DE69827152T2

DE69827152T2 - Chemilumineszierende zusammensetzungen und entsprechende verfahren

Info

Publication number: DE69827152T2
Application number: DE69827152T
Authority: DE
Inventors: Hashem Akhavan-Tafti
Original assignee: Lumigen Inc
Current assignee: Lumigen Inc
Priority date: 1997-09-12
Filing date: 1998-08-12
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2018-08-13
Also published as: CA2300096C; AU733086B2; JP4790905B2; AU733086C; CA2300096A1; WO1999014358A1; ATE280241T1; AU8897598A; US5922558A; EP1019525A4; ES2230710T3; JP2001516589A; EP1019525A1; DE69827152D1; EP1019525B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft chemilumineszente Zusammensetzungen, die mit einer Peroxidase und einem Peroxid unter Erzeugung von Chemilumineszenz reagieren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, die neue elektronenreiche Alkene enthalten, die mit einer Peroxidase und einem Peroxid unter Bildung einer angeregten Carbonylverbindung reagieren. Die Erfindung betrifft ferner Assay-Verfahren zum Nachweis einer Peroxidase und zum Nachweis eines peroxidasemarkierten spezifischen Bindungspartners in Immun-Assays, Nucleinsäure-Sonden-Assays und dergleichen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Peroxidaseenzyme, wie Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase, HRP) werden häufig als Marker oder Markierungen in enzymgebundenen Assays für biologische Moleküle und andere Analyten von Interesse, wie Arzneimittel, Hormone, Steroide und Krebsmarker, eingesetzt. Der chemilumineszente Nachweis dieser Enzyme bietet ein sicheres, einfaches und empfindliches Mittel zur Bereitstellung eines quantitativen Maßes der Menge an Enzym in einer Probe oder der Menge an enzymmarkiertem Analyt oder markiertem spezifischem Bindungspartner für einen Analyten. Andere chemilumineszente Reaktionsschemata sind entwickelt worden, um die Menge bestimmter Peroxidaseenzyme zu quantifizieren.
a. Chemilumineszente Peroxidasesubstrate.
Aminosubstituierte zyklische Acylhydrazide, wie die bekannten Luminol und Isoluminol, reagieren mit H₂O₂ und einem Peroxidasekatalysator (wie Meerrettichperoxidase, HRP) unter basischen Bedingungen mit Emission von Licht. Diese Reaktion wurde als Basis für Analyseverfahren zum Nachweis von H₂O₂ und für die Peroxidase verwendet. Von heterocyclischen Analoga von Luminol, wie (8-Amino-5-chlor-7-phenylpyrido[3,4-d]-pyridazin-1,4(2H,3H)dion (M. Ii et al., Biochem.
Biophys. Res. Comm., 193(2), 540-5 (1993)); Pyridazinochinoxalinone (U.S.-Pat. Nr. 5,324,835) und 1,3-disubstituierte Pyrazolo[4',3':5',6']pyrido-[2,3-d]-pyrazindione (Y. Tominaga et al., Tetrahedron Lett., 36, 8641-4 (1995)) ist bekannt, dass sie mit einer Peroxidase und Peroxid unter Erzeugung von Chemilumineszenz reagieren. Andere Hydrazidverbindungen, die chemilumineszent sind, wenn sie durch eine Peroxidase und ein Peroxid oxidiert werden, sind hydroxysubstituierte Phthalhydrazide (U.S.-Pat. Nr. 5,552,298).
Die U.S.-Patente Nr. 5,491,072, 5,523,212 und 5,593,845 des Anmelders offenbaren chemilumineszente N-Alkylacridancarbonsäureester, -thioester und -sulfonimide, die nach Reaktion mit einem Peroxid und einer Peroxidase Licht erzeugen, zur Verwendung zum Nachweis von Peroxidasen und in Assays. Eine PCT-Anmeldung (WO 94/02486) beschreibt die chemilumineszente Reaktion von Spiroacridanverbindungen mit Wasserstoffperoxid. Die Reaktion wird durch Zugabe von Meerrettichperoxidase verstärkt.
Verschiedene Verbindungen biologischen Ursprungs, die insgesamt als Luciferine bezeichnet werden, werden durch eine Peroxidase oxidiert (in L.J. Kricka und G.H.G. Thorpe, in Luminescence Immunoassay and Molecular Applications, K. Van Dyke und R. Van Dyke, Hrsg., CRC Press, Boca Raton, 1990, S. 77-98 zusammengefasst). In einigen Fälle wird kein Wasserstoffperoxid verwendet; das Enzym wirkt dann als eine Oxidase.
Bestimmte Phenolverbindungen erzeugen Chemilumineszenz bei Oxidation mit einer Peroxidase. Als Beispiele werden Pyrogallol B-1 und Purpurogallin B-2 in Kricka und Thorpe, s.o., sowie die Verbindungen des Cumarintyps Cumarin, Umbelliferon und Esculin (D. Slawinska, J. Slowinski, J. Biolumin. Chemilumin., 4, 226-30 (1989)); Phloroglucinol B-3 (M. Halmann et al., Photochem. Photobiol., 30, 165-7 (1979)) und Acetaminophen B-4 (K. Schmitt, G. Cilento, Photochem. Photobiol., 51, 719-23 (1990)) genannt.
Andere vermischte Verbindungen, von denen berichtet wird, dass sie in Gegenwart von Sauerstoff oder Peroxid und einer Peroxidase eine schwache Chemilumineszenz erzeugen, sind ein eine synthetische Schiff-Base enthaltendes Polymer (R. Zoulik et al., Coll. Czech. Chem. Commun., 60, 95-103 (1995)); Indol-3-essigsäure in Gegenwart von Xanthen-Farbstoffen mit oder ohne Wasserstoffperoxid (S. Krylov, A. Chebotareva, FEBS, 324(1), 6-8 (1993); Tyrosin, Tryptophan und Chlorpromazin (M. Nakano, J. Biolumin. Chemilumin. 4, 231-40 (1989)) sowie MCLA B-8 (M. Mitani et al., J. Biolumin. Chemilumin. 9, 355-61 (1994)), die jeweils die nachstehend gezeigten Strukturen B-5 bis B-8 aufweisen.
Keine der vorstehenden Bezugsstellen offenbart die chemilumineszente Oxidation der erfindungsgemäß offenbarten Verbindungen durch eine Peroxidase.
b. Realtion von Enolen mit HRP.
Eine Reihe von Artikeln beschreibt die peroxidasekatalysierte Luftoxidation enolisierbarer Aldehyde (H. Gallardo et al., Biochim. Biophys. Acta, 789, 57-62 (1984); W.J. Baader et al., Biochem. Ed., 14(4), 190-2 (1986); I. Nantes et al., Photochem. Photobiol., 63(6), 702-8 (1996)). Es wird angenommen, dass das reaktive Substrat die kleine Menge der Enolform im Gleichgewicht mit dem Aldehyd ist. Die Reaktion des Aldehyds wird durch Enolphosphate katalysiert, aber das Enolphosphat wird selbst nicht verbraucht. Die Bezugsstelle lehrt, dass das Enolphosphat nicht mit einer Peroxidase unter Erzeugung von Chemilumineszenz reagiert. Energietransfer auf fluoreszierende Energieakzeptoren erhöhte die Lichtemission (M.T. Grijalba et al., Photochem. Photobiol., 63(6), 697-701 (1996)). Als Enolsilylether maskierte Aldehyde (Baader, s.o.) oder Enolacetate wurden in gekoppelten Assays verwendet, in denen das Enol in einem ersten Schritt demaskiert wurde, um ein Enol in situ zu erzeugen, das anschließend zur Erzeugung von Chemilumineszenz mit einer Peroxidase reagierte (A. Campa et al., Photochem. Photobiol., 63(6), 742-5 (1996)).
c. Peroxidase-Enhancer.
Zahlreiche Enhancer wurden eingesetzt, um die Quantität und Dauer der Chemilumineszenz aus der Reaktion von Peroxidasen mit bekannten chemilumineszenten Substraten, einschließlich des vorstehend genannten Luminols und der Acridancarbonsäure-Derivate, zu erhöhen. Dazu gehören Benzothiazol-Derivative, wie D-Luciferin, verschiedene Phenolverbindungen, wie p-Iodphenol, p-Phenylphenol, Naphthole und aromatische Amine, die in G. Thorpe, L. Kricka, in Bioluminescence and Chemiluminescence, New Perspectives, J. Scholmerich et al., Hrsg., S. 199-208 (1987) aufgelistet sind. Andere Verbindungen, die als Enhancer der chemilumineszenten Oxidation aminosubstituierter cyclischer Acylhydrazide durch ein Peroxidase wirken, umfassen 4-(4-Hydroxyphenyl)-thiazol (M. Ii, s.o.), eine Gruppe von Verbindungen, die im U.S.-Pat. Nr. 5,171,668 offenbart ist, 2-Hydroxy-9-fluorenon und eine Gruppe hydroxysubstituierter Benzoxazol-Derivative, wie im U.S.-Pat. Nr. 5,206,149 offenbart, sowie bestimmte Phe nylborsäureverbindungen, wie im U.S.-Pat. Nr. 5,629,168 beschrieben. Keine der vorstehenden Bezugsstellen offenbart die chemilumineszente Oxidation der erfindungsgemäßen Verbindungen durch eine Peroxidase allein oder unter Verwendung von Enhancern.
d. Verstärkung der chemilumineszenten Peroxidasereaktionen durch Tenside.
Die Verstärkung der in peroxidasekatalysierten Reaktionen erzeugten Chemilumineszenz unter Verwendung polymerer und monomerer Tenside ist im Stand der Technik bekannt. Die Verstärkung kann durch Beeinflussung des Ergebnisses eines oder mehrerer Schritte erfolgen, z.B. durch Erhöhen der Fluoreszenzquantenausbeute der emittierenden Substanz, durch Erhöhen des Prozentanteils an Produktmolekülen im angeregten Zustand, die erzeugt werden, durch Erhöhen des Anteils an Molekülen, die der chemilumineszenten Reaktion unterliegen, durch Hemmung konkurrierender Nebenreaktionen oder durch Fördern der Wirkung eines Enzymkatalysators. Es existiert kein eindeutiges Muster hinsichtlich der Wirkung polymerer und monomerer Tenside auf chemilumineszente Reaktionen. Es ist unmöglich vorherzusagen, welche Tensidverbindungen, wenn überhaupt, die Chemilumineszenz aus einem bestimmten Prozess verstärken, und kann nur durch beträchtliche Experimente bestimmt werden.
Das kationische polymere Tensid Poly-N-ethyl-4-vinylpyridiniumbromid hemmte die chemilumineszente Reaktion von Luminol durch ein negativ geladenes Insulin-Peroxidase-Konjugat vollkommen und verminderte die Chemilumineszenz in einem geringeren Ausmaß, wenn das native Enzym verwendet wurde (S.B. Vlasenko et al., J. Biolumin. Chemilumin., 4, 164-176 (1989)).
Eine veröffentlichte japanische Pat.-Anmeldung Nr. JP 06,242,111 und ein Artikel (R. Iwata et al., Anal. Biochem., 231, 170-4 (1995)) offenbaren die Verwendung von nichtionischem Tensid und Magermilch bei der chemilumineszenten Peroxidation von Luminol zur Senkung der Hintergrundemission oder zur Verstärkung von Signal/Rauschen.
Keine der vorstehenden Bezugsstellen offenbart die chemilumineszente Oxidation der erfindungsgemäßen Verbindungen durch eine Peroxidase oder die Chemilumineszenzverstärkung mit Tensiden.
d. Tests unter Verwendung von HRP.
Das Enzym Meerrettichperoxidase hat in Enzym-Immun-Assays und DNA-Hybridisierungsassays mit Chemilumineszenznachweis unter Verwendung von Luminol oder Isoluminol als Substrat weitverbreitete Anwendung gefunden. Kommerziell erhältliche Kits, die HRP-Konjugate und einen verstärkten Luminol-Chemilumineszenznachweis einsetzen, sind erhältlich. Chemilumineszente Peroxidase-Assays sind auch in den vorstehend genannten U.S.-Patenten Nr. 5,491,072, 5,523,212 und 5,593,845 offenbart. Keine Bezugsstellen offenbaren die chemilumineszenten Peroxidase-Assays, die die erfindungsgemäßen Verbindungen als Substrate verwenden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen bereitzustellen, die Verbindungen erhalten, die mit einer Peroxidase und einem Peroxid reagieren, um Chemilumineszenz bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen, die Verbindungen enthalten, die mit einer Peroxidase und einem Peroxid unter Bereitstellung von Chemilumineszenz reagieren, zum Nachweis der Peroxidase bereitzustellen.
Es ist ebenfalls eine Ausgabe der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen bereitzustellen, die Verbindungen der Formel I enthalten, die eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung enthalten, die an einem Ende der Doppelbindung mit zwei Atomen, ausgewählt aus Sauerstoff oder Schwefel, substituiert sind, die jeweils an eine andere Gruppe X oder R¹ gebunden sind, und die am anderen Ende der Doppelbindung mit zwei Gruppen A¹ und A² substituiert sind, die derart ausgewählt sind, dass nach Reaktion von I mit einer Peroxidase und einem Peroxid ein angeregtes Produkt A¹A²C = O* entsteht.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen bereitzustellen, die Verbindungen der Formel I enthalten, wobei A¹ und A² zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, einen heterocyclischen oder carbocyclischen Ring bilden. Insbesondere kann der Ring eine stickstoff-, schwefel- oder sauerstoffhaltige heterocyclische Ringgruppe sein.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen bereitzustellen, die Verbindungen der Formel I enthalten, wobei, wenn Z²O ist, die an das Sauerstoffatom gebundene Gruppe Teil einer Alkoxygruppe, einer Aryloxygruppe, einer Aralkyloxygruppe, einer Phosphatmono-, -di- oder -triestergruppe, einer Carbonsäureestergruppe, einer Sulfatgruppe, einer Zuckergruppe oder einer Silylethergruppe ist, und wenn Z²S ist, die an das Schwefelatom gebundene Gruppe Teil der entsprechenden Thiogruppen ist.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Erzeugung von Chemilumineszenz nach Reaktion mit einer Peroxidase und einem Peroxid unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen bereitzustellen.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und Zusammensetzungen zur Verstärkung der Chemilumineszenz, die bei Reaktion von erfindungsgemäßen Verbindungen mit einer Peroxidase erzeugt wird, bereitzustellen.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, chemilumineszente Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung beim Nachweis von Peroxidasen und Konjugaten in Immun-Assays, Nucleinsäure-Sonden-Assays, Western-Blot-Assays, Southern-Blot-Assays und anderen Assays durch allgemein bekannten Verfahren, die Enzymmarkierungen zum Nachweis von Analyten verwenden, bereitzustellen. Somit eignen sich die Assays zum Nachweis von Analyten in solchen Assays durch Nachweisen der Peroxidase oder des Konjugats und Inbezugsetzen der dadurch erzeugten Chemilumineszenz mit dem Vorhandensein oder mit der Menge des Analyten.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Graph, der die Menge an HRP zu der bei Raumtemperatur ausgelösten Chemilumineszenzintensität bei 15 min, die von 100 μl eines im Beispiel 20 beschrie benen Reagenzes, das Acridanphosphat 5 enthält, emittiert wird, in Beziehung setzt. Die Chemilumineszenzemission wurde durch Zugabe von 10 μl HRP-Lösungen, die zwischen 1,4 × 10^-15 und 1,4 × 10^-19 mol Enzym enthielten, zu 100 μl des Reagenzes, das 0,055 M Tris-Puffer, pH 8,6, 0,25 mM Harnstoffperoxid, 0,05 mM p-Phenylphenol, 0,5 mM EDTA, 0,0125% Tween 20 und 3,3 × 10^-4 M Acridan 5 enthielt, in den Vertiefungen einer schwarzen Mikrotiterplatte eingeleitet. Der Begriff S-B bezieht sich auf das Chemilumineszenzsignal (S) in relativen Lichteinheiten (RLU) in Gegenwart von HRP, das hinsichtlich der Hintergrund-Chemilumineszenz (B) in Abwesenheit von HRP korrigiert wurde.
2 ist ein Graph, der die Menge an HRP zu der bei Raumtemperatur ausgelösten Chemilumineszenzintensität bei 15 min, die von 100 μl eines im Beispiel 21 beschriebenen Reagenzes, das Acridanphosphat 13 enthält, in Beziehung setzt. Die Chemilumineszenzemission wurde durch Zugabe von 10 μl HRP-Lösungen, die zwischen 1,4 × 10^-15 und 1,4 × 10^-19 mol Enzym enthielten, zu 100 μl eines Reagenzes, das 0,055 M Tris-Puffer, pH 8,6, 0,25 mM Harnstoffperoxid, 0,05 mM p-Phenylphenol, 0,5 mM EDTA, 0,0125% Tween 20 und 3,3 × 10^-4 M Acridan 13 enthielt, in den Vertiefungen einer schwarzen Mikrotiterplatte eingeleitet.
3 ist ein Graph, der das Zeitprofil der Chemilumineszenz zeigt, die sich aus der Reaktion von 1,4 × 10^-15 mol HRP bei 25°C mit 100 μl des im Beispiel 20 beschriebenen Reagenzes, das Acridan 5 enthält, ergibt.
4 ist ein Graph, der die Menge an HRP zu der bei Raumtemperatur ausgelösten maximalen Chemilumineszenzintensität bei 2 min, die von 100 μl eines Reagenzes, das Acridan 37 enthält, emittiert wird, in Beziehung setzt. Die Chemilumineszenzemission wurde durch Zugabe von 10 μl HRP-Lösungen, die zwischen 1,4 × 10^-14 und 1,4 × 10^-19 mol enthielten, zu 100 μl Reagenzzusammensetzung, die 0,01 M Tris-Puffer, pH 8,0, 0,5 mM Harnstoffperoxid, 0,1 mM p-Phenylphenol, 1 mM EDTA, 0,025% Tween 20 und 5 × 10^-5 M Acridan 37 enthielt, eingeleitet.
5 ist ein Graph, der das Zeitprofil der Chemilumineszenz zeigt, die sich aus der Reaktion von 1,4 × 10^-15 mol HRP bei 25°C mit 40 μl des eines Reagenzes, das 0,01 M Tris-Puffer, pH 8,0, 0,5 mM Harnstoffperoxid, 0,1 mM p-Phenylphenol, 1 mM EDTA, 0,025% Tween 20 und 5 × 10^-5 M Acridan 38 enthielt, ergibt. Die Lichterzeugung begann nach Mischen und erreichte nach 1 min maximale Intensität.
6 ist ein Graph, der die Menge an HRP zu der bei Raumtemperatur ausgelösten maximalen Chemilumineszenzintensität bei 30 min, die von 100 μl eines Reagenzes, das Acridan 39 enthält, emittiert wird, in Beziehung setzt. Die Chemilumineszenzemission wurde durch Zugabe von 10 μl HRP-Lösungen, die zwischen 1,4 × 10^-15 bis 1,4 × 10^-20 mol enthielten, zu 100 μl Reagenzzusammensetzung, die 0,01 M Tris-Puffer, pH 8,0, 0,5 mM Harnstoffperoxid, 0,1 mM p-Phenylphenol, 1 mM EDTA, 0,025% Tween 20 und 5 × 10^-5 M Acridan 39 enthielt, eingeleitet.
7 ist ein Graph, der das Zeitprofil der Chemilumineszenz zeigt, die sich aus der Reaktion von 3,5 × 10^-16 mol HRP bei 25°C mit 100 μl eines Reagenzes, das 0,01 M Tris-Puffer, pH 8,0, 0,5 mM Harnstoffperoxid, 0,1 mM p-Phenylphenol, 1 mM EDTA, 0,025% Tween 20 und 5 × 10^-5 M Acridan 50 enthielt, ergibt. Die Lichterzeugung begann nach Mischen und erreichte nach 7 min maximale Intensität.
8 ist ein Graph, der die Menge an HRP zu der bei Raumtemperatur ausgelösten maximalen Chemilumineszenzintensität bei 15 min, die von 100 μl eines Reagenzes, das Acridan 43 enthält, emittiert wird, in Beziehung setzt. Die Chemilumineszenzemission wurde durch Zugabe von 10 μl HRP-Lösungen, die zwischen 1,4 × 10^-15 bis 1,4 × 10^-19 mol enthielten, zu 100 μl einer Reagenzzusammensetzung, die 0,055 M Tris-Puffer, pH 8,6, 0,25 mM Harnstoffperoxid, 0,05 mM p-Phenylphenol, 0,5 mM EDTA, 0,0125% Tween 20, 1 mM CTAB und 6,6 × 10^-4 M Acridan 43 enthielt, eingeleitet.
9 ist ein Graph, der die Verstärkung der Chemilumineszenz durch Verwendung eines fluoreszierenden Energietransfermittels demonstriert. Reagenzzusammensetzungen, die 0,055 M Tris-Puffer, pH 8,6, 0,25 mM Harnstoffperoxid, 0,05 mM p-Phenylphenol, 0,5 mM EDTA, 0,0125% Tween 20, 1 mM CTAB und 3,3 × 10^-4 M Verbindung 46 allein oder mit 50 μM DBA umfassten, wurden hinsichtlich der Erzeugung von Chemilumineszenz getestet, indem ein 100-μl-Aliquot mit 3,5 × 10^-15 mol HRP umgesetzt wurde.
10 ist ein Graph, der das Zeitprofil der Chemilumineszenz zeigt, die sich aus der Reaktion von 3,5 × 10^-15 mol HRP bei 25°C mit 100 μl des eines Reagenzes, das 0,055 M Tris-Puffer, pH 8,6, 0,25 mM Harnstoffperoxid, 0,05 mM p-Phenylphenol, 0,5 mM EDTA, 0,0125% Tween 20 und 3,3 × 10^-4 M Verbindung 48 enthielt, ergibt.
11 ist ein Graph, der das Zeitprofil der Chemilumineszenz zeigt, die sich aus der Reaktion von 3,3 × 10^-15 mol HRP bei 25°C mit 100 μl des eines Reagenzes, das 0,055 M Tris-Puffer, pH 8,6, 0,25 mM Harnstoffperoxid, 0,05 mM p-Phenylphenol, 0,5 mM EDTA, 0,0125% Tween 20 und 3,3 × 10^-4 M Verbindung 49 enthielt, ergibt.
12 ist ein Bild eines Röntgenfilms aus einem Western-Blot-Assay von β-Galactosidase über einen HRP-markierten Antikörper auf einer PVDF-Membran mit einer chemilumineszenten Reagenzzusammensetzung. Verdünnungen von β-Galactosidase, die 5000, 1000, 180, 30 bzw. 5 pg Protein enthielten, wurden mit einem Reagenz nachgewiesen, das 0,055 M Tris-Puffer, pH 8,6, der 0,66 mM Acridanphosphat 5, 0,05 mM p-Phenylphenol, 0,25 mM Harnstoffperoxid, 0,5 mM EDTA, 0,0125% Tween 20 enthielt, umfasste, durch Exponieren der Membran mit einem Röntgenfilm für 30 s nach einer 14-minütigen Inkubation nachgewiesen.
13 ist ein Bild eines Röntgenfilms aus einem ähnlichen Western-Blot-Experiment unter Verwendung einer Nitrocellulosemembran. Das Bild wurde durch Exponieren der Membran mit einem Röntgenfilm für 5 min nach einer 10-minütigen Inkubationszeit erhalten.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Definitionen:

