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Diese
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfernung bakterieller Endotoxine
aus pharmazeutischen Zusammensetzungen, beispielsweise Impfstoffzusammensetzungen.
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Endotoxine
sind Lipopolysaccharide, die für
gewöhnlich
von den Zellwänden
von Bakterien und insbesondere von Gram-negativen Bakterien abgeleitet
sind.
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Eine
Verunreinigung mit Endotoxin stellt ein häufiges Problem in der pharmazeutischen
Industrie und insbesondere in nicht-sterilen Herstellungsverfahren
dar.
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Impfstoffe,
beispielsweise virale Impfstoffe, können durch Inokulieren eines
geeigneten viralen Substrats mit einem Virus hergestellt werden,
Inkubieren des Substrats um virale Replikationen zu ermöglichen,
und anschließend
Ernten des Virus von dem Substrat.
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Der
Virus wird anschließend
unter Verwendung eines geeigneten Inaktivierungs-Mittels inaktiviert, die virale Lösung wird
weiter verarbeitet und gereinigt, um den Impfstoff zu erhalten.
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In
einem Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen und insbesondere
von viralen Impfstoffen, wie beispielsweise einem Grippe bzw. Influenza-Impfstoff
werden Eier als das Substrat für
das Virus verwendet. Die Eier werden anschließend mit einem Impfvirus inokuliert,
inkubiert um virale Replikationen zu ermöglichen und das den Virus enthaltende
Allantois-Fluid wird von den Eiern geerntet. Das Allantois Fluid
wird anschließend einer
Reihe von Aufreinigungs-Schritten unterzogen, um eine gereinigte
virale Fraktion zu erhalten, die anschließend mit einem Detergens, wie
beispielsweise Triton, lysiert werden kann, um das Virus aufzubrechen bzw.
aufzuschließen
und die erwünschten
viralen Antigene freizusetzen. Die viralen Antigene werden weiter gereinigt,
und wahlweise, wenn es erwünscht
ist, mit anderen Antigenen gemischt, um eine multivalente Impfstoffzusammensetzung
zu erhalten. Eine Herstellung der Impfstoffe wird für gewöhnlich in
sterilen Räumlichkeiten
durchgeführt
und Konservierungsmittel, wie beispielsweise Thiamersal, werden
an verschiedenen Stufen während
des Prozesses hinzugegeben, um bakterielles Wachstum zu minimieren
oder zu verhindern.
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Falls
Eier als das virale Substrat verwendet werden, obgleich sie vor
einer Inokulierung zur Verringerung der Gesamtkeimzahl einem Reinigungsprozess
unterzogen werden, garantiert der Reinigungsprozess keine vollständige Entfernung
von Mikroorganismen. Es ist darüber
hinaus möglich,
dass die Eier nicht pathogenfrei sein und Bakterien enthalten können. Folglich
werden sich irgendwelche verunreinigenden Bakterien ebenso während des
Zeitraums des viralen Wachstums in den Eiern vermehrt. Obwohl die
Bakterien durch ein Konservierungsmittel abgetötet werden können, verbleiben
die Endotoxin enthaltenden bakteriellen Zellwände. Während des Aufschlusses der
viralen Partikel mit Detergens werden die bakteriellen Zellwände ebenso aufgebrochen,
was. zur Freisetzung von Endotoxin führt, was in die endgültige Impfstoffzusammensetzung mitaufgereinigt
werden kann. Falls hohe Niveaus bakteriellen Endotoxins in dem Impfstoff
nachgewiesen werden, besteht die momentane Vorgehensweise darin,
den verunreinigten Impfstoff zu verwerfen, eher als einen Versuch
zur Entfernung des Endotoxins zu unternehmen. Daher kann eine bedeutsame
und teure Verunreinigung während
einer Impfstoffherstellung als ein Ergebnis einer Endotoxinkontamination
herrühren.
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Eine
Endotoxin Verunreinigung stellt ein besonderes Problem bei der Herstellung
von Grippe-Impfstoffen dar. Die Hauptbestandteile von Grippe Impfstoffen
sind die Haemagglutinin (HA) Oberflächen-Antigene zusammen mit
geringeren Mengen an Neuraminidase-Oberflächen-Antigenen (NA). Beide,
das HA und NA, können
charakteristische Rosettenstrukturen ausbilden, entweder alleine
oder als gemischte Rosetten, die beide Arten von Antigenen enthalten.
Dieses Verhalten ist für
Membran-Proteine gewöhnlich,
wo die hydrophoben Stränge
(stalks), die die Membran durchlaufen, zur selbst-Assoziierung gezwungen
werden, um eine stabile, hydrophobe Mikroumgebung zu erzeugen.
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Die
Haemaglutinine liegen im Allgemeinen in der Form von Trimeren vor,
während
die Neuraminidase-Antigene dazu tendieren, in tetrameren Formen
vorzuliegen. Rosetten sind, wenn einmal gebildet, sehr stabil und
werden beispielsweise mit Detergenzien nicht einfach aufgeschlossen
(Sian Renfrey PhD Thesis, University of Oxford 1994).
