DE69833690T2 - Auf wechselwirkung frei gelöster liganden basierende molekültrennungsmethode - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Reinigung und Trennung von Spezies, insbesondere jenen von biologischem Interesse, aus freien Lösungen, worin die Verfahren lösliche niedermolekulare Liganden verwenden, die in der Lage sind, spezifisch mit der Spezies von Interesse wechselzuwirken.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Der Erfolg zahlreicher Forschungsprojekte auf dem Gebiet der Biotechnologie hängt absolut von der Verfügbarkeit von Verfahren ab, die die Trennung und Reinigung von einem oder mehreren Molekülen von Interesse aus komplexen Gemischen, die jene Moleküle von Interesse umfassen, ermöglichen. In dieser Hinsicht sind zur Zeit mehrere Verfahren zur Trennung und Reinigung von Molekülen von biologischem Interesse, wie z.B. Proteinen, aus komplexen Gemischen davon verfügbar. Diese Verfahren umfassen beispielsweise Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie (IEC), Größenausschlusschromatographie (SEC), Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), Hydrophob-Wechselwirkungschromatographie (HIC), verschiedene Varianten von Membranfiltration wie Ultrafiltration, Mikrofiltration, Umkehrosmose und dergleichen. Während sich diese Trennungsverfahren in zahlreichen verschiedenen Anwendungen als nützlich erwiesen haben, gibt es dennoch häufig zahlreiche andere Anwendungen, für die ihre Verwendung eingeschränkt ist.
  • Im Bemühen, die Trennungsfähigkeiten dieser Verfahren zu steigern, entwickelten die Forscher zahlreiche ähnliche Molekültrennungsverfahren, die jedoch zumindest teilweise auf der Fähigkeit eines Affinitätsmolekül basieren, sich an eine Einheit von Interesse zu binden und dadurch diese Einheit von Interesse von den anderen Komponenten eines flüssigen Gemisches abtrennbar zu machen. Ein solches Affinitätsmolekül-basiertes Trennungsverfahren ist Affinitätschromatographie, die biologische Moleküle basierend auf ihrer Fähigkeit, sich spezifisch und selektiv an eine Affinitätsmatrix oder ein Affinitätsgel zu binden, voneinander trennt. Affinitätsgele bestehen typischerweise aus einer Liganden-bindenden Gruppierung, die an einem Gelträger immobilisiert ist. In der GB 2.178.742 wurde beispielsweise Affinitätschromatographie verwendet, um Hämoglobin und seine chemisch modifizierten Derivate basierend auf der Tatsache, dass sich natives (Oxy-)Hämoglobin spezifisch an polyanionische Funktionalitäten bestimmter Affinitätsgele bindet, zu reinigen. In diesem Verfahren wird nicht modifiziertes Hämoglobin durch das Affinitätsgel zurückgehalten, während modifiziertes Hämoglobin, das sich nicht an das Gel bindet kann, da seine Polyanion-Bindungsstelle kovalent durch ein Modifikationsmittel besetzt ist, eluiert wird.
  • Wenn sich jedoch Affinitätschromatographie für zahlreiche verschiedene Anwendungen auch als nützlich erwiesen hat, so weist das Verfahren in sich Einschränkungen auf. Da beispielsweise Affinitätschromatographie von der Bindung eines Liganden an eine Festphasenmatrix (wie z.B. eine Polymerperle oder einen anderen Typ von Polymermatrix) abhängt, gibt es signifikante Konformationseinschränkungen für das gebundene Ligandenmolekül sowie für das Protein, das an das an die Matrix gebundene Ligandenmolekül gebunden wird. Darüber hinaus liefert die Festphasenmatrix eine potenzielle Stelle für nichtspezifische Bindung von verschiedenen Komponenten eines Reaktionsgemisches, wodurch dies häufig in nicht ganz vollständig wirksamen Trennungen resultiert. Auch ist die gesamte Kapazität eines Affinitätschromatographiesystems durch die verfügbare Oberfläche der Festphase und durch die Dichte, bis zu der diese Oberfläche durch Liganden substituiert werden kann, eingeschränkt.
  • Ein anderes, durchwegs bekanntes Affinitätsmolekül-basiertes Trennungsverfahren ist Affinitätsultrafiltration, ein Verfahren, das Affinitätsbindung mit membranbasierter Ultrafiltration kombiniert. Spezifischer verwendet Affinitätsultrafiltration einen großen polymeren Affinitätsliganden, an den sich ein Protein von Interesse binden kann, gefolgt von Ultrafiltrations-basierter Trennung des komplexierten polymeren Affinitätsliganden von den verbleibenden Komponenten eines Gemisches. (Siehe z.B. Mattiasson et al., Journal of Chromatography 283, 323–330 (1984); Luong et al., Biotechnology and Bioengineering 31, 516–520 (1988); und Male et al., Biotechnology and Bioengineering 35, 87–93 (1990).) Da jedoch große polymere Affinitätsliganden als Affi nitätsbindungsmolekül verwendet werden, bestehen signifikante Einschränkungen für die Trennungskapazität aufgrund der inhärenten Unlöslichkeit solcher Affinitätsliganden. Darüber hinaus sind polymere Affinitätsliganden häufig nicht leicht erhältlich und liefern relativ geringe Ausbeuten und/oder Reinigungsfaktoren.
  • Van Eijndhoven et al., Biotechnology and Bioengineering 48, 406–414 (1995), zeigten, dass Veränderungen der Ionenstärke einer proteinhältigen Lösung so funktionieren können, dass sie die scheinbare Größe eines Proteins in dieser Lösung verändern. Spezifischer gesagt zeigten van Eijndhoven et al., dass die Wechselwirkung von einwertigen Ionen (wie Cl–) mit einem Protein wie Rinderserumalbumin eine Veränderung des hydrodynamischen Volumens des Proteins hervorrufen kann. Es ist jedoch zur Zeit nicht bekannt. ob die Bindung von kleinen einwertigen Ionen an Proteine eine ausreichend signifikante Änderung des hydrodynamischen Volumens des Proteins liefert, um es von anderen Proteinen mit ähnlicher Größe in einem komplexen Gemisch davon unter Verwendung bekannter Trennungsverfahren abtrennbar zu machen.
  • Die EP-A-0104356 offenbart die Trennung von Faktor VIIIC von anderen Gerinnungsfaktoren durch Wechselwirkung mit z.B. PEG oder Ammoniumsulfat, um den Stokesschen Radius von FVIIIC zu reduzieren.
  • Es gibt daher einen Bedarf daran, neue Verfahren zur Trennung und Reinigung von Spezies von Interesse aus komplexen freien Lösungsgemischen zu entwickeln, die keinen Einschränkungen unterliegen, die anderen bekannten Affinitätsmolekül-basierten Trennungen innewohnen. Insbesondere gibt es einen Bedarf an Affinitätsmolekül-basierten Verfahren, die nicht den Konformationseinschränkungen und nicht-spezifischen Bindungsproblemen, die mit Affinitätschromatographie assoziiert sind, unterliegen. Darüber hinaus gibt es auch einen Bedarf an neuen Affinitätsmolekül-basierten Verfahren, die nicht den oben genannten Einschränkungen des Affinitätsultrafiltrationsverfahrens unterliegen. Die vorliegende Erfindung liefert eine Lösung für zahlreiche dieser Probleme.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Verfahren zur Trennung einer Spezies von Interesse von anderen verschiedenen Spezies, die in einem freien Lösungsgemisch davon vorhanden sind, die von Affinität und anderen Wechselwirkungen profitieren, die zwischen löslichen niedermolekularen Liganden und einer Spezies von Interesse auftreten. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Trennung einer ersten Spezies von Interesse von einer zweiten Spezies von Interesse in einem freien Lösungsgemisch, das die erste und die zweite Spezies von Interesse umfasst, worin sich die erste und die zweite Spezies von Interesse voneinander unterscheiden. Das hierin beschriebene Verfahren umfasst den Schritt des Kontaktierens des freien Lösungsgemisches mit einem niedermolekularen löslichen Liganden, der in freier Lösung mit der ersten Spezies von Interesse wechselwirkt, jedoch nicht zu einem signifikanten Ausmaß mit der zweiten Spezies von Interesse, wodurch ein Komplex aus erster Spezies von Interesse und Ligand gebildet wird, die in der Lage ist, von der zweiten Spezies von Interesse durch zahlreiche verschiedene Molekültrennungsverfahren getrennt zu werden, einschließlich beispielsweise Größenausschlusschromatographie und Membranfiltration. Der niedermolekulare Ligand weist ein geringeres Molekulargewicht als die erste Spezies von Interesse auf, mit der er wechselwirkt.
