungen waren in den NNT-1-transgenen Mäusen vorhanden:
Die Milz hatte moderate bis merkliche reaktive lymphoide Hyperplasie (10), einschließlich der follikularen (B-Zell) und periarteriolaren (T-Zell) Gebiete in den transgenen Mäusen. Die lymphoide Hyperplasie war in der hohen Expressormaus #62 (10) am deutlichsten und korrelierte gut mit der Splenomegalie, die bei der Leichenschau gesehen wurde. Die andere hohe Expressormaus #60 hatte nur milde Hyperplasie in den lymphoiden Gebieten, begleitet von massiver diffuser extramedullarer Hämatopoiese bei allen drei Abstammungslinien. Obwohl es schwierig ist, allgemeine Rückschlüsse über die Effekte von NNT-1 auf die Milz auf der Basis dieser zwei hohen Expressormäusen zu ziehen, ist die Lymphoproliferation, gesehen in Maus #62, in Übereinstimmung mit unseren Befunden mit dem injizierten Protein (siehe Beispiel X A unten), während der EMH-Befund in Maus #60 eine in vivo Korrelation mit den vorherigen Befunden der in vitro Knochenmark-Kultur reflektieren könnte.
Die Leber von Maus #60 hatte multifocale Aggregate von Lymphozyten und Plasmazellen, die perivaskuläre Räume infiltrierten und in benachbarte Sinusoide in einem besonderen Muster expandierten, was intrahepatischen „Inseln von Lymphopoiese" ähnelt (12). Durch Immunohistochemie wurde gefunden, daß die lymphoiden Aggregate aus B220+-Zellen und CD3+-Zellen bestehen. Ähnliche, aber mildere und typischerweise perivaskuläre lymphoide Infiltrate wurden ebenso in Maus #62 gefunden. Andere Veränderungen, die in der Leber gefunden wurden, traten sporadisch in individuellen Mäusen in der Kontroll- und/oder transgenen Gruppe auf.
Der gastrointestinale Trakt wies minimale bis moderate reaktive lymphoide Hyperplasie der Peyer-Plaques (Darm-assoziiertes lymphoides Gewebe) auf. Ebenso waren die cervicalen und mesenterischen Lymphknoten reaktiver in den transgenen Mäusen als in den Kontrollen, obwohl diese Veränderung nicht so ein deutliches Merkmal dieser Studie im Vergleich zu unserer Studie mit dem injizierten NNT-1-Protein (siehe Beispiel X A unten) war.
Das Knochenmark, das zentrale und das periphere Nervensystem der transgenen Mäuse erschien normal. Im allgemeinen wurde die Veränderung in den anderen Geweben sporadisch in einem oder mehreren Tieren in der negativen Kontroll- und/oder transgenen Gruppen gefunden und wurde als nicht den Transgenen zugehörig interpretiert.
Die Daten dieser Studie zeigen an, daß die NNT-1 transgenen Mäuse einen interessanten Phänotyp haben, der charakterisiert ist durch die Proliferation von T- und B- Lymphozyten und Plasmazellen in vielen peripheren Geweben, umfassend die Milz, Lymphknoten, Darmassoziiertes lymphoides Gewebe, Nieren und Leber. NNT-1 kann auch extramedulare Hämatopoese in einigen peripheren Geweben, wie zum Beispiel der Milz und Pankreas, in der Abwesenheit von signifikanten Veränderungen in peripheren Blut und Knochenmark induzieren. Daher unterstützen die Daten der NNT-1-transgenen Mäuse im allgemeinen die Befunde von unserer 7-Tage-Mausstudie mit injizierbarem NNT-1-Protein (Beispiel X A unten), welches die Proliferation von lymphoiden Geweben ohne detektierbare Effekte am Knochenmark oder zentralem Nervensystem induziert.
