DE69837111T2

DE69837111T2 - Antibiotikum tkr2999, verfahren zur herstellung desselben sowie mikrobe

Info

Publication number: DE69837111T2
Application number: DE69837111T
Authority: DE
Inventors: Kazutoh Otsu-shi TAKESAKO; Naoyuki Awazu; Mitsuhiro Kusatsu-shi UENO; Yoshimi Onishi; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1997-12-22
Filing date: 1998-12-22
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2018-12-23
Also published as: EP1044983B1; US6333305B1; EP1044983A4; ATE353905T1; WO1999032498A1; JP4132665B2; DE69837111D1; EP1044983A1; AU1889199A

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft das Antibiotikum TKR2999, das als ein therapeutisches Mittel für Krankheiten aufgrund von Pilzinfektionen nützlich ist, ein Verfahren zu seiner Herstellung, sowie Mikroorganismen, welche dieses herstellen.
HINTERGRUND DES STANDES DER TECHNIK
Pilze sind dafür bekannt, eine Vielzahl von Infektionskrankheiten beim Menschen, bei Tieren und Pflanzen zu verursachen. Beim Menschen verursachen sie zum Beispiel oberflächliche Mykosen, welche die Haut, die Mundhöhle und dergleichen beeinträchtigen, sowie systemische Mykosen, welche die Eingeweide, das Gehirn und dergleichen betreffen. Sie verursachen ähnliche Infektionen bei Haustieren und ebenso bei Nutztieren. Darüber hinaus fügen Pilze zahlreiche schädigende Wirkungen den Pflanzen zu, wie zum Beispiel Obstbäumen und Gemüsen.
Als die wichtigsten pathogenen Pilze, welche systemische Mykosen beim Menschen verursachen, sind unter anderem solche der Genera Candida, Cryptococcus und Aspergillus bekannt. Was die oberflächlichen Mykosen betrifft, werden Pilze der Spezies Candida, welche die Haut, die Mundhöhle und die Vagina befallen, sowie Pilze der Gattung Trichophyton, welche die Haut der Extremitäten infizieren, als die bedeutenden pathogenen Pilze angesehen. Abgesehen von jenen Pilzen gibt es viele andere Pilze in der Umwelt, welche verdächtigt werden, das Tier- und Pflanzenreich zu verunreinigen.
Als Antimykotika für die Verwendung zur Vorbeugung und Behandlung solcher Pilzinfektionen und -verunreinigungen sind lediglich sehr wenige bekannt. Als therapeutische Arzneimittel für systemische Mykosen bei Mensch und Tier können zum Beispiel Amphotericin B, Flucytosin, Miconazol und Fluconazol erwähnt werden. Jedoch sind solche Verbindungen nicht vollständig zufriedenstellend in ihrer Wirksamkeit, ihrem toxischen Potential, ihrem antimykotischen Spektrum, so dass sie als therapeutische Arzneimittel nicht fehlerlos sind. JP 02 233 689 offenbart ein Antibiotikum und seine Herstellung durch Kultivierung eines Stammes der Klasse Fungi imperfecti.
In Anbetracht des vorstehend erwähnten Standes der Technik ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Antibiotikum bereitzustellen, welches als ein therapeutisches Mittel für Pilzinfektionen wertvoll ist.
Bei der Suche nach neuen Antibiotika haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung eine große Zahl von Mikroorganismen aus der Natur isoliert, und die Antibiotika isoliert, welche sie produzieren, sowie ihre biologischen Eigenschaften genau untersucht. Als ein Ergebnis entdeckten sie, dass das Kulturmedium eines Stammes eines Mikroorganismus' der Klasse Fungi imperfecti ein Antibiotikum enthielt, welches eine antimykotische Wirkung gegenüber pathogenen Pilzen aufwies, einschließlich Candida albicans, C. kefyr, Cryptococcus neoformans und Aspergillus fumigatus. Dementsprechend isolierten die Erfinder dieses Antibiotikum und studierten seine physikalisch-chemischen Eigenschaften. Als ein Ergebnis entdeckten sie, dass es sich um eine neue Substanz handelte, die bestimmte physikalisch-chemische Eigenschaften aufwies, welche bisher in der Literatur nicht beschrieben wurden, und nannten sie TKR2999. Die vorliegende Erfindung beabsichtigt, das vorstehende Antibiotikum TKR2999 sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung bereitzustellen.
