DE69920221T2 - Polypeptid-polymer konjugat - Google Patents

Polypeptid-polymer konjugat Download PDF

Info

Publication number
DE69920221T2
DE69920221T2 DE69920221T DE69920221T DE69920221T2 DE 69920221 T2 DE69920221 T2 DE 69920221T2 DE 69920221 T DE69920221 T DE 69920221T DE 69920221 T DE69920221 T DE 69920221T DE 69920221 T2 DE69920221 T2 DE 69920221T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
polypeptide
conjugate
polymer
composition
industrial
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE69920221T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69920221D1 (de
Inventor
Heinz-Josef Deussen
Arne Agerlin Olsen
Tine Muxoll Fatum
Erwin Ludo Roggen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novozymes AS
Original Assignee
Novozymes AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novozymes AS filed Critical Novozymes AS
Publication of DE69920221D1 publication Critical patent/DE69920221D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69920221T2 publication Critical patent/DE69920221T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/66—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
    • A61K8/84—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds obtained by reactions otherwise than those involving only carbon-carbon unsaturated bonds
    • A61K8/86—Polyethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
    • A61K8/90—Block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/37—Polymers
    • C11D3/3703—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C11D3/3707—Polyethers, e.g. polyalkyleneoxides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/37—Polymers
    • C11D3/3703—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C11D3/3719—Polyamides or polyimides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38627—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38636—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing enzymes other than protease, amylase, lipase, cellulase, oxidase or reductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38654—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing oxidase or reductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/57—Compounds covalently linked to a(n inert) carrier molecule, e.g. conjugates, pro-fragrances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/70—Biological properties of the composition as a whole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/10—Washing or bathing preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q5/00—Preparations for care of the hair
    • A61Q5/02—Preparations for cleaning the hair
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q5/00—Preparations for care of the hair
    • A61Q5/06—Preparations for styling the hair, e.g. by temporary shaping or colouring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q5/00—Preparations for care of the hair
    • A61Q5/10—Preparations for permanently dyeing the hair
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q5/00—Preparations for care of the hair
    • A61Q5/12—Preparations containing hair conditioners
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q9/00—Preparations for removing hair or for aiding hair removal
    • A61Q9/02—Shaving preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid-Polymer-Konjugat, wobei es sich bei dem Polymer um ein Pfropf-, Block-, alternierendes oder statistisches Copolymer handelt, das an die Oberfläche des Polypeptids gekoppelt ist. Die Erfindung betrifft auch ein Konjugat der Erfindung umfassende, industrielle Zusammensetzungen und Produkte, die Verwendung eines Polypetid-Polymer-Konjugats der Erfindung zur Reduzierung der Allergenität von industriellen Zusammensetzungen und Produkten und schließlich ein Verfahren zur Reduzierung der Allergenität von Polypeptiden.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Sowohl für medizinische als auch für industrielle Anwendungen ist die Verwendung von Polypeptiden, einschließlich Enzymen auf dem Fachgebiet weithin bekannt. Da Polypeptide eine unerwünschte Immunreaktion, abhängig von der Angriffsweise typischerweise eine IgG- und IgE-Reaktion, verursachen können, wurden während den letzten drei Jahrzehnten Techniken zum Reduzieren dieser entwickelt.
  • Bei einer Technik handelt es sich um die Kopplungstechnik, wobei eine Anzahl von Polymermolekülen an das fragliche Polypeptid gekoppelt wird. Unter Verwendung dieser Technik erkennt das Immunsystem nur schwer die Epitope (auf der Oberfläche des Peptids), die für die Bildung von Antikörpern verantwortlich sind, wodurch die Immunreaktion reduziert wird.
  • Für Polypeptide, die direkt in das Kreislaufsystem des menschlichen Körpers eingebracht werden, um eine bestimmte physiologische Wirkung (d. h. Arzneimittel) hervorzurufen, handelt es sich bei der typischen potentiellen Immunreaktion um eine IgG- und/oder IgM-Reaktion, während Polypeptide, die durch das Atmungssystem inhaliert werden (d. h. industrielle Polypeptide) möglicherweise eine IgE-Reaktion (d. h. allergische Reaktion) verursachen.
  • Bei einer der die reduzierte Immunreaktion erklärenden Theorien handelt es sich darum, dass das (die) abschirmende(n) Epitop(e) des Polymermoleküls oder der Polymermoleküle auf der Oberfläche des Polypeptids für die Immunreaktion verantwortliche ist (sind), was zur Antikörperbildung führt. Einer andere Theorie oder zumindest ein Teilfaktor besagt, dass, je schwerer das Konjugat ist, desto reduzierter ist die Immunreaktion.
  • Typischerweise handelt es sich bei den zum Koppeln an das Polypeptid unter Bildung von Konjugaten verwendeten Polymeren um Homopolymere, d. h. solche, die aus einer wiederkehrenden Einheit, z. B. Ethylenoxid (EO), insbesondere Polyethylenglycol (PEG) oder Propylenoxid (PO), insbesondere Polypropylenglycol (PPG) bestehen. Saccharide wie Dextran wurden ebenso verwendet.
  • US-Patent Nr. 4,179,337 betrifft nicht-immunogene Polypeptide wie Enzyme und Peptidhormone, die an Polyethylenglycol (PEG) oder Polypropylenglycol (PPG) gekoppelt sind.
  • WO 96/17929 (Novo Nordisk A/S) betrifft für industrielle Anwendungen geeignete, modifizierte Polypeptidkonjugate, die zum Reduzieren der Atemallergenität an Polymermoleküle insbesondere an Polyethylenglycol (PEG) gekoppelt sind.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein für industrielle Anwendungen und zur Einbringung als Wirkstoffe in industrielle Produkte geeignetes Polypeptid-Polymer-Konjugat.
  • Die Erfinder fanden, dass beim Koppeln von Pfropf-, Block-, alternierenden oder statistischen Copolymeren der allgemeinen Formel: EOxPOy (I)wobei x = 1-99%, y = 1-99% und x+y =100%, die kovalent an ein für industrielle Anwendungen verwendetes Stamm-Polypeptid gebunden sind, die Atemallergenität verglichen mit dem Stamm-Enzym und sogar verglichen mit einem entsprechenden mit PEG oder anderen Homopolymeren gekoppelten Konjugat reduziert ist.
  • In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung Zusammensetzungen zur Verwendung in ein Konjugat der Erfindung umfassenden, industriellen Produkten.
  • In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Reduzierung der Allergenität von Polypeptiden.
  • Industrielle Polypeptide
  • Für industrielle Anwendungen geeignete Polypeptide weisen häufig enzymatische und/oder antimikrobielle Aktivität auf. Es ist nicht beabsichtigt, dass industrielle Polypeptide (im Gegensatz zu Arzneimittelpolypeptiden) in das Kreislaufsystem des Körpers eingebracht werden.
  • Deshalb ist es nicht sehr wahrscheinlich, dass industrielle Polypeptide wie Enzyme, die als Wirkstoffe in industriellen Zusammensetzungen und/oder Produkten (nachstehend definiert) wie Detergenzien wie Waschmittel- und Geschirrspüldetergenzien, Nahrungsmittel- oder Futterzusätze, einschließlich Zusätze zur Brotherstellung, Zusammensetzungen für Textilien und Körperpflegeprodukte, einschließlich Kosmetika, verwendet werden, in direktem Kontakt mit dem Kreislaufsystem des Körpers von Mensch und Tier kommen, da solche Polypeptide (oder solche Polypeptide umfassende Produkte) nicht in den Blutstrom (oder dergleichen) injiziert werden.
  • Folglich besteht im Falle des industriellen Polypeptids das mögliche Risiko der Atemallergenität (d. h. IgE-Reaktion) infolge der Inhalation von Polypeptiden durch die Atmungswege.
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung sind „industrielle Polypeptide" als Polypeptide, einschließlich Peptide, Proteine und/oder Enzyme definiert, wobei es nicht beabsichtigt ist, dass sie in das Kreislaufsystem des Körpers von Mensch und/oder Tier eingebracht werden.
  • Beispiele für ein solches Polypeptid schließen Polypeptide mit wie nachstehend definierter enzymatischer Aktivität ein.
  • Die Erfindung betrifft auch industrielle Zusammensetzungen und Produkte mit reduzierter Atemallergenität.
  • Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung eines Polypeptid-Polymer-Konjugats der Erfindung zur Reduzierung der Atemallergenität von industriellen Zusammensetzungen und Produkten.
  • Schließlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Reduzierung der Allergenität von Polypeptiden, insbesondere Enzymen durch Kopplung von einem oder mehreren eines Pfropf-, Block-, alternierenden oder statistischen Copolymers an ein unmodifiziertes Stamm-Polypeptid.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die Abbildung zeigt die IgE-Reaktion in Seren von Brown-Norway-Ratten auf modifizierte und unmodifizierte Enzyme.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein für industrielle Anwendungen und zur Einbringung als Wirkstoffe für industrielle Produkte geeignetes Polypeptid-Polymer-Konjugat. Die Konjugate der Erfindung weisen reduzierte Atemallergenität auf.
  • Der Begriff „Polypeptid-Polymer-Konjugat" bedeutet im Kontext der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid, an welches ein oder mehrere Polymere kovalent gekoppelt sind.
  • Der Begriff „reduzierte Allergenität" bedeutet im Kontext der vorliegenden Erfindung, dass die Menge von erzeugtem IgE (bei Menschen und Molekülen mit vergleichbaren Wirkungen bei spezifischen Tieren), die zu einem allergenen Zustand führen kann, beim Inhalieren eines modifizierten Polypeptids der Erfindung im Vergleich zum entsprechenden Stamm-Polypeptid herabgesetzt werden kann. Der Begriff „Atemallergenität" kann stattdessen verwendet werden.
  • Die Erfinder fanden, dass beim Koppeln eines unmodifizierten Stamm-Polypeptid an Pfropf-, Block-, alternierende oder statistische Copolymere die durch die Inhalation des Polypeptids verursachte, potentielle allergene Reaktion im Vergleich mit einem entsprechenden unmodifizierten Stamm-Polypeptid und sogar im Vergleich mit einem entsprechenden Konjugat, in welchem eine entsprechende Anzahl von Homopolymeren wie PEG an das entsprechende Stamm-Polypeptid gekoppelt wurden, reduziert ist.
  • Es ist weiterhin bekannt, dass ein Polymer verschiedene Konformationen (Morphologien) annehmen kann, die hauptsächlich, jedoch nicht nur, von seiner molekularen Architektur, den Lösungsmitteln, hier Wasser, der Temperatur und der Konzentration abhängen (S. Förster und M. Antonietti, Adv. Mater, 1998, 10, Nr. 3, S. 195-217). Diese Konformationen/Morphologien schließen Mizellen mit verschiedenen Formen, Lamellen, angeordnete Zylinder oder bikontinuierliche Strukturen ein. Die Molekülkonformation von Copolymeren in wässrigen Medien, wie eine solvatisierte statistische Spirale, eine verlängerte Spirale, ein stabähnliches Polymer, eine Hyperspirale, ein Vesikulum, sind weithin bekannt (Water soluble polymers, M. J. Comstock Ed., ACS Symposium Series, 1991).
  • Folglich wird, ohne an eine Theorie gebunden zu sein, angenommen, dass ein an die Polypeptidoberfläche gebundenes Pfropf-, Block-, alternierendes oder statistisches Copolymer eine Konformation im Wasser annimmt, die wie ein hydrophileres Homopolymer zu einer besseren Abschirmung der Oberfläche führt. Ebenso können synergistische Effekte aufgrund der Bildung von supramolekularen Strukturen die Zugänglichkeit der Polypeptidoberfläche reduzieren. Weiterhin könnte eine erhöhte Abstoßung des lipophileren Copolymers (im Vergleich zu einem PEG-Homopolymer) mit einem Antikörper eine Rolle spielen.
  • Ferner kann die starrere Struktur (im Vergleich zu Homopolymeren) von Pfropf-, Block-, alternierenden oder statistischen Copolymeren es dem Antikörper erschweren, „seinen Weg" (durch die starreren Polymere und die angenommene Konformation) zu dem Epitop auf der Polypeptidoberfläche für die IgE-Bildung zu finden, was zu einer allergenen Reaktion führt.
  • Es wird auch angenommen, dass die Hydrophobie des Polymers einen Einfluss auf die potentielle Allergenität eines Polypeptid-Polymer-Konjugats ausübt. Deshalb gilt: Je hydrophober das Polymer ist, desto besser schirmt es das Polypeptid ab.