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Bakterielle
Endotoxine sind Lipopolysaccharide, die eine große hydrophile Polysaccharid-Kette
aufweisen, und einen hydrophoben, Fettsäure enthaltenden Rest. Daher
weisen sie eine amphiphile Struktur auf. Falls sie in einer wässrigen
Umgebung vorliegen, besteht für
sie eine Tendenz zur Bildung von Aggregaten.
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Es
wurde gefunden, das Grippe-Oberflächen-Antigene und Endotoxin
voneinander schwierig zu trennen sind, und es wird angenommen, dass
dies auf Grund der Tatsache sein kann, dass beide Grippe-Oberflächen-Antigene,
wie beispielsweise HA, und Endotoxin eine amphiphile Struktur aufweisen,
und unter wässrigen
Bedingungen stark assoziiert werden können. Es scheint ebenso, dass
Endotoxin in die HA/NA Rosetten aufgenommen wird.
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Ein
Verfahren zur Entfernung von Endotoxin von Impfstoffzusammensetzungen
muss eine Anzahl von Kriterien erfüllen. Zuerst darf das Verfahren
nicht zu einem übermäßigen Verlust
des erzeugten bzw. Produkt Antigens führen. Zweitens muss es in der
Lage sein, vergleichsweise hohe Konzentrationen an Endotoxin zu entfernen
(beispielsweise sollte es in der Lage sein, die Niveaus an Endotoxin
auf weniger als 200 EU/ml, bspw. auf weniger als 100 EU/ml zu verringern).
Das Verfahren darf keine möglicherweise
toxischen Chemikalien in das Produkt einbringen und irgendwelche
verwendeten Chemikalien dürfen
die Antigene nicht nachteilig beeinflussen. Ein solches Verfahren
muss daher ebenso für
eine Maßstabsvergrößerung zur
Verwendung unter Herstellungsbedingungen geeignet sein. Ein Verfahren, das
ausschließlich
bei kleinen Maßstäben funktioniert,
das aber nicht effizient im Maßstab
vergrößert werden
kann, ist in einem Zusammenhang mit einer Herstellung nicht von
Nutzen. Schließlich
ist es wünschenswert,
dass das Verfahren zur Entfernung von Endotoxin in der Lage sein
sollte, unter Verwendung vorhandener Verfahrens- und Herstellungsausrüstung durchgeführt zu werden.
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Eine
Anzahl von Versuchen wurde unternommen, um Endotoxin von Impfstoffen
zu entfernen, allerdings waren diese bis jetzt im Allgemeinen ohne
Erfolg.
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Sucrose-Dichtegradient-Zentrifugation
ist eine Technik, die auf der Trennung von Substanzen auf Grundlage
ihrer spezifischen, molekularen Dichten beruht, wobei angenommen
wird, das keine Interaktion zwischen ihnen besteht. Diese Technik
wurde von den vorliegenden Anmeldern auf das Problem einer Endotoxin-Entfernung
von Grippe-Antigen-Lösungen angewendet;
wobei es gefunden wurde, dass obgleich 30 % des Endotoxins von dem
Haemagglutinin auf dem Sucrose-Dichtegradienten getrennt eluiert
wurden, die verbleibenden 70 % mit dem Oberflächen-Antigen assoziiert verblieben.
Eine Zugabe von Detergens zu den Sucrose-Dichtegradienten verbesserte
eine Endotoxin-Auflösung
von Haemagglutinin ausschließlich
zu einem vergleichsweise geringen Ausmaß.
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Es
wurde berichtet, dass Triethylamin mit Endodoxin wechselwirkt, und
ein Ansteigen in einer Endotoxin-Hydrophobizität verursacht, wobei es anschließend postuliert
wurde, dass Triethylamin eine Trennung des HA/NA-Endoxinkomplexes
induzieren kann, von dem eine Bildung angenommen wurde. Triethylamin
wurde daher zu dem Sucrose-Dichtegradienten hinzugegeben, allerdings
war dies bei einer Verbesserung der Auflösung von Endotoxin von Haemagglutininen
ohne Erfolg.
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Nicht
spezifische Absorptionen von Endodoxin auf aktivierte Aktivkohle,
Glas, Anionen-Austausch Medien (DEAE) und Polystyrol wurden ebenso
versucht, wobei derartige Versuche ohne Erfolg waren.
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Die
EP 0083999 beschreibt ein
Verfahren zur Depyrogenese (depyrogenating) proteinhaltiger Produkte
durch verlängerten
Kontakt mit einer Lösung
oder Suspension eines nicht-denaturierenden, nicht-ionischen Amphiphilen
gefolgt von einer Flüssigphasen-Trennung.
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Petsch
et al, J. Chromatography B, 693 (1997) 79–91 beschreibt die Verwendung
von funktionalisierten Mikrofiltrationsmembranen, die mit beispielsweise
Deoxycholat oberflächenmodifiziert
waren, um Endotoxine von Puffern und Proteinlösungen zu entfernen. Nagy LK,
Progr. Immunobiol. Standard.5 (1972) 341–347 beschreibt eine Depolymerisierung
von Endotoxin zu Bestandteilen mit niedrigerem Molekulargewicht
durch Verwendung von Natriumdeoxycholat.