Die vorliegenden Erfindungen werden in Einzelheiten nachfolgend beschrieben.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Das vorstehende Antibiotikum TKR2999 besitzt die physikalischchemischen Eigenschaften von (1), (2), (3), (4) und (5), die nachfolgend beschrieben sind:

(1) das Massenspektrum durch das FAB-MS-Verfahren ergibt einen Ionenpeak von [M + H]⁺ bei m/z 971;
(2) die Molekülformel wird durch C₄₄H₇₈N₁₀O₁₄ dargestellt und sein Massenspektrum durch hochauflösende FAB-MS ergibt m/z 971,5776 als [M + H]⁺;
(3) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum in Methanol weist eine End-Absorption auf;
(4) das Infrarot-Absorptionsspektrum durch das KBr-Verfahren zeigt die wichtigsten Absorptionen bei den Wellenzahlen von 3320, 2920, 1680, 1540, 1210, 1140, 840, 800 und 720 cm^–1;
(5) Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glycin, Alanin, β-Alanin und Ornithin werden durch Aminosäureanalyse unter Verwendung der Ninhydrin-Reaktion nachgewiesen; und
(6) die Löslichkeit ist dergestalt, dass es in Methanol löslich ist, und dass es in Hexan, Chloroform und Wasser praktisch unlöslich ist.

Das vorstehend erwähnte Antibiotikum TKR2999 weist das in 3 gezeigte ¹H-NMR-Spektrum und das in 4 gezeigte ¹³C-NMR-Spektrum auf, und wird dadurch gekennzeichnet, dass es in der Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie mit reverser Phase an der in 5 angegebenen Position eluiert wird.
Das vorstehend erwähnte Antibiotikum TKR2999 kann durch Züchtung eines Stammes eines Mikroorganismus' hergestellt werden, der zur Klasse Fungi imperfecti gehört und imstande ist, dieses TKR2999 in einem Kulturmedium herzustellen, sowie durch Isolieren der Substanz aus dem Kulturmedium des vorstehend erwähnten Stammes.
Der Stamm des Mikroorganismus', der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist nicht beschränkt und kann beliebig verwendet werden, vorausgesetzt, dass er imstande ist, das TKR2999 herzustellen. Ein Beispiel für diesen Stamm, der für die Herstellung dieser Verbindung verwendet wird, ist der Pilz TKR2999 (nachfolgend als der „TKR2999-Stamm" bezeichnet), der zur Klasse Fungi imperfecti gehört.
Der vorstehend erwähnte TKR2999-Stamm ist ein neuer Stamm, der bisher in der Literatur nicht beschrieben wurde, und er wurde zum erstenmal durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung isoliert und charakterisiert. Der Stamm weist die Eigenschaft auf, in vorteilhafter Weise TKR2999 herzustellen. Die mykologischen Eigenschaften dieses TKR2999-Stammes werden nunmehr in Einzelheiten wie folgt beschrieben.
Die Farben der Kolonien des TKR2999-Stammes auf verschiedenen Medien sind in Tabelle 1 angegeben. Die Beschreibung der Farben in der Tabelle beruht auf jenen, die im japanischen Industriestandard (Japanese Industrial Standard; JIS) Z 8102 (1985) vorgeschrieben sind. Die Ergebnisse der Beobachtung bei einem Zeitpunkt von 14 Tagen der Kultur bei 25 °C nach der Überimpfung sind gezeigt.
Tabelle 1
Der vorstehende TKR2999-Stamm wächst langsam auf Agar mit Malzextrakt, Agar mit Kartoffel-Dextrose und Sabouraud-Agar, und dergleichen. Die Kolonie besitzt ein samtartiges Aussehen und erhebt sich in der Mitte mit festen, harten Mycelen. Die Konidien des TKR2999-Stammes sind einzellig, zylindrisch mit glatter Oberfläche, und die beiden Kanten sind rund. Ihre Größe beträgt 3 – 8 × 1,5 – 2,5 μm. Die Konidien werden auf dem vorstehenden Medium gut ausgebildet, jedoch ist die Art der Konidien-Bildung in Anbetracht des Konidiophors uncharakteristisch.