  • In besonderen Ausführungsformen kann die erste Spezies von Interesse beispielsweise ein Protein oder Polypeptid (natürlich oder rekombinant gebildet), eine Aminosäure, ein Kolloid, ein Endotoxin, ein Virus, eine Nucleinsäure und dergleichen sein. Niedermolekulare Liganden, die Verwendung in der vorliegenden Erfindung finden, sind in freien Lösungssystemen löslich und umfassen beispielsweise Proteine, Peptide, Antikörper, Nucleinsäuren, Aminosäuren, organische und anorganische Moleküle, multiionische Moleküle und dergleichen. Typischerweise tritt die Wechselwirkung zwischen der ersten Spezies von Interesse und dem Liganden durch Affinität, hydrophobe und/oder ionische Wechselwirkungen auf.
  • In verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können die erste und die zweite Spezies von Interesse anfänglich etwa dieselben hydrodynamischen Volumina, Molekulargewichte und/oder isoelektrischen Punkte aufweisen, wodurch es schwierig gemacht wird, sie mittels herkömmlicher Trennungsverfahren zu trennen. Eine oder mehrere dieser Eigenschaften können sich jedoch bei Wechselwirkung durch den Liganden mit der ersten Spezies von Interesse verändern. In Fällen, in denen das hydrodynamische Volumen des Komplexes aus der ersten Spezies von Interesse und dem Liganden und der zweiten Spezies von Interesse etwa dasselbe ist, kann häufig der pH oder die Ionenstärke des Systems verändert werden, um den Unterschied im hydrodynamischen Volumen zwischen dem Komplex aus der ersten Spezies von Interesse und dem Liganden und der zweiten Spezies von Interesse wirksam zu steigern und dadurch die Fähigkeit zu erhöhen, sie unter Verwendung herkömmlicher Trennungsverfahren zu trennen.
  • In wiederum anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können die Komponenten der erste Spezies von Interesse und des Ligand des Komplexes, der anfänglich von der zweiten Spezies von Interesse getrennt wurde, dissoziiert und getrennt werden, wodurch ein relativ reines Präparat der ersten Spezies von Interesse bereitgestellt wird. Verfahren zur Induktion dieser Dissoziation umfassen im Allgemeinen eine Veränderung des pH des Systems, eine Veränderung einer oder mehrerer löslicher Komponenten im System und dergleichen.
  • Wiederum andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden für Fachleuten durch die Lektüre der vorliegenden Beschreibung ersichtlich sein.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1. Elution von rekombinantem humanisiertem IgG (rhuIgG) aus einer Superdex-200-Größenausschlusschromatographiesäule.
  • 1 zeigt das Elutionsprofil von rhuIgG aus einer Superdex-200-Größenausschlusschromatographiesäule. Das rhuIgG-Protein wurde in einer Konzentration von 8 mg/ml in einem Puffer von 0,025 M NaCl, 0,025 M Tris-Base, 0,005 M EDTA, pH 7,1 ± 0,1, und mit einem Ladevolumen von 0,04 % auf die Säule geladen. Die Daten sind als UV-Absorptionseinheiten (mAU) über der Zeit in Minuten (min) als Diagramm dargestellt.
  • 2. Elution von Sulfhydryl-modifiziertem Rinderserumalbumin (BSA) aus einer Superdex-200-Größenausschlusschromatographiesäule.
  • 2 zeigt das Elutionsprofil von BSA aus einer Superdex-200-Größenausschlusschromatographiesäule. Das BSA-Protein wurde in einer Konzentration von 0,3 mg/ml in einem Puffer von 0,025 M NaCl, 0,025 M Tris-Base, 0,005 M EDTA, pH 7,1 ± 0,1, und mit einem Ladevolumen von 0,2 % auf die Säule geladen. Die Daten sind als UV-Absorptionseinheiten (mAU) über der Zeit in Minuten (min) als Diagramm dargestellt.
  • 3. Elution eines Gemisches aus rekombinantem humanisiertem IgG (rhulgG) und Sulfhydryl-modifiziertem Rinderserumalbumin (BSA) aus einer Superdex-200-Größenausschlusschromatographiesäule.
  • 3 zeigt das Elutionsprofil eines Gemisches aus rhuIgG und BSA aus einer Superdex-200-Größenausschlusschromatographiesäule. Die rhuIgG- und BSA-Proteine wurden in einer Konzentration von 0,8 mg/ml bzw. 0,3 mg/ml in einem Puffer von 0,025 M NaCl, 0,025 M Tris-Base, 0,005 M EDTA, pH 7,1 ± 0,1, und mit einem Ladevolumen von 0,2 % auf die Säule geladen. Die Daten sind als UV-Absorptionseinheiten (mAU) über der Zeit in Minuten (min) als Diagramm dargestellt.
  • 4. Elution eines Komplexes aus rekombinantem humanisiertem IgG (rhuIgG)/rekombinantem Protein A (rPrA) aus einer Superdex-200-Größenausschlusschromatographiesäule.
  • 4 zeigt das Elutionsprofil von rhuIgG/rPrA-Komplex aus einer Superdex-200-Größenausschlusschromatographiesäule. Die rhuIgG- und rPrA-Proteine wurden in einer Konzentration von 0,8 mg/ml bzw. 0,2 mg/ml in einem Puffer von 0,025 M NaCl, 0,025 M Tris-Base, 0,005 M EDTA, pH 7,1 ± 0,1, und mit einem Ladevolumen von 0,2 % auf die Säule geladen. Die Daten sind als UV-Absorptionseinheiten (mAU) über der Zeit in Minuten (min) als Diagramm dargestellt.
  • 5. Elution von rekombinantem Protein A (rPrA) aus einer Superdex-200-Größenausschlusschromatographiesäule.
  • 5 zeigt das Elutionsprofil von rPrA aus einer Superdex-200-Größenausschlusschromatographiesäule. Das rPrA-Protein wurden in einer Konzentration von 2 mg/ml in einem Puffer von 0,025 M NaCl, 0,025 M Tris-Base, 0,005 M EDTA, pH 7,1 ± 0,1, und mit einem Ladevolumen von 0,2 % auf die Säule geladen. Die Daten sind als UV-Absorptionseinheiten (mAU) über der Zeit in Minuten (min) als Diagramm dargestellt.
  • 6. Elution eines Gemisches aus einem Komplex von rekombinantem humanisiertem IgG (rhuIgG) mit rekombinantem Protein A (rPrA) und Sulfhydryl-modifiziertem Rinderserumalbumin (BSA) aus einer Superdex-200-Größenausschlusschromatographiesäule.
  • 6 zeigt das Elutionsprofil eines Gemisches von rhuIgG/rPrA-Komplex und BSA aus einer Superdex-200-Größenausschlusschromatographiesäule. Die rhuIgG-, rPrA- und BSA-Proteine wurden in einer Konzentration von 0,8 mg/ml, 0,2 mg/ml bzw. 0,3 mg/ml in einem Puffer von 0,025 M NaCl, 0,025 M Tris-Base, 0,005 M EDTA, pH 7,1 ± 0,1, und mit einem Ladevolumen von 0,2 % auf die Säule geladen.
  • Die Daten sind als UV-Absorptionseinheiten (mAU) über der Zeit in Minuten (min) als Diagramm dargestellt.
  • 7. Elution von rekombinantem humanisiertem IgG (rhuIgG) aus einer Superose-6-Größenausschlusschromatographiesäule.
  • 7 zeigt das Elutionsprofil von rhuIgG aus einer Superose-6-Größenausschlusschromatographiesäule. Das rhuIgG-Protein wurde in einer Konzentration von 0,8 mg/ml in einem Puffer von 0,1 M Essigsäure, 0,15 M NaCl, pH 3,5 ± 0,1, und mit einem Ladevolumen von 0,2 % auf die Säule geladen. Die Daten sind als UV-Absorptionseinheiten (mAU) über der Zeit in Minuten (min) als Diagramm dargestellt.