Alkyl – Eine verzweigte, geradkettige oder cyclische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1-20 Kohlenstoffatomen. Niederalkyl, wie hier verwendet, bezieht sich auf Alkylgruppen mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen.
Alkenyl – Eine verzweigte, geradkettige oder cyclische Kohlenwasserstoffgruppe mit mindestens einer C-C-Doppelbindung und 2-20 Kohlenstoffatomen. Niederalkenyl, wie hier verwendet, bezieht sich auf Alkenylgruppen mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen.
Alkinyl – Eine verzweigte oder geradkettige Kohlenwasserstoffgruppe mit mindestens einer C-C-Dreifachbindung und 2-20 Kohlenstoffatomen. Niederalkinyl, wie hier verwendet, bezieht sich auf Alkinylgruppen mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen.
Analyt – Eine Substanz, deren Vorhandensein oder Menge in einer Probe durch einen Assay gemessen werden soll. Analyten umfassen organische und biologische Moleküle, zu denen es einen spezifischen Bindungspartner mit einer spezifischen Bindungsaffinität gibt. Beispielhafte Analyten umfassen, ohne Beschränkung, einzelsträngige oder doppelsträngige DNA, RNA, DNA-RNA-Komplexe, Oligonucleotide, Antikörper, Antikörperfragmente, Antikörper-DNA-Chimären, Antigene, Haptene, Proteine, Lektine, Avidin, Streptavidin und Biotin. Andere beispielhafte Analyten umfassen ferner hydrolytische Enzyme, Inhibitoren hydrolytischer Enzyme und dihydroxyaromatische Verbindungen.
Aryl – Eine einen aromatischen Ring enthaltende Gruppe mit 1 bis 5 carbocyclischen aromatischen Ringen, die mit 1 oder mehr von H verschiedenen Substituenten substituiert sein kann.
Biomedizinische Analyse – Analysen von Proben biologischen Ursprungs im Hinblick auf Analyten von Interessen. Die Analysen können Immun-Assays, Western-Blots, Norihern-Blots, Southern-Blots, DNA-Hybridisierungsassays, DNA-Sequenzanalyse, Koloniehybridisierungen, Genexpressionsanalyse, Arzneimittel-Screening mit hohem Durchsatz, Nachweis von Infektionserregern oder Pathogenen und dergleichen sein.
Glycosyl – Reste von Kohlenhydratgruppen, einschließlich Hexosen und Pentosen, die eine oder mehr Zuckereinheiten enthalten. Beispiele umfassen Fructose, Galactose, Glucose, Glucuronat, Mannose, Ribose, N-Acetylglucosamin und dergleichen.
Halogen –Fluor-, Chlor-, Brom- oder Iodatome.
Heteroaryl – Eine einen aromatischen Ring enthaltende Gruppe mit 1 bis 5 carbocyclischen aromatischen Ringen, in der mindestens eines der Ring-Kohlenstoffatome durch einStickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatom ersetzt ist und die mit 1 oder mehr von H verschiedenen Substituenten substituiert sein kann.
Lumineszent – In der Lage zur Aussendung von Licht, wenn in einen angeregten Elektronenzustand angeregt. Das Licht kann entweder als Fluoreszenz, wenn es vom Zurückfallen von einem angeregten Singulett-Zustand stammt, oder als Phosphoreszenz, wenn es vom Zurückfallen von einem angeregten Triplett-Zustand stammt, emittiert werden.
Peroxid – Eine Verbindung mit einer O-O-Bindung, vorzugsweise Wasserstoffperoxid oder ein Komplex von Wasserstoffperoxid, wie Harnstoffperoxid, Perborat oder Percarbonat.
Probe – Eine Flüssigkeit, die einen oder mehrere zu testende Analyten enthält oder von der angenommen wird, dass sie sie enthält. Übliche Proben, die durch das chemilumineszente Reaktionsverfahren analysiert werden, sind biologische Proben, einschließlich Zelllysate,Körperflüssigkeiten, wie Blut, Plasma, Serum, Urin, Samen, Speichel, Gewebeextrakte und dergleichen. Andere Arten von Proben umfassen Nahrungsproben und Umweltproben, wie Boden oder Wasser.
Spezifisches Bindungspaar – Zwei Substanzen, die eine gegenseitige BindungsaffiAntigen-Antikörper-,nität aufweisen. Beispiele umfassen Hapten-Antikörper- oder Antikörper-Antikörper-Paare, komplementäre Oligonucleotide oder Polynucleotide, Avidin-Biotin, Streptavidin-Biotin, Hormon-Rezeptor, Lektin-Kohlenhydrat, IgG-Protein A, Nucleinsäure-Nucleinsäurebindungsprotein und Nucleinsäure-anti-Nucleinsäure-Antikörper.
Substituiert – Bezieht sich auf den Ersatz mindestens eines Wasserstoffatoms an einer Gruppe durch eine von Wasserstoff verschiedene Gruppe. Es sollte beachtet werden, dass bei Hinweisen auf substituierte Gruppe beabsichtigt ist, dass mehrfache Stellen von Substitutionen vorhanden sein können, wenn nicht deutlich anders angegeben.