Von den mykologischen Eigenschaften des TKR2999-Stammes sind die physiologischen Eigenschaften wie folgt:
Temperaturbereich für das Wachstum: der Temperaturbereich für das Wachstum beträgt 10 bis 30 °C und der optimale Temperaturbereich für das Wachstum liegt bei etwa 25 °C.
Der pH-Bereich für das Wachstum: der pH-Bereich für das Wachstum beträgt pH 3 bis 9, und der optimale Bereich des pH-Werts für das Wachstum beträgt pH 5.
Die vorstehenden mykologischen Eigenschaften werden mit den Beschreibungen der Arten der Klasse Fungi imperfecti verglichen, die beschrieben sind in „A Manual of Soil Fungi" von Joseph C. Gilman (Constable and Company Ltd.) (1959), und dergleichen. Die Art des TKR2999-Stammes kann nicht identifiziert werden, da die Art ihrer Konidienbildung nicht identifiziert wurde.
Es war jedoch unter den Stämmen der Klasse Fungi imperfecti keine Beschreibung für einen Stamm eines Mikroorganismus' erhältlich, der die Fähigkeit aufweist, TKR2999 herzustellen. Somit betrachteten die Erfinder der vorliegenden Erfindung ihn als einen neuen Stamm und nannten den Pilzstamm der Fungi imperfecti TKR2999. Der Stamm wurde hinterlegt bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology (Adresse: 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan, Postleitzahl 305-0046) unter der Zugangsnummer FERM BP-6524 (ursprüngliches Datum der Hinterlegung: 21. November 1997; Datum des Antrags für die Übermittlung zur internationalen Hinterlegung: 24. September 1998).
Die vorliegende Erfindung kann in der Praxis nicht nur mit dem vorstehend erwähnten TKR2999-Stamm durchgeführt werden, sondern auch mit beliebigen spontanen und künstlichen Mutanten des TKR2999-Stammes oder eines beliebigen anderen Stammes eines Mikroorganismus', der zur Klasse Fungi imperfecti gehört und imstande ist, TKR2999 herzustellen.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird TKR2999 durch Kultivierung eines vorstehend beschriebenen, TKR2999-produzierenden Stammes in einem Nährmedium hergestellt. Nährmedien, die für das Medium verwendet werden sollen, umfassen verschiedene Kohlenstoffquellen, wie zum Beispiel Glukose, Fruktose, Saccharose, Stärke, Dextrin, Glycerin, Molassen, Malzsirup, Öle und Fette und organische Säuren.
Nährmedien, die für das Medium verwendet werden können, umfassen Stickstoffquellen, organische und anorganische Materialien, wie zum Beispiel Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maisquellwasser, Casein, Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Weizenkeime, Harnstoff, Aminosäuren, Ammoniumsalze und dergleichen. Salze als Nährmedien sind verschiedene anorganische Salze, wie zum Beispiel Salze des Natriums, Kaliums, Calciums, Magnesiums und dergleichen, sowie Salze der Phosphorsäure. Diese Materialien können unabhängig voneinander oder in einer geeigneten Kombination verwendet werden.
Falls nötig, kann das Nährmedium mit Schwermetallsalzen ergänzt werden, wie zum Beispiel Eisensalzen, Kupfersalzen, Zinksalzen, Kobaltsalzen, und dergleichen, mit Vitaminen, wie zum Beispiel Biotin, Vitamin B₁ und dergleichen, und anderen organischen und anorganischen Substanzen, welche das Wachstum des Mikroorganismus' unterstützen und die Erzeugung von TKR2999 fördern.
Zusätzlich zu den vorstehenden Bestandteilen können ein Entschäumer und/oder ein grenzflächenaktives Mittel, zum Beispiel Silikonöl, Polyalkylenglykolether und dergleichen, zu dem Nährmedium gegeben werden.