  • 8. Elution von rekombinantem Protein A (rPrA) aus einer Superose-6-Größenausschlusschromatographiesäule.
  • 8 zeigt das Elutionsprofil von rPrA aus einer Superose-6-Größenausschlusschromatographiesäule. Das rPrA-Protein wurde in einer Konzentration von 0,2 mg/ml in einem Puffer von 0,1 M Essigsäure, 0,15 M NaCl, pH 3,5 ± 0,1, und mit einem Ladevolumen von 0,2 % auf die Säule geladen. Die Daten sind als UV-Absorptionseinheiten (mAU) über der Zeit in Minuten (min) als Diagramm dargestellt.
  • 9. Elution eines Komplexes aus rekombinantem humanisiertem IgG (rhuIgG) und rekombinantem Protein A (rPrA) aus einer Superose-6-Größenausschlusschromatographiesäule bei einem pH von 3,5.
  • 9 zeigt das Elutionsprofil eines rhuIgG/rPrA-Komplexes aus einer Superose-6-Größenausschlusschromatographiesäule. Die rhuIgG- und rPrA-Proteine wurden in einer Konzentration von 0,8 mg/ml bzw. 0,2 mg/ml in einem Puffer von 0,1 M Essigsäure, 0,15 M NaCl, pH 3,5 ± 0,1, und mit einem Ladevolumen von 0,2 % auf die Säule geladen. Die Daten sind als UV-Absorptionseinheiten (mAU) über der Zeit in Minuten (min) als Diagramm dargestellt.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • A. Definitionen
  • Wie hierin verwendet beziehen sich die Bezeichnungen "Spezies" oder "Spezies von Interesse" im Allgemeinen auf ein oder mehrere Teilchen oder Molekül(e), die es aus einer freien Lösung oder einem Fluidgemisch, beispielsweise einer Flüssigkeit, zu trennen gilt. Die Spezies werden aus dem freien Lösungsgemisch und, in den meisten Fällen, von anderen Teilchen, Molekülen oder Spezies, die im Gemisch vorhanden sind, getrennt. Vorzugsweise sind die Spezies von Interesse biologische Einheiten natürlichen, biologischen oder biochemischen Ursprungs oder solche, die mittels biologischer oder biochemischer Verfahren hergestellt wurden. Beispiele für bevorzugte Spezies von Interesse umfassen, ohne jedoch die Erfindung darauf einzuschränken, Moleküle wie beispielsweise Polypeptide, entweder natürlich oder rekombinant hergestellt, Proteine, entweder natürlich oder rekombinant hergestellt, Zellkomponenten, Nucleinsäuren, einschließlich DNA und RNA, Kolloide, Mycoplasma, Endotoxine, Viren, Bakterien, Kohlenhydrate und verschiedene andere biologische Moleküle von Interesse, unabhängig davon, ob glykosyliert oder nicht. Eine oder mehrere Spezies von Interesse kann bzw. können eine "Verunreinigung" darstellen, was bedeutet, dass sie eine Komponente ist bzw. sind, die eine unerwünschte Komponente eines Gemisches darstellt und die es aus dem Gemisch abzutrennen gilt. Spezies von Interesse können auch Fusionsproteine sein, worin zumindest ein Teil des Fusionsproteins ein Polypeptid ist, für das zumindest ein niedermolekularer Ligand leicht erhältlich ist. Die erste Spezies von Interesse kann beispielsweise ein Protein sein, das ein von Immunglobulin abgeleitetes Polypeptid umfasst, zu dem der Protein-A-Ligand spezifische Bindungsaffinität aufweist.
  • Wie hierin verwendet bezieht sich ein "Gemisch" von Spezies auf eine freie Lösung (beispielsweise eine Flüssigkeit) oder eine Suspension, die zwei oder mehrere verschiedene Spezies enthält. Die Typen von Spezies, die in jeglichem Gemisch vorhanden sind, und ihre Häufigkeit im Gemisch können stark variieren, worin ein Gemisch beispielsweise verschiedene unterschiedliche Polypeptide, Puffer, Salze, Zel len und Zellkomponenten und dergleichen enthalten kann. Gemische können komplex sein, wobei eine große Anzahl verschiedener Spezies vorhanden ist, oder auch relativ einfach sein, wobei nur eine geringe Anzahl verschiedener Spezies vorhanden ist.
  • Wie hierin verwendet bezieht sich "Ligand" auf ein Molekül, das in freier Lösung löslich ist (d.h. einen gewissen Grad von Löslichkeit in der Lösung aufweist) und in der Lage ist, mit einer Spezies von Interesse wechselzuwirken, um zumindest eine der physikalischen Eigenschaften der Spezies zu verändern, mit der der Ligand wechselwirkt. Liganden, die hierin Verwendung finden, sind so beschaffen, dass einer oder mehrere mit einem einzelnen Molekül der Spezies von Interesse wechselwirken kann bzw. können. Unter "Wechselwirken" mit einer Spezies von Interesse wird verstanden, dass der Ligand in der Lage ist (oder mehrere Liganden in der Lage sind), sich physikalisch, entweder reversibel oder irreversibel, an die Spezies von Interesse zu binden oder in anderer Weise eine oder mehrere physikalische Eigenschaften der Spezies zu verändern, umfassend beispielsweise hydrodynamisches Volumen, Molekulargewicht, isoelektrischer Punkt und dergleichen. Häufig ist die Wechselwirkung zwischen der ersten Spezies von Interesse und dem Liganden "spezifisch", was bedeutet, dass der Ligand im Vergleich mit jeglicher anderen Einheit, die im Gemisch vorhanden ist, "spezifisch wechselwirkt mit" der ersten Spezies von Interesse oder "sich vorzugsweise bindet an" die erste Spezies von Interesse. Unter "bevorzugte" Wechselwirkung oder Bindung wird verstanden, dass der Ligand zu einem größeren Ausmaß mit der ersten Spezies wechselwirkt oder sich an diese bindet als mit bzw. an jegliche(r) andere(n) Spezies in der freien Lösung. Im Allgemeinen wechselwirkt ein "bevorzugter" Bindungsligand mit einer Spezies von Interesse zumindest etwa 2fach wirksamer als mit anderen Spezies, die in der Lösung vorhanden sind, vorzugsweise zumindest etwa 5fach wirksamer, und noch bevorzugter zumindest etwa 10fach wirksamer, in Bezug auf Bindungsaffinität und/oder Verweilzeit. In manchen Fällen kann der Ligand mit anderen Komponenten des freien Lösungsgemisches wechselwirken, er kann jedoch mit der ersten Spezies von Interesse zu einem größeren Ausmaß (z.B. mehr Ligandenmoleküle pro Speziesmolekül) wechselwirken und dadurch zu einer erwünschten Veränderung des Molekulargewichts, des hydrodynamischen Volumens und/oder des isoelektrischen Punktes führen.
  • Liganden, die in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden, sind "niedermolekulare Liganden", was bedeutet, dass sie in Bezug auf das Molekulargewicht kleiner als die erste Spezies von Interesse sind, mit der sie wechselwirken. In dieser Hinsicht bedeutet "kleiner", dass das Molekulargewicht des Liganden 0,5 bis 99,5 % jenes Gewichts der Spezies ausmacht, mit der er wechselwirkt, vorzugsweise etwa 5 bis 90 %, noch bevorzugter etwa 10 bis 80 %, und üblicherweise etwa 20 bis 75 %, des Molekulargewichts der Spezies, mit der er wechselwirkt. Liganden, die Verwendung in der vorliegenden Erfindung finden, sind in der Lage, mit der ersten Spezies von Interesse durch Affinität, hydrophobe und/oder ionische Wechselwirkungen wechselzuwirken, und umfassen beispielsweise Proteine, einschließlich Antikörper, Peptide, Nucleinsäuren, Saccharide, Aminosäuren, organische und anorganische Moleküle, multiionische Moleküle (d.h. Moleküle, die mehr als eine ionische Gruppe aufweisen) und dergleichen. Die Bezeichnung "Ligand" wie hierin definiert soll nicht einwertige ionische Spezies wie Protonen, Metallionen und dergleichen umfassen.
