DE69900632T2

DE69900632T2 - Protokoll zur herstellung eines simulierten, natürlichen biobelags

Info

Publication number: DE69900632T2
Application number: DE69900632T
Authority: DE
Inventors: L. Bakich; M. Gipp
Original assignee: SC Johnson and Son Inc
Current assignee: SC Johnson and Son Inc
Priority date: 1998-02-13
Filing date: 1999-02-12
Publication date: 2002-06-13
Anticipated expiration: 2019-02-13
Also published as: CA2321258A1; ES2165228T3; PT1053299E; AU2677199A; WO1999041354A1; EP1053299A1; DK1053299T3; EP1053299B1; DE69900632D1; US5928889A; ATE211165T1; CA2321258C

Description

Technisches Anwendungsgebiet

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Verfahren zur Herstellung von experimentellen Biofilm-Matrices auf ausgewählten Oberflächen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Herstellung von simulierten natürlichen Biofilmen zum Testen der Aktivitäten von formulierten Produkten zur Verhinderung oder Entfernung der simulierten Biofilme von einer Trägeroberfläche.

Technischer Hintergrund

Seit 1943 hat sich eine riesige technische Literatur in Verbindung mit Fortschritten auf dem Gebiet der Biofilm-Forschung entwickelt. Das Verständnis der Biofilm-Verfahren hat in dem letzten Jahrzehnt schnelle Fortschritte gemacht. Eines der Endziele der Erforschung von Biofilmen besteht darin, Einrichtungen zu entwickeln, um diese Verfahren zu manipulieren zur Erzielung technischer und ökologischer Vorteile. Eine Übersicht über die Biofilm-Wissenschaft ist in Publikationen wie "Food Reviews International", 8 (4), 573 (1992); "Microbial Ecology in Health and Disease", 8, 305 (1995); "Annu. Rev. Microbiol", 49, 711 (1995); "Applied and Environmental Microbiology", 4014 (Nov. 1996); und "Biofilms" von W. G. Characklis und K. C. Marshall (John Wiley & Sons, Inc., New York, 1989) zu finden.
Wie in der technischen Literatur dargelegt, besteht ein Biofilm aus Zellen, die auf einem Substrat immobilisiert und in eine organische Polymer-Matrix mikrobiellen Ursprungs eingebettet sind. Ein Biofilm ist ein Oberflächenbelag, der nicht notwendigerweise einheitlich in bezug auf Zeit oder Raum ist. Ein Biofilm kann bestehen aus einem signifikanten Anteil von anorganischen oder ablotischen Substanzen, die durch die biotische Matrix zusammengehalten werden. Ein Biofilm ist eine Schutzmatrix für Bakterien, die den wesentlichen Zweck hat, das Überleben in einer Umgebung mit begrenzter Nährstoffzufuhr zu ermöglichen.
Biofilme bestehen sowohl aus Wirts-Mikroben als auch ihren extrazellulären Produkten, in der Regel Exopolysacchariden. Mikroben haben die Neigung, diese Exopolysaccharid-Schutzmatrices zu schützen, nachdem sie mit einer Oberfläche haftend verbunden worden sind. Die Bildung von Biofilm-Komplexen erfordert lediglich feuchte Bedingungen und/oder Wassersysteme und den Kontakt mit einer Trägeroberfläche. Hinsichtlich der Nährstoffe kann ein Nährstoffmangel tatsächlich das Biofilm-Bildungsvermögen der Mikroben verstärken, wie in "Adv. Appl. Microbiol.", 29, 93 (1983), beschrieben.
Biofilme können von nahezu allen Mikroben unter geeigneten Bedingungen hergestellt werden. Die bekanntesten Biofilm-Produzenten gehören zu den Genera Pseudomonas, Enterobacter, Fiavobacterium, Alcaligenes, Staphylococcus, und Bacillus. Es gibt auch Anaerobier, die korrosive Biofilme aufbauen können.
Außer den Problemen, die Biofilme in bezug auf die Reinigung und Hygiene schaffen können, können sie auch Energieverluste und Verstopfungen in Kondensator- und Wärmeaustauscher-Rohren verursachen, Wasser- und Abwasser-Systeme stören und den Strömungswiderstand erhöhende Inkrustationen auf Schiffsaußenwänden bilden. In den medizinischen Disziplinen kann ein durch Bakterien, beispielsweise eine Pseudomonas-Species, gebildeter Biofilm (als "Glycocalix" bezeichnet) systemische Erkrankungen der Lungen oder der Gastrointestinal- und Urin-Trakte verursachen. Außerdem kann ein durch Bakterien wie z.B. Staphylococcus-Species gebildeter Biofilm ein schwerwiegendes Kontaminationsproblem in Fremdkörper-Instrumenten, beispielsweise Herz-Schrittmachern, Kathetern, Prothesen, künstlichen Ventilen und dgl. darstellen. Die Zahn-Plaque ist ebenfalls eine typische Form eines Biofilms.