Bei der Kultur eines Stammes des Mikroorganismus' in diesem Nährmedium, welcher Mikroorganismus imstande ist, TKR2999 herzustellen, kann eine Vielzahl von Kulturverfahren verwendet werden, die im Allgemeinen bei der Herstellung von Antibiotika durch Mikroorganismen verwendet werden. Jedoch ist ein Flüssigkulturverfahren, insbesondere ein Verfahren durch Schüttelkultur oder durch aerobe Submerskultur bevorzugt.
Die Kultivierung wird vorzugsweise bei 15 bis 25 °C durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums kann im Bereich von pH 3 bis 8 liegen, und er liegt vorzugsweise bei etwa pH 5. In Bezug auf die Inkubationszeit kann im Allgemeinen ein ausreichender Ertrag der Substanz nach 6 bis 15 Tagen Kultur erwartet werden.
Mittels der vorstehenden Kultivierung ist TKR2999 sowohl intrazellulär als auch extrazellulär enthalten, und wird in dem Kulturmedium angehäuft. In der vorstehenden Erfindung kann das in dem Kulturmedium angehäufte TKR2999 wiedergewonnen und aus dem Kulturmedium durch Ausnutzung seiner physikalisch-chemischen Eigenschaften isoliert werden, und falls nötig, durch weitere Reinigung.
Die vorstehend erwähnte Rückgewinnung kann durch Extraktion des gesamten Mediums mit einem nicht hydrophilen, organischen Lösungsmittel erfolgen, wie zum Beispiel Ethylacetat, Butylacetat, Chloroform, Butanol, Methylisobutylketon oder dergleichen. Als eine Alternative ist es möglich, das Nährmedium der Zentrifugation oder Filtration zu unterziehen, um das Medium und die Zellen zu trennen, und die Antibiotika jeweils aus dem Medium und den Zellen zu isolieren.
Zur Trennung des TKR2999 von dem Medium kann nicht nur das vorstehend erwähnte Extraktionsverfahren unter Verwendung eines nicht hydrophilen organischen Lösungsmittels, sondern auch das Verfahren verwendet werden, welches das In-Kontakt-Bringen des Mediums mit einem Adsorptionsmittel umfasst, um das TKR2999 auf dem Adsorptionsmittel zu adsorbieren, und es mit einem Lösungsmittel zu desorbieren oder zu eluieren.
Das Adsorptionsmittel, welches verwendet werden kann, umfasst zum Beispiel Aktivkohle, Zellulosepulver und adsorbierende Harze. Als das vorstehend erwähnte Lösungsmittel können eine Vielzahl von Lösungsmitteln selektiv entsprechend der Art und den Eigenschaften des Adsorptionsmittels verwendet werden, und sie können entweder einzeln oder in Kombination verwendet werden. Somit kann eine wässrige Lösung von einem oder mehreren wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie zum Beispiel wässriges Aceton, wässriger Alkohol, und dergleichen, verwendet werden. Zur Trennung von TKR2999 von den Zellen kann das Extraktionsverfahren unter Verwendung eines hydrophilen organischen Lösungsmittels, wie zum Beispiel Aceton, verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung kann der wie vorstehend beschriebene, aus dem Kulturmedium erhaltene Rohextrakt von TKR2999 einem Verfahren zur Reinigung unterzogen werden, falls nötig. Die Reinigung kann durch herkömmliche Verfahren zur Trennung und Reinigung von hydrophoben Antibiotika durchgeführt werden. Beispiele für die Verfahren sind die Säulenchromatographie oder die Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie unter Verwendung einer Säule, die mit einer stationären Phase gepackt ist, wie zum Beispiel Silikagel, aktiviertes Aluminiumoxid, Aktivkohle, adsorbierendes Harz und dergleichen. Das Elutionsmittel, welches für die Säulenchromatographie mit Silikagel verwendet werden kann, umfasst Chloroform, Ethylacetat, Methanol, Aceton, Wasser, eine Mischung derselben, und dergleichen.