  • Durch eine genaue Auswahl des Polymers und der Molekülarchitektur kann eine optimale Abdeckung im Bezug auf die abschirmenden Epitope auf der Oberfläche des Polypeptids erhalten werden. Weiterhin können durch Abstimmen der Eigenschaften der angehängten Polymere optimierte Eigenschaften für verschiedene Formulierungen, z. B. in Fetten oder Cremes, erhalten werden.
  • Im ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Polypeptid-Polymer-Konjugat, wobei ein oder mehrere Polymere kovalent an das Stamm-Polypeptid gekoppelt sind, wobei das Polymer durch die allgemeine Formel: EOxPOy (I)wobei x = 1-99%, y = 1-99% und x+y = 100%, gekennzeichnet ist.
  • „EO" bedeutet Ethylenoxid und „PO" bedeutet Propylenoxid. Das Molekulargewicht des Polymers liegt typischerweise im Bereich von 100 bis 100.000 Da, vorzugsweise 100 bis 50.000 Da, insbesondere 100 bis 10.000 Da.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das (die) Polymer(e) Ethylenoxideinheiten, (EO) und Propylenoxideinheiten (PO) in einem Verhältnis im Bereich von 10:90 oder 20:80 oder 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20 oder 90:10.
  • Allergenitätsbewertung
  • Die Allergenität kann auf der Basis von Inhalationstests durch Vergleichen der Wirkung von intratracheal (in die Trachea) verabreichten Stamm-Polypeptiden mit dem entsprechenden erfindungsgemäßen, modifizierten Polypeptid bewertet werden.
  • Es gibt eine Anzahl an in vivo-Tiermodellen für die Allergenitätsbewertung des Polypeptids. Einige dieser Modelle stellen eine geeignete Basis für die Risikobe wertung im Menschen bereit. Geeignete Modelle schließen ein Meerschweinchenmodell und ein Mäusemodell ein. Diese Modelle zielen auf die Identifizierung von Atemallergenen als Funktion von in den vorher sensibilisierten Tieren induzierten Hervorrufungsreaktionen. Gemäß diesen Modellen werden die vermeintlichen Allergene intratracheal in Tiere eingebracht.
  • Ein geeigneter Meerschweinchenstamm, der Dunkin-Hartley-Stamm, erzeugt im Gegensatz zum Menschen in Verbindung mit der allergenen Reaktion keine IgE-Antikörper. Jedoch erzeugt er einen anderen Antikörpertyp, das IgG1A und IgG1B (siehe z. B. Prentϕ, ATLA, 19, S. 8-14, 1991), der für seine allergene Reaktion auf inhalierte Polypeptide, einschließlich Enzyme verantwortlich ist. Deshalb handelt es sich bei der relativen IgG1A- und IgG1B-Menge unter Verwendung des Dunkin-Hartley-Tiermodells um ein Maß für den allergenen Grad.
  • Bei einem zur intratrachealen Aufnahme von Polypeptiden wie Enzymen geeigneten Rattenstamm handelt es sich um den Brown-Norway-Stamm. Brown-Norway-Ratten erzeugen IgE als allergene Reaktion.
  • Mehr Details über die Bewertung von Atemallergenen in Meerschweinchen und Mäusen ist von Kimber et. al., (1996), Fundamental and Applied Toxicology, 33, S. 1-10 beschrieben.
  • Andere Tiere wie z. B. Kaninchen können ebenso für Vergleichsstudien verwendet werden.
  • Das Polymermolekül
  • Bei dem an das Polypeptid gekoppelte Polymer handelt es sich um ein Pfropf-, Block-, alternierendes oder statistisches Copolymer der allgemeinen Formel: EOxPOy (I) wobei x = 1-99%, y = 1-99% und x+y = 100% sind.
  • Das Polymer ist vorzugsweise durch die allgemeine Formel (I) gekennzeichnet, wobei x = 10-90%, y = 10-90%, und x+y = 100% sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht das Polymer aus Ethylenoxideinheiten und Propylenoxideinheiten in einem Verhältnis (EO-Einheit: PO-Einheit) von 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20 und 90:10.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Polymer ein Molekulargewicht von 100 bis 100.000 Da, insbesondere 100 bis 50.000 Da, speziell 100 bis 10.000 Da auf.
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform weist das Polymer ein Molekulargewicht von 100 bis 12.000 Da, stärker bevorzugt von 300 bis 3.000 Da auf.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Polymer um ein Diblock-, Triblock-, Multiblockpolymer. Die allgemeine Formel (I) sollte so interpretiert werden, dass sie Polymere umfasst, in welchen die EO-Einheiten und PO-Einheiten unabhängig platziert sind.
  • Beispiele für Blockpolymere, die zum Koppeln an die Oberfläche des Polypeptids verwendet werden können, sind: Poly(propylenglycol)-block-poly(ethylenglycol)-block-poly(propylenglycol); Poly(ethylenglycol)-block-poly(propylenglycol)-block-poly(ethylenglycol); Poly(propylenglycol)-block-polyethylen(glycol)-block-poly(propylenglycol)monobutylether; Poly(ethylenglycol)-block-poly(propylenglycol)-block-poly(ethylenglycol)monobutylether; Poly(propylenglycol)-block-poly(ethylenglycol)-block-poly(propylenglycol)monomethylether; Poly(ethylenglycol)-block-poly(propylenglycol)-block-poly(ethylenglycol)-monomethylether.
  • Bei bevorzugten Blockpolymeren handelt es sich um Blockpolymere der allgemeinen Formel: H(-OCH2CH2-)x[-OCH(CH3)CH2-]y(-OCH2CH2-)zOH, mit einem mittleren Molekulargewicht (Mn) von 1.100 und einem Ethylenglycolgehalt von 10 Gew.-%, Mn = 1.900 und 50 Gew.-%, Mn = 2.000 und 10 Gew.-%, Mn = 2.800 und 10 Gew.-%, Mn = 2.800 und 15 Gew.-%, Mn = 2.900 und 40 Gew.-%, Mn = 4.400 und 30 Gew.-%, Mn = 5.800 und 30 Gew.-%, Mn = 8.400 und 80 Gew.-%.
  • Bei anderen bevorzugten Blockpolymeren handelt es sich zum Blockpolymere der allgemeinen Formel H[-OCH(CH3)CH2-]x(-OCH2CH2-)y[-OCH(CH3)CH2-]zOH, wobei das mittlere Molekulargewicht (Mn) 2.000 und der Ethylenglycolgehalt 50 Gew.-% beträgt, Mn = 2.700 und 40 Gew.-% und Mn = 3.300 und 10 Gew.-%.
  • Beispiele für spezifische Blockpolymere sind p7120: Pluronics, im Handel erhältlich von BASF (Deutschland), Tergitol, im Handel erhältlich von Union Carbide (USA), Synperonic, im Handel erhältlich von Fluka (Schweiz).
  • Beispiele für spezifische Copolymere, die zum Koppeln an die Oberfläche des Polypeptids verwendet werden können, sind Poly(ethylenglycol-copropylenglycol), insbesondere Poly(ethylenglycol-copropylenglycol) mit einem mittleren Molekulargewicht Mn von 2.500 und 75 Gew.-% Ethylenglycol und einem mittleren Molekulargewicht Mn von 12.000 und 75 Gew.-% Ethylenglycol; Poly(ethylenglycol-copropylenglycol)monobutylether, insbesondere Poly(ethylenglycol-copropylenglycol)monobutylether mit einem Mn von 970 und 50 Gew.-% Ethylenglycol, einem Mn von 1.700 und 50 Gew.-% Ethylenglycol und einem Mn von 3.900 und 50 Gew.-% Ethylenglycol; Poly(ethylenglycol-copropylenglycol)monomethylether.
  • Bei bevorzugten Polymeren handelt es sich um nicht-toxische Polymere, die z. B. aus PEG- und PPG-Copolymeren zusammengesetzt sind. Polymere, die relativ einfache chemische Vorgänge für ihre kovalente Kopplung an Anlagerungsgruppen auf der Oberfläche des Enzyms erfordern, sind bevorzugt.
  • Die Pfropf-, Block-, alternierenden oder statistischen Copolymere können sternenförmig oder verzweigt sein.
  • Herstellung von geeigneten Polymeren
  • An die Oberfläche des Stammpolypeptids anzulagernde Polymere können unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Standardtechniken hergestellt werden. Ferner sind verschiedene Polymere im Handel von Firmen wie BASF (Deutschland), Union Carbide (USA), Aldrich usw. erhältlich.
  • Aktivierung von Polymeren
  • Ist das mit dem fraglichen Polypeptid zu konjugierende Polymer nicht aktiv, muss es durch die Verwendung einer geeigneten Technik aktiviert werden. Es wird erfindungsgemäß ebenso erwogen, das Block- oder Copolymer durch eine Verbindungsgruppe an das Polypeptid zu koppeln. Die einzelnen Verbindungsgruppen sind dem Fachmann weithin bekannt.
  • Die Verfahren und chemischen Vorgänge zur Aktivierung von Polymermolekülen sowie zur Konjugation von Polypeptiden sind eingehend in der Literatur beschrieben.
  • Allgemein verwendete Verfahren zur Aktivierung von unlöslichen Polymeren schließen die Aktivierung von funktionellen Gruppen mit Cyanogenbromid, Periodat, Glutaraldehyd, Biepoxiden, Epichlorhydrin, Divinylsulfon, Carbodiimid, Sulfonylhalogeniden, Trichlortriazin usw. ein (siehe R. F. Taylor, (1991), „Protein immobilisation. Fundamental and applications", Marcel Dekker, N. Y.; S. S. Wong, (1992), „Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson et al., (1993), „Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N. Y.). Einige der Verfahren betreffen die Aktivierung von unlöslichen Polymeren, sind jedoch auch auf die Aktivierung von löslichen Polymeren anwendbar, z. B. Periodat, Trichlortriazin, Sulfonylhalogenide, Divinylsulfon, Carbodiimid usw. Die funktionellen Gruppen, bei welchen es sich um Amino, Hydroxy, Thiol, Carboxy, Aldehyd oder Sulfydryl handelt, am Polymer und die ausgewählte Anlagerungsgruppe am Protein müssen bei der Auswahl der chemischen Aktivierungs- und Konjugationsvorgängen, die gewöhnlich aus i) Polymeraktivierung, ii) Konjugation und iii) Blockieren der übrigen aktiven Gruppen bestehen, berücksichtigt werden.
  • Im Folgenden wird kurz eine Anzahl an geeigneten Polymeraktivierungsverfahren beschrieben. Jedoch sollte es klar sein, dass auch andere Verfahren verwendet werden können.
  • Das Koppeln von Polymermolekülen an die freien Säuregruppen von Polypeptiden kann mit Hilfe von Diimid und z. B. Amino-PEG oder Hydrazin-PEG (Pollak et al., (1976), J. Am. Chem. Soc., 98, 289-291) oder Diazoacetat/Amid (Wong et al., (1992), „Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press) durchgeführt werden.
  • Die Kopplung von Polymermolekülen an Hydroxygruppen ist im Allgemeinen sehr schwierig, da sie im Wasser durchgeführt werden muss. Gewöhnlich überwiegt die Hydrolyse gegenüber der Reaktion mit Hydroxygruppen.
  • Die Kopplung von Polymermolekülen an drei Sulfhydrylgruppen kann mit speziellen Gruppen wie Maleimido oder dem Orthopyridyldisulfid erzielt werden. Ebenso weist Vinylsulfon (US-Patent Nr. 5,414,135, (1995), Snow et al.) eine Vorliebe für Sulfhydrylgruppen auf, ist jedoch nicht so selektiv wie die anderen erwähnten Gruppen.
  • Auf zugängliche Argininreste in der Polypeptidkette kann durch zwei benachbarte carbonylgruppenumfassende Gruppen gezielt werden.
  • Techniken, die das Koppeln von elektrophil aktivierten PEGs an die Aminogruppen von Lysinen beinhaltet, können ebenso nützlich sein. Viele der üblichen austretenden Gruppen für Alkohole richten sich auf eine Aminbindung. Zum Beispiel können Alkylsulfonate wie Tresylate (Nilsson et al., (1984), Methods in Enzymology Band 104, Jacoby, W. B., Ed., Academic Press: Orlando, S. 56-66; Nilsson et al., (1937), Methods in Enzymology Band 135; Mosbach, K., Ed.; Academic Press: Orlando, S. 65-79; Scouten et al., (1987), Methods in Enzymology Band 135, Mosbach, K., Ed., Academic Press: Orlando, 1987; S. 79-84; Grossland et al., (1971), J. Amr. Chem. Soc. 1971, 93, S. 4217-4219), Mesylate (Harris, (1985), vorstehend; Harris et al., (1984), J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed. 22, S. 341-352), Arylsulfonate wie Tosylate und para-Nitrobenzolsulfonate verwendet werden.