Einer der Hauptzwecke der Bildung eines natürlichen Biofilms ist der Schutz der Wirts-Mikroben gegen eine feindliche Umgebung. Infolgedessen besteht eine Kampf-Wechselwirkung zwischen den Mikroben in Biofilmen und bioziden Vehicula wie Konservierungsmitteln, Desinfektionsmitteln und Antibiotika. Außerdem ist der Verankerungsmodus des bakteriellen Wachstums bei Biofilmen verschieden von demjenigen der gleichen Bakterien-Species, die als Plankton- Zellen in einem zirkulierenden wässrigen Medium vorliegen, das mit dem Biofilm Grenzflächen bildet. Die Biofilme fungieren auch als Falle für das Einfangen von Nährstoffen, die ein wichtiger Faktor ist, wenn Bakterien auf Oberflächen wachsen und die Nährstoffquelle oligotroph ist.
Wegen der vielfachen Verästelungen der Biofilm-Bildung gibt es eine ernsthafte Verpflichtung zur Biofilm-Erforschung in einem breiten Bereich der wissenschaftlichen Forschung. Die Methoden zur Untersuchung der Biofilm-Bildung umfassen mikrobiologische, physikalische und chemische Verfahren. Wenn Mikroben aus einer extremen natürlichen Umwelt kultiviert werden, führt die Standard-Platten-Auszählung in der Regel nicht zu genauen Ergebnissen. Deshalb sind die klassichen Bewertungsmethoden, die auf einem mikrobiologischen Ausstrich beruhen, von fraglichem Wert bezüglich der Laboruntersuchung von Biofilmen, die natürlichen Biofilmen authentisch entsprechen sollen, wie sie in der Biosphäre vorkommen. Außerdem ist die Bildung eines Biofilms vom natürlichen Typ in der Labor-Umgebung schwierig, hauptsächlich deshalb, weil es keine derzeit verfügbaren standardisierten Verfahren gibt. Es besteht daher ein zunehmendes Interesse an der Erforschung und Entwicklung von Verfahren zur Herstellung und Untersuchung von Biofilmen in einer Laborumgebung.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein verbessertes Verfahren für die Herstellung von Biofilmen im Labor zu entwickeln, die natürliche Biofilme simulieren, die unter Biosphären-Bedingungen wachsen.
Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht darin, ein Labor-Protokoll zum Simulieren der natürlichen Biofilm-Bildung in Kombination mit einem weiteren Protokoll zum Testen der Aktivitäten von formulierten Produkten für die Inhibierung oder Entfernung der simulierten Biofilme als zuverlässigen Indikator für die gleichen Aktivitäten unter natürlichen Umweltbedingungen zu entwickeln.
Weitere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung und den folgenden Beispielen hervor.
Zu den im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung interessierenden Hintergrund-Publikationen gehören "Wat. Res.", 29 (8), 2006 (1995); "J. Ind. Micbrobiol.", 15, 137 (1995) und die darin genannten Referenzen.
In US-A-5 403 742 ist ein Bioreaktor für die Biosynthese/Biotransformation von Produkten beschrieben, in dem das Verfahren gestartet wird durch Beschicken des Bioreaktors mit einem geeigneten Medium, das ein Mikroorganismus- oder Zell-Inokulans enthält. Die Mikroorganismen werden im Innern des Bioreaktors auf Sieben aus rostfreiem Stahl festgehalten, die ihrerseits als Anwuchsstellen für die Bildung eines Biofilms dienen.
In WO-A-95/27039 ist eine Vorrichtung zum Nachweis von Mikroorganismen in Industriewässern beschrieben, die besteht aus einem zylindrischen Formkörper, der herausnehmbare Stahlplatten umfasst. Die Anwesenheit von Mikroorganismen wird durch Überwachung der Bildung eines Biofilms auf den Stahlplatten nachgewiesen, nachdem die Platten für eine bestimmte Zeitspanne in dem Wasserstrom belassen worden sind.
In DE-U-89 08 583 ist eine entfernbare Trägerfolie zum Züchten von Zellkulturen, gegebenenfalls in einem Bioreaktor, beschrieben. Die Folien bieten die Möglichkeit, jederzeit das Wachstum, die Differenzierung und die Sekretion des Mikroorganismus sowie die Stabilität des Biofilms in einer einzigen Folie zu kontrollieren bzw. zu steuern.