Es wurde unerwarteterweise entdeckt, dass Verbindungen der nachstehenden Formel I mit einem Peroxid und einer Peroxidase unter Erzeugung von Chemilumineszenz reagieren. Erfindungsgemäße Verbindungen, die in Gegenwart einer Peroxidase Chemilumineszenz erzeugen, umfassen eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung, die an einem Ende der Doppelbindung mit zwei Atomen substituiert sind, ausgewählt aus Sauerstoff- und Schwefelatomen, und die die Formel I haben:
wobei Z¹ und Z² unabhängig aus O- und S-Atomen ausgewählt sind, R¹ eine organische Gruppe mit von 1 bis etwa 50 Nicht-Wasserstoffatomen ist, X eine Gruppe mit von 1 bis etwa 50 Nicht-Wasserstoffatomen ist und A¹ und A² Gruppen sind, die derart ausgewählt sind, dass nach Reaktion von I mit einer Peroxidase gemäß der nachstehenden Umsetzung ein Produkt mit angeregtem Elektronenzustand A¹A²-C = O* entsteht.
Die Gruppen A¹, A², Z¹, Z², X und R¹ werden derart ausgewählt, dass die erhaltene Verbindung I eine elektronenreiche C-C-Doppelbindung besitzt. Allgemein haben die meisten Verbindungen der allgemeinen Formel I, worin Z¹ und Z² aus O- und S-Atomen ausgewählt sind, eine ausreichend elektronenreiche C-C-Doppelbindung. Verbindungen, in denen A¹ und/oder A² stark elektronenanziehende Gruppen sind, können nicht wirken und sind nicht bevorzugt.
Die Gruppe R¹ kann jede organische Gruppe mit 1 bis etwa 50 Nicht-Wasserstoffatomen, die aus C, N, O, S, P, Si und Halogenatomen ausgewählt sind, sein, die Lichterzeugung gestattet. Letzteres bedeutet, dass, wenn eine Verbindung der Formel I mit einer Peroxidase und einem Peroxid umgesetzt wird, das Licht erzeugt wird und die Erzeugung von einem oder mehreren chemilumineszenten Zwischenprodukten umfassen kann. Gruppen, die als Gruppe R¹ wirken können, umfassen, ohne Beschränkung, Alkyl-, substituierte Alkyl-, Aryl-, substituierte Aryl-, Aralkyl- und substituierte Aralkylgruppen. Von H-Atomen verschiedene Substituentengruppen, wie ionische Gruppen oder polare Gruppen, können in unterschiedlichen Anzahlen und an ausgewählten Positionen an der Kohlenstoffkette oder dem Ring von R¹ eingebracht werden, um die Eigenschaften der Verbindung zu modifizieren oder eine leichte Synthese bereitzustellen. Solche Eigenschaften umfassen beispielsweise Chemilumineszenzquantenausbeute, Geschwindigkeit der Reaktion mit dem Enzym, maximale Intensität der Lichtemission, Dauer der Lichtemission, Wellenlänge der Lichtemission, Löslichkeit im Reaktionsmedium. Eine oder mehrere Gruppen, die eine kovalente Kopplung an ein anderes Molekül ermöglichen, wie einen spezifischen Bindungspartner, können ebenfalls als Substituenten an R' bereitgestellt werden. Beispielhafte spezifische Substituenten und ihre Wirkungen sind in den nachstehenden spezifischen Beispielen veranschaulicht, die jedoch den Umfang der Erfindung nicht beschränken.
Die Gruppe X wird aus substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, substituierten oder unsubstituierten Aryl-, substituierten oder unsubstituierten Aralkylgruppen mit 1-20 Kohlenstoffatomen, substituierten oder unsubstituierten Alkyl- oder Arylcarbonylgruppen mit von 1-20 Kohlenstoffatomen, Tri-(C₁-C₈-alkyl)silylgruppen, einer SO₃ ^--Gruppe, Glycosylgruppen und Phosphorylgruppen der Formel PO(OR')(OR'') ausgewählt, wobei R' und R'' unabhängig aus substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, substituierten oder unsubstituierten Aryl- und substituierten oder unsubstituierten Aralkylgruppen mit 1-20 Kohlenstoffatomen, Trialkylsilylgruppen, Alkalimetallkationen, Erdalkalikationen, Ammonium- und Phosphoniumkationen ausgewählt sind. Substituierte Alkylgruppen enthalten mindestens eine von einem Wasserstoffatom verschiedene Gruppe, wie ionische Gruppen oder polare Gruppen, und können an ausgewählten Positionen der Kohlenstoffkette oder des Rings von R' oder R'' eingebracht werden, um die Eigenschaften der Verbindung I zu modifizieren oder eine leichte Synthese bereitzustellen. Beispielhafte substituierte Alkylgruppen umfassen eine Cyanoethylgruppe oder eine Trimethylsilylethyl-gruppe.
Die Gruppen A¹ und A² werden unabhängig aus Wasserstoff oder organischen Gruppen ausgewählt, die nach Reaktion von Verbindung I mit Peroxid und einer Peroxidase ein Produkt mit angeregtem Elektronenzustand A¹A²C = O* bilden, einschließlich, ohne Beschränkung, Wasserstoff, Alkyl-, substituierter Alkyl-, Aryl-, substituierter Aryl-, Aralkyl- und substituierter Aralkylgruppen, Heteroaryl-, substituierter Heteroaryl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Alkylamino-, Arylamino-, Alkylthio- und Arylthiogruppen, vorausgesetzt dass mindestens eine nicht Wasserstoff ist. Die Gruppen A¹ und A² können zusammen unter Bildung eines heterocyclischen oder carbocyclischen Rings verbunden sein, der das Kohlenstoffatom enthält, das A¹ und A² trennt. Im Allgemeinen enthalten die Gruppen A¹ und A² von 1-50 Nicht-Wasserstoffatome, die aus C, N, O, S, P und Halogenen ausgewählt sind, und üblicher von 1-20 Nicht-Wasserstoffatome.
In einer ersten Gruppe bevorzugter Verbindungen der Formel I ist eines von A¹ und A² eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe und das andere ist aus Alkyl, substituiertem Alkyl, Aryl, substituiertem Aryl, Aralkyl, substituiertem Aralkyl, Heteroaryl, sub stituiertem Heteroaryl, Alkenyl, Alkinyl, Alkoxy, Aryloxy, Alkylamino, Arylamino, Alkylthio und Arylthio ausgewählt. Vorzugsweise ist mindestens eine der Arylgruppen mit mindestens einer Gruppe substituiert, die aus Amino, Alkylamino, Dialkylamino und OY' ausgewählt ist, wobei Y' ein Wasserstoffatom oder ein Alkalime-tallion ist. Die Arylgruppe umfasst 1-4 kondensierte carbocyclische oder heterocyclische 5- oder 6-gliedrige Ringe. Wenn einer oder mehrere der Ringe ein heterocyclischer Ring ist/sind, sind die Heteroatome im Ring aus N-, O- und S-Atomen ausgewählt. Bevorzugte Arylgruppen sind Phenyl, Naphthyl, Anthryl und Pyrenyl, die jeweils mit Nicht-Wasserstoffsubstituenten substituiert sein können. Stärker bevorzugt sind Phenyl- und Naphthylgruppen.
Besondere Ausführungsform von Verbindungen der Formel I, die gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung von Chemilumineszenz reaktiv sind, umfassen als Beispiele Verbindungen mit den Strukturen:
wobei Y Wasserstoff, ein Alkalimetallion oder eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl-, substituierte oder unsubstituierte Aryl-, substituierte oder unsubstituierte Aralkyl oder Trialkylsilylgruppe ist, Y' ein Alkalimetallion, ein Alkylcarboxyester, Arylcarboxyester, eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl-, substituierte oder unsubstituierte Aryl-, substituierte oder unsubstituierte Aralkylgruppe oder Trialkylsilylgruppe ist und Y'' Wasserstoff oder Halogen, insbesondere ein Chloratom, ist. Obwohl nur ein Doppelbin dungsisomer für diese Strukturen dargestellt ist, erkennt man, das jedes Isomer oder Gemische der beiden bei den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden kann. Andere Strukturen, die unter die vorstehend genannten Beschränkungen fallen, erscheinen dem Fachmann als bei den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet.
Eine zweite Gruppe bevorzugter Verbindungen hat die Formel II, wobei A¹ und A² unter Bildung eines mit Het bezeichneten heterocyclischen Rings verbunden sind. Das heterocyclische Ringsystem umfasst mindestens einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring, der mindestens ein Heteroatom enthält, das aus N-, O- und S-Atomen ausgewählt ist. Die Gruppen Z¹, Z², X und R¹ sind wie vorstehend definiert.
Das heterocyclische Ringsystem enthält mindestens ein Heteroatom, ausgewählt aus N-, O- und S-Atomen, das sich in Konjugation zu dem Ring-Kohlenstoffatom befindet, das die exocyclische Doppelbindung trägt. Bevorzugte heterocyclische Verbindungen umfassen Verbindungen der Formeln III und IV sowie ihre Doppelbindungsisomere oder Gemische der Isomere, wobei Q aus NR⁶, O und S ausgewählt ist, Z und R¹ wie vorstehend definiert sind und R²-R⁶ nachstehend definiert sind.
Siehe wiederum Formel II: beispielhafte Ringstrukturen, die die Gruppe Het umfassen können, beinhalten die nachstehenden Strukturen, wobei der Stern die Position der exocyclischen Doppelbindung angibt. Ohne dass explizit alle möglichen Substitutionsmuster gezeigt sind, sollte selbstverständlich sein, dass in solchen beispielhaften Ringstruktu ren jede Ringposition andere Substituenten als Wasserstoff enthalten kann. Andere, zur Ausführung der erfindungsgemäß beschriebenen Verfahren geeignete heterocyclische Ringverbindungen, die nachstehend nicht speziell aufgeführt sind, aber trotzdem in den Umfang der Formel II fallen, sind für den Fachmann ersichtlich.
In allen vorstehenden Verbindungen der Formel III und IV sind die Gruppen R²-R⁵ jeweils unabhängig H oder eine Substituentengruppe, die es gestattet, dass das Licht erzeugt wird, und enthalten in der Regel von 1 bis 50 Atome, die aus C, N, O, S, P und Ha logenatomen ausgewählt sind. Repräsentative Substituentengruppen, die vorhanden sein können, umfassen, ohne Beschränkung, Alkyl-, substituierte Alkyl-, Aryl-, substituierte Aryl-, Aralkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Halogen-, Amino-, substituierte Amino-, Carboxyl-, Carboalkoxy-, Carboxamid-, Cyano- und Sulfonatgruppen. Jedes Paar oder beide Paare von benachbarten Gruppen, d.h. R²-R³ oder R⁴-R⁵, können miteinander unter Bildung eines carbocyclischen oder heterocyclischen Ringsystems verbunden werden, das mindestens einen 5 oder 6-gliedrigen Ring umfasst, der mit dem Ring, der die exocyclische Doppelbindung trägt, kondensiert ist. Solche kondensierten heterocyclischen Ringe können N-, O- oder S-Atome enthalten und andere Ringsubstitutenten als H, wie die vorstehend genannten, enthalten.
In allen vorstehenden Verbindungen ist die Gruppe R⁶ eine organische Gruppe mit von 1 bis 50 Nicht-Wasserstoffatomen, ausgewählt aus C, N, O, S, P und Halogenatomen, zusätzlich zu der notwendigen Anzahl an H-Atomen, die zum Auffüllen der Valenzen der Atome in der Gruppe notwendig sind. Stärker bevorzugt enthält R⁶ von 1 bis 20 Nicht-Wasserstoffatome. Die organische Gruppe wird vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus Alkyl-, substituierten Alkyl-, Aryl-, substituierten Aryl- und Aralkylgruppen besteht. Stärker bevorzugte Gruppen für R⁶ umfassen substituierte oder unsubstituierte C₁-C₄-Alkylgruppen, substituierte oder unsubstituierte Benzylgruppen, Alkoxyalkyl- und Carboxyalkylgruppen.
Substituentengruppen können in verschiedenen Mengen und an ausgewählten Ring- oder Kettenpositionen in den heterocyclischen Ring eingebracht werden, um die Eigenschaften der Verbindung zu modifizieren oder eine leichte Synthese der endgültigen Phosphatverbindung bereitzustellen. Solche Eigenschaften umfassen z.B. die Chemilumineszenzquantenausbeute, die Geschwindigkeit der Reaktion mit dem Enzym, die maximale Lichtintensität, die Dauer der Lichtemission, die Wellenlänge der Lichtemission und die Löslichkeit im Reaktionsmedium. Spezifische Substituenten und ihre Wirkungen sind in den nachstehenden spezifischen Beispielen veranschaulicht, die jedoch nicht so verstanden werden sollen, dass sie den Umfang der Erfindung in irgendeiner Weise beschränken.
Eine bevorzugte Klasse von Verbindungen hat die nachstehende Formel V, wobei R¹ eine Arylringgruppe ist, die mindestens einen carbocyclischen oder heterocyclischen aromatischen Ring enthält und die ferner substituiert oder eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe sein kann, Z¹ aus O- und S-Atomen ausgewählt ist und X und R⁶ wie vorstehend definiert sind.
Die Gruppen R⁷ bis R¹⁴, die gleich oder verschieden sein können, sind jeweils ein Substituent, der von 1 bis 50 Atome, die aus C, H, N, O, S, P und Halogenatomen ausgewählt sind, enthalten kann, und die gestatten, dass das Licht erzeugt werden kann, und können, ohne Beschränkung, Alkyl-, substituierte Alkyl-, Aryl-, substituierte Aryl-, Aralkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Halogen-, Amino-, substituierte Aminogruppen, Carboxyl-, Carboalkoxy-, Carboxamid-, Cyano- und Sulfonatgruppen umfassen. Es ist bevorzugt, dass R⁷ bis R¹⁴ aus Wasserstoff, Halogen und Alkoxygruppen, wie Methoxy, Ethoxy, t-Butoxy und dergleichen, ausgewählt sind. Bei einer bevorzugten Gruppe von Verbindungen ist eines von R⁸, R⁹, R¹² oder R¹³ ein Chloratom und die anderen von R⁷ bis R¹⁴ sind Wasserstoffatome. Stärker bevorzugt sind Verbindungen der Formel VI, wobei Z und R¹ wie vorstehend definiert sind, X eine Phosphorylgruppe -PO(OR')(OR'') ist, wobei R' und R'' unabhängig aus substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, substituierten oder unsubstituierten Aryl- und substituierten oder unsubstituierten Aralkylgruppen mit 1-20 Kohlenstoffatomen, Trialkylsilylgruppen, Alkalimetallkationen, Erdalkalikationen, Ammonium- und Phosphoniumkationen ausgewählt sind.
Vorzugsweise ist mindestens eines von R' und R'' ein Alkalimetallkation und stärker bevorzugt sind es beide. Unter den Alkalimetallen sind Lithium, Natrium und Kalium bevorzugt.
Verbindungen der Formel I können durch verschiedene Verfahren hergestellt werden. Bei einem bevorzugten Verfahren kann Verbindung I, wenn die Z²-Gruppen O sind und Z¹ O oder S ist, durch Umsetzung des Enolats eines Esters oder Thioesters mit einem Reagenz der Formel X-LG, wobei LG eine Abgangsgruppe darstellt, gemäß dem nachstehenden Schema hergestellt werden.
Übliche Abgangsgruppen umfassen Halogene, wie Chlorid, Bromid und Iodid, Sulfonate, wie Methansulfonat und p-Toluolsulfonat und Trifluormethansulfonat, Carboxylate, wie Acetat und Benzoat, insbesondere wenn X eine Acylgruppe ist, in welchem Fall X-LG ein Säureanhydrid wäre, Sulfate, wie Methosulfat, und andere Gruppen, wie Imidazol, Triazol und Tetrazol, Maleinimid, Succinimidoxygruppen.
Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I, wobei beide Z-Gruppen S-Atome sind, umfassen nucleophile Addition einer Lithiosilan-Verbindung oder eines Phosphor-Ylids an eine geeignete Carbonylverbindung gemäß den beiden nachstehenden Schemata (F.A. Carey, A.S. Court, J. Org. Chem., 37, 1926-29, (1972)).
Bei einem anderen Verfahren wird ein Ester durch Umsetzung mit einem Bis(dialkylaluminium)dithiol-Reagenz in ein Ketendithioacetal umgewandelt, wie in E.J.
Corey und A.P. Kozikowski, Tetrahedron Lett., 925-8 (1975) offenbart und nachstehend gezeigt.
Bei noch einem anderen Verfahren wird ein Anion einer aktiven Methylengruppe mit CS, umgesetzt, und das Dithiocarboxylat wird mit einem Reagenz R₁-LG, das die R₁-Gruppe enthält, unter Bildung eines Dithioesters umgesetzt. Ein Beispiel für die letztere Verfahrensweise ist in I. Shahak und Y. Sasson, Tetrahedron Lett., 4207-10 (1973) offenbart. Der Dithioester wird in das Enolat umgewandelt und mit einem Reagenz der Formel X-LG umgesetzt.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Verbindungen einer der Formeln I-VI bei einem Verfahren zur Erzeugung von Chemilumineszenz durch Reaktion mit einer Peroxidase. Die Reaktion einer Verbindung der Formel I-VI mit einer Peroxidase und einem Peroxid in einer wässrigen Pufferlösung erzeugt leicht nachzuweisende Chemilumineszenz. Die Lichtintensität erreicht innerhalb von Minuten bei Raumtemperatur ein maximales Niveau, wenn die Reaktion bei alkalischem pH durchgeführt wird. Die Reaktion erfolgt gegebenenfalls in Gegenwart eines Enhancers.
Wir möchten zwar zu diesem Zeitpunkt keine spezifische mechanistische Erklärung für diese Entdeckung vorbringen, aber es wird angenommen, dass das Licht von dem elektronisch angeregten Zustand von VII emittiert wird. Eine notwendige Bedingung für die Erzeugung von Licht ist, dass die Reaktion ausreichend Energie erzeugt, dass der angeregte Zustand von VII gebildet wird. Ist VII* lumineszent, dann wird Chemilumineszenz durch die Reaktion über die Emission aus dem angeregten Zustand von VII erzeugt. Ist Zusammensetzung VII* nicht signifikant lumineszent, dann kann Chemilumineszenz durch Zugabe eines lumineszenten Energieakzeptors erzeugt werden.
Bei einem bevorzugten Verfahren zur Erzeugung von Chemilumineszenz wird Verbindung I mit einer Peroxidase, einem Peroxid und einem Enhancer in einem alkalischen Puffer mit einem pH zwischen etwa 8 und 10 umgesetzt, um ein kontinuierliches Chemilumineszenzsignal zu erzeugen, dass nach Reaktion des Enzyms und der Verbindung I beginnt. Die Analyseempfindlichkeit kann durch Zugabe eines nichtionischen Tensids erhöht werden, wie nachstehend eingehender beschrieben.
Bei einem bevorzugten Verfahren zur Erzeugung von Licht aus der Reaktion von Verbindung V mit einer Peroxidase wird die Reaktion bei einer Temperatur zwischen 5°C und 50°C, vorzugsweise zwischen 20°C und 40°C, in einer wässrigen Pufferlösung bei einem pH zwischen 7 und 10,5, vorzugsweise zwischen 8,5 und 10, durchgeführt. Verbindung V wird in einer Konzentration zwischen 1 μM und 20 mM, vorzugsweise zwischen 10 μM und 1 mM, verwendet. Das Enzym kann eine freie Peroxidase oder ein Peroxidasekonjugat sein. Licht wird von dem angeregten Zustand von VIII emittiert.
Erfindungsgemäße Verbindungen erzeugen üblicherweise Licht über ein 100-200 nm breites Emissionsband, das eine maximale Intensität bei Wellenlängen im nahen Ultraviolett- bis zum sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums aufweist. Übliche Wellenlängen der maximalen Intensität λ_max im Bereich von 350-500 nm. Es wird erwogen, dass Verbindungen der Formel I, die ein kovalent gebundenes Fluorphor tragen, einem intramolekularen Energietransfer unterliegen können, was zur Emission bei längeren Wellenlängen aus dem angeregten Zustand des Fluorphors führen würde.
Erfindungsgemäß kann mehr als eine Verbindung der Formel I in einem Verfahren zur Erzeugung von Licht durch Einwirkung einer Peroxidase verwendet werden. In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, zwei oder mehr Verbindungen der Formel I gleichzeitig mit der Peroxidase umzusetzen. Wenn die zwei oder mehr Verbindungen verschiedene lumineszente und physikalische Eigenschaften besitzen, kann die Kombination der Beiden wünschenswert sein, um eine lichtemittierende Reaktion mit Eigenschaften, die durch Verwendung einer der Verbindungen nicht leicht erzielbar wären, zu erzeugen. Beispiele für lumineszente und physikalische Eigenschaften, die sich bei den Verbindungen I unterscheiden können, umfassen das Emissionsspektrum, die Dauer der Lichtemission, den Enzymumsatz, die Anstiegsgeschwindigkeit der Emission bis zum Maximum, Hydrophobie/Hydrophilie und Löslichkeit.
Die Peroxidkomponente ist irgendein Peroxid oder Alkylhydroperoxid, das mit der Peroxidase reagieren kann. Bevorzugte Peroxide umfassen Wasserstoffperoxid, Harnstoffperoxid und Perboratsalze.
Die Peroxidase, die der Chemilumineszenzreaktion unterliegen kann, umfasst Lactoperoxidase, Mikroperoxidase, Myeloperoxidase, Haloperoxidase, z.B. Vanadium-Brom-Peroxidase, Meerrettichperoxidase, Pilzperoxidasen, wie Ligninperoxidase und Peroxidase aus Arthromyces ramosus, und Mn-abhängige Peroxidase, die von Weißfäulepilzen produziert wird, und Sojabohnenperoxidase. Andere, Peroxidase nachahmende Verbindungen, die keine Enzyme sind, aber peroxidaseähnliche Aktivität besitzen, einschließlich Eisenkomplexen und Mn-TPPS₄ (Y.-X. Ci et al., Mikrochem. J., 52, 257-62 (1995)), sind bekannt, die die chemilumineszente Oxidation von Luminol katalysieren, werden explizit als in den Umfang der Bedeutung von Peroxidase, wie hier verwendet, fallend betrachtet. Konjugate oder Komplexe einer Peroxidase und eines biologischen Moleküls können ebenfalls bei dem Verfahren zur Erzeugung von Chemilumineszenz verwendet werden, wobei die einzige Vorraussetzung ist, dass das Konjugat Peroxidaseaktivität zeigt. Biologische Moleküle, die mit einem oder mehreren Molekülen einer Peroxidase konjugiert werden können, umfassen DNA, RNA, Oligonucleotide, Antikörper, Antikörperfragmente, Antikörper-DNA-Chimären, Antigene, Haptene, Proteine, Lektine, Avidin, Streptavidin und Biotin. Komplexe, die eine Peroxidase umfassen oder beinhalten, wie Liposomen, Micel len, Vesikel und Polymere, die für die Bindung an biologische Moleküle funktionalisiert sind, können ebenfalls bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Das Einbringen bestimmter Enhancerverbindungen in das Reaktionsgemisch fördert die Reaktivität des Enzyms. Diese Enhancer umfassen phenolische Verbindungen und aromatische Amine, von denen bekannt ist, dass sie andere Peroxidasereaktionen verstärken, wie in G. Thorpe, L. Kricka, in Bioluminescence and Chemiluminescence, New Perspectives, J. Scholmerich et al., Hrsg., S. 199-208 (1987), M. Ii, H. Yoshida, Y. Aramaki, H. Masuya, T. Hada, M. Terada, M. Hatanaka, Y. Ichimori, Biochem. Biophys. Res. Comm., 193(2), 540-5 (1993) und in den U.S.-Pat. Nr. 5,171,668 und 5,206,149, die hier durch Bezugnahme aufgenommen sind, beschrieben. Substituierte und unsubstituierte Arylborsäureverbindungen und ihre Ester- und Anhydridderivate, wie im U.S.-Pat. Nr. 5,512,451 offenbart und hier durch Bezugnahme aufgenommen, sollen ebenfalls im Umfang der bei der vorliegenden Erfindung geeigneten Enhancer liegen. Bevorzugte Enhancer umfassen, sind aber nicht beschränkt aus: p-Phenylphenol, p-Iodphenol, p-Bromphenol, p-Hydroxyzimtsäure, p-Imidazolylphenol, Acetaminophen, 2,4-Dichlorphenol, 2-Naphthol und 6-Brom-2-naphthol. Gemische von mehr als einem Enhancer aus diesen oben genannten Klassen können ebenfalls eingesetzt werden.
Die Verwendung nichtionischer Tenside als Additive in den erfindungsgemäßen Chemilumineszenzreaktionen ist vorteilhaft, Das Einbringen nichtionischer Tenside in Reaktionen zur Erzeugung von Chemilumineszenz unter Verwendung einer Peroxidase fuhrt zu einer Verbesserung der Analyseempfindlichkeit im Hinblick auf die Peroxidase, indem die Dauer der Chemilumineszenz verlängert wird. Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung geeignete nichtionische Tenside umfasst beispielsweise polyoxyethylenierte Alkylphenole, polyoxyethylenierte Alkohole, polyoxyethylenierte Ether und polyoxyethylenierte Sorbitolester.
Kationische Tenside, einschließlich quaternärer Ammoniumverbindungen, wie CTAB, sind vorteilhaft für die Verwendung zur Erhöhung des Niveaus der Chemilumineszenz, die emittiert wird, wenn bestimmte erfindungsgemäße Verbindungen mit einer Peroxidase und einem Peroxid umgesetzt werden. Zum Beispiel wurde die Lichtintensität der Reaktion der nachstehend gezeigten erfindungsgemäßen Verbindung 43 oder 46 mehr als zehnfach erhöht, wenn CTAB zum Reaktionsgemisch gegeben wurde.