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Eine
Zahl von Affinitätschromatographie-Medien
ist im Handel für
den Zweck um Endotoxin von Arzneimitteln zu entfernen verfügbar. Die
proprietären
Detoxyfizierungs- Medien "Acticlean Etox, Prosep-Remtox und
CUNO Zeta Plus ZA" wurden
mit verschiedenen Erfolgsraten versucht. "Acticlean Etox" war bei einer Trennung von 99 % des
Endodoxins von den Haemagglutininen in einem Versuch in kleinem
Maßstab
von Erfolg, wobei allerdings die Trennung in kleinem Maßstab nicht
ausreichend wiederholt werden konnte, und das Verfahren in einem
größeren Maßstab nicht
effektiv funktionierte. "Prosep-Remtox" adsorbierte weder
Endotoxin noch Haemagglutinin, wohingegen "CUNO Zeta Plus ZA" 100 % Endotoxin und 100 % Haemagglutinin
adsorbierte.
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Daher
verblieb ein dringender Bedarf an einem Verfahren zur Entfernung
von Endotoxin aus pharmazeutischen Zusammensetzungen und insbesondere
aus Impfstoffzusammensetzungen.
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
eines Verfahrens zur Entfernung von Endotoxin, das in einem Herstellungsmaßstab effektiv
ist, keine toxischen oder störenden
chemischen Rückstände in dem
pharmazeutischen Produkt hinterlässt,
mit herkömmlicher
Prozessausrüstung
kompatibel ist und, insbesondere im Fall eines Impfstoffs, nicht
zu dem exzessiven Verlust oder Denaturierung von Antigen führt.
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Es
wurde nun gefunden, dass Grippe Oberflächen-Antigene, wie beispielsweise
HA und NA, und Endotoxin durch Zugabe eines Detergens und anschließendem Filtrieren
der erhaltenen Mischung durch einen Filter mit Molekulargewichts
cut-off bzw. Abgrenzung (MWCO) getrennt werden können, der eine Porengröße derartig
aufweist, dass das Antigen in dem Filter-Retentat verbleibt, während das
Endotoxin mit dem Filtrat den Filter passiert. Es ist ebenso angestrebt,
dass diese Technik ebenso auf andere pharmazeutische Produkte und
insbesondere Arzneimittel und Impfstoffe anwendbar sein wird, die
Polypetid-Ketten enthalten oder eine amphiphile Struktur aufweisen.
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Die
Erfindung stellt demgemäß ein Verfahren
zur Entfernung bakteriellen Endotoxins von einer pharmazeutischen
Verarbeitungslösung
bereit, welches ein/eine amphiphiles Arzneimittel oder Impfstoffsubstanz enthält, wobei
das Verfahren umfasst, Behandeln der Lösung mit einem oberflächenaktiven
Mittel und anschließend
Filtrieren der Lösung,
dadurch gekennzeichnet, dass das oberflächenaktive Mittel ein ionisches oberflächenaktives
Mittel ist, dass das Endotoxin von einem pharmazeutischen Arzneimittel
oder einer Impfstoffsubstanz in der Lösung abtrennen kann und in
einer Konzentration vorliegt, die mindestens ebenso groß wie die
kritische Mizellen Konzentration des Oberflächenaktiven-Mittels ist, und das die Lösung durch
einen Filter mit Molekulargewichts cut-off filtriert wird, der eine
Porengröße aufweist,
die das pharmazeutische Arzneimittel oder die Impfstoffsubstanz
zurückhalten
kann, dem disoziierten Endotoxin allerdings einen Durchgang dadurch
ermöglicht.
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Der
Ausdruck "pharmazeutische
Verarbeitungslösung", wie hierin verwendet,
betrifft irgendeine ein pharmazeutisches Arzneimittel enthaltende
Substanz oder eine ein Impfstoff- Antigen
enthaltende Lösung,
die als ein Teil des pharmazeutischen Herstellungsprozesses hergestellt
werden kann bis zum und einschließlich des Endprodukts. Die
pharmazeutische Verarbeitungs- bzw. Prozesslösung kann beispielsweise eine
Lösung von
teilweise gereinigten Impfstoff-Antigenen sein, von denen Zelltrümmer oder
unerwünschte
Materialien von einem mikrobiellen Partikel (beispielsweise einem
viralen Partikel) oder Zelle entfernt wurden.
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Die
pharmazeutische Substanz kann irgendein pharmazeutisches Arzneimittel
oder Impfstoff Substanz sein, die für eine Endotoxin Verunreinigung
während
ihres Herstellungsvorgangs empfänglich
oder möglicherweise
empfänglich
ist. Die Substanz kann beispielsweise ein Impfstoff-Antigen oder
ein therapeutisches Polypeptid-Produkt, wie beispielsweise ein Peptidhormon
oder ein Blutprodukt, sein. Das therapeutische Peptidprodukt kann
insbesondere ein rekombinantes Peptidprodukt sein. Die Ausdrücke "Peptid" und "Polypeptid", wie hierin verwendet,
schließen
Substanzen ein, die einzig aus Peptiden bestehen, ebenso wie Substanzen, wie
beispielsweise Glycoproteine, die Peptide in Assoziation mit oder
an andere Reste gebunden, wie beispielsweise Saccharid-Gruppen,
umfassen.