Beschreibung der Erfindung

Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich von dem oben diskutierten Stand der Technik, insbesondere dem nächsten Stand der Technik, wie er durch US-A-5 403 742 repräsentiert wird, dadurch, dass das Reservoir mit einem wässrigen Nährmedium wieder beschickt wird, um das Bakterienwachstum für eine Zeitspanne aufrechtzuerhalten, die ausreicht, um einen Biofilm der gewünschten Dicke auf der Objetträger-Oberfläche zu bilden.
Im Lichte des vorstehend beschriebenen nächstliegenden Standes der Technik bestand das technische Problem, das durch die vorliegende Erfindung gelöst werden sollte, darin, ein Verfahren zum Simulieren und Untersuchen des Wachstums von natürlichen Biofilmen unter die Natur imitierenden Umgebungs-Bedingungen zu entwickeln.
Dieses Problem wird gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung gelöst durch ein Verfahren zur kontrollierten (gesteuerten) Biofilm-Bildung entsprechend einem überwachten Protokoll, das umfasst:
(1) die Anordnung mindestens eines herausnehmbaren Objektträgers innerhalb des Innenreservoirs eines Reaktors;
(2) die Einführung eines Bakterien-Inokulums und eines wässrigen Nährmediums in das Reservoir;
(3) die Bereitstellung eines wässrigen Suspensionsmediums unter Rühren für eine Inkubationszeit, die ausreicht, um das Anhaften von Bakterien an der Objektträger-Oberfläche zu initiieren;
(4) das Ablaufenlassen des Suspensionsmediums aus dem Reservoir;
(5) das erneute Beschicken des Reservoirs mit einem wässrigen Nährmedium, um das Bakterienwachstum für eine gegebene Zeitspanne aufrechtzuerhalten, die ausreicht, um einen Biofilm mit der gewünschten Dicke auf der Objektträger-Oberfläche zu bilden; und
(6) die Entnahme des Objektträgers aus dem Reservoir.
Bevorzugte Ausführungsformen des Gegenstandes der vorliegenden Erfindung, wie er vorstehend definiert worden ist, sind in den nachfolgenden Unteransprüchen 2 bis 15 definiert.
Gemäß einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des mit einem Biofilm beschichteten Objektträgers, der nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist, in einem weiteren Protokoll zum Testen der Aktivität eines Produkts durch Bestimmung der Population von Bakterien-Koloniebildungs-Einheiten pro Quadratzentimeter des Biofilms auf den Objektträger-Oberflächen und zum Testen der Aktivität eines experimentellen Produkts oder eines Handelsprodukts, vorzugsweise eines bioziden Produkts, eines Reinigungsprodukts und/oder eines Produkts zum Öffnen von Durchgängen (Leitungen), die mit Biomasse verstopft sind, zum Inhibieren oder Entfernen des Biofilms von den Objektträger-Oberflächen.
Ein geeigneter Reaktor im Labormaßstab kann umfassen einen ringförmigen Reaktor, der Dimensionen zwischen 2 und 30 cm im Durchmesser und 5 und 50 cm in der Höhe hat. Ein bevorzugter Reaktor-Typ ist ein solcher, der aus Polycarbonat hergestellt ist, mit einer sich drehenden Innentrommel, die geeignet ist für die Befestigung von entnehmbaren Objektträgern vom rostfreien Stahl-Typ. Ringförmige Reaktoren sind im Handel erhältliche Produkte, beispielsweise die ringförmigen Reaktoren, die von der Firma Biosurface Technologies, Corp. Bozeman, Montana, vertrieben werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur gesteuerten bzw. kontrollierten Bildung eines Biofilms entsprechend einem überwachten Protokoll, das umfasst:
(1) die Anordnung von herausnehmbaren Objektträgern innerhalb des Innenreservoirs eines Reaktors;
(2) die Einführung eines Bakterien-Inokulums und eines wässrigen Nährmediums in das Reservoir;
(3) die Bereitstellung eines wässrigen Suspensionsmediums unter Rühren für eine Inkubationszeit, die ausreicht, um die Bakterienhaftung an den Objektträger-Oberflächen zu initiieren;
(4) das Ablaufenlassen des Suspensionsmediums aus dem Reservoir;
(5) das erneute Beschicken des Reservoirs mit einem wässrigen Nährmedium mindestens einmal nach einer verstrichenen Zeitspanne von jeweils 24 h;
(6) die Wiederholung der Stufe (5) für eine längere Zeitspanne, die ausreicht, um einen Biofilm in der gewünschten Dicke auf den Objetträger-Oberflächen zu bilden; und
(7) die Entnahme der Objekträger aus dem Reservoir und gegebenenfalls die Bestimmung der Population der Bakterien Koloniebildungs-Einheiten pro cm² (CFU/cm²) des Biofilms auf den Objektträger-Oberflächen.
Für die Biofilm-Bakterienwachtumscyclen kann ein standardisiertes Mineralsalz-Nährmedium verwendet werden. Geeignete Nährmedien für die Biofilm- Bildung sind in technischen Publikationen beschrieben, beispielsweise in "Biotechnol. Bioeng.", 53 (5), 459 (1997). Ein typisches Nährmedium enthält Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphat und Spuren-Nährstoffe.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform stammt das Bakterien-Inokulum von einem natürlichen Biofilm. Dies wird erläutert durch ein Bakterien-Inokulum, das aus einem Haushalts-Abflussrohr-Biofilm extrahiert wird. Das überwachte Protokoll in dem Reaktor ist so gestaltet, dass eine möglichst genaue Korrespondenz zu simulierten Haushalts-Abflussrohr-Bedingungen erzeugt wird, wodurch die Bildung eines simulierten Biofilms in dem Reaktor gefördert wird, der einem natürlichen Haushalts-Abflussrohr-Biofilm genau entspricht.
Der hier verwendete Ausdruck "simulierter Biofilm" bezieht sich auf einen abgeleiteten Biofilm, der dem Bakterienkonsortium der aus dem natürlichen Biofilm entnommenen Probe im wesentlichen phänotypisch entspricht.
Unter dem hier verwendeten Ausdruck "natürlicher Biofilm" ist ein an einer Biosphären-Oberfläche gebildetes Bakterien-Konsortium zu verstehen, das in einer dynamischen Beziehung zu den Umweltparametern steht.