Das Harz für die Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie umfasst ein chemisch derivatisiertes Silikagel, wie zum Beispiel Silikagel-Derivate mit Octadecyl-, Octyl-, oder Phenyl-Gruppen, und poröse Polymer-Gele aus Polystyrol, während die mobile Phase, welche verwendet werden kann, wässrige Lösungen von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln umfasst, wie zum Beispiel wässriges Methanol, wässriges Acetonitril und dergleichen.
Das TKR2999 der vorliegenden Erfindung kann in medizinischen Anwendungen jeweils als solches oder in Form eines pharmakologisch verträglichen Salzes verwendet werden. Es gibt keine besondere Beschränkung bezüglich der Art des pharmakologisch verträglichen Salzes. Somit umfasst das Salz Salze der Mineralsäuren, wie zum Beispiel Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Fluorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, und dergleichen, Salze von organischen Säuren, wie zum Beispiel Ameisensäure, Essigsäure, Weinsäure, Milchsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Kamphersulfonsäure, und dergleichen, sowie Salze von Alkalimetallen oder Erdalkalimetallen, wie zum Beispiel Natrium, Kalium, Calcium und dergleichen.
Um TKR2999 oder sein pharmakologisch verträgliches Salz als ein Arzneimittel zu verabreichen, kann es an Tiere einschließlich des Menschen entweder als solches oder in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden, die typischerweise 0,1 bis 99,5 %, vorzugsweise 0,5 bis 90 % desselben in einem pharmazeutisch verträglichen, nicht toxischen und inerten Träger enthält.
Der vorstehend erwähnte Träger umfasst einen Feststoff, einen Halbfeststoff oder flüssige Verdünnungsmittel, Füllstoffe, andere Hilfsmittel für die Formulierung, und dergleichen, und solche Träger können einzeln oder in Kombination verwendet werden.
Die vorstehend erwähnte pharmazeutische Zusammensetzung wird vorzugsweise in einheitlichen Dosierungsformen verabreicht und kann oral, parenteral, topisch (zum Beispiel transdermal) oder rektal verabreicht werden. Selbstverständlich sollten solche pharmazeutischen Zusammensetzungen in Dosierungsformen verabreicht werden, die für den jeweiligen Verabreichungsweg geeignet sind.
Für die Verabreichung von TKR2999 oder seines pharmakologisch verträglichen Salzes als ein Arzneimittel wird die Dosis als ein antimykotisches Mittel vorzugsweise unter Bezugnahme auf Faktoren ausgewählt, die durch den Patienten bedingt sind, wie zum Beispiel das Alter und das Körpergewicht, der Verabreichungsweg, das Wesen und der Schweregrad der Krankheit, und dergleichen. Beim Menschen beträgt jedoch die tägliche Dosis des wirksamen Bestandteils bei einem erwachsenen Patienten 10 bis 2000 mg. Während eine tägliche Dosis von weniger als dem vorstehenden Bereich in manchen Fällen ausreichend sein kann, kann eine höhere Dosis als der vorstehend angegebene Bereich in anderen Fällen erforderlich sein. Wenn eine hohe Dosis verwendet wird, wird die tägliche Dosierung vorzugsweise in einigen aufgeteilten Dosen verabreicht. Die vorstehende orale Verabreichung kann unter Verwendung von festen, pulverförmigen oder flüssigen Dosierungsformen erfolgen, wie zum Beispiel Pulvern in großen Mengen, Pulvern, Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropfen, sublingualen Tabletten, und dergleichen.
Für die vorstehende parenterale Verabreichung kann eine flüssige Dosierungsform in Form von Einheiten für die subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Verabreichung verwendet werden, typischerweise Lösungen und Suspensionen. Diese Zubereitungen können durch Suspendieren und Auflösen einer vorgegebenen Menge von TKR2999 oder eines pharmakologisch verträglichen Salzes desselben in einem nicht toxischen flüssigen Träger hergestellt werden, der für die Injektion geeignet ist, wie zum Beispiel einem wässrigen Medium oder einem öligen Medium, und durch Sterilisation der erhaltenen Suspension oder Lösung.