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Die
Substanz wird für
gewöhnlich
eine sein, die mit dem Endotoxin, beispielsweise unter Bildung eines Komplexes,
assoziiert. Nicht-Peptid Arzneimittel, die amphiphile Strukturen
aufweisen und die daher Komplexe mit Endotoxinen bilden können, können ebenso
einen Vorteil aus dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ziehen.
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Das
Oberflächenaktive-Mittel
ist ein ionisches oberflächenaktiven
Mittels, dass das Endotoxin von dem Antigen assoziieren kann, während die
Eigenschaften des Antigens, insbesondere seiner Befähigung in dem
MWCO Filter zurückgehalten
zu werden, nicht nachteilig beeinflusst werden. Vorzugsweise ist
es allerdings ein anionisches oberflächenaktives Mittel.
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Bestimmte
oberflächenaktive
Mittel sind anionische oberflächenaktive
Mittel mit einer Steroidstruktur und insbesondere die oberflächenaktiven
Mittel, die Gallensalz-Säuren
entsprechen oder analog zu ihnen sind. Daher kann das oberflächenaktive
Mittel beispielsweise ein geeignetes Salz von Deoxycholat, Cholat, Glycocholat,
Taurodeoxycholat oder Taurocholat zum Beispiel sein. Salze von Deoxycholat
(DOC) werden zurzeit bevorzugt.
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Andere
Beispiele von anionischen Oberflächenativen-Mitteln
umfassen langkettige Alkyl und Alkylaryl Sulphonate, wie beispielsweise
Alkyl-Benzolsulphonate und Dodecylsulphonate.
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Die
Konzentration an Oberflächenaktivem-Mittel
ist zumindest zu seiner kritischen Mizellen Konzentration (CMC)
gleich, die das Endotoxin vom Antigen disoziieren kann, während kein
nachteiliger Effekt auf das Antigen oder seiner Befähigung auf
der MWCO Membran zurückgehalten
zu werden vorliegt. Die Konzentration an Oberflächenaktivem-Mittel ist vorzugsweise größer als
seine kritische Mizellenkonzentration. Es ist zurzeit am meisten
bevorzugt, Konzentrationen des Oberflächenaktiven-Mittels von eineinhalb
bis 5-fach, beispielsweise
2 bis 4-fach, der kritischen Mizellenkonzentration zu verwenden.
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Das
Oberflächenaktive-Mittel
ist am meisten bevorzugt eines, das von dem Produkt, beispielsweise durch
Dialyse Techniken, einfach entfernt werden kann.
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Die
Filtrationsmembran mit Molekulargewichts cut-off (MWCO) wird derart
ausgewählt,
um ein Molekulargewicht cut-off aufzuweisen, der eine Retention
auf der Membran der erwünschten
Produkt-Antigene ermöglicht,
allerdings dem Endotoxin und oberflächenaktiven Mittel ein Passieren
durch die Membran ermöglicht.
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Mit
Grippe-Antigenen kann beispielsweise eine 100 kD MWCO Membran verwendet
werden. Diese wird den Hauptteil der Haemagglutinin-Antigene zurückhalten,
die für
gewöhnlich
in einer trimeren Form mit einem Molekulargewicht von ungefähr 230 kD
vorliegen.
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Es
ist möglich,
dass das Endotoxin Mizellen oder Aggregate mit dem oberflächenaktiven
Mittel bildet und, unter solchen Umständen, sollte das oberflächenaktive
Mittel derart sein, dass das Gesamtmolekulargewicht von irgendwelchen
Mizellen, die mit dem Endotoxin gebildet werden, geringer ist, als
der Molekulargewichts cut-off der Filtermembran.
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Die
Membran kann beispielsweise eine regenerierte Celluloseacetat Membran
sein, oder eine polysulphon Membran. Ein besonderes Beispiel für eine Membran,
die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung für eine Verwendung
geeignet ist, ist die 100 kD MWCO Celluloseacetat Membran von Millipor.
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Von
dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, für eine Trennung
eines bakteriellen Endotoxins von den Grippe vitalen Oberflächen-Antigenen
von Nutzen zu sein, wobei es ebenso angestrebt ist, dass das Verfahren
ebenso mit anderen vitalen, bakteriellen, protozoischen und parasitären Impfstoff-Antigenen
und insbesondere mit anderen Haemagglutinin-Antigenen, ebenso wie
mit anderen Polypeptid-Substanzen und anderen Arzneimittel-Substanzen
Anwendung findet, in denen eine Endotoxin-Verunreinigung ein Problem
darstellt.
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Das
Verfahren der Erfindung wird nun hinsichtlich der nachstehenden
Beispiele gezeigt, ist aber nicht darauf begrenzt.