Interessanterweise ähnelt die Glomerulonephritis, detektiert in den zwei hohen Expressor-NNT-1-transgenen weiblichen Mäusen, sehr der spontanen Glomerulonephritis, gesehen in den MRL/1pr (Fas-Mangel) Mäusen, welche ein frühes SLE-ähnliches Autoimmunsyndrom entwickeln, das mit polyklonaler B-Zell-Aktivierung, multiplen Autoantikörpern, zirkulierenden Immunkomplexen und Akkumulierung einer ungewöhnlichen Population von doppelt negativen (CD4- CD8- TCRab+ CD3+) T-Zellen assoziiert ist, die auch die CD45R-Isoform, genannt B220+, exprimieren, welche normalerweise ein Marker von B-Zellen ist (Singer et al., Curr. Opin. Immunol., 6:913-920, 1994). Überdies ähnlichen einige der biologischen Effekte von NNT-1 auch denjenigen von Interleukin-6, das (ähnlich CNTF, LIF und IL-11) den gp130 Signalling-Transducer verwendet und pleiotrophe Effekte auf die Leber, Niere, Gehirn, Haut, Immun- und hämatopoeitische Systeme hat (Ryffel et al., Int. Rev. Exp. Pathol., 34:A79-89, 1993). Daher wird es bedeutend sein, mittels Fluß-cytometrischer Analyse zu bestimmen, ob die Lymphozyten, die in peripheren Blut oder Geweben gefunden werden, einen ungewöhnlichen Phänotyp mit dualer Expression von T- und B-Zellenmarkern aufweisen.
B. FACS Immunophänotypisierung von NNT-1-transgenen Gründern
Analysierte Gewebe
Periphere Blutproben wurden über retro-orbitale Blutungen erhalten. Neun Proben von jeder Gruppe von Gründer-Wurfgeschwister-Kontrollen- und NNT-positiven (durch PCR) Mäusen wurden empfangen; keine wurde geronnen. Ungefähr 20 – 40 μl Blut pro Probe wurde zuerst mit Fc-Blockantikörper inkubiert, gefolgt durch fluoreszierende Antikörper für verschiedene Zelloberflächen-Antigene.
Antikörper wurden für Marker ausgewählt, um die meisten hämatopoietischen Zellpopulationen im zirkulierenden peripheren Blut zu unterscheiden. Ebenso wurden einige B- und T-Zell-Aktivierungs-/Differenzierungsmarker ausgewählt, basierend auf dem Ursprung der Bibliothek für diese exprimierten Sequenz-Tags (Est). Die Bibliothek wurde aus Jurkat-Zellen erstellt, einer T-Zellinie, aktiviert mit toxischem Schocksyndrom-Toxin (TSST).
Antikörper
Fc-Block (CD32/16) – als Teil der Prä-Inkubation, um nicht spezifische Bindung zu blockieren, insgesamt wurden 21 Antikörper verwendet. Daten wurden als Einzelfarben-Histogramme analysiert.
Ratten-IgG-Fluoresceinisothiocyanat (FITC) + Ratten-IgG-Phycoerythren (PE)
Ham IgG FITC + Ham IgG PE
CD45 FITC + GR-1 (CD97) PE – Pan Leukocyt vs Granulocyt
CD4 FITC + CD8 PE – T-Zell-Untergruppen Helfer vs Killer
Th1.2 FITC + B220 PE – T-Zell vs Pan B-Zellmarker
CD96 FITC + CD28 PE – Aktivierungsmarker für T- und B- oder nur T-Zellen
CD3 FITC + CTLA4 PE – Pan T-Zell vs T-Zell-Aktivierung
ckit FITC + Sca-1 PE – Myeloid- und Vorläufer-Zellen vs Vorläufer und periphäre Lymphozyten
CD40 FITC + CD40L PE – B-Zell-diff. Antigen vs T-Zell-Ligand für das gleiche
CD62 FITC + CD54 PE – Aktivierende Adhäsionsmoleküle auf B- und T-Zellen
CD34 FITC (Daten nicht analysiert)
Ergebnisse
Ein ausgeprägter Anstieg in absoluten Zellzahlen wurde für vier der NNT-1-positiven Tiere für B220+, CD40+, CD62L+ und CD54+-Zellen beobachtet.
Diese vier Tiere (#24, 35, 60, 62) wurden später als Expressoren durch Northern Blot bestätigt. Der Anstieg in B220+ und CD40+-Zellen reichte von 2 – 4-fach über der Kontrolle. CD62L+ (LECAM) und CD54+ (ICAM) reichte von 1,5 – 3-fach über der Kontrollgruppe. Marker, die einen Anstieg in drei der vier Expressoren zeigten, beinhalteten Sca-1 (2 – 6 mal Kontrolle) und ckit (2 -3 mal Kontrolle).