  • Liganden, die in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden, können für durchschnittliche Fachleute bekannt und erhältlich sein oder können leicht unter Verwendung von Routine-Screeningverfahren identifiziert werden. Beispielsweise können kombinatorische Oligopeptid- oder Oligonucleotidbibliotheken gescreent werden, um Bibliotheksmitglieder zu identifizieren, die in der Lage sind, mit der Spezies von Interesse wechselzuwirken, wodurch die Identifikation von Liganden ermöglicht wird, die möglicherweise Verwendung in der vorliegenden Erfindung finden. Jene Bibliothekselemente, die mit der ersten Spezies von Interesse wechselwirken, können dann gegebenenfalls auf die Unfähigkeit gescreent werden, mit der zweiten Spezies von Interesse wechselzuwirken. In diesem Zusammenhang wird angemerkt, dass Verfahren zur Herstellung und zum Screenen kombinatorischer Bibliotheken auf Elemente, die in der Lage sind, mit einem Targetmolekül wechselzuwirken, auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt sind.
  • Unter "Spezies von Interesse/Ligand-Komplex" oder grammatischen Entsprechungen davon wird der Komplex verstanden, der gebildet wird, wenn ein oder mehrere niedermolekulare Liganden mit einer Spezies von Interesse wechselwirken, wodurch das Molekulargewicht, das hydrodynamische Volumen und/oder der isoelektrische Punkt der Spezies von Interesse verändert wird und dadurch wiederum ermöglicht wird, diese Spezies von anderen Spezies, die in einem freien Lösungsgemisch vorhanden sind, zu trennen. Unter "in der Lage, abgetrennt zu werden" oder grammatischen Entsprechungen davon wird verstanden, dass Molekültrennungsverfahren, die zur Zeit bekannt sind oder die in der Zukunft entwickelt werden können, in der Lage sind, den Komplex aus erster Spezies von Interesse und Ligand von der zweiten Spezies von Interesse zu trennen, um eine Zusammensetzung bereitzustellen, die im Wesentlichen frei von der zweiten Spezies von Interesse ist. Unter "im Wesentlichen frei" wird verstanden, dass die zweite Spezies von Interesse entweder in der Zusammensetzung nicht vorhanden ist oder in der Zusammensetzung zu einem Ausmaß vorhanden ist, das keine der erwünschten Funktionen der gereinigten ersten Spezies von Interesse stört. Die einzelnen Komponenten eines Komplexes aus Spezies von Interesse und Ligand sind häufig zu Dissoziation in der Lage, wodurch sie die Trennung und Reinigung jener einzelnen Komponenten ermöglichen, nachdem der Komplex von anderen Komponenten, die in einem Fluidgemisch vorhanden sind, getrennt wurde.
  • In Bezug auf Spezies von Interesse und Liganden bedeutet die Bezeichnung "Trennen", dass eine Komponente oder Komponenten von (einer) anderen Komponente(n), die in einem Fluidgemisch vorhanden ist bzw. sind, weggereinigt wird. Verschiedene Molekültrennungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und finden hierin Verwendung, einschließlich Membranfiltration und Chromatographieverfahren.
  • Wie hierin verwendet bezieht sich "Membranfiltration" auf alle Typen von Filtrationsverfahren, die eine poröse Membran oder Membranen verwenden, um Moleküle unterschiedlicher relativer Größen voneinander zu trennen. Verschiedene Typen von Membranfiltrationsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfas sen beispielsweise Hochleistungs-Tangentialflussfiltration, Ultrafiltration, Umkehrosmose und Mikrofiltration.
  • Wie hierin verwendet beziehen sich "Tangentialflussfiltration" oder "TFF" auf ein Verfahren, in dem das freie Lösungsgemisch, das die durch Membranfiltration voneinander zu trennenden Komponenten enthält, tangential zur Fläche der Filtrationsmembran rezirkuliert wird, um den Massentransferkoeffizienten für Rückdiffusion zu steigern. In solchen Membranfiltrationen wird ein Druckdifferenz entlang der Länge der Filtrationsmembran angelegt, um die Lösung und die filtrierbaren Gelöststoffe dazu zu bringen, durch die Membran zu fließen. Diese Membranfiltration wird geeigneterweise als ein Chargenverfahren sowie als ein kontinuierliches Fließverfahren durchgeführt. Die Lösung kann beispielsweise wiederholt über die Filtrationsmembran geführt werden, während das Fluid, das durch die Membran dringt, kontinuierlich in eine separate Einheit abgezogen wird, oder die Lösung wird einmal über die Filtrationsmembran geführt, und das durch die Membran hindurchtretende Fluid wird kontinuierlich stromabwärts verarbeitet.
  • Wie hierin verwendet beziehen sich "Hochleistungs-Tangentialflussfiltration" oder "HPTFF" auf das Membranfiltrationsverfahren, das in den US-Patenten Nr. 5.256.294 und 5.490.937 beschrieben wird, die beide hierin ausdrücklich in ihrer Gesamtheit durch Verweis aufgenommen sind.
  • Wie hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung "Ultrafiltration" oder "UF" auf Membranfiltrationsverfahren, die Filtrationsmembranen verwenden, die so bemessen sind, dass sie Gelöststoffe mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 1 kDa und 1.000 kDa zurückhalten.
  • Wie hierin verwendet beziehen sich "Umkehrosmose" oder "RO" auf Membranfiltrationsverfahren, die Membranen verwenden, die in der Lage sind, Gelöststoffe mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 1 kDa, wie z.B. Salze und andere niedermolekulare Gelöststoffe, zurückzuhalten.
  • Wie hierin verwendet beziehen sich "Mikrofiltration" oder "MF" auf Membranfiltrationsverfahren, die Membranen mit einem Porengrößenbereich von 0,1 bis 10 μm verwenden.
  • Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck "Größenausschlusschromatographie" auf ein durchwegs bekanntes Verfahren, in dem chromatographische Verfahren zum Einsatz gebracht werden, um zumindest ein Molekül von zumindest einem anderen Molekül auf Grundlage seiner Größe zu trennen. Im Fall der vorliegend beanspruchten Verfahren wird Größenausschlusschromatographie im Allgemeinen bei geringer Ionenstärke durchgeführt, beispielsweise weniger als etwa 150 mM, vorzugsweise weniger als etwa 100 mM, und noch bevorzugter weniger als etwa 75 mM, üblicherweise weniger als etwa 50 mM.
  • B. Ausführungsformen der Erfindung
  • In ihrem weitest gefassten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Trennung einer ersten Spezies von Interesse von einer unterschiedlichen zweiten Spezies von Interesse in einem freien Lösungsgemisch, das sowohl die erste als auch die zweite Spezies von Interesse umfasst. Das Verfahren umfasst das Kontaktieren des freien Lösungsgemisches mit einem niedermolekularen Liganden, der in freier Lösung löslich ist und in der Lage ist, mit der ersten Spezies von Interesse wechselzuwirken, um einen Komplex aus erster Spezies von Interesse und Ligand in freier Lösung zu bilden und dadurch zumindest eine der physikalischen Eigenschaften der ersten Spezies von Interesse zu verändern. Vorzugsweise funktioniert der Ligand durch Wechselwirken mit der ersten Spezies von Interesse, um das hydrodynamische Volumen, das Molekulargewicht zu steigern und/oder den isoelektrischen Punkt der ersten Spezies von Interesse zu verändern und dadurch zu ermöglichen, diese von der zweiten Spezies von Interesse mittels bekannter Trennungsverfahren zu trennen. Die vorliegende Erfindung findet besonders Verwendung in Situationen, in denen es ursprünglich nicht möglich war, die erste und die zweite Spezies von Interesse effizient voneinander zu trennen, da sie beispielsweise ähnliche hydrodynamische Volumina, Molekulargewichte und/oder isoelektrische Punkte aufweisen. In solchen Fällen kann die erste Spezies von Interesse mit dem Liganden wechselwirken und dadurch das hydrodynamische Volumen davon erhöhen und es ermöglichen, sie (als Komplex) von der zweiten Spezies von Interesse zu trennen. Die erste Spezies von Interesse kann dann vom Liganden dissoziiert und getrennt werden, um einen Pool an reiner erster Spezies von Interesse bereitzustellen, der im Wesentlichen frei von dem Liganden und der zweiten Spezies von Interesse ist.