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Die 1 zeigt
schematisch die Hauptstufen, die in der Herstellung eines Impfstoffes
beteiligt sind;
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Die 2 ist
eine schematische Darstellung, eines MWCO Diafiltrationsgerätes, dass
in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird;
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Die 3 ist
ein Balkendiagramm, das die Menge (in %) des in der Antigen-Lösung verbleibenden
Endotoxins in der Abwesenheit einer Behandlung mit einem oberflächenaktiven
Mittel zeigt;
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Die 4 zeigt
ein Balkendiagramm, das die Auswirkung von Natriumdeoxycholat auf
die Menge (in %) von Endotoxin zeigt, das in der Antigen-Lösung nach
einer Filtration durch eine MWCO-Membran verbleibt;
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Die 5 zeigt
die Endotoxin-Niveaus in einer halbtechnischen Beschickung von Influenza
A/Texas #531 mit und ohne Vorbehandlung mit 0,2 % (w/v) Natrium-deoxycholat
(DOC) vor und nach Filtration durch eine 100 kD MWCO-Membran zeigt;
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Die 6 und 7 zeigen
HA und Endotoxin und A280 Messungen von
Fraktionen, die von Größenausschluss
Chromatographie (SEC) Analysen von Antigen-Präparationen gesammelt wurden,
die jeweils mit 0 % und 2 % w/v (50mM) DOC behandelt wurden.
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Die 8a und 8b zeigen
Elektronen Mikroaufnahmen eines Influenza A/Texas #531 Einfachmischungs-Pools
(MBP) vor und nach Behandlung mit 2 % w/v (50mM) Natriumdeoxycholat
(DOC), gefolgt durch Diafiltration durch eine 100 kD MWCO Membran
und anschließender
Dialyse gegen PBS unter Verwendung einer 10 kD MWCO Membran, um
DOC zu entfernen.
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Die 1 zeigt
schematisch die gewöhnliche
Abfolge von Schritten, die in der Herstellung eines Grippe-Impfstoffes
einbezogen sind. Hühnereier
werden daher zu erst gewaschen, um externe Verunreinigungen zu entfernen,
mit Arbeitsimpfvirus inokuliert und anschließend inkubiert, um virales
Wachstum und Vermehrung innerhalb der Eier stattfindet, zu lassen.
Am Ende des viralen Inkubationsschritts werden die Eier gekühlt und
das den Virus enthaltende Allantois Fluid wird von den Eiern geerntet.
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Nach
Ernten wird ein Konservierungsmittel (das Thiomersal sein kann)
hinzugegeben. Die erhaltene, konservierte Lösung wird anschließend zentrifugiert,
um die Lösung
zu klären,
und einer Ultrafiltration unterzogen, um die viralen Komponenten
zu konzentrieren.
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Nach
der Konzentrierung wird die Lösung
mit einem Virus inaktivierendem Mittel behandelt, das beispielsweise β-Propiolacton
sein kann, bevor das gesamte Virus mittels Zonal-Zentrifugation
gereinigt wird.
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Die
gereinigte virale Fraktion wird anschließend mit einem Detergens behandelt,
wie beispielsweise Triton N101, um die viralen Partikel aufzuschließen, wobei
die erhaltene Mischung anschließend
einer zonal-Zentrifugation unterzogen wird, um die dichteren viralen
Kernmaterialien von den Grippe-Oberflächen-Antigenen zu trennen.
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Anschließend der
Zugabe von Phosphatpuffer, wird das Oberflächen-Antigen anschließend von
den Detergens durch zonal-Zentrifugation getrennt, um eine Einzelstamm-Antigen-Lösung zu
erhalten. Beschickungen von Lösungen
von verschiedenen Herstellungsläufen
können
anschließend
gemischt werden, um einen "Einfachmischungs-Pool" (MBP) zu erhalten,
der anschließend
weiter aufgereinigt werden kann und mittels Ultrafiltration konzentriert
wird bevor mit Einfachmischungs-Pool von anderen viralen Stämmen gemischt wird,
um einen multivalenten Impfstoff zu erhalten.
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Während des
vorangehen Verfahrens, werden die Niveaus an Endotoxin für gewöhnlich an
verschiedenen Punkten gemessen und, wenn die Niveaus an einem gegebenen
Punkt höher
als das bestimmte Limit ist, wird die Beschickung verworfen, bei
den Verfahren die vor der vorliegenden Erfindung angewendet wurden.
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Es
wurde allerdings gefunden, dass das Endotoxin durch Unterziehen
des monovalenten Mischungs- Pools (MBP) einer Behandlung mit einem
geeigneten Detergens entfernt werden kann, um eine Bindung zwischen
dem Endotoxin und dem gereinigten Oberflächen-Antigen aufzubrechen,
und anschließendem
Filtrieren des erhaltenen Gemisches durch einen Filter mit Molekulargewichts
cut-off ausreichenden Grads, um Passieren eines Endotoxins zu ermöglichen,
das gereinigte Oberflächen-Antigen
aber zurückzuhalten.