Ausführungsformen der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere vorteilhaft für die Herstellung von simulierten Biofilmen, die ein bequemes und zuverlässiges Vehiculum zum Testen der Aktivitäten von formulierten Produkten darstellen, wobei die genannten Produkte der Inhibierung oder Entfernung von natürlichen Biofilmen dienen sollen, die jeweils in einer Verwandten-Beziehung zu den simulierten Biofilmen stehen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann unter Bezugnahme auf einen simulierten Haushalts-Abflussrohr-Biofilm erläutert werden, der von einem Inokulum eines natürlichen Haushalts-Abflussrohr-Biofilms abgeleitet ist.
In der Praxis werden das Inokulum und das wässrige Nährmedium in einen ringförmigen Reaktor eingeführt, der einen Satz von Objektträgern aus rostfreiem Stahl enthält. Der Reaktorinhalt wird 4 bis 60 h lang bei einer Temperatur zwischen 15 und 45ºC inkubiert.
Das Reaktor-Reservoir wird ablaufen gelassen und wieder beschickt mit einem wässrigen Nährmedium mindestens einmal alle 48 h über einen Gesamt- Zeitraum von mindestens etwa 72 h. Vorzugsweise wird das Reservoir ablaufen gelassen und wieder beschickt mindestens zweimal alle 24 Stunden über einen Gesamt-Zeitraum zwischen 2 und 45 Tagen.
Das simulierte Biofilm-Wachstum auf den Objetträger-Oberflächen in dem Ring-Reaktor wird fortgesetzt, bis die gewünschte Biofilm-Dicke, die beispielsweise zwischen 10 und 500 um liegt, erreicht ist. Die biotische Population in einem simulierten Biofilm liegt in der Regel zwischen 10&sup5; und 10¹&sup5; Bakterien- Koloniebildungseinheiten pro cm² (CFU/cm²) auf den Objetträger-Oberflächen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist allgemein anwendbar zur Herstellung von simulierten Biofilmen, die bestimmt sind für die Verwendung in einem weiteren Protokoll zum Test der Aktivität eines experimentellen Produkts oder eines Handelsprodukts. Das weitere Protokoll kann beispielsweise umfassen das Testen der Aktivität der Produkte, z.B. von Bioziden und Reinigern, und von Produkten zum Öffnen von Rohrleitungen, die durch eine Biomasse verstopft sind.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern. Die Komponenten und spezifischen Bestandteile werden hier als typisch bezeichnet.

Beispiel I

Dieses Beispiel erläutert das erfindungsgemäße Verfahren zum Züchten eines simulierten Biofilms, der von einem natürlichen Biofilm-Inokulum eines Haushalts-Abflussrohres abgeleitet ist, in einem Ringreaktor unter simulierten Haushalts-Kanalisations-Bedingungen.