  • Der Ligand kann in das System durch verschiedene Mittel eingeführt werden, von denen keines für die vorliegende Erfindung maßgeblich ist. Vorzugsweise wird der Ligand direkt in ein freies Lösungsgemisch eingeführt, das sowohl die erste als auch die zweite Spezies von Interesse umfasst. In solchen Situationen ist der Ligand in der Lage, vorzugsweise mit der ersten Spezies von Interesse im Vergleich zur zweiten wechselzuwirken. Der Ligand kann in das freie Lösungsgemisch in Form eines einzelnen Bolus eingeführt werden oder kann in mehreren Schritten über eine längere Zeitspanne hinweg zugesetzt werden.
  • Wie zuvor beschrieben können die erste und die zweite Spezies von Interesse jegliche aus zahlreichen verschiedenen Einheiten, biologisch oder nicht biologisch, sein und können Moleküle wie beispielsweise Polypeptide, entweder natürlich oder rekombinant gebildet, Proteine, entweder natürlich oder rekombinant gebildet, einschließlich Fusionsproteine, Zellkomponenten, Nucleinsäuren, einschließlich DNA und RNA, Kolloide, Mycoplasma, Endotoxine, Viren, Bakterien, Kohlenhydrate und verschiedene andere biologische Moleküle von Interesse, unabhängig davon, ob glykosyliert oder nicht, umfassen. Vorzugsweise ist die erste Spezies von Interesse ein rekombinant gebildetes Protein.
  • Liganden, die Verwendung in der vorliegenden Erfindung finden, sind in freier Lösung löslich (was bedeutet, dass sie zumindest einen gewissen Grad von Löslichkeit im System aufweisen) und haben ein geringeres Molekulargewicht als die erste Spezies von Interesse, mit der sie in der Lage sind, wechselzuwirken. In den meisten Fällen ist die Ligandeneinheit zu nicht-kovalenter Bindung an die erste Spezies von Interesse in der Lage und ist im Allgemeinen ein Protein, wie beispielsweise ein Anti körper, ein Peptid, eine Nucleinsäure, ein Saccharid, eine Aminosäure, ein organisches oder anorganisches Molekül, ein multiionisches Molekül und dergleichen, wobei insbesondere einwertige Einheiten wie Protonen und Metallionen ausgeschlossen sind. Liganden, die in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden, sind entweder im Handel leicht erhältlich oder können leicht auf herkömmliche Weise synthetisiert und identifiziert werden, wie beispielsweise durch Herstellung und Screenen von kombinatorischen Bibliotheken. In Fällen, in denen der ausgewählte Ligand ein Protein ist, ist das Protein im Handel erhältlich, wie z.B. Protein A, oder kann leicht mittels rekombinanter DNA-Expressionsverfahren hergestellt werden.
  • In Fällen, in denen der Ligand ein Antikörper ist, der in der Lage ist, sich spezifisch an die erste Spezies von Interesse zu binden, sind solche Antikörper in der Lage, mittels herkömmlicher Verfahren hergestellt und auf die erwünschte Bindungsspezifität gescreent zu werden. Durchschnittliche Fachleute sind beispielsweise in der Lage, entweder ein polyklonales oder ein monoklonales Antikörperpräparat rasch, leicht und routinemäßig zu gewinnen, das gegen jegliches Protein von Interesse gerichtet ist. Polyklonale Antikörper des Proteins werden im Allgemeinen in Tieren durch mehrfache subkutane (sk) oder intraperitoneale (ip) Injektionen des Proteins in Kombination mit einem Adjuvans gezüchtet. Es kann nützlich sein, das Protein oder Fragment von Interesse an ein Protein, das in der zu immunisierenden Spezies immunogen ist, z.B. Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin oder Sojabohnentrypsininhibitor, unter Verwendung eines bifunktionellen oder derivatisierenden Mittels, beispielsweise Maleinimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation durch Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (durch Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl2 oder R1N=C=NR, worin R und R1 verschiedene Alkylgruppen sind, zu konjugieren.
  • Wirtstiere können dann gegen die immunogenen Konjugate oder Derivate durch Kombinieren des Konjugats mit einem geeigneten Adjuvans und Injizieren der Lösung intradermal an mehrfachen Stellen immunisiert werden. Ein Monat später können die Tiere mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Menge des Konjugats in geeignetem Adjuvans durch subkutane Injektion an mehrfachen Stellen geboostet werden. 7 bis 14 Tage später wird den Tieren Blut abgenommen, und das Serum wird auf die Gegenwart von Anti-Protein-von-Interesse-Antikörper-Titer getestet. Tiere können geboostet werden, bis der Titer gesättigt ist. Auch können Aggregationsmittel wie Alaun verwendet werden, um die Immunantwort zu steigern. Polyklonale Antikörper werden dann aus dem Immunserum unter Verwendung herkömmlicher Verfahren gereinigt.
  • Monoklonale Antikörper, die gegen das Protein von Interesse gerichtet sind, können aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern gewonnen werden, d.h. die einzelnen Antikörper, aus der sich die Population zusammensetzt, sind identisch bis auf mögliche natürlich vorkommende Mutationen, die in geringfügigen Mengen vorhanden sein können. Monoklonale Antikörper beispielsweise, die gegen ein Protein von Interesse gerichtet sind, können unter Verwendung des Hybridomverfahrens hergestellt werden, das zuerst von Kohler & Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschrieben wurde, oder können durch DNA-Rekombinationsverfahren gebildet werden (Cabilly et al., US-Patent Nr. 4.816.567).
  • Im Hybridomverfahren wird eine Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier, wie z.B. ein Hamster, immunisiert, um Lymphozyten zu aktivieren, die Antikörper produzieren oder in der Lage sind, diese zu produzieren, die sich spezifisch an das zur Immunisierung verwendete Protein binden. Alternativ dazu können Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Lymphozyten können dann mit Myelomzellen unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittel wie Polyethylenglykol fusioniert werden, um eine Hybridomzelle zu bilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 59–103 (1986)).
  • Die so hergestellten Hybridomzellen können dann überimpft und in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet werden, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der nicht fusionierten, parentalen Myelomzellen inhibieren. Fehlt beispielsweise den parentalen Myelomzellen das Enzym Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT), so umfasst das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thy midin (HAT-Medium), Substanzen, die das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen unterbinden.
  • Bevorzugte Myelomzellen sind jene, die effizient fusionieren, stabile hochgradige Expression von Antikörper durch die selektierten, Antikörper-produzierenden Zellen unterstützen und auf ein Medium wie z.B. das HAT-Medium empfindlich sind. Unter diesen sind bevorzugte Myelomzelllinien murine Myelomlinien, wie jene, die aus MOPC-21- und MPC-11-Maustumoren stammen, die beim Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, USA, erhältlich sind, und SP-2-Zellen, die bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, erhältlich sind. Menschliche Myelomzelllinien und Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien wurden ebenfalls bereits zur Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern beschrieben (Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984), und Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, 51–63 (1987)).