Im Wesentlichen frei von Endotoxin gereinigtes Oberflächen-Antigen
kann anschließend
von dem Filter-Retentat wieder gewonnen werden. Die nachstehenden
Versuche zeigen die Auswirkung einer Behandlung mit dem anionischen
Detergens Natrium-deoxycholat und anschließender MWCO Filtration durch
einen 100 kD cut-off Filter auf Endotoxin Niveaus.
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Beispiel 1
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Studie im kleinen Maßstab
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Studien
in kleinem Maßstab
auf die Auswirkungen von 2 % w/v (50mM) und 0,2 % w/v (5mM) Konzentrationen
von Natriumdeoxycholat auf die Entfernung von Endotoxin durch einen
100 kD MWCO Filter wurden auf eine Probe von A/Texas/36/91 Beschickung
531 MBP ausgeführt,
das ungefähr
10.000 EU/ml des Antigens enthält.
Die Antigen Probe, die gemäß zu dem
vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, bestand im
Wesentlichen aus Haemagglutinin und Neuraminidase gereinigten Oberflächen-Antigenen
in 10 mM phosphatgepufferter Salzlösung bei pH 7,2, die 0,15 M
Natriumchlorid und 0,01 % Thiomersal enthielt.
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Natriumdeoxycholat
(DOC) weist eine Tendenz auf, Gele bei pH-Werten niedriger als seinem
pKs Wert zu bilden. Um eine Gelbildung zu
vermeiden, wurde der pH der Antigenprobe zuerst auf einen Wert von
pH 8 oder höher
vor Zugabe des Detergens eingestellt. 2 % w/v (0,14 M) Dinatriumphosphat
wurden daher zu dem MBP hinzugegeben, das auf 37°C erwärmt wurde, wobei beachtet wurde
sicherzustellen, dass das Dinatriumphosphat vollständig gelöst war.
Der pH des MBP wurde dadurch von ungefähr pH 7,4 auf einen Wert von
pH 8,1 erhöht.
Die Natriumionen-Konzentration der erhaltenen Lösung betrug ungefähr 0,3 M.
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Natriumdeoxycholat
wurde zu der MBP Lösung
hinzugegeben, um Testlösungen
mit Endkonzentrationen von 0,2 % m/v (5mM) und 2 % w/v (50mM) DOC
zu erhalten, wobei die Testlösungen
bei 37°C
für ungefähr eine
Stunde inkubiert wurden. Anschließend an die Inkubation wurde
jede Mischung durch eine 100 kD MWCO Membran unter Verwendung eines
Millipor Minitan Transversal-Fluss-Filtrations-Geräts, wie
in 2 gezeigt, filtriert.
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Nach
Filtration und Konzentration der mit DOC behandelten MBP Probe,
wurden das Retentat und Filtrat auf ihr ursprüngliches Volumen gebracht,
so dass die Konzentrationen von HA und Endotoxin unmittelbar verglichen
werden konnten.
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Haemagglutinin
Konzentrationen in dem Filtrat und Retentat wurden mittels eines
Enzym-verknüpften Immunosorbant
Assays (ELISA) und mittels radialer Immunodiffusion bestimmt. Endotoxin
Niveaus wurden unter Verwendung eines automatisierten LAL Assays
(Bio Whittaker Colorimetric Kinetic K-QCL LAL Assay) bestimmt. Elektronen
Gefügebilder
der Testprobe vor und nach Behandlung mit DOC wurden unter Verwendung
eines Phillips 300 Transmissions-Elektronenmikroskops gemacht, um
die Auswirkung des DOC auf die Rosettencluster von Grippe-Oberflächenantigenen
zu bestimmen. Die Ergebnisse des HA ELISA und der SRD Assays wurden
nachstehend in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt.
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Ergebnisse
bei kleinem Maßstab Tabelle
1 Zusammenfassung
der Ergebnisse die den Effekt einer Doc Behandlung (5mM und 50mM)
auf % HA in Retentat und Filtrat (0mM wurde als eine Kontrolle verwendet
zeigen.
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- a 50mM DOC Startprobe nicht entnommen
dafür 0mM
DOC Startprobe wurde als Divisor zur Berechnung von % HA und % LPS
in 50mM DOC Retentat und Filtratproben verwendet.
- b Der Konzentrationsfaktor gibt die
Konzentration des Antigens hinsichtlich zu der Konzentration an
Antigen nach Verdünnung
in der Lösung
folgend der Filtration und den Konzentrationsschritten an.
- c ND = Nicht getan.
Die HA und
LPS Niveaus (%) wurden wie folgend berechnet:
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Tabelle
2 Vergleich
von vorliegendem MBP HA Niveaus vor und nach Diafiltration mit und
ohne 0,2 % (5mM) DOC wie durch SRD gemessen
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Die
Ergebnisse des HA Assays zeigen, das HA im Allgemeinen nicht durch
die Membran in einem größerem Ausmaß in Gegenwart
von DOC passiert. In einem Versuch (Versuch 4) waren die Niveaus
von HA in dem Filtrat für
die Testlösung
(5mM DOC) vielmehr höher
als in den anderen Versuchen. Dies kann auf Grund der besonderen
Beschickung von HA sein, die einen höheren Prozentsatz von HA in
monomerer Form enthielt, dessen Molekulargewicht (77 kD) es ihm
ermöglichen
würde durch
die 100 kD MWCO Membran zu passieren.