Es wird ein Ringreaktor mit einer drehbaren Innentrommel verwendet (Biosurface Technologies, Corp.; Bozeman, Montana). Der Reaktor hat eine Höhe von 23 cm und einen Durchmesser von 13 cm und ist aus einem autoklavierbaren Polycarbonat hergestellt. Der Reaktor ist geeignet für die Aufnahme von 12 Objektträgern aus rostfreiem Stahl, die in dem Protokoll verwendet werden.
Eine Biofilm-Probe wird aus einem Haushalts-Abflussrohr entnommen und als Protokoll-Inokulum verwendet.
Es wird ein wässriges Nährmedium verwendet, das die folgende Zusammensetzung hat:
0,2% Hefeextrakt
0,2% Trypticase-Sojabrühe
0,1% Kaolin-Lösung
7 g/L K&sub2;HPO&sub4;
3 g/L KH&sub2;HPO&sub4;
1 g/L (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;
0,1 g/L MgSO&sub4;·7H&sub2;O
warmes Wasser (28-32ºC)
Eine Probe eines Männerrasier-Rückstandes wird dem Reaktor alle 24 h zusammen mit dem Nährmedium zugesetzt. Der Rückstand enthält EDGE®- Rasiercreme, Wasser, Haare und Hautzellen.
Das Protokoll wird auf die folgende Weise durchgeführt:
(1) eine Leiterschleifenfüllung eines homogenisierten Haushalts-Abflussrohr- Biofilms wird in jeweils 2 Kolben (mit jeweils 100 ml Trypticase-Sojabrühe) suspendiert und zwei Tage lang bei 37ºC in einem Schüttelinkubator inkubiert;
(2) 1 ml suspendierte Bakterien aus jedem Kolben werden in einen zweiten Kolben (mit 100 ml Trypticase-Sojabrühe) inokuliert und unter Rühren 2 Tage lang bei 37ºC inkubiert;
(3) der Suspensionsinhalt eines der beiden Kolben wird in den Ringreaktor eingeführt;
(4) ein Nährmedium und warmes Wasser (etwa 800 ml) werden dem Ringreaktor zugesetzt, so dass in sie 12 entnehmbare Objekträgern aus rostfreiem Stahl eintauchen, die an der Innentrommel-Oberfläche befestigt sind, und es wird begonnen, die Innentrommel zu drehen;
(5) der Reaktorinhalt wird 2 Tage lang bei Raumtemperatur inkubiert;
(6) das Flüssigkeitsvolumen im Reaktor wird ablaufen gelassen und der Reaktor wird wieder mit Nährmedium und Rasier-Rückständen gefüllt;
(7) die Stufe (6) des Ablaufenlassens und erneuten Füllens wird zweimal alle 24 h wiederholt, um den Gebrauch einer Haushalts-Kanalisation zu simulieren, und das Verfahren wird für eine Zeitspanne zwischen 4 und 6 Wochen fortgesetzt, die ausreicht, um einen 40 bis 50 um dicken Biofilm auf den Objekträgern aus rostfreiem Stahl zu entwickeln (10&sup9;-10¹² Kolonie-bildende Einheiten pro cm²);
(8) die Objekträgern aus rostfreiem Stahl werden entnommen, die einen daran haftenden Biofilm mit einer Bakterienpopulation aufweisen, die prototypisch den Umweltkonsortien der ursprünglich entnommenen Probe des natürlichen Haushalts-Abflussrohr-Biofilms entspricht, und
(9) die mit dem Biofilm beschichteten Objekträger werden in einem weiteren Protokoll zum Testen der Aktivitäten von Labor-Formulierungen und Handelsprodukten verwendet.