  • Kulturmedium, in dem Hybridomzellen gezüchtet werden, wird auf die Bildung von monoklonalen Antikörpern, die gegen das Protein von Interesse gerichtet sind, getestet. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität von monoklonalen Antikörpern, die von Hybridomzellen produziert werden, durch Immunfällung oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie z.B. Radioimmuntest (RIA) oder enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), bestimmt. Die Bindungsaffinität der monoklonalen Antikörper kann beispielsweise durch die Scatchard-Analyse von Munson & Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
  • Liganden, die Oligonucleotide sind, können mittels bekannter Verfahren wie Phosphotriester-, Phosphit- oder Phosphoramidit-Chemie, unter Verwendung von Festphasenverfahren wie jenen, die in EP 266.032 , veröffentlicht am 4. Mai 1988, beschrieben werden, oder über Desoxynucleosid-H-phosphonat-Zwischenprodukte, wie von Froehler et al., Nucl. Acids Res. 14, 5399 (1986), beschrieben, chemisch synthetisiert werden. Nach der Synthese können die Oligonucleotidsonden dann an Polyacrylamidgelen gereinigt werden. Liganden, die Peptide sind, können unter Verwen dung von Standard-Merrifield-Festphasen-Syntheseverfahren, manuell oder unter Verwendung eines Peptidsyntheseautomaten, unter Verwendung herkömmlicher chemischer Schutzverfahren (z.B. t-Boc- oder Fmoc-Chemie) und von Harzen (z.B. 4-Methylbenzhydrylamin oder Rink-Amidharz) synthetisiert werden. Aufeinander folgende Durchgänge von Schutzaufhebung an der terminalen Aminogruppe und Bindung von Aminosäuremonomeren, gefolgt von Schutzaufhebung und Spaltung von Peptiden von Harzen, resultiert in der Synthese von Oligopeptiden mit der erwünschten Sequenz und Länge. Darüber hinaus ist Flüssigphasenpeptidsynthese auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und kann ebenfalls verwendet werden. Kombinatorische Oligonucleotid- oder Oligopeptidbibliotheken können unter Verwendung herkömmlicher Verfahren erstellt werden, und jene Bibliotheken können gescreent werden, um Bibliotheksmitglieder zu identifizieren, die als niedermolekulare Liganden in den vorliegend beschriebenen Verfahren funktionieren können, worin solche Verfahren auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt sind.
  • Sind sie in einem Fluidgemisch vorhanden, so können die erste und die zweite Spezies von Interesse wirksam durch Kontaktieren des Fluidgemisches mit einem niedermolekularen Liganden, der in der Lage ist, mit der erste Spezies von Interesse wechselzuwirken, jedoch nicht mit der zweiten Spezies von Interesse (oder schon mit der zweiten Spezies von Interesse, jedoch zu einem geringeren Ausmaß), voneinander getrennt werden. Das Verfahren ist besonders in Situationen nützlich, in denen die erste und die zweite Spezies von Interesse etwa dieselbe Größe, dasselbe hydrodynamische Volumen und/oder denselben isoelektrischen Punkt aufweisen, was es schwierig macht, sie unter Verwendung herkömmlicher Molekültrennungsverfahren zu trennen. Durch Wechselwirkung mit der ersten Spezies von Interesse jedoch funktioniert der Ligand darin, dass er das Molekulargewicht und/oder das hydrodynamische Volumen der ersten Spezies von Interesse erhöht (und/oder den isoelektrischen Punkt der ersten Spezies von Interesse verändert) und dadurch die Möglichkeit schafft, sie mittels herkömmlicher Molekültrennungsverfahren abzutrennen.
  • Im Allgemeinen wird das hydrodynamische Volumen einer Spezies von Interesse durch Größenausschlusschromatographie, ein Verfahren, das auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, bestimmt. Weist eine Spezies von Interesse ein hydrodynamisches Volumen auf, das "etwa dasselbe" wie jenes einer anderen Spezies von Interesse ist, so weisen die zwei Spezies von Interesse hydrodynamische Volumina auf, die sich um weniger als etwa 10 % voneinander unterscheiden.
  • Der isoelektrische Punkt einer Spezies von Interesse ist der pH, bei dem die Spezies elektrisch neutral ist. Der isoelektrische Punkt einer Spezies von Interesse kann mittels herkömmlicher Verfahren, die die Spezies sowohl einem pH-Gradienten als auch einem elektrischen Feld unterziehen, und Bestimmen, bei welchem pH die Spezies elektrisch neutral ist, d.h. Bestimmen, bei welchem pH die Spezies weder in die eine noch die andere Richtung in einem elektrischen Feld wandert, bestimmt werden. Mit einem isoelektrischen Punkt, der "etwa derselbe" wie jener einer anderen Spezies von Interesse ist, liegen die isoelektrischen Punkte der zwei Spezies im gegenseitigen Vergleich innerhalb von etwa 0,5 pH-Punkten.
  • In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann die Fähigkeit, die erste und die zweite Spezies von Interesse voneinander zu trennen, durch Verändern des pH oder der Ionenstärke des Fluidgemisches weiter gesteigert werden. Dieser Schritt ist besonders in Situationen nützlich, in denen der Komplex aus erster Spezies von Interesse und Ligand ein hydrodynamisches Volumen aufweist, das etwa dasselbe wie jenes der zweiten Spezies von Interesse ist. Durch Verändern des pH und/oder der Ionenstärke des Systems kann die scheinbare Größe (hinsichtlich des hydrodynamischen Volumens oder des Molekulargewichts) eines Proteins oder Proteinkomplexes durch einen Faktor von bis zum 10fachen verändert werden (siehe z.B. Pujar & Zydney, "Analysis of Electrostatic Interactions on Protein Sieving: Experimental and Theoretical Investigations", North American Membrane Society Meeting, Ottawa, Kanada (1996)). Durch Erhöhen des Unterschieds der hydrodynamischen Volumina zwischen dem Komplex aus erster Spezies von Interesse und Ligand und der zweiten Spezies von Interesse (oder der ersten und der zweiten Spezies von Interesse) durch Verändern des pH und/oder der Ionenstärke des Fluidgemisches können die erste und die zweite Spezies von Interesse unter Verwendung herkömmlicher Molekültrennungsverfahren wirksamer voneinander getrennt werden.
  • Nachdem eine Wechselwirkung zwischen dem niedermolekularen Liganden und der ersten Spezies von Interesse im Fluidgemisch ermöglicht wurde, kann der Komplex aus erster Spezies von Interesse und Ligand von der zweiten Spezies von Interesse unter Verwendung herkömmlich verwendeter Molekültrennungsverfahren getrennt werden. Der Schritt der Trennung der Komponenten kann die Verwendung herkömmlicher Membranfiltrationsverfahren wie Tangentialflussfiltration, Hochleistungs-Tangentialflussfiltration, Ultrafiltration, Mikrofiltration und Umkehrosmose umfassen. Der Komplex aus erster Spezies von Interesse/Ligand und die zweite Spezies von Interesse können auch unter Verwendung herkömmlicher chromatographischer Verfahren, einschließlich beispielsweise SEC, HPLC und dergleichen, voneinander getrennt werden. Nachdem der Komplex erste Spezies von Interesse/Ligand von der zweiten Spezies von Interesse getrennt wurde, können die Komponenten des Komplexes unter Verwendung derselben Verfahren, wie zuvor für die Trennung des Komplexes von der zweiten Spezies von Interesse beschrieben, dissoziiert und getrennt werden. Der Komplex kann durch jegliches Verfahren dissoziiert werden, das die Wechselwirkung zwischen den zwei Molekülen stört, beispielsweise durch Senken des pH des Systems, in dem sie vorhanden sind, oder durch den Zusatz jeder beliebigen Komponente zum System, die eine Dissoziation der ersten Spezies von Interesse vom Liganden verursacht.
  • Das vorliegend beschriebene Verfahren ist praktisch für jegliche Anwendung nützlich, die erfordert, dass eine Einheit eines Gemisches von einer anderen Einheit, die im selben Gemisch vorhanden ist, getrennt wird. Bevorzugte Anwendungen umfassen beispielsweise die Trennung und Reinigung eines oder mehrerer Proteine aus einem komplexen Gemisch aus verschiedenen Proteinen, insbesondere während großtechnischer rekombinanter Proteinherstellung. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind zur Trennung und Reinigung einer großen Bandbreite von biologischen Molekülen, z.B. proteinartigen Fermentationsprodukten natürlicher oder gentechnisch veränderter Mikroorganismen, Polypeptiden, Antikörpern, Zellsekretionen, Kolloiden, Mycoplasma, Endotoxinen, Viren, Bakterien, Aminosäuren, DNA, RNA, Kohlenhydraten und dergleichen, einsetzbar.