Zusätzliche Marker, beinhaltend CD3, CD4, CD8, Thyl, 2, zeigten bescheidene Anstiege in zwei der vier Expressoren, obgleich nicht auf eine konsistente Weise (obwohl dies alle T-Zellenmarker sind, waren nicht alle positiv in denselben Expressoren). GR1 zeigte einen Anstieg in einem der Expressoren, aber es gab eine noch höhere GR1+-Zellzahl in einem der Kontrolltiere, so daß dies wahrscheinlich nicht signifikant ist. Der Rest der Antikörper war entweder nicht positiv, nicht signifikant verschieden, oder, im Fall von CD34, unmöglich zu analysieren.
Zusammenfassung
Ein sehr deutlicher Anstieg in der absoluten Zahl zirkulierender lymphoider Zellen wurde in diesen Mäusen beobachtet. Dieser Anstieg in der lymphoiden Population scheint primär aus B-Zellen zu bestehen, obwohl etwas Anstieg in den T-Zellzahlen ebenso zu sehen war. Keine der lymphoiden Populationen scheint einen Anstieg in aktivierten Zelltypen zu zeigen. Ein kleiner bis kein Effekt kann bei der zirkulierenden myeloiden Zellpopulation gesehen werden. Anstiege in ckit und Sca-1 korrelieren nicht notwendigerweise mit einem Anstieg in Vorläuferzellen, da diese Marker ebenso an gereiften zirkulierenden Zellen gefunden werden.
Die Daten zeigen eine B-Zell-gerichtete Proliferation an, da diese Zellzahlen alle sehr gut mit der Expression korrelieren. Die Anstiege in einigen der T-Zellen der Tiere könnten ein sekundärer Effekt von einigen anderen Faktoren) sein, die durch die angestiegenen B-Zellen produziert werden. Eine interessante Beobachtung bezüglich der B-Zellen ist ein geringer aber sehr konsistenter Unterschied zwischen den Zahlen an B220+-Zellen und CD40+-Zellen. Obwohl beide B-Zell-Marker sind, wird CD40 auch auf dendritischen Zellen gefunden.
Beispiel X: Lymphoide Hyperplasie in Mäusen, injiziert mit NNT-1
A. Eine 7-Tage intravenöse/subkutane Forschungsstudie in NNT-1-behandelten BDF1 weiblichen Mäusen
Das Protein, das von NNT-1 kodiert wird, wies einige Homologie zu CNTF und in vitro Aktivität in Knochenmark- und Nervenzell-Assays auf. Das Ziel dieser Studie war es, die systemischen Effekte und potentielle Toxizität von NNT-1-Proteinen zu bestimmen, wenn es täglich an Mäuse für 7 Tage verabreicht wird.
Material und Methoden
Zwanzig 6-Wochen alte, weibliche BDF1-Mäuse wurden für diese Studie verwendet. Die Mäuse wurden zufällig in die folgenden Behandlungsgruppen (n=5/Gruppe) eingeteilt:

1. PBS-Puffer-Kontrolle (intravenöse Dosierung, einmal täglich für 7 Tage)
2. NNT-1, 1,5 mg/kg (intravenös)
3. NNT-1, 0,15 mg/kg (intravenös)
4. NNT-1, 1,5 mg/kg (subkutan)

Die Mäuse wurden nicht vor der oberflächlichen Necropsie fasten gelassen. Eine Stunde vor der Leichenschau (24 Stunden nach der letzten Dosierung) wurde den Mäusen eine intraperitoneale Injektion von BrdU (50 mg/kg für Zellproliferationsstudien) verabreicht. Blut wurde durch kardiale Punktur für die Bestimmung der Hämatologie (Hämoglobin, Hämatokrit, rote Blutzellzahl, Plättchenzahl, durchschnittliches Plättchenvolumen, gesamte und differentiale Leukozytenzahlen) und klinische Chemie-Parameter (Alanin, Aminotransferase, Aspartataminotransferase, alkalische Phosphatase, Laktatdehydrogenase, Glukose, Harnstoff, Nitrogen, Kreatinin, Gesamtprotein, Albumin, Globulin, Kalzium, Phosphor, Gesamtbilirubin, Harnsäure, Cholesterol und Triglyceride) erhalten.
Eine oberflächliche Necropsie wurde mit ausgewählten Geweben durchgeführt, fixiert in gepuffertem Zinkformalin für histopathologische Untersuchung [Nebennieren, Knochenmark, Knochen (Femur), Gehirn, Blinddarm, Dickdarm und distaler Darm, Duodenum, Esophagus, Herz, Ileum, Jejunum, Nieren, Leber, Lungen, Brustdrüsen, Eierstöcke, Pankreas, skeletaler Muskel, Haut, Milz, Magen, Thymus, Schilddrüsen, Luftröhre, Harnblase, Uterus, Vagina, weißes und braunes Fettgewebe, alle groben Läsionen]. Gewebe wurden über Nacht vor der routinehistologischen Bearbeitung fixiert. Organgewichte wurden für die Milz, Leber, Magen, Nieren und Thymus bestimmt.