  • Organische Sulfonylchloride, z. B. Tresylchlorid, wandeln Hydroxygruppen in einer Anzahl an Polymeren, z. B. PEG, effektiv in gute austretende Gruppen (Sulfonate) um, die beim Umsetzen mit Nukleophilen wie Aminogruppen in Polypeptiden die Bildung von stabilen Bindungen zwischen Polymer und Polypeptid gewähren. Zusätzlich zu den hohen Konjugationsausbeuten sind die Reaktionsbedingungen im Allgemeinen mild (neutraler oder leicht alkalischer pH-Wert, um eine Denaturierung und geringe oder keine Aktivitätsunterbrechung zu vermeiden) und erfüllen die nicht-zerstörenden Anforderungen für das Polypeptid.
  • Tosylat ist reaktiver als das Mesylat, wird jedoch auch unstabiler in PEG, Dioxan und Sulfonsäure zersetzt (Zalipsky, (1995), Bioconjugate Chem, 6, 150-165).
  • Epoxide können ebenso zum Bilden von Aminbindungen verwendet werden, sind jedoch weniger reaktiv als die vorstehend erwähnten Gruppen.
  • Die Umwandlung von PEG in ein Chlorformiat mit Phosgen richtet sich auf Carbamatbindungen an Lysinen. Dieses Thema kann bei vielen Varianten, die das Chlor mit N-Hydroxysuccinimid (US-Patent Nr. 5,122,614, (1992); Zalipsky et al.,(1992), Biotechnol. Appl. Biochem., 15, S. 100-114; Monfardini et al., (1995), Bioconjugate Chem., 6, 62-69), mit Imidazol (Allen et al., (1991), Carbohydr. Res., 213, S. 309-319), mit para-Nitrophenol, DMAP ( EP 632 082 A1 , (1993), Looze, Y.) usw. ersetzen, eine Rolle spielen. Die Derivate werden gewöhnlich durch Umsetzen des Chlorformiats mit der gewünschten austretenden Gruppe hergestellt. Alle diese Gruppen richten sich auf Carbamatbindungen am Peptid.
  • Weiterhin können Isocyanate und Isothiocyanate unter Erhalt von Harnstoffen beziehungsweise Thioharnstoffen eingesetzt werden.
  • Amide können von PEG-Säuren unter Verwendung derselben wie vorstehend erwähnten austretenden Gruppen und cyclischen Imidthronen (US-Patent Nr. 5,349,001, (1994), Greenwald et al.) erhalten werden. Die Reaktivität dieser Verbindungen ist sehr hoch, kann jedoch eine zu schnelle Hydrolyse bewirken.
  • Aus der Umsetzung von Bernsteinsäureanhydrid hergestelltes PEG-Succinat kann ebenso verwendet werden. Die hier eingeschlossene Estergruppe kann eine stärkere Anfälligkeit des Konjugats für die Hydrolyse bewirken (US-Patent Nr. 5,122,614, (1992), Zalipsky). Diese Gruppe kann mit N-Hydroxysuccinimid aktiviert werden.
  • Weiterhin kann eine spezielle Verbindungsgruppe eingebracht werden. Bei der ältesten handelt es sich um Cyanurchlorid (Abuchowski et al., (1977), J. Biol. Chem., 252, 3578-3581; US-Patent Nr. 4,179,337, (1979), Davis et al.; Shafer et al., (1986), J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24, 375-378).
  • Die Kopplung von PEG an ein aromatisches Amin, gefolgt von der Diazotierung ergibt ein sehr reaktives Diazoniumsalz, das in situ mit einem Peptid umgesetzt werden kann. Eine Amidbindung kann ebenso durch Umsetzen eines Azlactonderivats von PEG (US-Patent Nr. 5,321,095, (1994), Greenwald, R. B.) erhalten werden, wodurch eine zusätzliche Amidbindung eingebracht wird.
  • Da einige Peptide nicht viele Lysine umfassen, kann es vorteilhaft sein, mehr als ein PEG an dasselbe Lysin anzulagern. Dies kann z. B. unter Verwendung von 1,3-Diamino-2-propanol durchgeführt werden.
  • PEGs können auch mit Carbamatbindungen an die Aminogruppen des Enzyms angelagert werden (WO 95/11924, Greenwald et al.). Lysinreste können ebenso als Gerüst verwendet werden.
  • Position des gekoppelten Copolymers oder der gekoppelten Copolymere
  • Offensichtlich liegen alle ionisierten Gruppen wie die Aminogruppe der Lysinreste auf der Oberfläche des Polypeptidmoleküls vor (siehe z. B. Thomas E. Creighton, (1993), „Proteins", W.H. Freeman and Company, New York). Deshalb ist die Anzahl von leicht zugänglichen Anlagerungsgruppen (d. h. Aminogruppen) auf der Oberfläche des Polypeptids gleich der Anzahl von Lysinresten in der primären Struktur des Polypeptids plus die N-terminale Aminogruppe.
  • Erfindungsgemäß werden 1 bis 100 Polymere, vorzugsweise 4 bis 50 Polymermoleküle, 5 bis 35 Polymere an das fragliche Stamm-Polypeptid gekoppelt.
  • Das Stamm-Polypeptid
  • Die modifizierten Polypeptide der Erfindung können auf der Basis von Stamm-Polypeptiden typischerweise mit einem Molekulargewicht im Bereich von 1 bis 100 kDa, vorzugsweise 15 bis 60 kDa unter Verwendung einer beliebigen auf dem Fachgebiet bekannten Technik hergestellt werden.
  • Der Begriff „Stamm"-Polypeptid soll auf ein beliebiges ungekoppeltes Polypeptid (d. h. ein zu modifizierendes Polypeptid) hinweisen. Das Polypeptid kann vorzugsweise mikrobiellen Ursprungs wie bakteriellen Ursprungs, vom Ursprung eines Fadenpilzes oder vom Ursprung einer Hefe sein.
  • Bei dem Stamm-Polypeptid kann es sich um ein natürlich vorkommendes (oder vom Wildtyp) Polypeptid oder eine Variante davon handeln.
  • Bevorzugte Polypeptide sind Enzyme und Polypeptide mit antimikrobieller Aktivität. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Enzym um ein Enzym, das für Hautpflegezusammensetzungen und Produkte mit einer bedeutenden enzymatischen Aktivität im in Hautpflegeprodukten verwendeten pH-Bereich geeignet ist.
  • Bei der Auswahl eines Stamm-Polypeptids ist es vorteilhaft, ein Polypeptid mit einer hohen Anzahl an Anlagerungsgruppen zu verwenden.
  • Ferner sind in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Block-, oder Copolymere breit über die Oberfläche des Stamm-Polypeptids verteilt. Für Enzyme ist es bevorzugt, dass keine Block- oder Copolymere an die Fläche nahe der aktiven Stelle gekoppelt sind.
  • Im vorliegenden Kontext bedeutet „breit verteilt" eine solche Position, dass die an die Anlagerungsgruppen des Polypeptids gekoppelten Polymermoleküle verschie dene Teile der Polypeptidoberfläche, vorzugsweise den gesamten oder nahezu den gesamten Oberflächenbereich abschirmen, um zu gewährleisten, dass das (die) relevante(n) Epitop(e) erkennbar abgeschirmt ist (sind) und dadurch durch die Antikörper des Immunsystems nicht erkannt wird (werden). Es wird angenommen, dass der Oberflächenbereich der Wechselwirkung zwischen dem Polypeptid und einem Antikörper im Bereich von etwa 500 Å2 (26 × 19 Å) liegt (siehe Sheriff et al. (1987). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 84, Seite 8075).
  • Für Enzyme ist es bevorzugt, dass sie einen minimalen Verlust an enzymatischer Aktivität gewährleisten und nicht an Polymere in einem engen Abstand der aktiven Stelle koppeln. Allgemein betrachtet, ist es bevorzugt, dass keine Polymere innerhalb von 5 Å, vorzugsweise 10 Å von der aktiven Stelle angelagert sind.
  • Ferner sind ebenso erfindungsgemäß als vorteilhaft auch Polypeptide berücksichtigt, bei welchen Polymere an ein bekanntes vom Immunsystem erkennbares Epitop gekoppelt sind, oder die eng an das Epitop gekoppelt sind. Ist die Position des Epitops oder der Epitope unbekannt, ist es vorteilhaft, so viele Polymere wie möglich an die auf der Oberfläche des Polypeptids verfügbaren Anlagerungsgruppen zu koppeln. Es ist bevorzugt, dass die Anlagerungsgruppen breit über die Oberfläche des Polypeptids in einem geeigneten Abstand von der aktiven Stelle verteilt sind.
  • Stamm-Polypeptide, die die vorstehenden Ansprüche für die Verteilung von gekoppelten Polymeren auf der Oberfläche des Polypeptids erfüllen, sind erfindungsgemäß bevorzugt.
  • Für Enzyme sind insbesondere Enzyme mit oder nur sehr wenig Polymeren (d. h. 0 bis 2), die innerhalb eines Abstands von 0 bis 5 Å, vorzugsweise 0 bis 10 Å von der aktiven Stelle gekoppelt sind, bevorzugt.
  • Die Enzymaktivität
  • Das Stamm-Enzym kann eine beliebige Aktivität aufweisen, von welcher bekannt ist, dass sie in wie nachstehend definierten, industriellen Zusammensetzungen und Produkten zu verwenden ist. Erwogene Enzymaktivitäten schließen Oxidoreduktasen (E.C. 1, Enzyme Nomenclature, (1992), Academic Press, Inc.) wie Laccase und Superoxiddismutase (SOD); Hydrolasen (E.C. 3), einschließlich Proteasen, speziell Serinproteasen wie Subtilisine und lipolytische Enzyme; Transferasen (E.C. 2), wie Transglutaminasen (TGasen); Isomerasen (E.C. 5), wie Proteindisulfidisomerasen (PDI) ein.
  • Hydrolasen
  • Proteolytische Enzyme
  • Erwogene proteolytische Enzyme schließen Proteasen ein, die aus der Gruppe von sauren Aspartamproteasen, Cysteinproteasen, Serinproteasen wie Subtilisinen oder Metallproteasen mit den vorstehend angegebenen Eigenschaften (d. h. Anzahl an Anlagerungsgruppen, Position von Anlagerungsgruppen usw.) ein.
  • Spezifische Beispiele für geeignete Stammproteasen mit einer geeigneten Anzahl an Anlagerungsgruppen sind in nachstehender Tabelle 1 angegeben: Tabelle 1
    Figure 00190001
  • Das Subtilisin PD498 weist ein Molekulargewicht von 29 kDa und wie aus SEQ ID Nr.: 2 ersichtlich 12 Lysingruppen zur Polymeranlagerung auf der Oberfläche des Enzyms plus eine N-terminale Aminogruppe auf. Wie vorstehend erwähnt, weisen bevorzugte Enzyme über der Oberfläche breit verteilte Lysine auf. PD498 weist keine Lysinreste in einem Abstand von 0 bis 10 A von der aktiven Stelle auf, wodurch es in modifizierter Form besonders geeignet ist. Ferner sind die Lysinreste breit über der Oberfläche des Enzyms (d. h. weg von der aktiven Stelle) verteilt.
  • Das Enzym Subtilisin DY weist ein Molekulargewicht von 27 kDa und 12 Aminogruppen (d. h. Lysinreste) auf der Oberfläche des Enzyms und eine N-terminale Aminogruppe auf (siehe SEQ ID Nr.:3).
  • Die Stamm-Protease Lion Y weist ein Molekulargewicht von 46 kDa und 14 Aminogruppen (d. h. Lysinreste) auf der Oberfläche des Enzyms plus eine N-terminale Aminogruppe auf (siehe SEQ ID Nr.: 4).
  • Die neutrale Metallprotease Thermolysin weist ein Molekulargewicht von etwa 34 kDa und 11 Aminogruppen (d. h. Lysinreste) auf der Oberfläche plus eine N-terminale Aminogruppe auf (siehe SEQ ID Nr.: 5).
  • Lipolytische Enzyme
  • Erwogene lipolytische Enzyme schließen Lipasen von Humicola lanuginosa, z. B. diejenigen, die in EP 258 068 und EP 305 216 beschrieben sind, Humicola insolens, eine Lipase von Rhizomucor miehei, z. B. wie beschrieben in EP 238 023 , lipolytische Enzyme von Absidia sp. (WO 96/13578), eine Lipase von Candida, wie eine Lipase von C. antarctica, z. B. die Lipase A oder B von C Antarctica, beschrieben in EP 214 761 , eine Lipase von Pseudomonas, wie eine Lipase von P. alcaligenes und P. pseudoalcaligenes, z. B. wie beschrieben in EP 218 272 , eine Lipase von P. cepacia, wie beschrieben in EP 331 376 , eine Lipase von Pseudomonas sp., wie offenbart in WO 95/14783, eine Lipase von Bacillus, z. B. eine Lipase von B. subtilis (Dartois et al., (1993) Biochemica et Biophysica acta 1131, 253-260), eine Lipase von B. stearothermophilus (JP 64/744992) und eine Lipase von B. Pumilus (WO 91/16422) ein. Andere lipolytische Typen schließen Cutinasen, z. B. abgeleitet von Humicola insolens, Pseudomonas mendocina (WO 88/09367) oder Fusarium solani pisi (z. B. beschrieben in WO 90/09446) ein.