Die topische Verabreichung (zum Beispiel transdermale Verabreichung) kann unter Verwendung einer Vielzahl topischer Dosierungsformen durchgeführt werden, wie zum Beispiel mit Flüssigkeiten, Cremen, Pulvern, Pasten, Gelen und Salben. Diese Dosierungsformen können unter Verwendung einer vorgegebenen Menge von TKR2999 oder eines pharmakologisch verträglichen Salzes desselben in Verbindung mit einem oder mehreren Hilfsstoffen hergestellt werden, wie zum Beispiel einem Parfüm, Färbemittel, Füllstoff, grenzflächenaktiven Mittel, Feuchthaltemittel, einem weichmachenden Mittel, einem gel-bildenden Mittel, Träger, Konservierungsmittel, Stabilisator und dergleichen, welche für die Formulierungen zur topischen Dosierung geeignet sind.
Die rektale Verabreichung kann zum Beispiel unter Verwendung von Zäpfchen erfolgen, wobei jeweils eine vorgegebene Menge von TKR2999 oder seines pharmakologisch verträglichen Salzes der vorliegenden Erfindung mit einem niedrig schmelzenden, festen Grundstoff vermischt wird, wie zum Beispiel höheren Estern, zum Beispiel Myristylpalmitat, Polyethylenglycol, Kakaobutter, oder eine Mischung derselben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Antibiotikums TKR2999. Die Ordinate stellt die Absorption dar und die Abszisse stellt die Wellenlänge (nm) dar.
2 ist ein Infrarot-Absorptionsspektrum des Antibiotikums TKR2999. Die Ordinate stellt die Durchlässigkeit (%) dar und die Abszisse stellt die Wellenzahl (cm^–1) dar.
3 ist ein ¹H-NMR-Spektrum des Antibiotikums TKR2999. Die Ordinate stellt die Intensität des Signals dar und die Abszisse stellt die chemische Verschiebung (ppm) dar.
4 ist ein ¹³C-NMR-Spektrum des Antibiotikums TKR2999. Die Ordinate stellt die Intensität des Signals dar und die Abszisse stellt die chemische Verschiebung (ppm) dar.
5 zeigt ein HPLC-Elutionsmuster des Antibiotikums TKR2999. Die Abszisse stellt die relative Intensität der Ultraviolett-Absorption dar und die Ordinate stellt die Retentionszeit (Min.) dar.
DIE BESTE ART ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Eine Platinöse mit dem Stamm TKR2999 (FERM BP-6524) von einer Schrägröhrchenkultur wurde verwendet, um einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben zu beimpfen, der 100 ml Flüssigmedium (Stickstoffbase aus Hefe von Difco 0,67 % (w/v) und Glukose 2,0 % (w/v)) enthielt, und die Kultur wurde auf einem Schüttler bei 25 °C für 10 Tage inkubiert, um eine Impfkultur herzustellen. Diese Impfkultur (1,0 ml) wurde auf jeweils 26 Erlenmeyer-Kolben mit 500 ml Fassungsvermögen übertragen, die jeweils 120 ml des gleichen flüssigen Mediums wie vorstehend enthielten, und sie wurden (unter Schütteln bei 220 UpM) bei 25 °C für 12 Tage inkubiert. Das gewonnene Kulturmedium wurde zentrifugiert und in den Überstand und die Zellen getrennt.
Die erhaltenen Zellen wurden mit 1 1 Methanol vermischt und einer ausreichenden Mischung für die Extraktion unterzogen. Der Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde mit jeweils 300 ml Wasser und Butanol vermischt und einer ausreichenden Mischung unterzogen, um eine Extraktion mit Butanol durchzuführen. Der Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingeengt, um 362 mg eines Rückstands zu ergeben.