Die erfindungsgemäße Reaktion erfolgt in einer Lösung, wie einem wässrigen Puffer, die in Kontakt mit der Oberfläche eines festen Trägers, wie einer Perle, einem Röhrchen, einer Membran oder einer Mikrotiterplatte, der mit Peroxidase beschichtet ist, sein kann. Geeignete Puffer umfassen einen der üblicherweise verwendeten Puffer, die einen pH im Bereich von etwa 6 bis etwa 9 aufrechterhalten können, beispielsweise Phosphat, Borat, Carbonat, Tris(hydroxymethylamino)methan, Glycin, Tricin, 2-Amino-2-methyl-1-propanol, Diethanolamin und dergleichen. Das bevorzugte Verfahren zur Ausführung der Erfindung wird in dieser Hinsicht von den Anforderungen der bestimmten beabsichtigten Verwendung vorgegeben.
Das durch das erfindungsgemäße Verfahren emittierte Licht kann durch irgendeine geeignete bekannte Maßnahme, wie ein Luminometer, einen Röntgenfilm, Hochgeschwindigkeitsfotografiefilm, eine CCD-Kamera, einen Szintillationszähler, ein chemisches Actinometer oder visuell, nachgewiesen werden. Jede Nachweismaßnahme hat eine unterschiedliche spektrale Empfindlichkeit. Das menschliche Auge ist für grünes Licht optimal empfindlich, CCD-Kameras zeigen eine maximale Empfindlichkeit bei rotem Licht, Röntgenfilme mit maximaler Reaktion auf entweder UV- oder blaues Licht oder grünes Licht sind verfügbar. Die Auswahl der Nachweisvorrichtung wird durch die Anwendung und Überlegungen im Hinblick auf Kosten, und ob die Bereitstellung einer ständigen Aufzeichnung erforderlich ist, bestimmt.
Bei einer weiteren Ausführungsform können lumineszente Energieakzeptoren eingesetzt werden, um die maximale Emission zu längeren Wellenlängen (Rotverschiebung) zu verschieben und/oder die Menge der emittierten Lumineszenz zu erhöhen. Verschiedene Techniken zur Rotverschiebung der Emission sind im Stand der Technik für chemilumineszente Reaktionen und Assays bekannt. Kovalent gebundene Fluorophore, wie vorstehend beschrieben, sind ein Beispiel. Fluoreszierer können alternativ als getrennte Spezies zur Reaktionslösung gegeben werden. Fluoreszierer können an ein Polymer gebunden oder mit einer Micelle oder einem Polymer verknüpft werden, um den Fluoreszierer in engen Kontakt mit der Verbindung zu bringen. Fluoreszierende Energietransfermittel können vorteilhaft eingesetzt werden, wenn die inhärente Fluoreszenzeffizienz des angeregten Donor-Reaktionsprodukts A¹A²C = O* niedrig ist oder wenn das angeregte Reaktionsprodukt ein angeregter Triplet-Zustand ist. Im ersten Fall kann ein Energietransfer des Singulett-Singulett-Typs erfolgen, im letzteren Fall kann es sich um den Triplett-Singulett-Typ handeln. Geeignete Energietransfermittel haben einen angeregten Zustand bei einem Energieniveau, das mit demjenigen des angeregten Reaktionsprodukts A¹A²C = O* überlappt, so dass der Transfer von Anregungsenergie und ein angeregter fluoreszierender Zustand möglich werden, der der gleiche, wie der angeregte Zustand, der mit demjenigen des Donors überlappt, sein kann oder nicht. Energietransfermittel, die dazu geeignet sind, einen Singulett-Singulett-Energietransfer zu bewirken, sind im Stand der Technik bekannt. Energietransfermittel, die dazu geeignet sind, einen Triplett-Singulett-Energietransfer zu bewirken, sind ebenfalls im Stand der Technik bekannt und besitzen in der Regel mindestens ein Metallatom oder andere schwere Atome, wie Brom- oder Iodatome. Übliche Beispiele sind 9,10-Dibromanthracen (DBA), sulfonierte Derivate von DBA und Ru(bpy)₃ ²⁺. Fluoreszierende Energietransfermittel werden empirisch bewertet, indem die Intensität oder Wellenlänge der Chemilumineszenz, die bei einer Reaktion einer Peroxidase, eines Peroxids und einer Verbindung der Formel I erzeugt wird, in An- und Abwesenheit des Mittels verglichen werden.
Eine wichtige Anwendung der erfindungsgemäßen Chemilumineszenzverfahren ist zum Nachweis des Vorhandenseins oder der Menge eines Analyten in einem Assayverfahren durch eine chemilumineszente Reaktion. Das Verfahren umfasst die Schritte: Inkontaktbringen einer Probe, von der angenommen wird, dass sie den Analyten enthält, mit einer erfindungsgemäßen chemilumineszenten Verbindung und einer Peroxidase, Nachweisen des erzeugten Lichts in einem qualitativen Verfahren und, wenn Quantifizierung gewünscht ist, Inbezugsetzen der erzeugten Lichtmenge zur Menge des Analyten. Die Beziehung zwischen der Lichtintensität und der Menge an Analyt kann leicht durch Konstruktion einer Kalibrierungskurve mit bekannten Mengen des Analyten festgestellt werden. Die chemilumineszente Verbindung wird üblicherweise in einer Konzentration von etwa 10^-5 M bis etwa 10^-2 M, vorzugsweise zwischen etwa 10^-4 M und etwa 10^-3 M, verwendet. Die Peroxidase beträgt vorzugsweise weniger als etwa 10^-9 M, wenn sie in einer Lösung nachge wiesen wird. Übliche Proben, die durch das chemilumineszente Reaktionsverfahren analysiert werden, sind Körperflüssigkeiten, wie Blut, Plasma, Serum, Urin, Samen, Speichel, ZSF und dergleichen.
Analyten, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren gestestet werden können, umfassen Peroxidasen, dann ist es nicht mehr nötig, zusätzliche Peroxidase zuzugeben, Inhibitoren von Peroxidasen und verschiedene Klassen organischer und biologischer Moleküle, die mit einer Peroxidase markiert werden können oder durch enzymmarkierte spezifische Bindungspartner spezifisch nachgewiesen werden können. Das Enzym kann direkt als Markierung an der an den Analyten bindenden Verbindung eingebracht werden. Alternativ kann die an den Analyten bindende Verbindung an mindestens eine enzymmarkierte spezifische Bindungssubstanz für die an den Analyten bindende Verbindung gebunden werden. Alternativ kann die an den Analyten bindende Verbindung mit mindestens einer zweiten spezifischen Bindungssubstanz markiert werden, die dann an einen enzymmarkierten Bindungspartner für die zweite spezifische Bindungssubstanz gebunden wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung dieses Verfahrens zum Nachweis von Wasserstoffperoxid bei einem Assayerfahren durch eine Chemilumineszenzreaktion mit einer Verbindung der Formel I und einem Peroxidaseenzym, wobei die Menge an erzeugtem Licht mit der Menge des vorhandenen Peroxids in Bezug gesetzt wird. Für den Fachmann auf dem Gebiet der Chemilumineszenz-Assays ist ersichtlich, dass die erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis von Oxidaseenzymen und Dehydrogenaseenzymen verwendet werden können. Diese Enzyme erzeugen Wasserstoffperoxid durch Reduktion von Sauerstoff und Oxidation ihrer nativen Substrate. Das dadurch erzeugte Wasserstoffperoxid kann dann entweder gleichzeitig mit seiner Erzeugung oder in einem anschließenden Schritt mit der erfindungsgemäßen Verbindung I und einer Peroxidase unter Erzeugung von Licht weiter umgesetzt werden. Eine Eigenschaft des erzeugten Lichts wird dann mit der Menge des Oxidase- oder Dehydrogenaseenzyms in Bezug gesetzt. Ferner können das Oxidase- oder Dehydrogenaseenzym als Konjugat an einem biologischen Molekül oder einem Mitglied eines spezifischen Bindungspaars in einem Assay für den Analyten vorhanden sein.
Die Reaktion einer Verbindung der Formel I mit einer Peroxidase unter Erzeugung von Chemilumineszenz bildet ein schnelles und sensitives Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins oder der Menge der Peroxidase. Deshalb kann von dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Zweck der Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge einer Peroxidase in einer Probe Gebrauch gemacht werden, indem die Menge oder die Intensität von Licht, das durch Reaktion der Probe mit einer Verbindung der Formel I erzeugt wird, gemessen wird. Eine solche Bestimmung kann z.B. beim Nachweis der Peroxidaseaktivität von Säugerblut als Beweisstück bei forensischen Untersuchungen Anwendung finden.
Ein zweites Anwendungsgebiet für die chemilumineszente Messung der Peroxidaseaktivität ist beim Nachweis und bei der Messung von Enzyminhibitoren. Inhibitoren können reversibel wirken, indem sie als Substrat in Konkurrenz mit einem zweiten Substrat, wie den erfindungsgemäßen Verbindungen, wirken. Eine andere Weise der Inhibition, die als Selbstmordhemmung bekannt ist, wirkt irreversibel durch Deaktivierung des Enzyms. Peroxidaseinhibitoren umfassen beispielsweise Cyanid, Sulfid und hohe Konzentrationen von Wasserstoffperoxid. Ferner ist bekannt, dass einige Substanzen nur in bestimmten Konzentrationen inhibitorisch sind und nur partiell inhibitorisch sein können.
Messungen der Menge oder der Eigenschaften eines Inhibitors, wie die Hemmkonstante K_i oder die Halbwertszeit der Hemmung, t_1/2, erfolgen durch Messen der Enzymaktivität einer Probe, die das fragliche Enzym enthält, in Gegenwart eines Substrats, das ein nachweisbares Produkt erzeugt, und einer Menge des Inhibitors. Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis eines Enzyminhibitors erzeugt eine Verbindung der Formel I Licht als nachweisbares Produkt. Die Reaktion des Enzyms und der chemilumineszenten Verbindung erfolgt in An- und Abwesenheit der Inhibitorsubstanz, und die Ergebnisse werden verglichen, um das Vorhandensein oder die Menge des Inhibitors zu bestimmen. Die Wirkung des Inhibitors kann eine oder mehr von drei Wirkungen sein: eine Abnahme der Lichtintensität, eine kleinere Anstiegsgeschwindigkeit der Lichtintensität oder eine Verzögerung des Zeitraums, bevor die Lichtemission beginnt.
Techniken zur Durchführung von Enzymtests sind bekannt. Mit der durch die Beispiele bereitgestellten Anleitung, wie hier gelehrt, lassen sich Variationen von Verfahren zur Herstellung von Proben, Bestimmung geeigneter Mengen und Verhältnisse von Rea genzien, Reaktionszeiten, Konstruktion von Kalibrierungskurven und dergleichen innerhalb der Fähigkeit des Durchschnittsfachmanns aufgrund von Routineexperimenten ersinnen.
Weil die Reaktion durch die Peroxidase katalysiert wird, sind überaus kleine Mengen an Enzym ausreichend, um eine nachweisbare Lichtmenge zu erzeugen. Empfindlichkeiten unter 1 attomol (1 × 10^-18 mol) wurden erzielt. Die Fähigkeit, solche kleinen Mengen von Peroxidase nachzuweisen, machen die erfindungsgemäße Chemilumineszenztechnologie für Analysen vieler Typen von Analyten unter Verwendung enzymgebundener Tests geeignet. Solche Analysen und Assays erfordern aufgrund des geringen Vorkommens des in der Probe zu analysierenden Analyten oder aufgrund einer begrenzten Probenmenge die Fähigkeit, kleine Mengen an Peroxidasen nachweisen zu können. Bei diesem Assay-Typ wird eine Peroxidase mit einem Mitglied eines spezifischen Bindungspaars konjugiert. Ein Beispiel ist ein chemilumineszenter enzymgebundener Immun-Assay, wie der so genannte enzymgebundene Immunosorbent-Assay oder ELISA. Solche Assays werden üblicherweise sowohl in einem manuellen Format als auch auf automatisierten Mehrfachtest-Immun-Assay-Systemen verwendet. Bei einem üblichen Immun-Assay wird der Analyt Hapten, Antigen oder Antikörper durch Nachweisen des Vorhandenseins oder der Menge eines enzymmarkierten spezifischen Bindungspartners für den Analyten oder eines enzymmarkierten Analogons des Analyten getestet. Verschiedene Assay-Formate und die Protokolle zur Durchführung der immunchemischen Schritte sind im Stand der Technik bekannt. Diese Assays fallen in zwei große Kategorien. Kompetitive Assays beinhalten eine immunologische Bindung eines spezifischen Antikörpers an den Analyten und ein Analytanalogon, z.B. ein nachweisbar markiertes Analytmolekül. Sandwich-Assays erfolgen durch aufeinander folgende oder gleichzeitige Bindung von zwei Antikörpern, von denen einer nachweisbar markiert ist, an den Analyten. Das so gebildete nachweisbar markierte Bindungspaar kann mit den erfindungsgemäßen Verbindungen und Verfahren getestet werden. Wenn die nachweisbare Markierung das Peroxidaseenzym ist, wird es direkt nachgewiesen. Wenn die nachweisbare Markierung ein Mitglied eines anderen spezifischen Bindungspaars ist, z.B. ein Hapten, wird zuerst ein Konjugat seines Bindungspartners mit einer Peroxidase umgesetzt und die Peroxidase dann mit den erfindungsgemäßen Verfah ren nachgewiesen. Die Messung kann mit enzymmarkierter Spezies, die an eine feste Oberfläche oder einen Träger, einschließlich Perlen, Röhrchen, Mikrotiterplattenvertiefungen, magnetischer Partikel, Teststreifen, Membranen und Filtern, wie sie im Stand der Technik üblicherweise Verwendung finden, gebunden ist, durchgeführt werden. Die nachweisbare enzymmarkierte Spezies kann auch frei in Lösung oder eingeschlossen in einen organischen Zusammenschluss, wie einem Liposom, vorkommen, in welchem Fall ein lytisches Mittel eingesetzt wird, um das Liposom zu lysieren und das nachweisbare Enzym freizusetzen.
Eine weitere beispielhafte Verwendung ist der Nachweis von Proteinen durch die Technik des Western-Blotting. Eine Probe, die ein Protein von Interesse als Analyten enthält, wird einer elektrophoretischen Trennung unterzogen. Die getrennten Proteine werden durch Kapillarwirkung oder mithilfe eines elektrischen Feldes auf eine Blottingmembran, wie eine Nitrocellulose- oder PVDF-Membran, übertragen. Dieses übertragene Protein wird üblicherweise mit einem spezifischen primären Antikörper und einem enzymmarkierten sekundären Antikörper, der den primären Antikörper erkennt und daran bindet, nachgewiesen. Die Sichtbarmachung der Markerenzymaktivität spiegelt das Vorhandensein des Analytproteins wider. Um die erfindungsgemäßen Verfahren an das Western-Blotting anzupassen, kann ein HRP-konjugierter sekundärer Antikörper eingesetzt und die Peroxidaseaktivität mit Chemilumineszenz unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Verbindung als chemilumineszentes Reagenz gemessen werden. Variationen dieser Technik, beispielsweise unter Verwendung von biotinylierten Antikörpern und Avidin-HRP, werden als im Umfang von Assays betrachtet, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden können.
Zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Antigen-Antikörper-, Hapten-Antikörperoder Antikörper-Antikörper-Paaren können spezifische Bindungspaare auch komplementäre Oligonucleotide oder Polynucleotide, Avidin-Biotin, Streptavidin-Biotin, Hormon-Rezeptor, Lektin-Kohlenhydrat, IgG-Protein A, Nucleinsäure-Nucleinsäurebindungsprotein und Nucleinsäure-anti-Nucleinsäure-Antikörper umfassen.
Eine besonders geeignete Anwendung der erfindungsgemäßen Nachweisverfahren ist der Nachweis von Nucleinsäuren durch Verwendung enzymmarkierter Nucleinsäure sonden. Verfahren zur Analyse und zum chemilumineszenten Nachweis von Nucleinsäuren unter Verwendung von Enzymmarkierungen, beispielsweise Lösungs-Hybridisierungsassays, DNA-Nachweis durch Southern-Blotting, RNA durch Northern-Blotting, DNA-Sequenzierung, DNA-Fingerprinting, Koloniehybridisierungen und Plaquelift sind gut etablierte Techniken. Die Enzymmarkierung (z.B. HRP) kann als direktes Konjugat mit einem Sondenoligonucleotid oder Fängeroligonucleotid vorliegen oder kann durch indirekte Bindungsmaßnahmen unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren eingebracht werden. Beispiele für indirekte Bindungsmaßnahmen umfassen haptenmarkierte Oligonucleotide und anti-Hapten-HRP-Konjugate oder biotinylierte Oligonucleotide und Avidin-HRP-Konjugate. Solche Nucleinsäure-Assays können auf einer Blottingmembran oder in Lösung unter Verwendung von Oligonucleotiden durchgeführt werden, die an feste Oberflächen, einschließlich Perlen, Röhrchen, Mikrotiterplattenvertiefungen, magnetischer Partikel oder Teststreifen, wie im Stand der Technik bekannt, gebunden sind.
Unter einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Reagenzzusammensetzung zur Erzeugung von Chemilumineszenz durch Reaktion mit einer Peroxidase, umfassend einen wässrigen Puffer mit einem pH zwischen etwa 7 und etwa 10,5, eine Verbindung der Formel I in einer Konzentration von 0,01-10 mM und ein Peroxid in einer Konzentration von 0,01-10 mM. Gegebenenfalls können die Zusammensetzungen ferner mindestens einen Enhancer in einer Menge, die wirksam ist, um die Chemilumineszenz zu verstärken, vorzugsweise zwischen 0,001 und 10 mg/ml, und ein nichtionisches Tensid in einer Konzentration von 0,01 und 10 mg/ml umfassen.
Eine bevorzugte Reagenzzusammensetzung zur Erzeugung von Chemilumineszenz durch Reaktion mit einer Peroxidase umfasst einen wässrigen Puffer mit einem pH zwischen etwa 7,5 und etwa 9, ein Acridanphosphat der Formel V oder VI in einer Konzentration von 0,01-10 mM, ein Peroxid in einer Konzentration von 0,01-10 mM, einen Enhancer in einer Konzentration von 0,001 und 10 mg/ml und ein nichtionisches Tensid in einer Menge, die wirksam ist, um die Chemilumineszenz zu verstärken, vorzugsweise zwischen 0,001 und 10 mg/ml. Die Formulierung kann ferner einen Chelatbildner, wie EDTA, in einer Konzentration von 0,01-10 mM umfassen.
Um verschiedene Aspekte der vorliegenden Erfindung vollständiger zu beschreiben, werden die folgenden Beispiele gegeben, die den Umfang der Erfindung in keiner Weise beschränken.
BEISPIELE
1. Synthese von Acridanphosphaten.
Die folgenden Verbindungen wurden wie in der PCT-Anmeldung WO 97/26245 des Anmelders beschrieben hergestellt.
R⁷-R¹⁴ sind H, wenn nicht anders angegeben. Die Verbindungen 3, 4 und 6 wurden als Gemisch von Doppelbindungsisomeren erhalten. Jede dieser Verbindungen wirkt in den erfindungsgemäßen Reaktionen unter Erzeugung von Chemilumineszenz.
2. Acridanbis(cyanoethyl)phosphat-Verbindungen.
Jede der Verbindungen 1-13 wurde durch Entfernung der Schutzgruppe von der entsprechenden bis(cyanoethyl)-geschützten Phosphattriester-Verbindung 1a-13a mit der Formel:
hergestellt. Die Bis(cyanoethyl)phosphat-Derivate reagierten ebenfalls mit einem Peroxid und einer Peroxidase unter Erzeugung von Chemilumineszenz.
3. Synthese weiterer Acridanphosphatsalze und Acridanbis(cyanoethyl)phosphat-Verbindungen.
Weitere Acridanphosphatsalze 14-23 und -bis(cyanoethyl)ester 14a-23a, die wie in der PCT-Anmeldung WO 97/26245 des Anmelders beschrieben hergestellt wurden, haben die Formeln
sowie Verbindung 24 (Y = Na) und 24a (Y = CH₂CH₂CN) mit der Formel:
und Verbindungen 25-36 (Y = Na) und 25a-36a (Y = CH₂CH₂CN) mit der Formel:
wobei U p-I (25), p-CH₃ (26), m-OCH₃ (27), o-Cl(28), m-Cl (29), o-Br (30), m-Br (31), p-Br (32) und p-NO₂ (33) ist, sowie Verbindungen dieser Formel mit einer 3,4-Dichlor- (34), 2,5-Dichlor- (35) und 2,6-Dichlorphenylgruppe (36). Alle erzeugen Chemilumineszenz, wenn sie mit einer Peroxidase und einem Peroxid umgesetzt werden.
Die folgenden beispielhaften Verbindungen wurden hergestellt, und es wurde gefunden, dass sie gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren Chemilumineszenz erzeugen.
7. Synthese von Acridanderivat 37
Eine Lösung von Phenyl-10-methylacridan-9-carboxylat (250 mg, 0,79 mmol) in THF wurde mit LDA bei -78°C deprotoniert. Gleichzeitig wurden (EtO)₂POCl (205 mg, 1,2 mmol) und Pyridin (94 mg, 1,2 mmol) über Spritzen zugegeben und das Rühren für 15 min fortgesetzt. Das Trockeneisbad wurde entfernt und das Rühren für 2 Std. fortgesetzt. Die flüchtigen Substanzen wurden entfernt, und das Produkt wurde aus dem Rückstand in zwei Schritten chromatographisch isoliert. Eine säulenchromatographische Reinigung unter Verwendung von 30% Ethylacetat/Hexan ermöglichte die Abtrennung des Produkts, das eine fluoreszierende Verunreinigung enthielt. Die endgültige Reinigung erfolgte durch präp. DC unter Verwendung von 10% Ethylacetat/CH₂Cl₂; ¹H-NMR (Aceton-d₆) δ 1,08 (t, 6H), 3,46 (s, 3H), 3,76-3,97 (m, 4H), 6,79-7,91 (m, 13H).
8. Synthese von Acridanderivat 38
Eine Lösung von Phenyl-10-methylacridan-9-thiocarboxylat (1,0 g, 3 mmol) in THF wurde mit LDA bei -78°C deprotoniert. Gleichzeitig wurden (EtO)₂POCl (958 mg, 5 mmol) und Pyridin (2,5 ml, 3 mmol) über Spritzen zugegeben, und das Rühren wurde für 15 min fortgesetzt. Das Trockeneisbad wurde entfernt, und das Rühren wurde für 2 Std. fortgesetzt. Die flüchtigen Substanzen wurden entfernt und das Produkt aus dem Rückstand in zwei Schritten chromatographisch isoliert. Eine säulen-chromatographische Reinigung unter Verwendung von 30-100% Ethylacetat/Hexan ermöglichte die Abtrennung des Produkts, das blau und grün fluoreszierende Verunreinigungen enthielt. Die endgültige Reinigung erfolgte durch präp. DC unter Verwendung von 12% Ethylacetat/CH₂Cl₂; ¹H-NMR (Aceton-d₆) δ 1,01 (t, 6H), 3,49 (s, 3H), 3,74-3,96 (m, 4H), 6,91-7,45 (m, 11H), 7,78 (d, 1H), 7,99 (d, 1H).
9. Synthese von Acridanderivat 39
Eine Lösung von Phenyl-10-methylacridan-9-carboxylat (311 mg, 1 mmol) in THF wurde tropfenweise zu einer Lösung of LDA bei -78°C zugegeben. Nach 30 Minuten bei -78°C wurde Essigsäureanhydrid (161,3 mg, 1,6 mmol) über eine Spritze zugegeben, und das Trockeneisbad wurde entfernt. Nach einer Stunde wurden die flüchtigen Bestandteile entfernt und das Produkt aus dem Rückstand chromatographisch isoliert. Eine säulenchromatographische Reinigung unter Verwendung von 5% Ethylacetat/Hexan lieferte eine reine Fraktion von 90 mg als weißen Feststoff und eine zweite Fraktion (250 mg), die etwas Ausgangsmaterial enthielt; ¹H-NMR (CDCl₃) δ 2,04 (s, 3H), 3,44 (s, 3H), 6,82-7,65 (m, 13H).
10. Synthese von Acridanderivat 40
Eine Lösung von Phenyl-10-methylacridan-9-thiocarboxylat (1,05 g) in THF wurde mit LDA bei -78°C deprotoniert. Essigsäureanhydrid (0,45 ml) in 10 ml THF wurde tropfenweise zugegeben, das Trockeneisbad wurde entfernt und das Rühren über Nacht fortgesetzt. Die flüchtigen Substanzen wurden entfernt und das Produkt aus dem Rückstand chromatographisch isoliert. Eine säulenchromatographische Reinigung unter Verwendung von 5-20% Ethylacetat/Hexan lieferte 1,15 g Verbindung 40 als einen gelblich-weißen Feststoff; ¹H-NMR (CDCl₃) δ 1,89 (s, 3H), 3,48 (s, 3H), 6,95-7,06 (m, 4H), 7,20-7,34 (m, 5H), 7,40-7,44 (m, 2H), 7,62 (d, 1H), 7,79 (d, 1H).
11. Synthese von Acridanderivat 41
Eine Lösung von Phenyl-10-methylacridan-9-carboxylat (333,4 mg, 1,06 mmol) in THF wurde mit LDA bei -78°C für 30 min deprotoniert. Die tief orangefarbene Lösung wurde mit t-Butyldimethylsilylchlorid (253,4 mg, 1,68 mmol) in 10 ml wasserfreiem THF behandelt. Das Trockeneisbad wurde entfernt und das Rühren für 2 Std. fortgesetzt. Die flüchtigen Substanzen wurden entfernt und das Produkt aus dem Rückstand unter Verwendung von 5% Ethylacetat/Hexan als ein Öl (212 mg) chromatographisch isoliert; ¹H-NMR (CDCl₃) δ -0,12 (s, 6H), 0,77 (s, 9H), 3,37 (s, 3H), 6,75-7,38 (m, 12H), 7,79 (dd, 1H).
12. Synthese von Acridanderivat 42
Eine Lösung von Phenyl-10-methylacridan-9-thiocarboxylat (322,3 mg, 0,97 mmol) in THF wurde mit LDA bei -78°C deprotoniert. t-Butyldimethylsilylchlorid (270 mg, 1,8 mmol) in 5 ml wasserfreiem THF wurde schnell zugegeben, das Trockeneisbad wurde entfernt, und das Rühren dauerte für 90 min an. Die flüchtigen Substanzen wurden entfernt und 330 mg des Produkts aus dem Rückstand unter Verwendung von 5% Ethylacetat/Hexan als ein Öl chromatographisch isoliert, das sich beim Stehenlassen verfestigte; ¹H-NMR (CDCl₃) δ -0,09 (s, 6H), 0,73 (s, 9H), 3,43 (s, 3H), 6,84-7,01 (m, 4H), 7,16-7,47 (m, 7H), 7,73-7,76 (m, 1H), 7,90-7,93 (m, 1H).
13. Synthese von Verbindung 43
Das E-Isomer ist hier zur Veranschaulichung dargestellt. Obwohl im Wesentlichen ein Isomer gebildet wurde, ist nicht mit Sicherheit bekannt, welches Isomer.