  • Oxidoreduktasen
  • Laccasen
  • Erwogene Laccasen schließen die Laccasen ein, die in WO 96/00290 und WO 95/33836 von Novo Nordisk offenbart sind.
  • Andere Oxidoreduktasen schließen Catalase, Glucoseoxidase, Peroxidase, Haloperoxidase, Superoxiddismutase und Lipoxygenase ein.
  • Transferasen
  • Transglutaminasen
  • Geeignete Transferasen schließen beliebige Transglutaminasen ein, die in WO 96/06931 (Novo Nordisk A/S) und WO 96/22366 (Novo Nordisk A/S) offenbart sind.
  • Isomerasen
  • Proteindisulfidisomerase
  • Ohne daran gebunden zu sein, schließen geeignete Disulfidisomerasen PDI's ein, die in WO 95/01425 (Novo Nordisk A/S) beschrieben sind.
  • Industrielle Zusammensetzung
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine ein modifiziertes Peptid mit reduzierter Allergenität umfassende „industrielle Zusammensetzung".
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung bedeutet eine „industrielle Zusammensetzung" eine Zusammensetzung, von welcher es nicht beabsichtigt ist, dass sie in das Kreislaufsystem eingebracht wird. Mit anderen Worten bedeutet sie eine Zusammensetzung, die nicht für die intradermale, intravenöse oder subkutane Verabreichung beabsichtigt ist.
  • Wie vorstehend erwähnt, handelt besteht das Hauptproblem für Polypeptide wie Enzyme für industrielle Anwendungen aus dem potentiellen Risiko der Atemallergie, die durch Inhalation durch das Atmungssystem, d. h. intratracheale oder intranasale Aufnahme verursacht wird.
  • Beispiele für eine „industrielle Zusammensetzung" sind Polypeptide, insbesondere Enzyme und antimikrobielle Polypeptide, die in Zusammensetzungen und/oder Produkten wie Detergenzien, einschließlich Waschmittel- und Geschirrspüldetergenzien, Haushaltsartikelprodukte, landwirtschaftliche Chemikalien, Körperpflegeprodukte wie Hautpflegeprodukte, einschließlich Kosmetika und Toilettenartikel, orale und dermale Arzneimittel, zum Behandeln/Verarbeiten von Textilien verwendete Zusammensetzungen, Zusammensetzungen zur Reinigung von harten Oberflächen und zur Herstellung von Nahrungsmitteln und Futter verwendete Zusammensetzungen, einschließlich Nahrungsmittel- und Futterzusätze, wie Zusätze zur Herstellung von Brot oder dergleichen usw., verwendet werden. Erfindungsgemäß besonders berücksichtigt sind Hautpflegeprodukte und Detergenzien.
  • Hautpflegeprodukte
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung deckt der Begriff „Hautpflegeprodukte" alle zum Reinigen, Pflegen und/oder zur Verschönerung der Haut des Körpers verwendeten Körperpflegeprodukte und ferner andere Produkte wie Haarpflegeprodukte, die während der Verwendung in Kontakt mit der Haut oder dem At mungssystem kommen können, ab. Ebenso sind entsprechende Produkte für Tiere erfindungsgemäß berücksichtigt.
  • Spezifische Beispiele für erfindungsgemäß berücksichtigte Hautpflegeprodukte sind Seife, Kosmetika, Hautcremes, Hautgele, Hautmilch, Hautlotion, Reinigungscreme, Reinigungslotion, Reinigungsmilch, Feuchtigkeitscreme, Cremeseife, Make-Up-Basis, Milchlotion, Packungen, Calaminlotion, T-Zonen-Essenz, Handcreme, Essenzpuder, Bleichpuder, Puderseife, Seifenstücke, Transparenzseife, Lippencreme, Lippenstift, Nähressenz, Cremegrundierung, Gesichtspuder, Puder, Puderlidschatten, Pudergrundierung, Nagellackentferner, Haartonic, Haarwasser, Haarcreme, Haargel, Haarbehandlung, Haarwuchspräparate, Haarfarbstoffe, Haarfärbemittel, Toupetbehandlung, Shampoo, Balsam, Haarspülung, Haarspray, Sonnenöl, Sonnenschutz, Rasierschaum und -gel, Rasiercreme, Babyöl, Aknepflegeprodukte, Antischweißmittel, insektenabweisende Mittel, Deodorants usw.
  • Zur Hautpflege geeignete Enzymaktivitäten
  • Hautpflegezusammensetzungen der Erfindung umfassen Konjugate mit reduzierter Allergenität der Erfindung und ferner Zusätze, deren Verwendung in Hautpflegezusammensetzungen bekannt ist.
  • Eine Anzahl an Enzymaktivitäten ist zur Verwendung in Hautpflegezusammensetzungen bekannt.
  • Proteasen
  • Proteasen sind wirksame Zusätze in Hautreinigungsprodukten. Proteasen entfernen die obere Schicht von toten keratinhaltigen Hautzellen und lassen dadurch die Haut strahlender und frischer aussehen. Ferner verbessern Proteasen auch die Glattheit der Haut.
  • Proteasen werden in Toilettenartikeln, Bade- und Duschprodukten, einschließlich Shampoos, Conditioners, Lotions, Cremes, Seifenriegel, Toilettenseifen und Flüssigseifen verwendet.
  • Lipasen
  • Lipasen können zur kosmetischen Verwendung als Wirkstoffe in Hautreinigungsprodukten und Antiahneprodukten zur Entfernung von überschüssigen Hautlipiden und in Bade- und Duschprodukten wie Cremes und Lotions als Wirkstoffe zur Hautpflege verwendet werden.
  • Lipasen können auch in Haarreinigungsprodukten (z. B. Shampoos) zum wirksamen Entfernen von Talg und anderen Fettbestandteilen von der Oberfläche des Haars verwendet werden.
  • Oxidoreduktasen
  • Die üblichste Oxidoreduktase für Körperpflegezwecke ist eine Oxidase (gewöhnlich Glucoseoxidase) mit einem Substrat (z. B. Glucose), das die Herstellung von H2O2 gewährleistet, das dann die Oxidation z. B. von SCN- oder I- in antimikrobielle Reagenzien (SCNO- oder I2) durch eine Peroxidase (gewöhnlich Lactoperoxidase) initiiert. Dieser enzymatische Komplex ist in der Natur z. B. von Milch und Salbeiöl bekannt.
  • Es wird im Handel als antimikrobielles System in Mundpflegeprodukten (Mundspülung, Zahnpasta, Kaugummi) verwendet, wo es auch mit einer Amyloglucosidase zur Herstellung der Glucose kombiniert werden kann. Diese Systeme sind auch in Kosmetikprodukten zur Konservierung bekannt.
  • Bei einer anderen Anwendung von Oxidoreduktasen handelt es sich um das oxidative Haarfärben unter Verwendung von Oxidasen, Peroxidasen und Laccasen (siehe z. B. WO 96/00290 oder WO 95/33836 von Novo Nordisk).
  • Es ist bekannt, dass auf der Oberfläche der Haut (und dem Haar) gebildete freie Radikale mit dem Alterungsprozess der Haut (der Splissbildung des Haars) verbunden sind.
  • Die freien Radikale aktivieren Kettenreaktionen, die zur Zerstörung von Fettmembranen, Kollagen und Zellen führen.
  • Die Anwendung von Radikalfängern wie Superoxiddismutase in Kosmetika ist weithin bekannt (R. L. Goldemberg, DCI, Nov. 93, S. 48-52).
  • Bei Proteindisulfidisomerase (PDI) handelt es sich ebenso um eine Oxidoreduktase. Sie kann zum Wellen des Haars (Reduktion und Reoxidation von Disulfidbindungen im Haar) und Reparieren von gesplissenem Haar (wo es sich bei der Schädigung hauptsächlich um eine Reduktion von bestehenden Disulfidbindungen handelt) verwendet werden.
  • Transglutaminase
  • Hautpflegezusammensetzung zur Anwendung auf menschlicher Haut, menschlichem Haar oder menschlichen Nägeln umfassen (a) einen aminofunktionellen Wirkstoff, (b) Transglutaminase zur Katalyse der Vernetzung des Wirkstoffs auf der Haut, dem Haar oder den Nägeln und (c) einen aus US-Patent Nr. 5,490,980 bekannten Träger.
  • Eine zur Anwendung auf Säugerhaut, -haar oder -nägeln geeignete kosmetische Zusammensetzung umfasst (a) mindestens ein Corneocyt-Ummantelungsprotein in einer zum Bereitstellen einer Schutzschicht auf der Haut, dem Haar oder den Nägeln ausreichende Menge; (b) eine Transglutaminase in einer Menge, die zur Bildung von kovalenten Bindungen zwischen dem Corneocyt-Ummantelungsprotein und extern freigelegten Corneocytproteinen, die im Stratum Corneum der Haut, des Haars oder der Nägel vorliegen, ausreichend ist; (c) Calciumionen in einer zum Aktivieren der Transglutaminase ausreichenden Menge; und (d) ein kosmetisch verträgliches Vehikulum, wobei die Zusammensetzung eine Emulsion mit zwei Phasen umfasst und das Corneocyt-Ummantelungsprotein in einer der Phasen und die Transglutaminase in der anderen Phase enthalten ist (siehe US-Patent Nr. 5,525,336).
  • JP 3083908 beschreibt ein kosmetisches Material, das eine mit einer wasserlöslichen Substanz modifizierte Transglutaminase enthält. Bei der modifizierenden Substanz handelt es sich z. B. um eine oder mehrere von Polyethylenglycol, Ethylenglycol, Propylenglycol, Glycerin, Polyvinylalkohol, Glucose, Saccharose, Alginilsäure, Carboxymethylcellulose, Stärke und Hydroxypropylcellulose. Die Modifizierung wird z. B. durch Einbringen von reaktiven Gruppen und Binden an das Enzym durchgeführt. Zur Bereitstellung eines Materials, das mild zur Haut ist, eine geringe Entfärbung oder Geruchsbildung im Laufe der Zeit verursacht und gute Wirkungen auf die Heilung von rauer Haut, der Bewahrung von Feuchtigkeit und der schöneren Konditionierung der Haut.
  • Die Hautpflegeprodukte der Erfindung
  • Im dritten Aspekt betrifft die Erfindung ein eine Hautpflegezusammensetzung der Erfindung umfassendes Hautpflegeprodukt.
  • Ein Hautpflegeprodukt der Erfindung kann eine wirksame Menge an modifizierten Enzymen der Erfindung umfassen. Solche dem Fachmann bekannten wirksamen Mengen liegen häufig im Bereich von über 0 bis 5% des fertigen Hautpflegeprodukts.
  • Berücksichtige Hautpflegeprodukte der Erfindung schließen ohne darauf beschränkt zu sein, die folgenden Produkte ein: Seife, Kosmetika, Hautcremes, Hautmilch, Hautlotion, Hautgel, Reinigungscreme, Reinigungslotion, Reinigungsmilch, Feuchtigkeitscreme, Cremeseife, Make-Up-Basis, Milchlotion, Packungen, Kalaminlotion, T-Zonen-Essenz, Handcreme, Essenzpuder, Bleichpuder, Puderseife, Lippencreme, Lippenstift, Nähressenz, Cremegrundierung, Gesichtspuder, Puderlidschatten, Pudergrundierung, Nagellackentferner, Haartonic, Haarwasser, Haarcreme, Haargel, Haarbehandlung, Haarwuchspräparate, Haarfarbstoffe, Haarfarbmittel, Toupetbehandlung, Shampoo, Balsam, Haarspülung, Haarspray, Sonnenöl, Sonnenschutz, Rasierschaum, Rasiercreme, Babyöl, Aknepflegeprodukte, Antischweißmittel, insektenabweisende Mittel, Deodorants usw. ein.
  • Allgemeine Hautpflegeproduktformulierungen
  • Der Begriff „für Hautpflegeprodukte verwendete Zusätze", bedeutet, dass er alle zur Verwendung in Hautpflegeproduktformulierungen bekannten Zusätze abdeckt. Beispiele für solche Zusätze sind in „Cosmetics and Toiletries", herausgegeben von Wilfried Umbach und veröffentlicht von Ellis Horwood, Limited, England, (1991) und „Surfactants in Consumer Products", herausgegeben von J. Falbe und veröffentlicht vom Springer-Verlag, (1987), zu finden.