Der Rückstand wurde in 2 ml Methanol gelöst und der Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie unterzogen, um eine aktive Fraktion bereitzustellen. Die Fraktion wurde unter vermindertem Druck eingeengt, um 1,2 mg gereinigtes TKR2999 als ein weißes Pulver zu gewinnen. Die Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
Gerät: LC-8A (Shimadzu)
Säule: YMC pack C18 (2,0 cm × 25 cm) (YMC)
Mobile Phase: 60 % (v/v) Acetonitril/Wasser, das 0,05 % Trifluoressigsäure enthielt
Physikalisch-chemische Eigenschaften
Die Massenspektrometrie wurde mit dem Massenspektrometer JMS-DX302 (Jeol Ltd.) durchgeführt. Das ¹H-NMR-Spektrum (in deuteriertem Dimethylsulfoxid mit deuteriertem Dimethylsulfoxid als Referenz) und das ¹³C-NMR-Spektrum (in deuteriertem Dimethylsulfoxid mit deuteriertem Dimethylsulfoxid als Referenz) wurden mit einem Spektrometer für die kernmagnetische Resonanz (JNM-A500, Jeol Ltd.) gemessen. Die Ultraviolett-Spektralphotometrie (in Methanol) wurde durch ein automatisch aufzeichnendes Spektralphotometer (UV-250, Shimadzu) durchgeführt, und die Infrarot-Absorptionsspektrometrie (KBr-Verfahren) wurde durch ein Infrarot-Spektralphotometer 270-30 (Hitachi) durchgeführt. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Substanz TKR2999 sind nachfolgend beschrieben.
(1) Massenspektrometrie und Bestimmung der Molekülformel
Es wurde anhand der Messung mit FAB-MS gefunden, dass das gereinigte, weiße, pulverförmige Produkt, welches aus der Konzentrierung der aktiven Fraktion in der Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie im Vakuum erhältlich ist, eine Substanz mit m/z 971 [M + H]⁺ darstellt. Darüber hinaus wurde ein hochauflösendes FAB-MS gemessen und ein [M + H]⁺ wurde bei m/z 971,5776 beobachtet. Dieses Ergebnis ergab die Molekülformel C₄₄H₇₈N₁₀O₁₄ (berechnet 971,5699) für TKR2999.
(2) Ultraviolett-Absorptionsspektrum
Es wurde gefunden, dass die UV-Absorption in Methanol des gereinigten, weißen, pulverförmigen Produktes, das aus der Vakuumkonzentrierung der aktiven Fraktion in der Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie erhältlich ist, eine Endabsorption aufweist.
Das UV-Absorptionsspektrum ist in 1 gezeigt.
(3) Infrarot-Absorptionsspektrum
Die spektralphotometrische Charakterisierung im infraroten Bereich (KBr-Verfahren) des gereinigten, weißen, pulverförmigen Produktes, das aus der Vakuumkonzentrierung der aktiven Fraktion in der Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie erhältlich ist, war wie folgt:
IR (KBr) (cm^–1): 3320, 2920, 1680, 1540, 1210, 1140, 840, 800, 720
Das Infrarot-Absorptionsspektrum ist in 2 gezeigt.
(4) ¹H-NMR- und ¹³C-NMR-Spektren
Das gereinigte, weiße, pulverförmige Produkt, das aus der Vakuumkonzentrierung der aktiven Fraktion in der Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie erhältlich ist, wurde verwendet, um das ¹H-NMR-Spektrum und das ¹³C-NMR-Spektrum zu messen.
Das ¹H-NMR-Spektrum und das ¹³C-NMR-Spektrum dieses Produkts sind in der 3 bzw. in der 4 dargestellt.
(5) Aminosäureanalyse
Das gereinigte, weiße, pulverförmige Produkt, das aus der Vakuumkonzentrierung der aktiven Fraktion in der Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie erhältlich ist, wurde in 6 N HCl bei 110 °C für 24 Stunden hydrolysiert. Das zersetzte Produkt wurde durch einen Aminosäureanalysator analysiert, und es wurden Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glycin und Alanin nachgewiesen. Darüber hinaus wurden β-Alanin und Ornithin nachgewiesen.
(6)
Was die Löslichkeit dieser Substanz in verschiedenen Lösungsmitteln betrifft, so war sie löslich in Methanol, jedoch in Hexan, Chloroform und Wasser praktisch unlöslich.
Auf der Grundlage der vorstehenden Analysen wurde das gereinigte, weiße, pulverförmige Produkt, das aus der Vakuumkonzentrierung der aktiven Fraktion in der Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie erhältlich ist, als TKR2999 identifiziert.