(a) Ein Gemisch von 2-(6-Hydroxy-2-naphthyl)-propansäure (1,00 g) und Benzolthiol (0,635 g) in 100 ml wasserfreiem THF wurde mit 1,2 g DCC durch Rühren über Nacht behandelt. Das Gemisch wurde bis zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit Hexan gewaschen und filtriert. Der Rückstand wurde zwischen CH₂Cl, und Wasser ausgeschüttelt und die organische Schicht getrocknet und eingedampft. Das rohe Thioesterphenyl-2-(6-hydroxy-2-naphthyl)-propanthioat wurde durch Säulenchromatographie mit 30% Ethylacetat/Hexan gereinigt; ¹H-NMR (CDCl₃) δ 1,66 (d, 3H), 4,14 (q, 1H), 5,30 (s, 1H), 7,09-7,74 (m, 11H); ¹³C-NMR (CDCl₃) δ 18,63, 54,09, 103,02, 109,42, 118,35, 126,54, 126,97, 127,06, 127,88, 128,88, 129,18, 129,39, 129,82, 134,04, 134,52, 153,86, 199,78.
(b) Die Phenolgruppe wurde durch Umsetzen des Produkts des vorherigen Schritts (2,5 g) mit 1,1 ml Pivaloylchlorid in 3 ml Triethylamin als Pivalatester geschützt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Gemisch bis zur Trockne eingedampft und der Rückstand zwischen CH₂Cl₂ und Wasser ausgeschüttelt. Die organische Schicht wurde mit Wasser, gefolgt von gesätt. NaCl gewaschen, getrocknet und eingedampft. Das rohe Thioesterphenyl-2-(6-pivaloyloxy-2-naphthyl)-propanthioat wurde durch Säulenchromatographie mit 0-5% Ethylacetat/Hexan gereinigt; ¹H-NMR (CDCl₃) ⎕ 1,41 (s, 9H), 1,66 (d, 3H), 4,17 (q, 1H), 7,19-7,87 (m, 11H).
(c) Die Umwandlung des Thioesters von Schritt (b) in das Enol-bis(cyanoethyl)phosphat erfolgte durch Deprotonierung von 2,0 g des Thioesters mit 1,5 Äq. LDA in wasserfreiem THF bei -78°C und Umsetzen des Enolats mit 0,71 ml of POCl₃ und 0,62 ml Pyridin, gefolgt von Zugabe von 1,04 ml 3-Hydroxypropionitril in 1,2 ml Pyridin. Die Reaktionslösung wurde filtriert und eingedampft. Das Produkt wurde aus dem Rückstand durch Säulenchromatographie unter Verwendung von 60% Ethylacetat/Hexan isoliert, gefolgt von einer weiteren Wäsche mit Wasser, um restliches 3-Hydroxypropionitril zu entfernen. Das Produkt schien im Wesentlichen ein Isomer (43a) zu sein; ¹H-NMR (CDCl₃) ⎕ 1,39 (s, 9H), 2,38 (s, 3H), 2,67 (m, 4H), 4,25 (m, 4H), 7,2-7,8 (m, 11H); ³¹P-NMR (CDCl₃) ⎕ -7,43
(d) Von Verbindung 43a wurde durch Umsetzen von 0,72 g in 35 ml Aceton, das 0,198 g in 1 ml Wasser gelöstes NaOH enthielt, die Schutzgruppe entfernt. Das gefällte Salz wurde mit Aceton gewaschen, in Ethanol gelöst und mit Aceton gefällt, um 43 herzustellen; ¹H-NMR (CD₃OD) ⎕ 2,34 (s, 3H), 6,80-7,44 (m, 11 H); 13C-NMR (CD₃OD) ⎕ 21,26, 111,32, 124,15, 125,10, 125,08, 127,38, 127,90, 128,62, 129,35, 129,44, 135,79, 136,06, 136,14, 136,51, 139,31, 139,43, 140,07, 164,99; ³¹P-NMR (CD₃OD) ⎕ 6,24.