Ergebnisse
Milz. Es gab prominente lymphoide Hyperplasie in der weißen Pulpa der Milz mit Vergrößerung der periateriolare lymphoiden Hüllen (T-Zellgebiete) und Folikel (B-Zellgebiete) in den NNT-1-behandelten Gruppen. Jedoch war das Ausmaß der extramedularen Hämatopoese nicht offensichtlich erhöht in diesen Gruppen, welches andeutet, daß dieses Protein einen stimulatorischen oder Wachstumsfaktor-ähnliche Effekte auf Lymphozyten eher als auf hämatopoietische Zellen in vivo haben könnte.
Lymphknoten. Die NNT-1-behandelten Mäuse hatten milde bis ausgeprägte reaktive lymphoide Hyperplasie der follikulären (B-Zell) und parakortikalen T-Zell) Gebiete des Lymphknotencortex. Obwohl diese Veränderung eine frühe Immunantwort auf das rekombinante Protein widerspiegeln könnte, schlägt der Grad der verallgemeinerten reaktiven lymphoiden Hyperplasie, die in der Milz, Lymphknoten, Peyer-Plaques und Knochenmark anwesend war, vor, daß dies ein spezifischer Behandlungs-bezogener Effekt von NNT-1 ist.
Zusammenfassung und Schlußfolgerungen
Der signifikanteste Befund, der aus dieser Studie abgeleitet wurde, ist, daß die NNT-1-Behandlung von Mäusen für sieben Tage die Proliferation von lymphoiden Geweben, insbesondere in der Milz und den Lymphknoten, zu induzieren scheint. Jedoch schien dieses Protein keine detektierbaren Effekte auf das hämatopoietische oder zentrale Nervensystem unter den Bedingungen dieser Studie zu haben.
B. FACS-Analyse von NNT-1 injizierten Mäusen
Reagenzien und Mäuse. Rekombinantes humanes NNT-1 und rhIL-1 waren von Amgen Inc., Thousand Oaks, CA. LPS (Escherichia coli 0111:B4) wurde von LIST Biologic Laboratories, Campbell, CA gekauft. Weibliche Balb/c Mäuse von ungefähr 20 g wurden von Charles River Laboratories, Wilmington, MA gekauft. Mäuse wurden in Räumen bei konstanter Temperatur und Feuchtigkeit gehalten und einem 12 Stunden hell/dunkel Zyklus ausgesetzt. Mäuse erhielten Standard-Labor-Ernährung und Wasser ad libitum. Verfahren, die Tiere und deren Behandlung beinhalteten, wurden in Übereinstimmung mit Institutsvorschriften, die in Einhaltung von nationalen und internationalen Gesetzen und Grundsätzen sind (U.S. National Research Council, Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 1996), durchgeführt.
Lymphknotengewicht und Zellzahlen. Für sieben aufeinander folgende Tage erhielten Mäuse eine tägliche i.p. Injektion von 5 mg/kg NNT-1 oder Puffer. 24 Stunden nach der siebten Injektion wurden die Mäuse für die Sammlung von peripheren (zervikalen und axyllaren) Lymphknoten getötet. Lymphknoten wurden zusammen gelegt, gewogen und homogenisiert, um eine Zellsuspension herzustellen. Zellen wurden danach mit einem Sismex-Zellzähler (Toa Medical Corporation, Kobe, Japan) gezählt, durch direkte IF unter der Verwendung eines Ratten-anti-Maus-anti-CD45R (anti-B220) MAb (Pharmingen, San Diego, CA) gefärbt und in einem FACSCAN unter der Verwendung der Cell Quest Software (Becton und Dickinson, San Jose, CA) analysiert.
Statistische Analyse. Ergebnisse wurden als Durchschnitt ± SD angegeben. TNF-Werte wurden log-transformiert, um deren verzerrte Verteilung zu verringern und um sie auf Normalität zu bringen. Der Shapiro-Wilks-Test wurde verwendet, um die Normalität ihrer Verteilung vor und nach der Transformation zu analysieren. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch den Studenten t-Test analysiert. Da BW wiederholt in jedem Individuum gemessen wurde, wurden die Differenzen in BW innerhalb und zwischen den Gruppen durch Analyse der Varianz (ANOVA) für wiederholte Messungen getestet.