  • Im Folgenden ist eine nicht abschließende Liste an führenden Formulierungen aufgezählt. Diese stellt einen Überblick von wichtigen erfindungsgemäß berücksichtigten Hautpflegeproduktformulierungen dar.
  • Toilettenseife
    Figure 00270001
  • Figure 00280001
  • Syndet (Synthetische Detergenzien)
    Figure 00280002
  • Schaumbäder und Duschbäder
    Figure 00280003
  • Figure 00290001
  • Hautcreme (Wasser-in-Öl-Typ und Öl-in-Wasser-Typ)
    Figure 00290002
  • Figure 00300001
  • Körperlotion ( Öl-in-Wasser-Typ) und Hautlotion zur Anwendung auf nasse Haut
    Figure 00300002
  • Figure 00310001
  • Gesichtslotion
    Figure 00310002
  • Haarshampoos
    Figure 00310003
  • Figure 00320001
  • Haarsspülung und Haarconditioner
    Figure 00320002
  • Figure 00330001
  • Haarfarbstoffe
    Figure 00330002
  • Rasiercreme
    Figure 00330003
  • Figure 00340001
  • Rasierlotion
    Figure 00340002
  • Haarpomade
    Figure 00340003
  • Figure 00350001
  • Festigerlösung
    Figure 00350002
  • Detergenzoffenbarung
  • Die Detergenzzusammensetzungen der Erfindung können zum Beispiel als Hand- und Maschinenwaschmittel für Detergenzzusammensetzungen, einschließlich Waschmittelzusatzzusammensetzungen und Zusammensetzungen, die zur Verwendung bei der Vorbehandlung von befleckten Stoffen, Spülungen, Zusatzstoffweichmacherzusammensetzungen und Zusammensetzungen zur Verwendung in allgemeinen Reinigungsvorgängen für harte Haushaltsoberflächen und Geschirrspülvorgängen formuliert werden.
  • Die Detergenzzusammensetzung der Erfindung umfasst das Konjugat der Erfindung und ein oberflächenaktives Mittel. Zusätzlich kann es gegebenenfalls einen Gerüststoff, ein anderes Enzym, einen Schaumunterdrücker, einen Weichmacher, ein farbübertragungshemmendes Mittel und andere Komponenten, die gewöhnlich in Detergenzien verwendet werden, wie Schmutzsuspensionsmittel, Schmutzfreisetzungsmittel, optische Aufheller, Scheuermittel, Bakterizide, Beschlagshemmmittel, Färbemittel und/oder eingekapselte oder nicht eingekapselte Parfums umfassen.
  • Die erfindungsgemäße Detergenzzusammensetzung kann in Form von Flüssigkeiten, Pasten, Gelen, Stangen oder Granulaten verwendet werden. Der pH-Wert (gemessen in wässriger Lösung bei Verwendungskonzentration) ist gewöhnlich neutral oder alkalisch und liegt z. B. im Bereich von 7-11. Erfindungsgemäße Granulatzusammensetzungen können auch in „Kompaktform" vorliegen, d. h. sie können eine relativ höhere Dichte als die herkömmlichen Granulatdetergenzien, d. h. von 550 bis 950 g/l aufweisen.
  • Das Enzymkonjugat der Erfindung und gegebenenfalls ein anderes in die Detergenzzusammensetzung eingebrachtes Enzym wird gewöhnlich in die Detergenzzusammensetzung mit einem Gehalt von 0,0001% bis 2% Enzymprotein (Gewicht) der Zusammensetzung, vorzugsweise mit einem Gehalt von 0,0001 bis 1 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung, stärker bevorzugt mit einem Gehalt von 0,001 bis 0,5 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung, sogar noch stärker bevorzugt mit einem Gehalt von 0,01 bis 0,2 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung eingebracht.
  • Oberflächenaktives System
  • Das oberflächenaktive System kann nichtionische, anionische, kationische, ampholytische und/oder zwitterionische oberflächenaktive Mittel umfassen. Das oberflächenaktive System besteht vorzugsweise aus einem anionischen oberflächenaktiven Mittel oder einer Kombination aus einem anionischen und einem nichtionischen oberflächenaktiven Mittel, z. B. 50-100% anionischen oberflächenaktiven Mitteln und 0-50% nichtionischen oberflächenaktiven Mitteln. Die Waschmitteldetergenzzusammensetzungen können auch kationische, ampholytische, zwitterionische und semipolare oberflächenaktive Mittel sowie die nichtionischen und/oder anionischen oberflächenaktiven Mittel, die von denjenigen, die hier schon beschrieben sind, verschieden sind, enthalten.
  • Das oberflächenaktive Mittel liegt typischerweise mit einem Gehalt von 0,1 bis 60 Gew.-% vor. Einige Beispiele für oberflächenaktive Mittel sind nachstehend beschrieben.
  • Nichtionisches oberflächenaktives Mittel
  • Das oberflächenaktive Mittel kann Polyalkylenoxid- (z. B. Polyethylenoxid-) Kondensate von Alkylphenolen umfassen. Die Alkylgruppe kann etwa 6 bis etwa 14 Kohlenstoffatome in geradkettiger oder verzweigter Form enthalten. Das Ethylenoxid kann in einer Menge gleich etwa 2 bis etwa 25 Mol pro Mol Alkylphenol vorliegen.
  • Das oberflächenaktive Mittel kann auch Kondensationsprodukte von primären und sekundären aliphatischen Alkoholen mit etwa 1 bis etwa 25 Mol Ethylenoxid umfassen. Die Alkylkette des aliphatischen Alkohols kann entweder geradkettig oder verzweigt sein und enthält im Allgemeinen etwa 8 bis etwa 22 Kohlenstoffatome.
  • Ferner kann das nichtionische oberflächenaktive Mittel Polyethylenoxidkondensate von Alkylphenolen, Kondensationsprodukte von primären und sekundären aliphatischen Alkoholen mit etwas 1 bis 25 mol Ethylenoxid, Alkylpolysaccharide und Gemische davon umfassen. Besonders bevorzugt sind C8-C14 Alkylphenolethoxylate mit 3 bis 15 Ethoxygruppen und C8-C18 Alkoholethoxylaten (vorzugsweise C10 durchschnittlich) mit 2 bis 10 Ethoxygruppen und Gemische davon.
  • Anionische oberflächenaktive Mittel
  • Geeignete anionische oberflächenaktive Mittel schließen alkylalkoxylierte Sulfate ein, bei welchen es sich um wasserlösliche Salze oder Säuren der Formel RO(A)mSO3M handelt, wobei R eine unsubstituierte C10-C24 Alkyl- oder Hydroxyalkylgruppe mit einer C10-C24-Alkylkomponente, vorzugsweise einer C12-C20 Alkyl- oder Hydroxyalkyl, stärker bevorzugt C12-C18 Alkyl- oder Hydroxyalkyl ist, A eine Ethoxy- oder Propoxyeinheit ist, m größer als Null, typischerweise zwischen etwa 0,5 und etwa 6 ist, stärker bevorzugt zwischen etwa 0,5 und etwa 3 ist und M H oder ein Kation, das z. B. ein Metallkation (z. B. Natrium, Kalium, Lithium, Calcium, Magnesium usw.) sein kann, Ammonium oder substituiertes Ammoniumkation ist. Alkylethoxylierte Sulfate sowie alkylpropoxylierte Sulfate sind hier berücksichtigt. Spezifische Beispiele für substituierte Ammoniumkationen schließen Methyl-, Diemethyl-, Trimethylammoniumkationen und quartäre Ammoniumkationen wie Tetramethylammonium und Dimethylpiperidiniumkationen und diejenigen, abgeleitet von Alkylaminen wie Etyhlamin, Diethylamin, Triethylamin, Gemische davon und dergleichen ein.
  • Andere geeignete anionische oberflächenaktive Mittel schließen die oberflächenaktiven Alkylsulfate ein, bei welchen es sich um wasserlösliche Salze oder Säuren der Formel ROSO3M handelt, wobei R vorzugsweise ein C10-C24 Hydrocarbyl, vorzugsweise ein Alkyl- oder Hydroxyalkyl mit einer C10-C20 Alkylkomponente, stärker bevorzugt ein C12-C18 Alkyl- oder Hydroxyalkyl ist und M H oder ein Kation, z. B. ein Alkalimetallkation (z. B. Natrium, Kalium, Lithium) oder Ammonium oder substituiertes Ammonium ist.
  • Andere anionische oberflächenaktive Mittel schließen Salze (einschließlich z. B. Natrium-, Kalium-, Ammonium- und substituierte Ammoniumsalze wie Mono-, Di- und Triethanolaminsalze) von Seife, C8-C22 primäre oder sekundäre Alkansulfonate, C8-C24 Olefinsulfonate, sulfonierte durch Sulfonierung des pyrrolysierten Produkts von Erdalkalicitraten hergestellte Polycarbonsäuren ein.
  • Alkylbenzolsulfonate, insbesondere lineare (geradkettige) Alkylbenzolsulfonate (LAS), wobei die Alkylgruppe vorzugsweise 10 bis 18 Kohlenstoffatome enthält, sind geeignet.
  • Die Waschmitteldetergenzzusammensetzungen umfassen typischerweise etwa 1 bis etwa 40 Gew.-%, vorzugsweise etwa 3 bis etwa 20 Gew.-% solcher anionischen oberflächenaktiven Mittel.
  • Gerüststoffsystem
  • Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können ferner ein Gerüststoffsystem umfassen. Jedes beliebige Gerüststoffsystem, einschließlich Aluminosilicatmaterialien, Silicate, Polycarboxylate und Fettsäuren, Materialien wie Ethylendiamintetraacetat (EDTA), Metallionmaskierungsmittel wie Aminopolyphosphonate, ist zur Verwendung hier geeignet. Phosphatgerüststoffe können ebenso hier verwendet werden.
  • Bei geeigneten Gerüststoffen kann es sich um ein anorganisches Ionenaustauschmaterial, allgemein ein anorganisches hydriertes Aluminiumsilicatmaterial, stärker bevorzugt einen hydrierten synthetischen Zeolith wie einen hydrierten Zeolith A, X, B, HS oder MAP handeln.
  • Detergenzgerüststoffsalze sind gewöhnlich in Mengen von 5 bis 80 Gew.-% der Zusammensetzung eingeschlossen. Bevorzugte Gehalte an Gerüststoff für Flüssigdetergenzien betragen 5 bis 30 %.
  • Andere Detergenzenzymaktivitäten
  • Die Detergenzzusammensetzung kann zusätzlich zu dem Konjugat der Erfindung mit einer spezifischen Aktivität ferner andere Enzymaktivitäten, z. B. auch in Form eines wie erfindungsgemäß beschriebenen Enzymkonjugats, die Reinigungsleistung und/oder Faserschutzwirkung bereitstellen, z. B. Proteasen, Lipasen, Cutinasen, Amylasen, Cellulasen, Peroxidasen, Haloperoxidasen, Oxidasen (z. B. Laccasen) umfassen.
  • Spezifische Beispiele für berücksichtigte Enzyme sind vorstehend im Abschnitt „Enzymaktivität" aufgezählt.
  • Bleichmittel:
  • Die Detergenzzusammensetzung kann (insbesondere im Fall eines Granulatdetergenzes) Bleichmittel, z. B. eine Sauerstoffbleiche oder ein Halogenbleiche enthalten. Bei der Sauerstoffbleiche kann es sich um ein Wasserstoffperoxid freisetzendes Mittel wie ein Perborat (z. B. PB1 oder PB4) oder ein Percarbonat oder z. B. eine Percarbonsäure handeln. Die Teilchengröße kann 400-800 Mikron betragen. Falls sie vorliegt, liegt die Sauerstoffbleichverbindung typischerweise mit Gehalten von etwa 1 bis 25% vor.
  • Das Wasserstoffperoxid freisetzende Mittel kann in Kombination mit Bleichaktivatoren wie Tetraacetylethylendiamin (TAED), Nonanoyloxybenzolsulfonat (MOBS), 3,5-Trimethylhexanonoloxybenzolsulfonat (ISONOBS) oder Pentaacetylglucose (PAG) verwendet werden.
  • Bei der Halogenbleiche kann es sich z. B. um ein Hypohalogenidbleichmittel, z. B. Trichlorisocyanursäure und die Natrium- und Kaliumdichlorisocyanurate und N-Chlor- und N-Bromalkansulfonamide handeln. Solche Materialien werden ge wöhnlich mit 0,5-10 Gew.-% des fertigen Produkts, vorzugsweise 1-5 Gew.-% zugesetzt.
  • Textilanwendungen
  • Proteasen
  • Proteasen werden zur Degummieren und zum Sand-Waschen von Seide verwendet.