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Bestimmung der Endotoxin
Niveaus
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Die
Endotoxin Niveaus wurden vor und nach Behandlung mit DOC und Diafiltration
und Dialyse, wie vorstehend beschrieben, bestimmt und die Ergebnisse
werden in den 3 und 4 gezeigt.
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Die
in 3 angezeigten Ergebnisse zeigen, dass Diafiltration
alleine Endotoxin von dem MBP nicht entfernen wird. Wenn DOC hinzugegeben
(4) und die Lösung
filtriert wird, sind die Niveaus an Endotoxin in dem Retentat (Massenprodukt)
im Vergleich zu den Vorbehandlungsniveaus wesentlich reduziert.
Die Niveaus an Endotoxin in dem Filtrat (Abfall) stiegen entsprechend.
Beide Konzentrationen an DOC (5mM und 50mM) waren bei Entfernung
von Endotoxin von MBP von Wirkung.
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Beispiel 2
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Versuch im halb-technischen
Maßstab
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Die
Versuche im kleinen Maßstab,
wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden durch Behandlung einer Beschickung
von 4,32 l Influenza A/Texas Beschickung #531 MBP mit 2 % w/v Dinatriumphosphat
heraufgesetzt, um einen pH von 8,15 zu erzielen; Zugabe von 0,2
% w/v DOC und anschließend
Filtrieren durch eine 100 kD MWCO regenerierte Celluloseacetat Membran
niedriger Bindung (Millipor). Als eine Kontrolle wurde Influenza A/Texas
Beschickung #531 MBP durch die gleiche Membran aber ohne Behandlung
mit DOC filtriert. Nach der Filtration und vor einer Messung der
Endotoxin Niveaus, wurde jede der Lösungen auf das Volumen (4,3
l) der Startlösung
aufgefüllt.
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Die 5 zeigt
die erhaltene Verteilung des Endotoxins in den Startlösungen,
Retentaten und Filtraten. Die in 5 gezeigten
Ergebnisse zeigen, dass wie mit den Versuchen in kleinem Maßstab mehr
als 90 % des Endotoxins durch Diafiltration in der Gegenwart von
Deoxycholat entfernt werden kann.
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Die
Heamagglutinin Konzentrationen wurden mittels ELISA und SRD, wie
vorstehend in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt.
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Die
HA Niveaus vor und nach DOC Behandlung von 4,32 1 von mit Endotoxin
verunreinigtem MBP wurden gefunden innerhalb der Grenzen von versuchsbedingtem
Fehler im Wesentlichen gleich zu sein. Das HA Niveau vor einer Behandlung
mit DOC war daher 68,25 μg/ml
und das Niveau an HA, das nach DOC Behandlung bestimmt wurde, war
68,75 μg/ml.
Diese Ergebnisse zeigen, dass eine DOC Behandlung die HA Epitope
nicht beeinträchtigte.
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Beispiel 3
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Größenausschluss-Chromatographie
(SEC) unter Verwendung von HPLC
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Ein
mit Endotoxin verunreinigter Einmischungs-Pool (MBP) wurde durch
eine SEC Säule
(G43000 SWXL) hinunter passiert, wobei mit 10mM PBS bei pH 8 mit
und ohne 50mM DOC eluiert wurde, um zu bestimmen, ob (a) DOC irgendeine
Wirkung auf die Größe von HA
Rosetten aufweist, und (b) HA und Endotoxin in der gleichen Fraktion
eluieren und dadurch anzeigen dass sie assoziiert sein können.
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Daher
wurde A/Texas #531 MBP, 10-fach konzentriert, durch SEC mit 0 %
und 0,2 % (50mM) DOC untersucht, um zu bestimmen, ob die Anwesenheit
von DOC den molekularen Radius von HA beeinflusst und um zu ermitteln,
ob das HA als ein getrenntes Molekül in höher aggregierten Formen vorliegt.
Die erhaltenen Fraktionen wurden für HA und Endotoxin analysiert,
und mit der 280nm Protein Absorptions-Elutionsprofil (siehe 6 und 7)
verglichen. Von DOC wurde gefunden, Licht zwischen 800 und 200nm
nicht zu absorbieren, so dass die Absorptionsmuster für A/Texas
MBP mit 0 und 50mM DOC unmittelbar verglichen werden konnten. Die
Ergebnisse des HA-ELISA zeigen eine HA Spitze, die mit der 280nm
Protein-Spitze bei ungefähr 3000
kD in der Gegenwart von beidem, 0 % und 0,2 % DOC, zusammenfällt. Diese
Ergebnisse, die zeigen, dass die HA Rosetten in der gleichen Position
mit oder ohne DOC eluieren, zeigen, dass die HA Moleküle eine aggregierte
Rosettenform annehmen, die durch ein 50mM DOC Behandlung nicht unterbrochen
wird.