14. Synthese von Verbindung 44

(a) Ein Gemisch von 2-(6-Hydroxy-2-naphthyl)-propansäure (7,00 g) und 4-Chlorbenzolthiol (6,22 g) in wasserfreiem THF wurde mit 8,85 g DCC durch Rühren über Nacht behandelt. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde zwischen CH₂Cl₂ und Wasser ausgeschüttelt und die organische Schicht nacheinander mit Wasser und gesätt. NaCl gewaschen. Trocknen und Verdampfen des Lösungsmittels erzeugte das Thioesterphenyl-2-(6-hydroxy-2-naphthyl)-propanethioat, das durch Säulenchromatographie mit 20% Ethylacetat/Hexan gereinigt wurde; ¹H-NMR (CDCl₃) ⎕ 1,65 (d, 3H), 4,08-4,18 (m, 1H), 7,11-7,75 (m, 10H).
b) Die Phenolgruppe wurde als Pivalatester geschützt. Der Thioester aus dem vorherigen Schritt (6,14 g) wurde mit Pivaloylchlorid (2,89 g) und 5 ml of Triethylamin umgesetzt. Nach Verdampfen des Gemischs bis zur Trockne wurde der Rückstand mit Wasser und gesätt. NaCl gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Die weitere Reinigung wurde mittels Chromatographie mit 5% Ethylacetat/Hexan durchgeführt; ¹H-NMR (CDCl₃) ⎕ 1,41 (s, 9H), 1,65-1,68 (d, 3H), 4,12-4,19 (q, 1H), 7,20-7,87 (m, 10H); ¹³C-NMR (CDCl₃) σ 18,57, 27,22, 39,18, 54,21, 103,02, 118,35, 121,78, 126,57, 126,99, 128,33, 129,39, 131,43, 133,25, 136,74, 149,06, 177,32, 198,59.
(c) Die Umwandlung des geschützten Thioesters in das Enol-bis(cyanoethyl)phosphat erfolgte durch Deprotonierung von 2,2 g des Thioesters mit 1,5 Äq. LDA in wasserfreiem THF bei -78°C und Umsetzen des Enolats mit 1,5 Äq. POCl₃ und 1,5 Äq. Pyridin, gefolgt von Zugabe von 1,04 ml 3-Hydroxypropionitril in 1,2 ml Pyridin. Die Reaktionslösung wurde eingedampft und der Rückstand zwischen CH₂Cl₂ und Wasser ausgeschüttelt. Die organische Schicht wurde nacheinander mit Wasser und gesätt. NaCl gewaschen, getrocknet und eingedampft. Das Produkt wurde aus dem Rückstand unter Verwendung von 65% Ethylacetat/Hexan chromatographisch als Gemisch von Isomeren (44a E/Z) isoliert; ¹H-NMR (CDCl₃) ⎕ 1,40 (s, 9H), 2,36 & 2,36 (2s, 3H), 2,72-2,76 (m, 4H), 4,24-4,35 (m, 4H), 7,17-7,81 (m, 10H); ³¹P-NMR (CDCl₃) ⎕ -7,07.
(d) Von Verbindung 44a wurde durch Umsetzen von 0,80 g in 60 ml Aceton, das 0,26 g in 1 ml Wasser gelöstes NaOH enthielt, die Schutzgruppe entfernt. Das gefällte Salz wurde mit Aceton gewaschen und getrocknet, was Verbindung 44 als Gemisch von Isomeren (44 E/Z) erzeugte; ¹H-NMR (D₂O) ⎕ 2,19 (s, 3H), 6,79-7,54 (m, 11H); ³¹P-NMR (D₂O) ⎕ 2,90.

15. Synthese von Verbindung 45

(a) Diphenylessigsäure (3,12 g) wurde durch Erhitzen unter Rückfluss in 50 ml SOCl₂ für 2,5 Stunden in das Säurechlorid umgewandelt und mit 1,52 g Phenol in 50 ml CH₂Cl₂, das ca. 2 ml Et₃N enthielt, über Nacht verestert. Die flüchtigen Substanzen wurden unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde zwischen Hexan und Wasser ausgeschüttelt. Die organische Schicht wurde getrocknet und der Ester ohne weitere Reinigung verwendet; ¹H-NMR (CDCl₃) ⎕ 5,27 (s, 1H), 7,05-7,44 (m, 15H); ¹³C-NMR (CDCl₃) ⎕ 57,09, 121,44, 125,99, 127,54, 128,70, 128,82, 129,42, 138,26, 150,79, 171,04.
(b) Der Ester wurde durch Deprotonierung von 3,0 g mit 1,1 Äq. LDA in wasserfreiem THF bei -78°C für 30 min und Umsetzen des Enolats mit 1,15 Äq. POCl₃ und 1,15 Äq. Pyridin für 3 Stunden, wobei sich die Reaktion auf Raumtemperatur erwärmte, in das Enolbis(cyanoethyl)phosphat umgewandelt. 3-Hydroxypropionitril (2,05 ml) in 4,8 ml Pyridin wurde zugegeben und die Reaktion über Nacht gerührt. Die Reaktionslösung wurde eingedampft und der Rückstand zwischen CH₂Cl₂ und Wasser ausgeschüttelt. Die organische Schicht wurde nacheinander mit Wasser und gesätt. NaCl gewaschen, getrocknet und eingedampft. Das Produkt (45a) wurde aus dem Rückstand unter Verwendung von 70% Ethylacetat/Hexan chromatographisch isoliert; ¹H-NMR (CDCl₃) ⎕ 2,30-2,45 (m, 4H), 3,69-3,84 (m, 4H), 7,08-7,45 (m, 15H).
(c) Von Verbindung 45a wurde durch Umsetzen von 1,04 g in 30 ml Aceton, das 0,18 g in 1 ml Wasser gelöstes NaOH enthielt, über Nacht die Schutzgruppe entfernt. Das gefällte Salz wurde mit Aceton gewaschen und getrocknet, was Verbindung 45 (0,5 g) erzeugte; ¹H-NMR (D₂O) ⎕ 7,00-7,56 (m, 15H); ¹³C-NMR (D₂O) ⎕ 110,51, 110,60, 116,21, 122,29, 126,60, 126,72, 128,26, 129,54, 129,87, 129,96, 139,01, 146,75, 146,87, 156,55, 201,63; ³¹P-NMR (D₂O) ⎕ 2,15.

15. Synthese von Verbindung 46

(a) Diphenylessigsäure (6,0 g) wurde durch Erhitzen unter Rückfluss in 30 ml SOCl₂ in das Säurechlorid umgewandelt und mit 3,5 g Thiophenol in 50 ml CH₂Cl₂, das ca. 10 ml Et₃N enthielt, über Nacht verestert. Die Lösung wurde nacheinander mit Wasser, gesättigtem NaHCO₃ und Salzlösung extrahiert. Nach Trocknen über Na₂SO₄ wurden die flüchtigen Bestandteile unter Vakuum entfernt und der Thioester ohne weitere Reinigung verwendet; ¹H-NMR (CDCl₃) ⎕ 5,31 (s, 1H), 7,2-7,6 (m, 15H);
(b) Der Thioester wurde durch Deprotonierung von 3,0 g mit 1,1 Äq. LDA in wasserfreiem THF bei -78°C für 30 min. und Umsetzen des Enolats mit 1,15 Äq. POCl₃ und 1,15 Äq. Pyridin für 3,5 Stunden in das Enolbis(cyanoethyl)phosphat umgewandelt, wobei sich die Reaktion auf Raumtemperatur erwärmte. 3-Hydroxypropionitril (2,05 ml) in 4,8 ml Pyridin wurde zugegeben und die Reaktion über Nacht gerührt. Die Reaktionslösung wurde eingedampft und der Rückstand zwischen CH₂Cl₂ und Wasser ausgeschüttelt. Die organische Schicht wurde nacheinander mit Wasser und gesätt. NaCl gewaschen, getrocknet und eingedampft. Das Produkt (46a) wurde aus dem Rückstand unter Verwendung von 65% Ethylacetat/Hexan chromatographisch isoliert; ¹H-NMR (CDCl₃) ⎕ 2,3-2,5 (m, 4H), 3,62-3,82 (m, 4H), 7,2-7,45 (m, 15H).
(c) Von Verbindung 46a wurde durch Umsetzen von 1,79 g in 50 ml Aceton, das 0,3 g in 2 ml Wasser gelöstes NaOH enthielt, über Nacht die Schutzgruppe entfernt. Das gefällte Salz wurde mit Aceton gewaschen und getrocknet, was Verbindung 46 (1,5 g) erzeugte; ¹H-NMR (D₂O) ⎕ 7,08-7,44 (m, 15H); ¹³C-NMR (D₂O) ⎕ 125,78, 127,23, 127,41, 127,60, 128,11, 128,17, 129,11, 129,93, 129,54, 135,58, 135,67, 139,86, 140,74, 140,86, 141,62; ³¹P-NMR (D₂O) ⎕⎕ 2,30.

16. Synthese von Verbindung 47

(a) Ein Gemisch von 1-Pyrenessigsäure (3,00 g) und Benzolthiol (1,27 g) in 100 ml wasserfreiem THF wurde mit 2,38 g DCC durch Rühren über Nacht behandelt. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde zwischen CH₂Cl₂ und Wasser ausgeschüttelt und die organische Schicht nacheinander mit gesätt. NaHCO₃, Wasser und gesätt. NaCl gewaschen. Trocknen und Verdampfen des Lösungsmittels erzeugte das Thioesterphenyl-2-pyrenethioacetat, das mittels Chromatographie unter Verwendung von 15% Ethylacetat/Hexan gereinigt wurde; ¹H-NMR (CDCl₃) ⎕ 4,66 (s, 2H), 7,35 (s, 5H), 8,02-8,30 (m, 9H); ¹³C-NMR (CDCl₃) ⎕ 109,23, 124,96, 125,51, 127,45, 127,66, 128,33, 129,15, 129,39, 134,49, 170,01.
(b) Die Umwandlung des Thioesters in das Enobis(cyanoethyl)phosphat erfolgte durch Deprotonierung von 0,5 g des Thioesters mit 1,2 Äq. LDA in 30 ml wasserfreiem THF bei -78°C und Umsetzen des Enolats mit 1,2 Äq. POCl₃ und 1,2 Äq. Pyridin, gefolgt von Zugabe von 0,255 ml 3-Hydroxypropionitril in 0,30 ml Pyridin. Die Reaktionslösung wurde eingedampft und der Rückstand zwischen CH₂Cl₂ und Wasser ausgeschüttelt. Die organische Schicht wurde nacheinander mit Wasser und gesätt. NaCl gewaschen, getrocknet und eingedampft. Das Produkt wurde aus dem Rückstand unter Verwendung von 60% Ethylacetat/Hexan als 5:2-Gemisch von Isomeren (47a E/Z) chromatographisch isoliert; ¹H-NMR (CDCl₃) ⎕ 2,15-2,24 (m), 2,63-2,67 (m) 3,62-3,78 (m), 4,14-4,22 (m), 7,24-8,26 (m); ³¹P-NMR (CDCl₃) ⎕ 27,39, 28,16; ¹³C-NMR (CDCl₃) ⎕ 19,06, 19,15, 19,54, 19,64, 62,40, 62,46, 62,98, 63,04, 116,16, 116,49, 123,51, 123,75, 124,39, 124,54, 124,71, 124,81, 125,57, 125,63, 125,72, 125,87, 126,18, 126,39, 127,09, 127,15, 127,32, 127,46, 127,88, 128,06, 128,17, 128,27, 128,30, 128,76, 129,33, 129,42, 129,76, 129,82, 130,67, 130,85, 131,03, 131,22, 131,31, 131,40, 132,91, 141,32, 142,96, 143,11.
(c) Von Verbindung 47a wurde durch Umsetzen von 0,247 g in 6 ml Aceton, das 0,04 g in 0,1 ml Wasser gelöstes NaOH enthielt, die Schutzgruppe entfernt. Das gefällte Salz wurde mit Aceton gewaschen und getrocknet, was Verbindung 47 als Gemisch von Isomeren (47 E/Z) erzeugte; ¹H-NMR (D₂O) ⎕ 6,22 (s), 6,74-8,1 (m), 8,47 (d); ³¹P-NMR (D₂O) ⎕ 0,12, 0,69, 0,70.