  • Lipasen
  • Lipasen werden zur Entfernung von hydrophobe Ester (z. B. Triglyceride) enthaltenden Fettbestandteilen während des Appretierens von Textilien verwendet (siehe z. B. WO 93/13256 von Novo Nordisk A/S).
  • Oxidoreduktasen
  • Beim Bleichaufreinigen von Textilien können Catalasen zum Entfernen von überschüssigem Wasserstoffperoxid dienen.
  • Carbohydrasen
  • Cellulytische Enzyme werden weit verbreitet beim Appretieren von Denimstoffen zum Bereitstellen einer lokalisierten Abweichung in der Farbdichte des Stoffs verwendet (Enzym-ermöglichtes „Stone-Waschen").
  • Ebenso finden cellulytische Enzyme beim Biopolierverfahren Verwendung. Beim Biospolieren handelt es sich um eine spezifische Behandlung der Garnoberfläche, das die Stoffqualität in Bezug auf die Handhabung und das Erscheinungsbild ohne Verlust der Stoffbenetzungsfähigkeit verbessert. Das Biospolieren kann durch Anwenden des in z. B. WO 93/20278 beschriebenen Verfahrens erhalten werden.
  • Während des Webens von Textilien sind die Fäden einer bemerkenswerten mechanischen Belastung ausgesetzt. Zum Verhindern des Reißens werden sie gewöhnlich durch Beschichtung (Schlichten) mit einer gelatineartigen (Schlichte) Substanz verstärkt. Bei dem üblichsten Schlichtemittel handelt es sich um Stärke in nativer oder modifizierter Form. Eine gleichmäßige und dauerhafte Appretur kann folglich nur nach Entfernung der Schlichte von dem Stoff, dem so genannten Entschlichten erhalten werden. Das Entschlichten von Stoffen, die mit einer Stärke oder modifizierte Stärke enthaltenden Schlichte geschlichtet ist, wird vorzugsweise unter Verwendung von amylolytischen Enzymen erleichtert.
  • Nahrungsmittel- und Futteranwendungen
  • Konjugierte Enzyme oder Polypeptide der Erfindung können vorteilhaft bei der Herstellung von Nahrungsmitteln und Futter verwendet werden.
  • Proteasen
  • Das Gluten im Weizenmehl ist der essentielle Bestandteil, der dafür verantwortlich ist, dass das Mehl in gebackenen Nahrungsmitteln verwendet werden kann. Proteolytische Enzyme werden manchmal zum Modifizieren der Glutenphase des Teigs benötigt, z. B. kann ein Hartweizenteig mit einer Protease erweicht werden.
  • Neutrase® ist eine im Handel erhältliche neutrale Metallprotease, die zur Gewährleistung einer gleichförmigen Teigqualität und Brottextur und zur Verbesserung des Geschmacks verwendet werden kann. Die Glutenproteine werden entweder mäßig oder intensiver zu Peptiden zersetzt, wodurch eine enge Regulierung zum Vermeiden von überschüssigem Erweichen des Teiges nötig ist.
  • Proteasen werden auch zum Modifizieren von Milchprotein verwendet.
  • Zum Koagulieren von Kasein in Milch bei der Herstellung von Käse können Proteasen wie Rennet oder Chymosin verwendet werden.
  • In der Brauereiindustrie werden Proteasen zum Brauen mit ungemalzten Cerealien und zum Regulieren des Stickstoffgehalts verwendet.
  • In Tierfutterprodukten werden Proteasen zum Ansprechen der Erweiterung des tierischen Verdauungssystems verwendet.
  • Lipasen
  • Die Anwendung von Lipase in der Backindustrie ist sehr neu. Die Zugabe von Lipase führt zu verbesserten Teigeigenschaften und einer verbesserten Brotherstellungsqualität in Bezug auf ein größeres Volumen, verbesserte Krümelstruktur und weißere Krümelfarbe. Der beobachtete Effekt kann durch einen Mechanismus erklärt werden, durch welchen die Lipase die Wechselwirkung zwischen dem Gluten und einigen Lipidfragmenten während des Teigmischens verändert. Dies führt zu einer verbesserten Glutenvernetzung.
  • Die Geschmacksentwicklung von Blauschimmelkäse (z. B. Danablue), bestimmten italienischen Käsesorten und milchhaltigen Produkten, die Butterfett enthalten, hängen von der Zersetzung von Milchfett zu freien Fettsäuren ab. Die Lipasen können zur Entwicklung des Geschmacks in solchen Produkten verwendet werden.
  • In der Öl- und Fett herstellenden Industrie werden Lipasen z. B. zum Minimieren der Menge an unerwünschten Nebenprodukten, zum Modifizieren von Fetten durch Veresterung und zur Synthese von Estern verwendet.
  • Oxidoreduktasen
  • Ferner können vorteilhaft Oxidoreduktasen mit erfindungsgemäß reduzierter Allergenität bei der Herstellung von Nahrungsmitteln und Futter verwendet werden.
  • Verschiedene Oxidoreduktasen, Glucoseoxidase, Lipoxygenase, Peroxidase, Katalase und Kombinationen davon werden zum Backen verwendet. Traditionell verstärken Bäcker Gluten durch Zugabe von Ascorbinsäure und Kaliumbromat. Einige Oxidoreduktasen können zum Ersetzen von Bromat in Teigsystemen durch Oxidation von freien Sulfydryleinheiten mit Glutenproteinen verwendet werden. Hierdurch werden Disulphidbindungen gebildet, was zu stärkeren, elastischeren Teigen mit größerer Festigkeit führt.
  • Gluzyme® (Novo Nordisk A/S) ist ein Glucoseoxidasepräparat mit Catalaseaktivität, das zum Ersetzen von Bromat verwendet werden kann. Die Teigverstärkung wird als größere Festigkeit gegenüber mechanischem Schlag, besserer Ofenfederung und größerem Laibvolumen gemessen.
  • Carbohydrasen
  • Mehl weist einen variierenden Gehalt an Amylasen auf, was zu Unterschieden in der Backqualität führt. Die Zugabe von Amylasen kann nötig sein, um das Mehl zu standardisieren. Amylasen und Pentosanasen stellen im Allgemeinen Zucker für die Hefegärung, Verbesserung des Brotvolumens, Rückhaltung der Retrogradierung und Verminderung der Beschleunigung der aus Pentosangummis resultierenden Geschmacklosigkeit und Klebrigkeit bereit. Beispiele für Carbohydrasen sind nachstehend angegeben.
  • Bestimmte maltogene Amylasen können zur Verlängerung der Haltbarkeit von Brot um zwei oder mehrere Tage ohne Verursachen der Gummiartigkeit des Produkts verwendet werden. Die gelatinisierte Stärke modifiziert durch Spalten des nicht reduzierenden Endes der Stärkemoleküle, selektiv Zucker mit niedrigem Molekulargewicht und Dextrine. Die Stärke wird in solcher Weise modifiziert, dass eine Retrogradierung weniger wahrscheinlich auftritt. Die hergestellten Zucker mit niedrigem Molekulargewicht verbessern die Wasserrückhaltekapazität von Backwaren ohne Bildung von zur Gummiartigkeit des fertigen Produkts führenden Dextrinen mit mittlerer Länge. Das Enzym wird während des Brotbackens inaktiviert, so dass es als Verarbeitungshilfe betrachtet werden kann, die auf dem Etikett nicht deklariert werden muss. Eine Überdosierung von Novamyl kann nahezu ausgeschlossen werden.
  • Das Brotvolumen kann durch Pilz-α-Amylasen verbessert werden, die ferner eine gute und gleichförmige Struktur der Brotkrümel bereitstellen. Bei den α-Amylasen handelt es sich um Endoenzyme, die Maltose, Dextrine und Glucose erzeugen. Cerealien und einige Bakterien-α-Amylasen werden bei Temperaturen über der Gelatinisierungstemperatur von Stärke inaktiviert, weshalb sie bei der Zugabe zu einem Weizenteig zu einem geringen Brotvolumen und einem klebrigen Teiginneren führen. Fungamyl weist den Vorteil auf, dass es thermolabil ist und direkt unter der Gelatinisierungstemperatur inaktiviert wird.
  • Enzympräparate, die eine Anzahl an Pentosanase- und Hemicellulaseaktivitäten enthalten, können die Handhabung und Stabilität des Teigs und die Frische, die Krümelstruktur und das Brotvolumen verbessern.
  • Durch Hydrolysieren der Pentosanfraktion im Mehl verliert es einen Großteil seiner Wasserbindungskapazität, und das Wasser wird dann für die Stärke und das Gluten verfügbar. Das Gluten wird nachgiebiger und dehnbarer, und die Stärke gelatinisiert leichter. Pentosane können in Kombination mit oder als Alternative zu Emulgatoren verwendet werden.
  • Ferner werden Carbohydrasen zur Herstellung von Sirupen aus Stärke verwendet, die weit verbreitet in alkoholfreien Getränken, Süßigkeiten Fleischprodukten, Milchprodukten, Brotprodukten, Eis, Babynahrung, Marmelade usw. verwendet werden.
  • Die Umwandlung von Stärke wird gewöhnlich in drei Schritten durchgeführt. Zuerst wird die Stärke durch die Verwendung von α-Amylasen verflüssigt. Maltodextrine, die primär aus Oligosacchariden und Dextrinen bestehen, werden erhalten.
  • Das Gemisch wird dann mit einer Amyloglucosidase zum Hydrolysieren der Oligosaccharide und Dextrine in Glucose behandelt. Auf diesem Weg wird ein süßeres Produkt erhalten. Sind Sirupe mit höherem Maltosegehalt erwünscht, können β-Amylasen allein oder in Kombination mit einer Pullulanase (entzweigendes Enzym) verwendet werden.
  • Das Glucosegemisch kann durch Isomerisierung zu Fructose sogar noch süßer hergestellt werden. Dafür kann eine immobilisierte Glucoseisomerase verwendet werden.
  • In der Zuckerindustrie ist es übliche Praxis, den Aufbruch der vorliegenden Stärke in Rohrsäften zu beschleunigen. Dadurch wird der Stärkegehalte in Rohzucker reduziert und eine Filtration in der Raffinerie erleichtert.
  • Weiterhin werden Dextranasen zu Aufbrechen von Dextran in Rohzuckersäften und Sirupen verwendet.
  • In der Alkoholindustrie werden α-Amylasen vorteilhaft zum Verdünnen von Stärke in Destilliermaischen verwendet.
  • In der Brauereiindustrie werden α-Amylasen als Zusatzverflüssigung verwendet.
  • In der Milchindustrie werden β-Galactosidasen (Lactase) verwendet, wenn die Herstellung von Milch mit niedrigem Lactosegehalte für an Lactosefehlabsorption leidende Personen hergestellt wird.
  • Werden geschmacklich verbesserte Milchgetränke aus mit Lactase behandelter Milch hergestellt, kann die Zugabe von Zucker ohne Reduzierung der Süße des Produkts reduziert werden.
  • Bei der Herstellung von Kondensmilch kann eine Lactosekristallisation durch Lactasebehandlung vermieden werden, und das Risiko der durch eine Kaseinkoagulation in Lactosekristallen verursachten Verdickung wird folglich reduziert.
  • Bei der Herstellung von Eis, das aus mit Lactase behandelter Milch (oder Weizen) hergestellt ist, werden keine Lactosekristalle gebildet, und der Fehler der Sandigkeit tritt nicht auf.
  • Ferner ist die Verwendung von Xylanasen in einer Anzahl an nahrungsmittel/futterindustriellen Anwendungen wie in WO 94/21785 (Novo Nordisk A/S) beschrieben bekannt.
  • α-Amylasen werden in der Tierfutterindustrie als Zugabe zu cerealienhaltigem Futter zur Verbesserung der Verdauungsfähigkeit von Stärke verwendet.
  • Antimikrobielle Polypeptide
  • Bestimmte bakteriolytische Enzyme können z. B. zum Waschen von Kadavern in der Fleischverpackungsindustrie verwendet werden (siehe US-Patent Nr. 5,354,681 von Novo Industri A/S).
  • Transferasen
  • Transglutaminasen mit erfindungsgemäß reduzierter Allergenität können vorteilhaft bei der Herstellung von Nahrungsmitteln und Futter verwendet werden.
  • Transglutaminasen weisen die Fähigkeit zum Vernetzen von Protein auf.
  • Diese Eigenschaft kann zum Gelieren von wässrigen, proteinhaltigen Phasen verwendet werden. Dies kann bei der Herstellung von Brotaufstrichen verwendet werden (WO 96/08156 von Novo Nordisk A/S).