Lymphknotengewicht und Zellzahlen. Die NNT-1-Behandlung erhöhte die Zahl von Gesamt- und CD45-positiven Zellen in peripheren Lymphknoten (17).
Beispiel XI: NNT-1 zeit in vivo Aktivitäten, charakteristisch für Zytokine der IL-6 Familie
Reagenzien, Mäuse und statistische Analysen sind wie in Beispiel X B oben dargelegt.
Serumamyloid A (SAA)-Induktion, Potenzierung von Corticosteron und IL-6 Induktion durch IL-1 und Inhibierung von LPS-induziertem TNF. NNT-1 wurde i.p. bei einer Dosis von 5 mg/kg allein oder in Assoziation mit IL-1 (100 ng/Maus) oder LPS (100 ng Maus) gegeben. Kontrollmäuse erhielten das Lösungsmittel von NNT-1 (10 mM Acetat in Saline). Blut wurde vom retro-orbitalen Plexus acht Stunden nach der Verabreichung von NNT-1 oder Saline zur SAA-Bestimmung, zwei Stunden danach für Corticosteron und IL-6, und 1,5 Stunden danach für TNF abgenommen. Experimente wurden an Gruppen von fünf oder zehn Mäusen durchgeführt.
SAA, IL-6 und TNF wurden in Serum durch ELISA unter der Verwendung kommerziell erhältlicher Kits (Biogen, Camarillo, CA) gemessen; Ergebnisse wurden in μg, ng bzw. pg/ml ausgedrückt. Coricosteron wurde durch RIA unter der Verwendung eines kommerziell erhält lichen Kits (ICB Biomedical, Costa Mesa, CA) gemessen; Ergebnisse wurden in ng/ml ausgedrückt.
SAA-Induktion Potenzierung von Coritcosteron und IL-6-Induktion durch IL-1 und Inhibierung von LPS-induziertem TNF. NNT-1 induzierte zirkulierende SAA (13).
NNT-1 potenzierte die Induktion durch eine niedrige Dosis von IL-1 von entweder Serum-Coticosteron oder von IL-6 (14 und 15). NNT-1 zeigte aber auch die Fähigkeit, die zirkulierenden Spiegel von Coticosteron anzuheben, wenn es allein injiziert wurde.
NNT-1 inhibierte die Induktion von LPS von Serum-TNF durch LPS (16).
Zusammenfassung der Ergebnisse
Inflammatorische Prozesse werden begleitet von der Produktion von TNF, einem Cytokin, das hauptsächlich für Gewebezerstörung und funktionelle Schädigung verantwortlich ist, welches die entzündungs-zugehörige Pathologie unterscheidet. Oftmals wird IL-1 mit TNF co-produziert und es wird auch angenommen, daß es ein pathogener Mediator während der Entzündung ist.
Coricosteroide sind Breitspektrum- und sehr starke anti-inflammatorische Mittel, die durch IL-1 über einen effizienten negativen Rückkopplungs-Kreislauf induziert werden.
Corticosteroide inhibieren TNF- und IL-1-Produktion. IL-6, welches ebenso durch TNF und IL-1 induziert wird, ist auch fähig, TNF- und IL-1-Produktion über einen anderen negativen Rückkopplungs-Kreislauf zu inhibieren.
Die Fähigkeit von NNT-1, Corticosterioide und IL-6 zu induzieren, zumindest in der Anwesenheit von IL-1, zeigt an, daß dieses Molekül die Fähigkeit zur Potenzierung von zwei physiologischen anti-inflammatorischen Kreisläufen hat. Dies könnte zu einer beschleunigten Inhibierung der Produktion von TNF und IL-1 und daher zu einer beschleunigten Auflösung von inflammatorischen Prozessen führen. Zusätzlich und unabhängig von der Induktion von Corticosteroiden und IL-6-Produktion zeigt NNT-1 die Eigenschaft, die TNF-Produktion di rekt zu blockieren. Dies addiert sich interessanterweise zu den anti-inflammatorischen Eigenschaften, wie oben ausgeführt.