Beispiel II

Dieses Beispiel erläutert ein Verfahren zur Bestimmung der Kolonie-bildenden Einheiten pro cm² (CFU/cm²) auf mit einem Biofilm beschichteten Objekträgern.
Ein Objekträger aus rostfreiem Stahl, der aus dem Ringreaktor gemäß Beispiel I entnommen worden ist, wird in einen Becher mit 10 ml PBS-Nährmedium gelegt. Der Objekträger wird von oben nach unten abgeschabt unter Verwendung eines sterilen Zellenabschabers, um eine Biofilm-Probe zu erhalten. Die Probe wird 1 min lang bei mittlerer Geschwindigkeit durch einen Gewebezerkleinerungs-Arbeitsgang homogenisiert.
1 ml der homogenisierten Biofilm-Probe wird mit 9 ml PBS-Medium verdünnt. Die resultierende 10 ml-Probe wird verwirbelt und dann wird die Probe einer Reihenverdünnung unterzogen. Eine 0,1 ml-Menge einer verdünnten Probe wird auf R2A-Agar ausgestrichen. Jede Probenverdünnung wird in dreifacher Ausfertigung ausgestrichen.
Die Verdünnungsprobe auf jeder Platte wird mit einem Plattenverteiler verteilt und die Platten werden 5 Tage lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Eine ausgestrichene Probe, die etwa 30 bis 300 Kolonien enthält, wird ausgezählt. Das. Ergebnis der Kolonien-Auszählung, die Verdünnung und die abgeschabte Fläche des Objekträgers werden dazu verwendet, den Wert für CFU/cm² zu bestimmen.