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Endotoxin
eluiert zusammen mit HA, wenn DOC nicht vorhanden ist, was zeigt,
dass das Endotoxin mit den HA Rosetten (6) wahrscheinlich
assoziiert ist.
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Keine
Schlüsse
können
von dem SEC-Fraktion Endotoxin-Profil der Probe gezogen werden,
die 50 mM DOC als die Endotoxin Messung in dem LAL Test enthält, inhibiert
durch die Anwesenheit von DOC (7).
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In 7 kann
die zweite Spitze, die bei 90 Minuten auftritt, durch Lichtdiffraktion
durch Detergens Mizellen erklärt
werden. Derartige Mizellen können
ein geringes Niveau an Protein (Vergleiche das 280nm Profil) enthalten
und können
Endotoxin enthalten.
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EM
Fotografien zeigen HA Rosetten eines mittleren Durchmessers von
ungefähr
34nm vor und nach DOC Behandlung, was ebenso anzeigt, dass die HA
Rosetten nicht durch 2 % DOC (siehe 8a und 8b) unterbrochen
werden.
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Die
in den vorstehenden Beispielen gezeigten Ergebnisse zeigen, dass
falls MBP in der Abwesenheit von Doc diafiltriert wird, Endotoxin
die 100kD MWCO Membran nicht passiert und in dem Retentat mit den
HA Rosetten (5) verbleibt. Analyse von Größenausschluss
Chromatographie Fraktionen (6) mit 0
% DOC zeigte, dass die Elution von Endotoxin gleichzeitig mit HA
stattfindet, was anzeigt, dass sie körperlich assoziiert sein können. Zugabe
von 5 bis 50mM DOC ermöglicht
Endotoxin die 100 kD MWCO Membran frei in das Filtrat zu passieren
und dadurch von HA (3, 4 und 5 und
Tabelle 1) getrennt zu werden, dass die MWCO Membran nicht zu einem
größeren Ausmaß passiert.
Ohne von einer Theorie gewünscht
gebunden zu sein, wird angenommen, dass die Affinität von DOC
für das
Endotoxin größer sein
könnte
als die Affinität
des Endotoxins für
die HA Rosette, so dass das Endotoxin an DOC eher als an HA bindet.
Es ist möglich,
dass Endotoxin Moleküle
die 100 kD MWCO Membran in der Form von gemischten Endotoxin/DOC
Mizellen passieren. Derartige Mizellen müssten Molekulargewichte von
weniger als 100 kD aufweisen, um durch die Filtermembran zu passieren.
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Die
erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass MBP HA, abgeleitet von A/Texas
#531, A/Texas #570 und B/Panama #87, die 100 kD MWCO Membran mit
5mM oder 50mM DOC zu einem größeren Ausmaß nicht
passiert, da nahezu kein HA in dem Filtrat durch HA-ELISA (siehe Tabelle
1) gemessen wird. Dies zeigt, dass die HA Rosette oder das Protein-Trimer nicht in Moleküle kleiner
als 100 kD dissoziiert. Das Molekulargewicht von individuellen HA
Trimeren wird geschätzt
bei 230 kD zu liegen und so sollten sie theoretisch nicht durch
die 100 kD MWCO Membran passieren. Es scheint nicht, dass HA Trimere
aus 77 kD bestehenden bzw. einzelnen Monomeren in der Gegenwart
von DOC reduziert werden.
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Eine
Entfernung von DOC ist ein wichtiger Schritt, da (a) es im Endprodukt
nicht erwünscht
ist und (b) eine Trennung von Endotoxin von dem verunreinigten MBP
nicht gemessen werden kann, wenn DOC in Proben vorliegt. In einem
Versuch wurde DOC erfolgreich zu weniger als 0,002 % von Retentat
Proben entfernt, die ursprünglich
um 0,5 % DOC durch Diafiltration über eine 30 kD MWCO enthielten.
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Daher
zeigen die vorstehenden Ergebnisse, das eine Natrium-deoxycholat
Behandlung von Antigen-Lösungen,
gefolgt durch Filtration durch eine Filtermembran mit Molekulargewichts
cut-off ein wirksames Mittel zur Trennung von Endotoxin von Impfstoffpräparationen
bereitstellen kann, trotz vorheriger Annahmen, dass dies nicht in
einem großen
Maßstab
erzielt werden könnte.
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Die
vorstehenden Beispiele zeigen die Erfindung, sind aber nicht gedacht
in irgendeiner Art wie dem Gebiet der Erfindung zu begrenzen. Beispielsweise
wird angestrebt, dass andere Detergenzien mit ähnlichen Eigenschaften zur
DOC in dem Verfahren der Erfindung von Nutzen sein können und
es wird angestrebt, dass das Verfahren bei der Entfernung von Endotoxin
von Antigenen verschieden von Grippe-Antigenen verwendet werden
wird und ebenso von anderen pharmazeutischen Arzneimittelprodukten
(beispielsweise anderen Polypeptiden), in denen eine Endotoxin Verunreinigung
ein mögliches
Problem darstellt.