Das vorstehende TKR2999 wurde durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie mit einer Verteilung bezüglich der reversen Phase (HPLC) unter Verwendung der Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie LC-10A (Shimadzu) analysiert. Diese HPLC-Analyse wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
Säule: CAPCELL PAK C₁₈ (6 mm × 150 mm) (Shiseido)
Mobile Phase: 50 % (v/v) Acetonitril/Wasser, das 0,05 % Trifluoressigsäure enthielt
Säulentemperatur: 40 °C
Nachweis bei einer Wellenlänge der UV-Strahlung von: 220 nm
Als ein Ergebnis wurde das vorstehende TKR2999 bei der in 5 angegebenen Position eluiert.
Biologische Eigenschaften
Das erhaltene TKR2999 wurde in Bezug auf das antimikrobielle Spektrum gegenüber zahlreichen Mikroorganismen getestet. Mittels des Messverfahrens, bei dem das Flüssigmedium verdünnt wird, wurde die Konzentration, welche eine im Wesentlichen vollständige Hemmung des mikrobiellen Wachstums verursacht, als die minimale hemmende Konzentration (μg/ml) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Die minimale Konzentration, welche eine teilweise Hemmung des Pilzwachstums verursacht, wurde als die „sub-inhibierende" Konzentration (μg/ml) bestimmt und ist in Klammern in der Tabelle gezeigt. In der Tabelle steht YNBG für ein Medium, das 0,67 % Stickstoffbase aus Hefe (yeast nitrogen base, Difco) und 1,0 % Glukose umfasst, und BHI steht für ein Medium, das 0,5 % Gehirn-Herz-Infusions-Bouillon (brain heart infusion bouillon, Nissui) umfasst.
Tabelle 2
Es ist aus Tabelle 2 ersichtlich, dass TKR2999, das Antibiotikum gemäß der vorliegenden Erfindung, gegen pathogene Pilze wirksam ist, wie zum Beispiel Candida albicans, Candida kefyr, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, und dergleichen. Die intraperitoneale Verabreichung des vorstehend erhaltenen TKR2999 bei einer Dosierung von 50 mg/kg an ICR-Mäuse verursachte keine toxischen Anzeichen.
GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT
Die vorliegende Erfindung liefert das Antibiotikum TKR2999, welches für die klinische Medizin von Nutzen ist, zum Beispiel bei der Therapie von infektiösen Pilzkrankheiten, sowie ein Verfahren zur Herstellung der Substanz.

Claims

Antibiotikum TKR2999 mit den physikalisch-chemischen Eigenschaften von (1), (2), (3), (4) und (5), die nachfolgend beschrieben sind, und sein pharmakologisch akzeptables Salz: (1) das Massenspektrum mittels des FAB-MS-Verfahrens ergibt m/z 971 als [M + H]⁺; (2) die Molekülformel wird durch C₄₄H₇₈N₁₀O₁₄ dargestellt und sein Massenspektrum durch hochauflösende FAB-MS ergibt m/z 971,5776 als [M + H]⁺; (3) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum in Methanol weist eine End-Absorption auf; (4) das Infrarot-Absorptionsspektrum mittels des KBr-Verfahrens zeigt Hauptabsorptionen bei folgenden Wellenzahlen: 3320, 2920, 1680, 1540, 1210, 1140, 840, 800 und 720 cm^–1; (5) Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glycin, Alanin, β-Alanin und Ornithin werden durch Aminosäureanalyse unter Verwendung der Ninhydrin-Reaktion nachgewiesen; und (6) die Löslichkeit ist dergestalt, dass die Verbindung in Methanol löslich, und in Hexan, Chloroform und Wasser praktisch unlöslich ist.
Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums TKR2999, welches die Kultivierung eines Stammes eines Mikroorganismus umfasst, der zur Klasse Fungi imperfecti gehört und imstande ist, TKR2999 herzustellen, und welches das Ernten des gewünschten Antibiotikums aus dem erhaltenen Kulturmedium umfasst.
Mikroorganismus des Stammes TKR2999 (FERM BP-6524).