Beispiel III

Dieses Beispiel erläutert ein Verfahren zum Testen der Aktivitäten von Haushalt-Abflussrohr-Reinigungsprodukten gegenüber im Labor gezüchteten Biofilmen, die natürliche Haushalts-Abflussrohr-Biofilme simulieren.
Ein Spülbecken-Abflussrohr-System wird zusammengebaut aus drei 15,24 cm (6 inches) langen geraden Abschnitten eines Glasrohres mit einem Innendurchmesser von 3,18 cm (1,25 inch), einer Glas-P-Falle mit einem Innendurchmesser von 3,18 cm (1,25 inch) und einem Glasablaufrohr-Abschnitt mit einem Innendurchmesser von 3,18 cm (1,25 inch).
Das Ablaufsystem wird mit 3,79 l (1 gallon) Wasser (von 38ºC) gespült. Ein mit einem Biofilm beschichteter Objekträger gemäß dem Protokoll des Beispiels I wird auf der Oberseite des horizontalen Glasrohr-Abschnittes nach der P-Falle befestigt und ein weiterer mit einem Biofilm beschichteter Objekträger wird an der Unterseite des horizontalen Glasrohr-Abschnitts nach der P-Falle befestigt.
Ein Haushalts-Abflussrohr-Pflegeprodukt wird in dem Ablauf-System verteilt und das Produkt wird 8 h lang in dem Abfluss-System belassen. Das Ablauf- System wird dann vorsichtig mit 3,79 l (1-gallon) Wasser (von 38ºC) gespült.
Die behandelten Objekträger werden entnommen und in Vertiefungen eines Schlitz-Trogs gelegt. Die Objekträger werden 2 min lang in eine 5%ige Natriumthiosulfat-Lösung eingetaucht und dann in einen zweiten Trog mit entionisiertem Wasser überführt. Es werden die Werte für CFU/cm² bestimmt und mit der anfänglichen Auszählung der Kontrollproben verglichen.
Unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Arbeitsgänge wird die Aktivität eines experimentellen Abflussrohr-Pflegeprodukts, Formulierung DC-X, getestet im Vergleich zu einem handelsüblichen Abflussrohr-Pflegeprodukt, PS Liquid Plumr®. Die Ergebnisse des Vergleichstests sind in den Tabellen I und II zusammengefasst.

Tabelle I

Behandlung Mittelwert des letzten Quadrats (LOG CFU*)

Kontrolle 9,00 A
Plumr (oberer Objekträger) 7,72 B
DC-X (oberer Objekträger) 4,43 C
DC-X (unterer Objekträger) 3,76 Cd
Plumr (unterer Objekträger) 3,68 Cd
* ABC/abcd: Mittelwerte mit dem gleichen Buchstaben sind nicht signifikant verschieden bei einem Zuverlässigkeitswert von 95/90%. Tabelle II Test vs. Kontroll-Differenz (Log CFU) Differenz (prob)
Die Vergleichsdaten zeigen, dass mit der Formulierung DC-X eine größere Biofilm-Oberfläche wirksam behandelt wird als mit dem PS Liquid Plumr- Produkt. Mit der Formulierung DC-X wird mehr Biofilm entfernt als mit Plumr auf dem oberen Objekträger in dem Abflussrohr-System, bestimmt durch die Anzahl der verbleibenden CFU/cm² auf dem Objekträger. Hinsichtlich des unteren Objekträgers in dem Ablauf-System sind DC-X und Plumr gleich wirksam.
Die mit DC-X behandelten oberen und unteren Objekträger weisen eine ähnliche Reduktion der Menge des Biofilms auf, während der mit Plumr behandelte obere Objekträger eine geringere Reduktion als der mit Plumr behandelte untere Objekträger aufweist.
Die durch die Vergleichsdaten angezeigten Differenzen sind statistisch signifikant (Zuverlässigkeitswert 95%) und mikrobiologisch signifikant. Insbesondere sind die festgestellten Differenzen größer als eine 2 log-Reduktion in bezug auf die Menge des Biofilms, was signifikant ist im Hinblick auf die mikrobiologischen Beobachtungen in der Biosphären-Umgebung.

Industrielle Anwendbarkeit

Beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung eines Biofilms, der verwendbar ist zum Testen von Reinigungsprodukten und anderen formulierten Produkten, die dazu bestimmt sind, solche Biofilme zu inhibieren, zu entfernen oder anderweitig zu beeinflussen. Dies ist beispielsweise nützlich für die Entwicklung von handelsüblichen Reinigungsprodukten.