  • Transglutaminasen werden zur Verbesserung der Backqualität von Mehl, z. B. durch Modifizieren von Weizenmehl, das bei der Herstellung von Kuchen mit verbesserten Eigenschaften wie verbessertem Geschmack, Vertiefung, Mundgefühl und einem höheren Volumen zu verwendenden ist, verwendet (siehe JP 1-110147).
  • Ferner wird es zur Herstellung von pastenartigen Nahrungsmaterial verwendet werden, das z. B. als Fettersatz in Nahrungsmitteln wie Eis, Garnierungen, eingefrorenen Desserts, Mayonnaisen und Brotaufstrichen mit geringem Fettgehalt verwendet wird (siehe WO 93/22930 von Novo Nordisk A/S).
  • Weiterhin kann es zur Herstellung von Gelen für Joghurt, Mousses, Käse, Puddings, Orangensaft, aus Milch und milchähnlichen Produkten und Binden von geschnetzelten Fleischprodukten, Verbesserung des Geschmacks und der Textur von Nahrungsmittelproteinen verwendet werden (siehe WO 94/21120 und WO 94/21129 von Novo Nordisk A/S).
  • Phytasen
  • Phytasen der Erfindung können vorteilhaft bei der Herstellung von Nahrungsmitteln, wie Frühstückscerealien, Kuchen, Süßigkeiten, Getränken, Brot oder Suppen usw. und Tierfutter verwendet werden.
  • Phytasen können entweder zum Ausnutzen der Phosphorbindung in der in pflanzlichen Proteinquellen vorliegenden Phytat-/Phytinsäure oder zum Ausnutzen der in Phytinsäurekomplexen gebundenen nährstoffwichtigen Mineralien verwendet werden.
  • Mikrobielle Phytase kann Futter für einmägige Tiere zum Vermeiden der Ergänzung des Futters mit anorganischem Phosphor zugesetzt werden (siehe US-Patent Nr. 3,297,548).
  • Ferner können Phytasen bei der Sojaverarbeitung verwendet werden. Sojabohnenmehl kann hohe Gehalte an Antinährfaktorphytat enthalten, der diese Proteinquelle zur Anwendung in Babynahrung oder Futter für Fische, Kälber und andere Wiederkäuer ungeeignet macht, da das Phytat darin vorliegende essentielle Mineralien chelatiert (siehe EP 0 420 358 ).
  • Ebenso können für Backzwecke Phytase verwendet werden. Brot mit einer besseren Qualität kann durch Backen von abgeteilten Stücken eines Weizenmehl usw. und Phytase enthaltenden Teigs hergestellt werden (siehe JP-0-3076529-A).
  • Ein Koji-Schimmel mit hoher Phytaseaktivität ist zur Verwendung zur Herstellung von raffiniertem Sake bekannt (siehe JP-0-6070749-A).
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines modifizierten Polypeptids der Erfindung zur Reduzierung der Allergenität von wie vorstehend definierten industriellen Zusammensetzungen und Produkten.
  • MATERIALIEN UND VERFAHREN
  • Materialien
  • Enzyme:
    • Neutrase®: Protease, abgeleitet von Bacillus amyloliquefaciens.
    • Die Sequenz von Neutrase® ist in SEQ II) Nr.: 6 dargestellt.
    • PD498: Protease vom Subtilisintyp, dargestellt in WO 93/24623. Die Sequenz von PD498 ist in SEQ ID Nr.: 1 und 2 dargestellt.
    • Subtilisin DY: Protease vom Subtilisintyp, dargestellt in SEQ ID Nr.: 3, isoliert von einer Variante von Bacillus sp. (Betzel et al. (1993), Archives of Biophysics, Band 302, Nr. 2, S. 439-502).
  • ELISA Reagenzien:
    • Meerettichperoxidase-markierter Anti-Kaninchen-Ig (Dako, DK, P217, Verdünnung 1:1000).
    • Ratten-Anti-Mäuse-IgE (Serotec MCA419; Verdünnung 1:100). Mäuse-Anti-Ratten-IgE (Serotec MCA193; Verdünnung 1:200).
    • Biotin-markierter Mäuse-Anti-Ratten-IgG1-monoklonaler-Antikörper (Zymed 03-9140; Verdünnung 1:1000)
    • Biotin-markierter Ratten-Anti-Mäuse-IgG1-monoklonaler-Antikörper (Serotec MCA336B; Verdünnung 1:2000)
    • Streptavidin-Meerettichperoxidase (Kirkegård & Perry 14-30-00; Verdünnung 1:1000).
  • Puffer und Lösungen:
    • – PBS (pH 7,2 (1 Liter))
      NaCl 8,00 g
      KCl 0,20 g
      K2HPO4 1,04 g
      KH2PO4 0,32 g
    • – Waschpuffer PBS, 0,05% (V/V) Tween 20
    • – Blockierungspuffer PBS, 2% (G/V) entrahmtes Milchpulver
    • – Verdünnungspuffer PBS, 0,05% (V/V) Tween 20, 0.,5% (G/V) entrahmtes Milchpulver
    • – Citratpuffer (0,1 M, pH 5,0-5,2 (1 Liter))
      Na-Citrate 20,60 g
      Zitronensäure 6,30 g
    • – Stopplösung (DMG-Puffer)
    • – Natriumborat, Borax (Sigma)
    • – 3,3-Dimethylglutarsäure (Sigma)
    • – CaCl2 (Sigma)
    • – Tween 20: Polyoxyethylensorbitmonolaurat (Merck Katalognr. 822184)
    • – N-Hydroxysuccinimid (Fluka Art. 56480)
    • – Phosgen (Fluka Art. 79380)
    • – Lactose (Merck 7656)
    • – PMSF (Phenylmethylsulfonylflourid) von Sigma
    • – Succinyl-Alanin-Alanin-Prolin-Phenylalanin-para-Nitroanilid (Suc-AAPF-pNP) Sigma Nr. S-7383, Mw 624,6 g/Mol.
    • – mPEG (Fluka)
  • Färbesubstrat:
    • OPD: o-Phenylendiamin, (Kementec Kat. Nr. 4260)
  • Testtiere:
  • Brown-Norway-Ratten (von Charles River, DE)
  • Ausrüstung:
    • XCEL II (Novex)
    • ELISA Leser (UVmax, Molecular Devices)
    • HPLC (Waters)
    • PFLC (Pharmacia)
    • Superdex-75 Säule, Mono-Q, Mono S von Pharmacia, SW.
    • SLT: Fotometer von SLT LabInstruments
    • Größenausschlusschromatograph (Spherogel TSK-G2000 SW).
    • Größenausschlusschromatograph (Superdex 200, Pharmacia, SW)
    • Amicon-Zelle
  • Verfahren:
  • Intratracheale (IT) Stimulierung von Brown-Norway-Ratten
  • Für die IT-Verabreichung von Molekülen werden Wegwerfspritzen mit einer 2½" langen Metallsonde verwendet. Diese Sonde wird in die Trachea der Ratten etwa 1 cm unter die Epiglottis eingeführt, und 0,1 ml einer Lösung der Moleküle werden abgeschieden.
  • Bei den Testtieren handelt es sich um Brown-Norway-Ratten (BN) in Gruppen von 10 Tieren. Das Gewicht zum Zeitpunkt des Beginns beträgt mehr als 200 Gramm und bei Beendigung etwa 450 Gramm.
  • ELISA-Verfahren zur Bestimmung der relativen Konzentrationen von IgE-Antikörpern in Brown-Norway-Ratten.
  • Ein dreischichtiger Sandwich-ELISA wird zur Bestimmung der relativen Konzentrationen für spezifische IgE-Serumantikörper verwendet.
    • 1) Die ELISA-Platte wird mit 10 mg Mäuse-Anti-Ratten-IgE-Puffer 1 (50 μl/Mulde) beschichtet. Es wird über Nacht bei 4°C inkubiert.
    • 2) Die Platten werden entleert und mit Blockierungspuffer für eine Dauer von mindestens ½ Stunde bei Raumtemperatur (200 μl/Mulde) blockiert. Es wird sanft geschüttelt. Die Platten werden 3 Mal mit Waschpuffer gewaschen.
    • 3) Es wird mit Rattenserum (50 μl/Mulde), beginnend von unverdünnt und fortgesetzt mit 2-fachen Verdünnungen, inkubiert. Einige Mulden werden nur für Puffer 4 freigelassen (Blindproben). Es wird 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Es wird sanft geschüttelt. Die Platten werden 3 Mal in Waschpuffer gewaschen.
    • 4) Das Enzym wird in Verdünnungspuffer auf die geeignete Proteinkonzentration verdünnt. 50 μl/Mulde werden für eine Dauer von 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Es wird sanft geschüttelt. Die Platten werden 3 Mal in Waschpuffer gewaschen.
    • 5) Das spezifische polyklonale Anti-Enzym-Antiserum-Serum (pIg) zum Nachweis von der Bindung von Antikörpern in Verdünnungspuffer wird verdünnt. 50 μl/Mulde werden für eine Dauer von 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Es wird sanft geschüttelt. Die Platten werden 3 Mal mit Waschpuffer gewaschen.
    • 6) Meerettichperoxidase-konjugierter Anti-pIg-Antikörper wird in Verdünnungspuffer verdünnt. 50 μl/Mulde werden bei Raumtemperatur für eine Dauer von 30 Minuten inkubiert. Es wird sanft geschüttelt. Die Platten werden 3 Mal in Waschpuffer gewaschen.
    • 7) 0,6 mg ODP/ml + 0,4 μl H2O2/ml werden in Substratpuffer gemischt. Die Lösung wird direkt vor der Verwendung hergestellt. Es wird 10 Minuten inkubiert. 50 μl/Mulde.
    • 8) Zum Stoppen der Reaktion werden 50 μl Stopplösung pro Mulde zugesetzt.
    • 9) Die Platten werden bei at 492 nm mit 620 nm als Bezug abgelesen. Die Daten werden berechnet und in Lotus dargestellt.
  • Bestimmung des Molekulargewichts
  • Eine elektrophoretische Abtrennung von Proteinen wurde durch Standardverfahren unter Verwendung eines 4-20%igen Gradienten aus SDS Polyacrylamidgel (Novex) durchgeführt. Die Proteine wurden durch Silberfärben nachgewiesen. Das Molekulargewicht wurde in Bezug auf die Beweglichkeit des Standards des Typs Mark-12® mit breiten Molekulargewichtsbereich von Novex gemessen.
  • Proteaseaktivität
  • Analyse mit Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa:
  • Proteasen spalten die Bindung zwischen dem Peptid und p-Nitroanilin unter Erhalt einer sichtbaren gelben Farbe, die bei 405 n absorbiert.
    Puffer: z. B. Britton-and-Robinson-Puffer, pH 8,3
    Substrat: 100 mg suc-AAPF-pNa wird in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. 100 ml davon werden in 10 ml Britton-and-Robinson-Puffer verdünnt.
  • Analyse
  • Die Substrat- und Proteaselösung werden gemischt und die Absorption bei 405 nm als Zeitfunktion und ABS405 nm/Min. überwacht. Die Temperatur sollte reguliert sein (20-50°C, abhängig von der Protease). Dies ist ein Maß der Proteaseaktivität in der Probe.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Aktivierung von Poly(ethylenglycol)-block-poly-(propylenglycol)-block-poly(ethylenglycol) 1900 (50 Gew.-% Ethylenglycol) mit N-Succinimidylcarbonat
  • Poly(ethylenglycol)-block-poly(propylenglycol)-block-poly(ethylenglycol) 1900 (50 Gew.-% Ehtyleneglycol) von ALDRICH wurde in Toluol (5 ml/g Polymer) gelöst. Etwa 20% wurde bei Normaldruck abdestilliert, um die Reaktanten azeotrop zu trocknen. Die Lösung wurde auf 20°C abgekühlt, und Phosgen in Toluol (1,93 M, 1 Mol/Mol Polymer) wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde dann bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel und überschüssiges Phosgen wurden im Vakuum entfernt, und das Zwischenprodukt Bis(chlorformat) wurde als Öl erhalten.
  • Toluol (trocken, 4 ml/g Polymer) wurde zum Wiederlösen des Öls zugesetzt. N-Hydroxysuccinimid (NHS) (2,4 mol/Mol Polymer) wurde zugesetzt und das Gemisch mit einem Eisbad gekühlt. Triethylamin (2,2 mol/Mol Polymer) wurde bei 0°C zugetropft. Die Zwischenausfällung von Triethylaminhydrochlorid (Et3N.HCl) konnte beobachtet werden. Der Niederschlag wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Glasfritte (G5) filtriert, um das Et3N.HCl zu entfernen. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck zur Trockene eingedampft, um 97% (Mol/Mol) eines Öls zur erhalten. Ein NMR zeigte >90%ige Aktivierung und <8% (mol/Mol) ungebundenes NHS. 1H-NMR (400MHz) für Poly(ethylenglycol)-block-poly(propylenglycol)-block-poly(ethylenglycol) 1900 Bis(succinimidylcarbonat) (50 Gew.-% Ehtylenglycol) (CDCl3) δ: 1,15 bs (I=330 -CH3 in PPG), 2,69 s (l=1,7 nicht umgesetztes NHS), 2,83 s (1=41, Succinimid), 3,41 m (I=110, CH-CH2 in PPG), 3,55 m (I=220, CH-CH2 in PPG), 3,61 m (l= 440 Hauptpeak), 4,46 t (I=19, CH2-O-CO- in PEG).