Hinterlegung von DNA
E. coli-Zellen DH10B, beinhaltend den Vektor P1 kodierend die humane genomische DNA für NNT-1 (NNT-g-PI), und E. coli-Zellen DH10B, beinhaltend den Vektor PSPORT kodierend die humane cDNA für NNT-1, wurden bei der ATCC (American Type Culture Collection 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) am 21. Januar 1997 hinterlegt und ihnen wurden die Hinterlegungsnummern 98294 bzw. 98295 zugeordnet.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

NNT-1 Polypeptid, das die biologische Aktivität von Stimulieren des Wachstums von motorischen oder sympathischen Neuronen aufweist, ausgewählt aus (a) dem Polypeptid von SEQ ID Nr: 2 oder Nr: 5 (b) dem Polypeptid, das aus den Aminosäuren 1-198 von SEQ ID Nr: 2 oder Nr: 5 besteht (c) dem Polypeptid, das zu mindestens 70 Prozent identisch zu dem Polypeptid von (a) oder (b) ist, und (d) einem Fragment von einem von (a)-(c), das die biologische Aktivität aufweist.
NNT-1 Polypeptid, das die biologische Aktivität von Stimulieren des Wachstums von motorischen oder sympathischen Neuronen aufweist, das das Polypeptid von SEQ ID Nr: 2 oder Nr: 5 oder ein Fragment davon ist, das die biologische Aktivität aufweist.
NNT-1 Polypeptid nach Anspruch 2, das keine terminale Aminosäure Methionin besitzt.
NNT-1 Polypeptid nach Anspruch 2, das zusätzlich eine terminale Aminosäure Methionin besitzt.
Isolierter und gereinigter Antikörper oder ein Fragment davon, der/das spezifisch an ein Polypeptid bindet, das die biologische Aktivität von Stimulieren des Wachstums von motorischen oder sympathischen Neuronen aufweist, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus (a) dem Polypeptid von SEQ ID Nr: 2 oder Nr: 5 oder (b) dem Polypeptid, das aus den Aminosäuren 1-198 von SEQ ID Nr: 2 oder Nr: 5 besteht.
Isolierter und gereinigter Antikörper oder ein Fragment davon nach Anspruch 5, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, wobei das Polypeptid die biologische Aktivität von Stimulieren des Wachstums von motorischen oder sympathischen Neuronen aufweist, ausgewählt aus (a) dem Nukleinsäuremolekül von SEQ ID Nr: 1 (b) dem Nukleinsäuremolekül von SEQ ID Nr: 3 (c) dem Nukleinsäuremolekül von SEQ ID Nr: 4 (d) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das aus den Aminosäuren-27 bis 198 oder 1 bis 198 von SEQ ID Nr: 2 oder Nr: 5 besteht (e) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das zu mindestens 70 Prozent identisch zu dem Polypeptid von (d) oben ist, und (f) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Fragment eines Polypeptids von (d) oder (e) oben kodiert, wobei das Polypeptid die biologische Aktivität aufweist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül von SEQ ID Nr: 1.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül von SEQ ID Nr: 3.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid von SEQ ID Nr: 2 kodiert.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für die Aminosäuren 1 bis 198 von SEQ ID Nr: 2 kodiert.
Vektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 7 bis 11.
Wirtszelle, umfassend einen Vektor nach Anspruch 12.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, wobei das Polypeptid eine biologische Aktivität von Stimulieren des Wachstums von motorischen oder sympathischen Neuronen aufweist, umfassend die Schritte von: (a) Exprimieren eines Polypeptids, das durch eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 7 bis 11 kodiert wird in einem geeigneten Wirt, und (b) Isolieren des Polypeptids.
Verwendung eines NNT-1 Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten, der an einer neurologischen oder immunologischen Erkrankung oder Abweichung leidet.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Erkrankung oder Abweichung ausgewählt ist aus Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, amyothropher Lateralerkrankung, Sklerose, Charcot-Marie-Tooth Syndrom, Morbus Huntington, peripherer Neuropathie, Dystrophie oder Degeneration der neuralen Retina.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Erkrankung oder Abweichung durch eine Defizienz von B-Zellen oder T-Zellen gekennzeichnet ist.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Erkrankung oder Abweichung herkömmliche variable Immundefizienz (CVID), selektive IgA Defizienz, Hypogammaglobulinämie und X-gekoppelte Agammaglobulinämie ist.
Verwendung eines NNT-1 Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Medikaments zum Boosten der Immunreaktivität und Antikörperproduktion nach Impfung.
Verwendung eines NNT-1 Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Entzündungszustands in einem Patienten, der dieser Behandlung bedarf.