17. Synthese von Verbindung 48

(a) Eine Lösung von Thioxanthon (10 g) in 60 ml Benzol wurde mit 5,0 g LAH durch Rühren für 15 min behandelt. Das Gemisch wurde erhitzt und 100 ml Ether wurden vorsichtig zugegeben. Der Rückfluss wurde für 90 min fortgesetzt. Das abgekühlte Gemisch wurde mit Wasser neutralisiert. Die Feststoffe wurden abfiltriert, und das Filtrat wurde bis zur Trockne eingedampft. Reines Thioxanthen (9,1 g, 98%) wurde mittels Chromatographie unter Verwendung von 20% Ethylacetat/Hexan isoliert; ¹H-NMR (CDCl₃) ⎕ 3,82 (s, 3H), 7,21 (m, 4H), 7,33 (m, 2H), 7,46 (m, 2H).
(b) Thioxanthen, 9,1 g, wurde in 100 ml wasserfreiem THF gelöst. Die Lösung wurde in einem Eisbad abgekühlt, und n-BuLi (24 ml einer 2,5 M Lösung) wurde tropfenweise zugegeben. Die rote Lösung wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde gerührt. Pulverisiertes CO₂ (ca. 150 g) wurde zugegeben, was die Bildung eines weißen Niederschlags bewirkte. Nach Rühren für eine weitere Stunde wurde das Gemisch eingedampft und der Rückstand in Wasser gelöst. Die wässrige Lösung wurde mit CH₂Cl₂ extrahiert und mit HCl neutralisiert. Das gefällte Produkt wurde in Ether gelöst, getrocknet und einge dampft, was Thioxanthen-9-carbonsäure als weißen Feststoff (8,8 g) erzeugte: ¹H-NMR (DMSO-d₆) ⎕ 5,25 (s, 1H), 7,30 (m, 4H), 7,49 (m, 4H), 12,60 (s, 1H).
(c) Thioxanthen-9-carbonsäure (5,8 g) und Thionylchlorid (30 ml) wurden bei Raumtemperatur für 1 Std. gerührt. Das Thionylchlorid wurde eingedampft und der Rückstand in 100 ml CH₂Cl₂ gelöst. Pyridin (4 ml) und Thiophenol (4 g) wurden zugegeben und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur für 5 Std. gerührt. Das Gemisch wurde eingedampft und der Rückstand mit Wasser, gefolgt von Ether, gewaschen. Der Thioester wurde mittels Chromatographie unter Verwendung von 20% Ethylacetat/Hexan gereinigt, was 6,3 g reines Phenylthioxanthen-9-thiocarboxylat ergab: ¹H-NMR (CDCl₃) ⎕ 5,16 (s, 1H), 7,32 (m, 9H), 7,50 (m, 4H); ¹³C-NMR (CDCl₃) ⎕ 63,0, 126,9, 127,3, 128,1, 128,4, 129,2, 129,4, 130,9, 132,4, 133,7, 134,5, 196,5.
(d) Der Thioester (4,6 g) wurde mit 1,5 Äq. LDA in 40 ml wasserfreiem THF bei -78°C für 30 min deprotoniert. Eine Lösung von POCl₃ (3,2 g) und Pyridin (1,66 g) in 10 ml wasserfreiem THF wurde zur Reaktion tropfenweise zugegeben, die man sich auf Raumtemperatur erwärmen ließ. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 45 min wurde eine Lösung von Cyanoethanol (5,68 g) und Pyridin (6,3 g) zugegeben, und das Rühren dauerte über Nacht an. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat zu einem dicken Rückstand eingeengt, der unter Verwendung von 70% Ethylacetat/Hexan chromatographisch aufgetrennt wurde. Das Enolbis(cyanoethyl)phosphat (48a) wurde als Schaum (3,1 g) erhalten; ¹H-NMR (CDCl₃) ⎕ 2,52 (m, 4H), 3,94 (m, 4H), 7,20-7,48 (m, 10H), 7,55 (dd, 1H), 7,74 (dd, 1H), 7,85 (dd, 1H); ¹³C-NMR (CDCl₃) ⎕ 19,5, 62,5, 116,6, 126,2, 126,3, 126,7, 127,0, 127,1, 128,0, 128,1, 128,2, 129,1, 129,5, 129,7, 132,5, 133,0, 133,3, 134,2, 134,3, 134,6, 137,7, 137,8; ³¹P-NMR (CDCl₃) ⎕ -10,35 (p).
(e) Von Verbindung 48a wurde durch Umsetzen von 1,8 g in 40 ml mit Argon gespültem Aceton, das 0,28 g in 5,6 ml Wasser gelöstes NaOH enthielt, über Nacht die Schutzgruppe entfernt. Das gefällte Salz wurde mit 10% wäss. Aceton gewaschen und getrocknet, was Verbindung 48 (1,57 g) als weißen Feststoff erzeugte; ¹H-NMR (D₂O) ⎕ 6,94-7,25 (m, 9H), 7,38 (m, 2H), 7,76 (d, 1H), 8,08 (d, 1H); ³¹P-NMR (D₂O) ⎕ 0,73 (s).

18. Synthese von Verbindung 49
Verbindung 49 wurde durch die im vorherigen Beispiel beschriebene Reaktionsfolge hergestellt, wobei im Schritt (c) Thiophenol an Stelle von Phenol eingesetzt wurde.

(a) Phenylthioxanthen-9-thiocarboxylat: ¹H-NMR (CDCl₃) ⎕ 5,26 (s, 1H), 6,94 (d, 2H), 7,15 (t, 1H), 7,24-7,34 (m, 6H), 7,51 (m, 4H).
(b) 9-(Phenoxyphosphoryloxymethyliden)thioxanthen, Bis(cyanoethyl)ester (49a); ¹H-NMR (CDCl₃) ⎕ 2,50 (m, 4H), 3,84 (m, 2H), 4,02 (m, 2H), 7,16 (m, 5H), 7,29-7,54 (m, 7H), 7,82 (d, 1H); ¹³C-NMR (CDCl₃) ⎕ 19,5, 63,0, 124,1, 126,4, 126,5, 126,8, 127,5, 127,8, 128,0, 129,2, 130,1, 131,2, 131,4, 133,4, 134,4, 142,7, 142,9, 155,0; ³¹P-NMR (CDCl₃) ⎕ -10,92 (p) (c) 9-(Phenoxyphosphoryloxymethyliden)thioxanthen, Dinatriumsalz (49); ¹H-NMR (D₂O) ⎕ 6,92 (t, 1H) 7,04 (t, 2H), 7,07-7,34 (m, 6H), 7,38 (t, 1H), 7,45 (d, 1H), 7,71 (d, 1H), 8,05 (d, 1H); ³¹P-NMR (D₂O) ⎕ 0,22 (s).

19. Synthese von Verbindung 50
Phenyl-10-methylacridan-9-thiocarboxylat, 1,0 g, wurde mit LDA in 60 ml wasserfreiem THF bei -70°C in das Enolat umgewandelt. Nachdem die Temperatur für 1 Std. bei -70°C gehalten wurde, wurden 0,76 g Methyltriflat zugegeben, und man ließ das Reaktionsgemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen. Das Gemisch ließ man für 4 Tage stehen. CH₂Cl₂ (150 ml) wurde zugegeben, die Lösung wurde mit Wasser extrahiert und auf Na₂SO₄ getrocknet. Der rohe Produkt wurde mittels präp. DC mit einem Elutionsmittel aus 70/30 Hexan:CH₂Cl₂ gereinigt. ¹H-NMR (CDCl₃) ⎕ 3,53 (s, 3H), 3,56 (s, 3H), 6,93-7,45 (m, 11 H), 7,71 (d, 1 H), 7,93 (d, 1H).
20. Chemilumineszenter Nachweis von HRP mit Acridanphosphat 5
Reagenzzusammensetzungen, die 0,055 M Tris-Puffer, pH 8,6, 0,25 mM Harnstoffperoxid, 0,05 mM p-Phenylphenol, 0,5 mM EDTA, 0,0125% Tween 20 und 3,3 × 10^-4 M Acridan 5 umfassten, wurden durch Umsetzen dreifacher 100-μl-Aliquots mit 10 μl Lösungen von HRP in Wasser, die zwischen 1,4 × 10^-15 und 1,4 × 10^-19 mol Enzym enthielten, auf die Produktion von Chemilumineszenz getestet. Die Lichterzeugung begann nach Mischen und wurde nach 5, 10 und 15 min gemessen. Die Beziehung zwischen der Chemilumineszenzintensität bei 15 min und der Menge an Enzym ist in 1 dargestellt.
21. Chemilumineszenter Nachweis von HRP mit Acridanphosphat 13.
Reagenzzusammensetzungen, die 0,055 M Tris-Puffer, pH 8,6, 0,25 mM Harnstoffperoxid, 0,05 mM p-Phenylphenol, 0,5 mM EDTA, 0,.0125% Tween 20 und 3,3 × 10⁴ M Acridan 13 umfassten, wurden durch Umsetzen dreifacher 100-μl-Aliquots mit 10 μl Lösungen von HRP in Wasser, die zwischen 1,4 × 10^-15 und 1,4 × 10^-19 mol Enzym enthielten, auf die Produktion von Chemilumineszenz getestet. Die Lichterzeugung begann nach Mischen und wurde nach 15 min gemessen. Die Beziehung zwischen der Chemilumineszenzintensität und der Menge an Enzym ist in 2 dargestellt.
22. Chemilumineszenter Nachweis mit den Acridanphosphaten 1-4 und 6-12 und 14.
Auf die Weise des Beispiels 21 wurden Zusammensetzungen, die jeweils die Verbindungen 1-4 und 6-12 und 14 enthielten, mit HRP bei 25°C umgesetzt. Jede erzeugte leicht messbare Chemilumineszenz, die über dem Hintergrund, der in Abwesenheit von HRP gemessen wurde, unterschieden werden konnte.
23. Kinetisches Profil der Chemilumineszenzintensität.
Das Chemilumineszenzprofil von Acridanphosphat 5, das mit HRP umgesetzt wurde, ist in 3 dargestellt. Die Reaktion von 100 μl der Reagenzzusammensetzung von Beispiel 20 mit 1,4 × 10^-15 mol HRP bei 25°C verursachte einen sofortigen Anstieg der Lichtemission, die in ca. 5 min maximale Intensität erreichte.
24. Chemilumineszenter Nachweis von HRP mit Acridandiethylphosphat 37.
Reagenzzusammensetzungen, die 0,01 M Tris-Puffer, pH 8,0, 0,5 mM Harnstoffperoxid, 0,1 mM p-Phenylphenol, 1 mM EDTA, 0,025% Tween 20 und 5 × 10^-5 M Acridan 37 umfassten, wurden durch Umsetzen dreifacher 100-μl-Aliquots mit 10 μl HRP im Bereich von 1,4 × 10^-14 bis 1,4 × 10^-19 mol auf die Produktion von Chemilumineszenz getestet. Die Lichterzeugung begann nach Mischen und wurde nach 2 min gemessen. Die Beziehung zwischen der Chemilumineszenzintensität und der Menge an Enzym ist in 4 dargestellt.
25. Chemilumineszenter Nachweis von HRP mit Acridandiethylphosphat 38.
Eine Reagenzzusammensetzung (40 μl), die 0,01 M Tris-Puffer, pH 8,0, 0,5 mM Harnstoffperoxid, 0,1 mM p-Phenylphenol, 1 mM EDTA, 0,025% Tween 20 und 5 × 10^-5 M Acridan 38 umfasste, wurde mit 1 μl einer Lösung umgesetzt, die 1,4 × 10^-15 mol HRP enthielt. Die Lichterzeugung begann nach Mischen und erreichte in 1 min maximale Intensität. Das Zeitprofil der Chemilumineszenz ist in 5 dargestellt.
26. Chemilumineszenter Nachweis von HRP mit Acridanacetat 39.
Reagenzzusammensetzungen, die 0,01 M Tris-Puffer, pH 8,0, 0,5 mM Harnstoffperoxid, 0,1 mM p-Phenylphenol, 1 mM EDTA, 0,025% Tween 20 und 5 × 10^-5 M Acridan 39 umfassten, wurden durch Umsetzen dreifacher 100-μl-Aliquots mit 10 μl HRP im Bereich von 1,4 × 10^-15 bis 1,4 × 10^-20 mol auf die Produktion von Chemilumineszenz getestet. Die Lichterzeugung begann nach Mischen und erreichte in 30 min maximale Intensität. Die Beziehung zwischen der Chemilumineszenzintensität und der Menge an Enzym ist in 6 dargestellt.
27. Chemilumineszenter Nachweis von HRP mit Acridanacetat 40.
Eine Reagenzzusammensetzung (100 μl), die 0,01 M Tris-Puffer, pH 8,0, 0,5 mM Harnstoffperoxid, 0,1 mM p-Phenylphenol, 1 mM EDTA, 0,025% Tween 20 und 5 × 10^-5 M Acridan 40 umfasste, wurde mit 10 μl einer Lösung umgesetzt, die 1,4 × 10^-15 mol HRP enthielt. Die Lichterzeugung begann nach Mischen und erreichte in 7 min maximale Intensität.
28. Chemilumineszenter Nachweis von HRP mit Acridan 50.
Eine Reagenzzusammensetzung (100 μl), die 0,01 M Tris-Puffer, pH 8,0, 0,5 mM Harnstoffperoxid, 0,1 mM p-Phenylphenol, 1 mM EDTA, 0,025% Tween 20 und 5 × 10^-5 M Acridan 50 umfasste, wurde mit 2,5 μl einer Lösung umgesetzt, die 3,5 × 10^-16 mol HRP enthielt. Die Lichterzeugung begann nach Mischen und erreichte in 7 min maximale Intensität. Das Zeitprofil der Chemilumineszenz ist in 7 dargestellt.
29. Chemilumineszenter Nachweis von HRP mit Verbindung 43.
Reagenzzusammensetzungen, die 0,055 M Tris-Puffer, pH 8,6, 0,25 mM Harnstoffperoxid, 0,05 mM p-Phenylphenol, 0,5 mM EDTA, 0,0125% Tween 20, 1 mM CTAB und 6,6 × 10^-4 M Acridan 43 umfassten, wurden durch Umsetzen dreifacher 100-μl-Aliquots mit 10 μl Lösungen von HRP, die zwischen 1,4 × 10^-15 und 1,4 × 10^-19 mol HRP enthielten, auf die Produktion von Chemilumineszenz getestet. Die Beziehung zwischen der Chemilumineszenzintensität bei 15 min und der Menge an Enzym ist in 8 dargestellt.
30. Chemilumineszenter Nachweis von HRP mit Verbindung 46 und Verstärkung der Chemilumineszenz mit einem Energietransfermittel.
Reagenzzusammensetzungen, die 0,055 M Tris-Puffer, pH 8,6, 0,25 mM Harnstoffperoxid, 0,05 mM p-Phenylphenol, 0,5 mM EDTA, 0,0125% Tween 20, 1 mM CTAB und 6,6 × 10^-4 M Verbindung 46 allein oder mit 50 μM DBA umfassten, wurden durch Umsetzen eines 100-μl-Aliquots mit 3,5 × 10^-15 mol HRP auf die Produktion von Chemilumineszenz getestet. Die relativen Chemilumineszenzzeitprofile sind in 9 dargestellt und zeigen die Verstärkung von Chemilumineszenz durch den Triplett-Energieakzeptor DBA.
31. Chemilumineszenter Nachweis von HRP mit Verbindung 48.
Reagenzzusammensetzungen, die 0,055 M Tris-Puffer, pH 8,6, 0,25 mM Harnstoffperoxid, 0,05 mM p-Phenylphenol, 0,5 mM EDTA, 0,0125% Tween 20 und 3,3 × 10^-4 M Verbindung 48 umfassten, wurden durch Umsetzen eines 100-μl-Aliquots mit 3,5 × 10^-15 mol HRP auf die Produktion von Chemilumineszenz getestet. Das Zeitprofil der Chemilumineszenz ist in 10 dargestellt.
32. Chemilumineszenter Nachweis von HRP mit Verbindung 49.
Reagenzzusammensetzungen, die 0,055 M Tris-Puffer, pH 8,6, 0,25 mM Harnstoffperoxid, 0,05 mM p-Phenylphenol, 0,5 mM EDTA, 0,0125% Tween 20 und 3,3 × 10^-4 M Verbindung 49 umfassten, wurden durch Umsetzen eines 100-μl-Aliquots mit 3,3 × 10^-15 mol HRP auf die Produktion von Chemilumineszenz getestet. Das Zeitprofil der Chemilumineszenz ist in 11 dargestellt.
33. Western-Blot-Assay unter Verwendung von PVDF-Membran.
Erfindungsgemäße Zusammensetzungen wurden zum Nachweis und zur Quantifizierung eines Proteins, β-Galactosidase (β-Gal), in einem Western-Blot mit einem HRP-markierten Antikörper auf einer Polyvinylidendifluorid- (PVDF-) Membran verwendet. Verdünnungen von β-Gal, die 5000, 1000, 180, 30 bzw. 5 pg Protein enthielten, wurden elektrophoretisch aufgetrennt und auf PVDF-Membranen (Millipore, Bedford, MA) übertragen. Die Membranen wurden mit 1% fettfreier Milch in 7-TBS (0,05% Tween 20 in TBS; TBS ist 50 mmol/l Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 mol/l NaCl) blockiert und dann nacheinander mit einer 1:1500-Verdünnung von Maus-anti-β-Gal (Boehringer-Mannheim, Indianapolis) und einer 1:600-Verdünnung von Schaf-anti-Maus-HRP-Konjugat (Boehringer-Mannheim) umgesetzt. Die Membranen wurden in T-TBS gewaschen und für 3 min mit einem Reagenz getränkt, das 0,055 M Tris-Puffer, pH 8,6, enthielt, der 0,66 mM Acridanphosphat 5, 0,05 mM p-Phenylphenol, 0,25 mM Harnstoffperoxid, 0,5 mM EDTA, 0,0125% Tween 20 enthielt. Die Membranen wurden zwischen transparente Kunststofffolien eingebracht und mit einem Röntgenfilm exponiert. 12 zeigt den Nachweis von β-Gal nach 14 min mit Exponieren für 30 s. Das erzeugte Licht führte zu einer intensiven Emission, die für mehrere Stunden abgebildet werden konnte.
34. Western-Blot unter Verwendung von Nitrocellulosemembran.
Ein Western-Blot-Assay gemäß dem Verfahren im vorhergehenden Beispiel wurde unter Verwendung von Nitrocellulosemembran (Schleicher & Schuell, Keene, NH) als Festphase durchgeführt. β-Gal-Standards im Bereich of 5000-5 pg wurden verwendet. Das Nachweisreagenz des vorhergehenden Beispiels ermöglichte, dass der Nachweis über mehrere Stunden durchgeführt werden konnte. 13 zeigt den Nachweis von β-Gal nach 10 min mit Exposition für 5 min.
35. Western-Blot unter Verwendung anderer erfindungsgemäßer chemilumineszenter Reaenzien.
Ähnliche Western-Blot-Assays von β-Galactosidase sowohl auf PVDF- als auch auf Nitrocellulosemembranen unter Verwendung von Nachweisreagenzien, die an Stelle von Verbindung 5 jeweils die Verbindungen 1, 12 und 13 enthielten, ergaben qualitativ das gleiche Ergebnis.
35. Southern-Blot unter Verwendung eines erfindungsgemäßen chemilumineszenten Reaenzes.
Ein Southern-Blot-Assay kann gemäß den im U.S.-Patent 5,593,845 des Anmelders beschriebenen Verfahren durchgeführt werden, wobei an Stelle des darin beschriebenen Nachweisreagenzes eine Reagenzzusammensetzung gemäß dem erfindungsgemäßen Beispiel 20 oder 33 eingesetzt wird.