  • Die vorliegende Erfindung weist zahlreiche Vorteile gegenüber dem Stand der Technik auf. Beispielsweise ist das vorliegend beschriebene Verfahren gegenüber herkömmlichen Festphasen-Affinitätschromatographieverfahren darin von Vorteil, dass es Liganden mit geringem Molekulargewicht verwendet, die in freier Lösung löslich sind. Als solches ist, während es bei der Affinitätschromatographie sowohl bezüglich des Liganden als auch der Spezies, an die er sich bindet, Konformationseinschränkungen gibt, dies bei den vorliegende beschriebenen Verfahren nicht der Fall. Darüber hinaus ist die Trennungsfähigkeit eines Affinitätschromatographiesystems durch die Oberfläche der verwendeten festen Matrix und die Dichte, bis zu der die Oberfläche mit Liganden substituiert werden kann, eingeschränkt. Dahingegen ist die Trennungsfähigkeit der vorliegend beschriebenen Verfahren nur durch die Löslichkeit des Liganden im Fluidgemisch limitiert. Weiters liefert die Gegenwart der festen Matrix in einem Affinitätschromatographiesystem eine bedeutsame Gelegenheit für nichtspezifische Protein-Matrix-Wechselwirkungen, was zu nicht effizienten Molekültrennungen resultiert.
  • Das vorliegend beschriebene Verfahren ist auch gegenüber Affinitätsultrafiltration darin von Vorteil, dass die großen polymeren Liganden, die bei Affinitätsultrafiltration verwendet werden, häufig nicht leicht erhältlich sind oder nicht leicht synthetisiert werden können, während die löslichen, niedermolekularen Liganden, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, leicht erhältlich sind und/oder routinemäßig synthetisiert werden können. Darüber hinaus ist Affinitätsultrafiltration auf Anwendungen eingeschränkt, die Ultrafiltrationsvorgänge verwenden, während das vorliegende Verfahren mit zahlreichen verschiedenen Molekültrennungsverfahren verwendet werden kann, einschließlich beispielsweise zahlreicher Typen von Membranfiltration sowie Chromatographieverfahren. Weiters liefert Affinitätsultrafiltration aufgrund der eingeschränkten Löslichkeit zahlreicher großer polymerer Liganden in Lösungen häufig relativ geringe Ausbeuten und Reinigungsfaktoren, ein Problem, dem durch die Verwendung löslicher, niedermolekularer Liganden, wie dies in der vorliegenden Erfindung der Fall ist, beigekommen werden kann.
  • Nähere Details zur Erfindung werden anhand der folgenden, nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht.
  • C. Beispiele
  • BEISPIEL I – Molekültrennung von rekombinantem humanisiertem IgG aus einer Rinderserumalbumin-Verunreinigung unter Verwendung eines löslichen Protein-A-Liganden.
  • Das vorliegende Molekültrennungsverfahren mittels Ligandenwechselwirkung wurde verwendet, um rekombinantes humanisiertes IgG-Protein aus einem Gemisch abzutrennen, das auch ein Sulfhydryl-modifiziertes Rinderserumalbuminprotein als eine Verunreinigung enthielt. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-(HPLC-) SEC wurde verwendet, um einzelne Moleküle zu identifizieren sowie Komplexbildung, Dissoziation und Proteintrennung vom Liganden zu demonstrieren. Das HPLC-System bestand aus einer quaternären Pumpe, einem automatischen Probenahmeund Injektionsgerät, einem UV-Absorptionsdetektor, einem Schnittstellenmodul, einem Computer und einer Chemstation-Datenerfassungs- und -verarbeitungs-Software von Hewlett Packard (Modell 1050 HPLC, Hewlett Packard, Inc., Palo Alto, Kalifornien).
  • Der Komplex wurde unter Verwendung von rekombinantem humanisiertem IgG (rhuIgG) als Proteinprodukt von Interesse und rekombinantem Protein A (rPrA) als niedermolekularem Liganden, der damit wechselwirkt, gebildet. Stammlösungen wurden im Puffer der mobilen Phase (0,025 M NaCl, 0,025 M Tris-Base, 0,005 M EDTA, pH 7,1 ± 0,1) in einer Konzentration von 8 mg/ml bzw. 5 mg/ml hergestellt. Die Stammlösungen wurden in diesem Puffer kombiniert und verdünnt, um einen Komplex zu bilden, der 0,8 mg/ml rhuIgG und 0,2 mg/ml rPrA enthielt.
  • Rinderserumalbumin-(BSA-) Monomer wurde aus Sulfhydryl-modifiziertem BSA von Miles Corporation unter Verwendung von Größenausschlusschromatographie gereinigt. Dieses Monomer wurde als die Verunreinigung verwendet. Eine Stammlösung wurde im Puffer der mobilen Phase (0,025 M NaCl, 0,025 M Tris-Base, 0,005 M EDTA, pH 7,1 ± 0,1) in einer Endkonzentration von 5 mg/ml hergestellt.
  • Um den Komplex in Gegenwart der Verunreinigung zu bilden, wurde rPrA zu einer Lösung von rhuIgG und BSA im Puffer der mobilen Phase (0,025 M NaCl, 0,025 M Tris-Base, 0,005 M EDTA, pH 7,1 ± 0,1) zu einer Endkonzentration von 0,8 mg/ml rhuIgG, 0,2 mg/ml rPrA und 0,3 mg/ml BSA zugesetzt. Als eine Kontrolle, um die Trennung der Verunreinigung vom Produkt ohne die Gegenwart des Komplexes zu demonstrieren, wurden die rhuIgG- und BSA-Stammlösungen vereinigt und im Puffer der mobilen Phase zu einer Endkonzentration von 0,8 mg/ml bzw. 0,3 mg/ml verdünnt.
  • Proben der drei einzelnen Stammlösungen sowie Proben der Komplex-, Komplexverunreinigungs- und Proteinproduktverunreinigungslösungen wurden auf Größenausschlusschromatographie-(SEC-) Säulen, wie zuvor beschrieben, injiziert, um die Retentionszeiten und Trennungen der verschiedenen Spezies zu bestimmen.
  • Die oben beschriebenen einzelnen Stammlösungen und verschiedene Gemische davon wurden durch Größenausschlusschromatographie wie folgt analysiert. Proben wurden in zwei Superdex-200-Säulen (innerer Durchmesser = 10 mm, Länge = 300 mm pro Säule, Pharmacia Biotech. Inc., Piscataway, New Jersey) injiziert, die in Serie angeordnet waren. Ein Puffer, der 0,025 M NaCl, 0,025 M Tris-Base, 0,005 M EDTA, pH 7,1 ± 0,1, enthielt, wurde als mobile Phase verwendet. Nach Injektion auf die Säulen wurden die Proben in den Säulen bei einer volumetrischen Durchflussgeschwindigkeit von 0,5 ml/Minute getrennt. Die Gesamtdurchlaufzeit pro Probe betrug 90 min. Proteinelution wurde durch UV-Absorption bei 280 nm gemessen. Diese Parameter sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
  • TABELLE 1: HPLC-SEC-Verfahren: Komplexverunreinigungsabtrennung
    Figure 00250001
  • Unter den oben beschriebenen Bedingungen konnte Abtrennung der BSA-Verunreinigung vom rhuIgG-Produkt nicht erreicht werden. Wie in den 1 und 2 beispielsweise gezeigt, zeigten die einzelnen BSA- und rhuIgG-Moleküle Retentionszeiten, die sehr nahe beieinander lagen, 55,9 min für rhuIgG (1) und 57,7 min für BSA (2). Wurde ein Gemisch der rhuIgG- und BSA-Moleküle hergestellt und durch das oben beschriebene HPLC-SEC-Trennungsverfahren analysiert, so wurde ein einzelner Peak mit einer Retentionszeit von 56,7 min (3) beobachtet, was auf die Unfähigkeit, das erwünschte Proteinprodukt (rhuIgG) von der Verunreinigung (BSA) zu trennen, hinweist.
  • Die Bildung des rhuIgG/rPrA-Komplexes wurde durch das zuvor beschriebene HPLC-SEC-Verfahren mit einem einzelnen Peak bei 47,3 min, der bei Injektion der Lösung, die einen aus 0,8 mg/ml rhuIgG und 0,2 mg/ml rPrA gebildeten Komplex enthielt, beobachtet wurde, nachgewiesen (4). Einzeln injiziert wiesen rhuIgG und rPrA Retentionszeiten von 55,9 min (1) bzw. 52,3 min (5) auf. Die Verschiebung zu einem einzelnen Peak mit einer geringeren Retentionszeit als beide der zwei einzelnen Moleküle weist auf die Bildung eines Komplexes mit einem größeren Molekulargewicht und hydrodynamischen Volumen hin.