Claims

1. Verfahren zur gesteuerten bzw. kontrollierten Bildung eines Biofilms entsprechend einem überwachten Protokoll, das umfasst

(1) die Anordnung mindestens eines entfernbaren Objektträgers innerhalb des Innen-Reservoirs eines Reaktors;

(2) die Einführung eines Bakterien-Inokulums und eines wässrigen Nährmediums in das Reservoir;

(3) die Bereitstellung eines wässrigen Suspensionsmediums unter Rühren für eine Inkubationszeit, die ausreicht, um die Bakterien-Fixierung an der Objektträger-Oberfiläche zu initiieren;

(4) das Ablaufenlassen des Suspensionsmediums aus dem Reservoir;

(5) das erneute Beschicken des Reservoirs mit einem wässrigen Nährmedium, um das Bakterienwachstum für eine Gesamt-Zeitspanne aufrechtzuerhalten, die ausreicht, um einen Biofilm mit der gewünschten Dicke auf der Objektträger-Oberfläche zu bilden; und

(6) das Entnehmen des Objektträgers aus dem Reservoir.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Reservoir in der Stufe (5) mindestens einmal alle 24 h des verstrichenen Zeitraums erneut mit einem wässrigen Nährmedium beschickt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Stufe (5) für eine längere Zeitspanne wiederholt wird, die ausreicht, um einen Biofilm mit der gewünschten Dicke auf den Objetträger-Oberflächen zu bilden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Reaktor ringförmig ist und Dimensionen zwischen 2 und 30 cm im Durchmesser und zwischen 5 und 50 cm in der Höhe hat.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin eine Vielzahl von Objektträgern aus rostfreiem Stahl in dem Reservoir in der Stufe (1) angeordnet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das wässrige Nährmedium Hefe-, Pepton- und Mineralsalz-Ingredientien umfasst.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Bakterien- Inokulum aus einem natürlichen Biofilm stammt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Bakterien- Inokulum aus einem Haushalts-Abflussrohr-Biofilm stammt und das überwachte Protokoll in dem Reaktor den simulierten Haushalts-Abflussrohr- Bedingungen entspricht.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin in der Stufe (3) die Inkubation für eine Zeitspanne zwischen 40 und 60 h bei einer Temperatur zwischen 15 und 45ºC durchgeführt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, worin das Reaktor-Reservoir in der Stufe (5) mindestens einmal alle 48 h eines verstrichenen Zeitraums ablaufen gelassen und wieder mit einem wässrigen Nährmedium beschickt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, worin in der Stufe (5) der verstrichene Zeitraum mindestens etwa 72 h beträgt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, worin das Reservoir in der Stufe (5) mindestens zweimal alle 24 h über einen verstrichenen Zeitraum zwischen 2 und 45 Tagen ablaufen gelassen und wieder mit einem wässrigen Nährmedium beschickt wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, worin der in der Stufe (5) gebildete Biofilm eine Dicke zwischen 10 und 500 um auf den Objetträger- Oberflächen aufweist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 13, worin der in der Stufe (5) gebildete Biofilm eine Population zwischen 10&sup5; und 10¹&sup5; Bakterienkolonie- Bildungseinheiten pro Quadratzentimeter (CFU/cm²) auf den Objetträger- Oberflächen aufweist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 14, worin der Biofilm, der in Form einer Schicht auf die Objetträger-Oberflächen aufgebracht ist, ein simulierter natürlicher Biofilm ist.

16. Verwendung des mit einem Biofilm beschichteten Objekträgers, der nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15 hergestellt worden ist, in einem weiteren Protokoll zum Testen der Aktivität eines Produkts durch Bestimmung der Population der Bakterienkolonie-Bildungseinheiten pro Quadratzentimeter des Biofilms auf den Objektträger-Oberflächen und Testen der Aktivität eines experimentellen Produkts oder eines Handelsprodukts, vorzugsweise eines Biozid-Produkts, eines Reinigungsprodukts und/oder eines Produkts zum Öffnen von Rohrleitungen, die mit einer Biomasse verstopft sind, zur Inhibierung oder Entfernung des Biofilms von den Objektträger-Oberflächen.