Claims

Verfahren zur Erzeugung einer Chemilumineszenz, das ein Umsetzen eines Peroxidaseenzyms mit einer Peroxidase und zumindest einer Verbindung der Formel I
umfasst, wobei X aus substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, substituierten oder unsubstituierten Aryl-, substituierten oder unsubstituierten Aralkylgruppen oder 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, substituierten oder unsubstituierten Alkyl- oder Arylcarboxylgruppen mit von 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, Tri- (C₁-C₈-alkyl) silylgruppen, einer SO₃ ^--Gruppe, Glycosylgruppen und Phosphorylgruppen der Formel -PO(OR')(OR''), wobei R' und R" unabhängig aus substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, substituierten oder unsubstituierten Aryl- und substituierten oder unsubstituierten Aralkylgruppen von 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, aus Trialkylsilylgruppen, Alkalimetallkationen und Erdalkalimetallkationen ausgewählt ist, Z¹ und Z² unabhängig aus O- und S-Atomen ausgewählt sind, R¹ eine organische Gruppe mit von 1 bis 50 Nicht-Wasserstoffatomen ist, ausgewählt aus C-, N-, O-, S-, P-, Si- und Halogenatomen, um die Chemilumineszenz zu erzeugen, und einer Verbindung mit einem angeregten Elektronen-Zustand mit der Formel A¹A²C = O*, wobei A¹ und A² unabhängig aus Wasserstoff, Alkyl-, substituierten Alkyl-, Aryl-, substituierten Aryl-, Aralkyl-, substituierten Aralkyl-, Heteroaryl-, substituierten Heteroaryl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Alkoxy-, Aryloxy- und Alkylthiogruppen ausgewählt ist, vorausgesetzt, dass zumindest eines nicht Wasserstoff ist, und wobei A¹ und A² zusammen in einem heterocyclischen oder carbocyclischen Ring verbunden sein können, wobei A¹ und A² beide nicht Wasserstoff sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verbindung nach Formel I aus Verbindungen der Formel II ausgewählt ist:
wobei A¹ und A² zusammen zur Bildung einer heterocyclischen Ringgruppe Het gebunden sind, die zumindest einen 5- oder 6-gliedrigen Ring umfasst, der zumindest ein Heteroatom enthält, ausgewählt aus N-, O- und S-Atomen.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Verbindung nach Formel II aus Verbindungen der Formel III und Verbindungen der Formel IV ausgewählt ist:
wobei Q aus NR⁶-, O- und S-Atomen ausgewählt ist, wobei jedes von R² bis R⁵ ein Substituent ist, der von 1 bis 50 Atomen enthält, ausgewählt aus C-, H-, N-, O-, S-, P- und Halogenatomen, die erlauben, dass eine Chemilumineszenz erzeugt wird, und wobei Paare benachbarter Gruppen zusammen gebunden werden können, um ein carbocyclisches oder heterocyclisches Ringsystem zu bilden, das zumindest einen 5- oder 6-gliedrigen Ring umfasst, und wobei R⁶ eine organische Gruppe ist, die von 1 bis 50 Nicht-Wasserstoffatome enthält, ausgewählt aus C-, N-, O-, S-, P-, Si- und Halogenatomen.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei in der Verbindung von Formel III Q die NR⁶-Gruppe ist, Z² das O-Atom ist und die Formel V aufweist:
wobei jedes von R⁷ bis R¹⁴ unabhängig ein Substituent ist, der von 1 bis 50 Atome enthalten kann, ausgewählt aus C-, H-, N-, O-, S-, P-, Si- und Halogenatomen, und der ermöglicht, dass eine Chemilumineszenz erzeugt werden kann.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei zumindest eines von R¹ bis R¹⁴ eine Halogen- oder eine Alkoxygruppe ist und der Rest von R⁷ bis R¹⁴ Wasserstoff ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei R⁶ aus substituierten oder unsubstituierten C₁-C₄-Alkyl-, substituierten oder unsubstituierten Benzyl-, Alkoxyalkyl- und Carboxyalkylgruppen ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die Verbindung von Formel V die folgende Formel aufweist:
wobei R' und R'' unabhängig ausgewählt sind aus substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, substituierten oder unsubstituierten Aryl-, substituierten oder unsubstituierten Aralkylgruppen oder 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, Trialkylsilylgruppen, Alkalimetallkationen und Erdalkalimetallkationen, Alkalimetallkationen.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei R' und R'' unabhängig aus Alkalimetallkationen ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Verbindung der Formel V aus
ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Verbindung der Formel V die folgende Formel auf weist:
wobei R¹⁵ eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl- oder eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei jedes von R⁷ bis R¹⁴ ein Wasserstoffatom ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei in der Verbindung der Formel III Q das S-Atom ist, Z² das O-Atom ist, R¹ eine Phenylgruppe ist und X die Phosphorylgruppe ist und die folgende Formel aufweist:
wobei R' und R'' unabhängig ausgewählt sind aus substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, substituierten oder unsubstituierten Aryl- und substituierten oder unsubstituierten Aralkylgruppen von 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, Trialkylsilylgruppen, Alkalimetallkationen und Erdalkalimetallkationen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eines von A¹ und A² eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe ist und das andere aus Wasserstoff, substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, Alkoxy-, Alkylthio- und Arylgruppen ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei zumindest eines von A¹ und A² eine Arylgruppe ist, die 1 bis 4 kondensierte carbocyclische oder heterocyclische 5- oder 6-gliedrige Ringe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Arylgruppe aus der Gruppe ausgewählt ist, die Phenyl-, Naphthyl-, Anthryl- und Pyrenylgruppen umfasst, die mit Nicht-Wasserstoffsubstituenten substituiert sein können.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Nicht-Wasserstoffsubstituenten aus Amino, Alkylamino, Dialkylamino und OY' ausgewählt sind, wobei Y' Wasserstoff oder ein Alkalimetallion ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei die Formel I die folgende Struktur aufweist:
wobei Y aus Wasserstoff, einem Alkalimetallion oder einem substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, substituierten oder unsubstituierten Aryl-, substituierten oder unsubstituierten Aralkyl- und Trialkylsilylgruppen ausgewählt ist, wobei Y' aus Wasserstoff und Alkalimetallion, einem Alkylcarboxyester, Arylcarboxyester, substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, substituierten oder unsubstituierten Aryl-, substituierten oder unsubstituierten Aralkylgruppen und Trialkylsilylgruppen ausgewählt ist und Y'' aus Wasserstoff und Halogen ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei Y aus einem Alkalimetallion oder Wasserstoff ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, wobei Y'' Chlor ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Peroxidaseenzym aus Lactoperoxidase, Mikroperoxidase, Myeloperoxidase, Haloperoxidase, Vanadiumbromperoxidase, Meerrettichperoxidase, Pilzperoxidasen, Sojaperoxidasen, Peroxidase mimetischen Verbindungen und Peroxidasekonjugaten ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Peroxidaseenzym Meerrettichperoxidenzym Meerrettichperoxidase ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 21, wobei das Peroxidasekonjugat ein Peroxidaseenzym umfasst, gebunden an ein biologisches Molekül, ausgewählt aus der Grup pe, die aus Haptenen, Antikörpern, Proteinen, Nucleinsäuren und Oligonucleotiden besteht.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Peroxid aus Wasserstoffperoxid, Harnstoffperoxid, Perboratsalzen und Alkylhydroperoxiden ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das weiterhin zumindest eine Enhancer-Verbindung in einer Menge einschließt, die zur Steigerung der Chemilumineszenz wirksam ist, wobei die Enhancer-Verbindung vorzugsweise aus phenolischen Verbindungen, aromatischen Aminen und Arylboronsäureverbindungen ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das weiterhin einen nichtionischen oder kationischen oberflächenaktiven Stoff einschließt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das weiterhin den Einschluss eines Lumineszenzenergietransfermittels einschließt.
Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit oder der Menge eines Analyten in einem Assay-Verfahren durch eine Chemilumineszenz-Reaktion gemäß Anspruch 1, das folgendes umfasst: a) Umsetzen einer Peroxidverbindung und eines Peroxidaseenzyms mit zumindest einer Verbindung nach Formel I, wie in einem der Ansprüche 1 bis 19 definiert; und b) Inbezugsetzen der erzeugten Chemilumineszenzmenge mit der Anwesenheit oder Menge des Analyten, wobei der Analyt entweder das Peroxid oder die Peroxidase ist.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei der Analyt das Peroxid oder das Peroxidenzym ist.
Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit oder der Menge eines Analyten in einem Assay-Verfahren durch eine Chemilumineszenzreaktion gemäß Anspruch 1, das folgendes umfasst: a) Umsetzen einer Peroxidverbindung und eines Peroxidasekonjugats, das ein Peroxidaseenzym, gebunden an einen spezifischen Bindungspartner, umfasst, mit zumindest einer Verbindung nach Formel I, wie in einem der Ansprüche 1 bis 19 definiert; und b) Inbezugsetzen der erzeugten Chemilumineszenzmenge mit der Anwesenheit oder Menge des Analyten.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei der spezifische Bindungspartner aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Haptenen, Antigenen, Antikörpern, Nucleinsäuren und Oligonucleotiden besteht.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Peroxidasekonjugat an den Analyten oder an einen zweiten spezifischen Bindungspartner bindet und der zweite spezifische Bindungspartner an den Analyten bindet.
Verfahren nach Anspruch 29, verwendet in einem Immun-Assay, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, die aus einem Sandwich-Assay, einem Nucleinsäurehybridisierungs-Assay, Western-Blot-Assay, Southern-Blot-Assay und Northern-Blot-Assay besteht.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Sandwich-Assay ein kompetitiver Assay ist.
Verfahren zum Nachweisen eines Analyten, ausgewählt aus einem Oxidaseenzym oder einem Substrat für das Oxidaseenzym in einem Assay-Verfahren durch eine Chemilumineszenzreaktion gemäß Anspruch 1, das folgendes umfasst: a) Umsetzen des Oxidaseenzyms und des Substrates, um dadurch Wasserstoffperoxid zu erzeugen; b) Umsetzen des Wasserstoffperoxids mit einem Peroxidaseenzym und einer Verbindung der Formel I, wie in einem der Ansprüche 1 bis 15 definiert; und c) Inbezugsetzen der Menge an Chemilumineszenz, erzeugt durch die Anwesenheit oder der Menge des Analyten.
Reagenzzusammensetzung, die eine Chemilumineszenz gemäß Anspruch 1 in Gegenwart eines Peroxidaseenzyms erzeugt, das in einer wässrigen Lösung folgendes umfasst: a) Verbindung nach Formel I, wie in einem der Ansprüche 1 bis 19 definiert; und b) eine Peroxidverbindung.
Zusammensetzung nach Anspruch 35, die weiterhin zumindest einen Enhancer umfasst, ausgewählt aus phenolischen Verbindungen, aromatischen Aminen und Arylboronsäureverbindungen in einer Menge, die zur Steigerung der Chemilumineszenz wirksam ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 36, wobei zumindest ein Enhancer aus p-Phenylphenol, p-Iodphenol, p-Bromphenol, p-Hydroxyzimtsäure, p-Imidazolylphenol, Paracetamol, 2,4-Dichlorphenol, 2-Naphthol und 6-Brom-2-naphthol ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 36, die weiterhin zumindest einen nicht-ionischen oberflächenaktiven Stoff umfasst, ausgewählt aus polyoxyethylenierten Alkylphenolen, polyoxyethylenierten Alkoholen, polyoxyethylenierten Ethern und polyoxyethylenierten Sorbitolestern.
Zusammensetzung nach Ansprüchen 36 bis 38, die weiterhin einen kationischen oberflächenaktiven Stoff einschließt.
Zusammensetzung nach Anspruch 36 bis 39, die weiterhin ein Lumineszenzenergietransfermittel einschließt.