  • Durch die Bildung des Komplexes zwischen rhuIgG und rPrA und dadurch Ändern des effektiven hydrodynamischen Volumens des Proteins konnte nun eine Abtrennung der BSA-Verunreinigung vom rhuIgG/rPrA-Komplex erreicht werden. Wie in 6 beispielsweise gezeigt, betrug die Retentionszeit für den Komplex 47,8 min, während die Retentionszeit für die eindeutig anders beschaffene BSA-Verunreinigung 56,9 min betrug. Somit kann durch Einführen eines niedermolekularen Liganden, der in der Lage ist, mit einem Produktprotein wechselzuwirken, wodurch das effektive Molekulargewicht und hydrodynamische Volumen des Proteinprodukts verändert wird, das Produktprotein (in der Komplexform mit einem Liganden) wirksam von einer Verunreinigung getrennt werden, die vom Produktprotein nicht abtrennbar ist, wenn sie individuell kombiniert werden.
  • Nach der Trennung der BSA-Verunreinigung vom rhuIgG/rPrA-Komplex wie zuvor beschrieben wurde der Komplex in seine einzelnen Komponenten dissoziiert, die dann wiederum getrennt wurden, um ein reines rhuIgG-Proteinprodukt, das frei von BSA und rPrA ist, zu erhalten. Dissoziation des rhuIgG/rPrA-Komplexes in seine einzelnen rhuIgG- und rPrA-Komponenten wurde durch Ändern des pH und der Ionenstärke der Lösung wie folgt beobachtet.
  • Im Detail beschrieben wurden zwei Superose-6-Säulen (innerer Durchmesser = 10 mm, Länge 300 mm pro Säule, Pharmacia Biotech., Inc., Piscataway, New Jersey) in Serie laufen gelassen. Ein Puffer, der 0,1 M Essigsäure, 0,15 M NaCl, pH 3,5 ± 0,1, enthielt, wurde bei einer volumetrischen Durchflussgeschwindigkeit von 0,4 ml/min als mobile Phase verwendet. Proteinelution wurde durch UV-Absorption bei 214 nm beobachtet. Gesamtdurchlaufzeit pro injizierte Probe betrug 110 min. Diese Parameter sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengefasst.
  • TABELLE 2: HPLC-SEC-Verfahren: Komplexdissoziation und Komponententrennung
    Figure 00270001
  • Proben einzelner rhuIgG- und rPrA-Stammlösungen sowie die komplexe Lösung, die 0,8 mg/ml rhuIgG und 0,2 mg/ml rPrA enthielt, wurden auf die Säule injiziert, um Retentionszeiten und Abtrennung der verschiedenen Spezies zu bestimmen. Die Proben wurden in einem Laufpuffer von 0,025 M NaCl, 0,025 M Tris-Base, 0,005 M EDTA, pH 7,1 ± 0,1, hergestellt. Da das Volumen von injizierter Probe im Vergleich zum Gesamtvolumen der Säule so gering war (0,2 % Beladung), zeigten theoretische Berechnungen, dass die Proben zur mobilen Phase von 0,1 M Essigsäure, 0,15 M NaCl, pH 3,5 ± 0,1 innerhalb des ersten Zentimeters der Säulenlänge ausgetauscht wurden.
  • Unter den neuen, saureren Pufferbedingungen zeigte eine Analyse der einzelnen Proben von rhuIgG und rPrA Retentionszeiten von 91,8 min für rhuIgG (7) und von 80,6 min für rPrA (8).
  • Die Analyse einer Injektion des Komplexes zeigte Basislinientrennung von zwei Peaks mit Retentionszeiten, die den Peaks für die einzelnen rhuIgG- und rPrA-Komponenten entsprachen (9; 91,8 min bzw. 80,4 min). Diese Resultate weisen darauf hin, dass sich der Komplex unter diesen Bedingungen in die individuellen rhuIgG- und rPrA-Komponenten teilt, sodass der rhuIgG-Pool als ein gereinigtes Produkt abgenommen werden kann.
  • Die oben dargestellten Resultate zeigen, dass die Abtrennung einer Verunreinigung von einem Proteinprodukt in freier Lösung durch den Zusatz eines niedermolekularen Liganden erreicht werden kann, der in der Lage ist, mit dem Proteinprodukt wechselzuwirken und dadurch das Molekulargewicht und das hydrodynamische Volumen des Proteinprodukts zu verändern und es von der Verunreinigung abtrennbar zu machen. Wie zuvor gezeigt ermöglichte Affinitätsbindung die Bildung des Protein/Ligand-Komplexes rhuIgG/rPrA. Diese Wechselwirkung veränderte die Eigenschaften des Proteins rhuIgG und bildet dadurch ein Molekül mit einem größeren hydrodynamischen Volumen. Diese neuen Eigenschaften ermöglichten die Trennung der BSA-Verunreinigung vom rhuIgG-Protein unter Verwendung von HPLC-SEC. Nach der Abtrennung des Komplexes von der Verunreinigung wurde der Komplex anschließend durch Verändern der Lösungsbedingungen, des pH und der Ionenstärke erfolgreich in seine einzelnen Komponenten dissoziiert. Endgültige Reinigung des rhuIgG-Produkts wurde durch Abtrennung des einzelnen Proteins von den Ligandenmolekülen unter Verwendung von HPLC-SEC erreicht.
  • Die obige Beschreibung stellt spezifische Verfahren im Detail dar, die verwendet werden können, um die vorliegende Erfindung durchzuführen. Anhand dieser detaillierten Beschreibung solcher spezifischen Verfahren wird es für Fachleute durchwegs ersichtlich sein, wie sie alternative zuverlässige Verfahren entwickeln können, die unter Verwendung der Erkenntnisse der vorliegenden Erfindung dieselben Informationen liefern können. Auch wenn jedoch die obige Beschreibung ausformuliert vorliegen sollte, ist sie nicht als Einschränkung für den gesamten Schutzumfang der Erfindung zu verstehen; der Umfang der vorliegenden Erfindung wird nur durch den rechtsgültigen Aufbau der beiliegenden Ansprüche festgelegt.

Claims (11)

  1. Verfahren zum Trennen einer ersten Spezies von Interesse von einer zweiten Spezies von Interesse in einem freien Lösungsgemisch, das die erste und zweite Spezies von Interesse umfasst, wobei die erste und zweite Spezies etwa das gleiche hydrodynamische Volumen aufweisen und das Verfahren Folgendes umfasst: Kontaktieren des freien Lösungsgemischs mit einem Liganden, der im freien Lösungsgemisch löslich ist, worin der Ligand mit der ersten Spezies wechselwirkt, worin das Molekulargewicht des Liganden kleiner ist als das Molekulargewicht der ersten Spezies und worin die Wechselwirkung zur Bildung eines Komplexes aus der ersten Spezies und dem Liganden führt, der ein größeres hydrodynamisches Volumen aufweist als die zweite Spezies in freier Lösung; und Trennen des Komplexes aus der ersten Spezies und dem Liganden von der zweiten Spezies durch Größenausschlusschromatographie oder Membranfiltration; wodurch eine Zusammensetzung bereitgestellt wird, die im Wesentlichen frei von der zweiten Spezies ist; und worin die erste Spezies aus der aus einem Protein, einem Polypeptid und einem Antikörper bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die erste Spezies von Interesse ein Immungammaglobulin umfasst und der Ligand Protein A ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Größenausschlusschromatographie bei einer Ionenstärke von weniger als etwa 100 mM durchgeführt wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Trennschritt durch Membranfiltration durchgeführt wird.
  5. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Membranfiltration Tangentialflussfiltration ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, worin die Tangentialflussfiltration Hochleistungstangentialflussfiltration ist.
  7. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Membranfiltration Ultrafiltration, Umkehrosmose oder Mikrofiltration ist.
  8. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, ferner den Schritt des Dissoziierens des Komplexes aus der ersten Spezies und dem Liganden in seine Einzelkomponenten umfassend, worin das Dissoziieren nach dem Trennschritt stattfindet.
  9. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin mehr als ein Ligand mit der ersten Spezies von Interesse wechselwirkt.
  10. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Ligand nicht mit der zweiten Spezies von Interesse wechselwirkt.
  11. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die erste Spezies von Interesse eine Verunreinigung ist.
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