  • Beispiel 2
  • Aktivierung von Poly(ethylenglycol)-block-Poly(propylenglycol)-block-Poly(ethylenlycol) 2900 (ca. 40 Gew.-% Ethylenglycol) mit N-Succinimidylcarbonat
  • Poly(ethylenglycol)-block-poly(propylenglycol)-block-poly(ethylenglycol) 2900 (ca. 40 Gew.-% Ethylenglycol) von ALDRICH wurde in Toluol (4,4 ml/g Polymer) gelöst. Etwa 15% wurden unter Normaldruck abdestilliert, um die Reaktanten azeotrop zu trocknen. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt, und Phosgen in Toluol (1,93 M, 7 Mol/Mol Polymer) wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde dann bei Raumtemperatur für eine Dauer von 19 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel und überschüssiges Phosgen wurden im Vakuum entfernt, und die Zwischenverbindung Bis(chlorformiat) wurde als Öl erhalten.
  • Toluol (trocken, 2,5 ml/g Polymer) wurde zum Wiederlösen des Öls zugesetzt. N-Hydroxysuccinimid (NHS) (2,4 Mol/Mol Polymer) wurde bei Raumtemperatur zugesetzt. Triethylamin (2,2 Mol/Mol Polymer) wurde zugetropft. Die Zwischenausfällung von Triethylaminhydrochlorid (Et3N.HCl) konnte beobachtet werden. Das Gemisch wurde dann für eine Dauer von 21 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Glasfritte (G5) filtriert, um unlösliches Et3N.HCl zu entfernen. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck zur Trockene eingedampft, um 96% (Mol/Mol) eines Öls zur erhalten. Eine NMR zeigte >70%ige Aktivierung und <26% (Mol/Mol) ungebundenes NHS. 1H-NMR (400MHz) für Poly(ethylenglycol)-block-poly(propylenglycol)-block-poly(ethylenglycol) 2900 Bis(succinimidylcarbonat) (ca. 40 Gew.-% Ethylenglycol) (400 MHz, CDCl3) δ: 1,15 bs (I=1000 -CH3 in Propylenglycol), 2,68 s (I=10,6 nicht umgesetztes NHS), 2,84 s (I=61,7, Succinimid), 3,40 m (I=318, CH-CH2 in Propylenglycol), 3,55 m (I=668, -CH-CH2 in Propylenglycol), 3,61 m (I=1022 Hauptpeak, -CH2-CH2- in Ethylenglycol), 4,46 t (I=25,7, CH2-O-CO-).
  • Beispiel 3
  • Aktivierung von Poly(ethylenglycol)-co-(propylenglycol)monobutylether 970 (ca. 50 Gew.-% Ethylenglycol) mit N-Succinimidylcarbonat
  • Poly(ethylenglycol)-co-(propylenglycol)monobutylether 970 (ca. 50 Gew.-% Ethylenglycol) von ALDRICH wurde in Toluol gelöst (4 ml/g Polymer). Etwa 25% wurden unter Normaldruck abdestilliert, um die Reaktanten azeotrop zu trocknen. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt, und Phosgen in Toluol (1,93 M, 7 Mol/Mol Polymer) wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde dann bei Raumtemperatur für eine Dauer von 21 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel und überschüssiges Phosgen wurden im Vakuum entfernt, und die Zwischenverbindung Chlorformiat wurde als Öl erhalten.
  • Toluol (trocken, 2 ml/g Polymer) wurde zum Wiederlösen des Öls zugesetzt. N-Hydroxysuccinimid (NHS) (2,4 Mol/Mol Polymer) wurde bei Raumtemperatur zugesetzt. Triethylamin (1,1 Mol/Mol Polymer) wurde bei 0°C zugetropft. Die Zwischenausfällung von Triethylaminhydrochlorid (Et3N.HCl) konnte beobachtet werden. Das Gemisch wurde dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Glasfritte (G5) filtriert, um unlösliches Et3N × HCl zu entfernen. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck zur Trockene eingedampft, um 89% (Mol/Mol) eines Öls zur erhalten. Eine NMR zeigte > 72%ige Aktivierung und < 5% (Mol/Mol) ungebundenes NHS. 1H-NMR (400MHz) für Poly(ethylenglycol)-co-(propylenglycol)-monobutylether 970 Succinimidylcarbonat (ca. 50 Gew.-% Ethylenglycol) (400 MHz, CDCl3) δ: 0,91 t (I=1000 -CH3 Butyl), 1,15 bs (I = 8744 -CH3 in Propylenglycol), 1,39 m (I=1320 CH3-CH2-CH2-Butyl), 1,55 m (I=656 -CH2-O-Butyl), 2,68 s (I=60,8 nicht umgesetztes NHS), 2,83 s (I=963,2 Succinimid), 3,40 m (I=3059, CH-CH2 in Propylenglycol), 3,55 m (I=2678, -CH-CH2 in Propylenglycol), 3,61 m (I=1764 Hauptpeak, -CH2-CH2- in Ethylenglycol), 4,46 m (CH2-O-CO-).
  • Beispiel 4
  • Bewertung der allergenen Leistungen von mit Co- und Blockpolymeren modifizierter Protease.
  • Jede Probe wurde auf 0,015 mg Protein/ml verdünnt und in 1,5 ml aliquotiert. Diese Fraktionen wurden bei -20°C bis zur Verwendung gelagert. Zusätzlich wurden 100 μl der jeweiligen Fraktionen in einem Laborgefrierschrank bei -20°C zur immunochemischen Analyse bei Beginn, im Zwischenstadium und am Ende der Studie gelagert. Für jede Immunisierung wurde jede Analyse einer neuen Fraktion verwendet.
  • Zwanzig intratracheale Immunisierungen wurden wöchentlich mit 100 μl der vorstehend erwähnten Proteinverdünnung durchgeführt. So erhielt Gruppe 1 unmodifiziertes PD498, Gruppe 2 PD498-EO50PO50970, Gruppe 3 unmodifiziertes Subtilisin DY (CDJ31), Gruppe 4 Subtilisin DY (CDJ31)-EO50PO50970, Gruppe 5 Sutilisin DY (CDJ31)-EO40PO602900, Gruppe 6 Neutrase und Gruppe 7 Neutrase-EO50PO50970. Jede Gruppe enthielt 10 Ratten. Kontrollratten erhielten 100 μl 0,9%ige NaCl. Blutproben (2 ml) wurden von dem Auge eine Woche nach jeder zweiten Immunisierung entnommen. Das Serum wurde durch Blutgerinnung und Zentrifugation erhalten.
  • Spezifische IgE-Gehalte wurden unter Verwendung des ELISA-Verfahrens bestimmt. Die Abbildung zeigt, dass die IgE-Reaktion für die modifizierten Enzyme verglichen mit den unmodifizierten Enzymen reduziert ist.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Figure 00610001
  • Figure 00620001
  • Figure 00630001
  • Figure 00640001
  • Figure 00650001

Claims (17)

  1. Für industrielle Anwendungen geeignetes Polypeptid-Polymer-Konjugat, das eine oder mehrere an das Stamm-Polypeptid gekoppelte Polymere aufweist, wobei das Polymer durch die allgemeine Formel EOxPOy (I)wobei x = 1-99%, y = 1-99% und x+y = 100%, gekennzeichnet ist.
  2. Konjugat nach Anspruch 1, wobei x = 10-90%, y = 20-90% und x+y = 100%.
  3. Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polymer ein Molekulargewicht von 100 bis 100.000 Da aufweist, insbesondere von 100 bis 50.000 Da aufweist.
  4. Konjugat nach Anspruch 1 bis 3, wobei das Stamm-Polypeptid ein Molekulargewicht von 1 bis 100 kDa aufweist, insbesondere ein Enzym ein Molekulargewicht von 15 bis 60 kDa ist.
  5. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das (die) Block- oder Copolymer(e) Ethylenoxideinheiten (EO) und Propylenoxideinheiten (PO) in einem Verhältnis im Bereich von 10:90 oder 20:80 oder 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20 oder 90:10 umfasst (umfassen).
  6. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei 1 bis 100 Polymermoleküle, vorzugsweise 4 bis 50, insbesondere 5 bis 35 Polymermoleküle kovalent an das Stamm-Enzym gekoppelt sind.
  7. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polypeptid mikrobiellen Ursprungs wie bakteriellen Ursprungs, vom Ursprung eines Fadenpilzes oder von Ursprung einer Hefe ist.
  8. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Polypeptid ein Enzym der Hydrolasegruppe, einschließlich Proteasen, einschließlich Serinprotease, Subtilisine und Metalloproteasen oder Lipasen oder Oxidoreduktasen wie Laccase und Halogenperoxidasen oder Superoxiddismutase, ist.
  9. Konjugat nach Anspruch 8, wobei die Stamm-Protease ausgewählt ist aus der Gruppe, einschließend PD498, Savinase®, ProteinaseK, Proteinasen, Thermitase, Subtilisin DY, Lion Y, Alcalase®, ProteinaseT, Neutrase® und JA16.
  10. Konjugat nach Anspruch 9, wobei das Enzym PD498, dargestellt in SEQ ID NR:1 oder die Protease vom Subtilisin-Typ, dargestellt in SEQ ID NR: 3, oder Lion Y, dargestellt in SEQ ID NR: 5, oder Neutrase®, dargestellt in SEQ ID NR: 6, ist.
  11. Industrielle Zusammensetzung, umfassend ein Konjugat nach Anspruch 1-10.
  12. Industrielle Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei die Zusammensetzung Inhaltsstoffe umfasst, von welchen die Verwendung in Körperpflegezusammensetzungen, insbesondere Hautpflegezusammensetzungen bekannt ist.
  13. Industrielle Zusammensetzung nach Anspruch 12, die ein Detergenz wie eine Waschmittelzusammensetzung, Geschirrspülzusammensetzung oder Reinigungszusammensetzung für harte Oberflächen ist.
  14. Industrielle Zusammensetzung nach Anspruch 11, die eine Zusammensetzung wie ein Nahrungsmittel oder Nahrungsmittelzusatz, insbesondere ein Zusatz zur Brotherstellung oder dergleichen ist.
  15. Industrielle Zusammensetzung nach Anspruch 11, die eine Zusammensetzung zur Behandlung von Textilien ist.
  16. Verwendung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1-10 zur Reduzierung der Atemallergenität von industriellen Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 11-16.
  17. Verfahren zum Reduzieren der Allergenität eines Polypeptids, umfassend an ein Stammpeptid nach einem der Ansprüche 4, 7-10 koppelnde Block- oder Copolymere wie in einem der Ansprüche 1-3, 5, 6 definiert.
DE69920221T 1998-06-23 1999-06-23 Polypeptid-polymer konjugat Expired - Fee Related DE69920221T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK80998 1998-06-23
DKPA199800809 1998-06-23
PCT/DK1999/000359 WO1999067370A1 (en) 1998-06-23 1999-06-23 A polypeptide-polymer conjugate

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69920221D1 DE69920221D1 (de) 2004-10-21
DE69920221T2 true DE69920221T2 (de) 2005-09-08

Family

ID=8097828

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69920221T Expired - Fee Related DE69920221T2 (de) 1998-06-23 1999-06-23 Polypeptid-polymer konjugat

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP1088059B1 (de)
JP (1) JP2002518044A (de)
CN (1) CN1312857A (de)
AT (1) ATE276358T1 (de)
AU (1) AU768765B2 (de)
CA (1) CA2332334A1 (de)
DE (1) DE69920221T2 (de)
WO (1) WO1999067370A1 (de)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE990935A1 (en) * 1999-11-08 2002-04-03 Procter & Gamble Cosmetic Compositions
WO2008057293A2 (en) 2006-10-27 2008-05-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company Methods and compositions for prion decontamination
EP2205732A2 (de) 2007-11-01 2010-07-14 Danisco US Inc. Herstellung von thermolysin und varianten davon sowie deren verwendung in flüssigreinigungsmitteln
EP2123163A1 (de) * 2008-05-16 2009-11-25 Puratos N.V. Verfahren und Zusammensetzung für verbesserte Weichheit von Gebäck
US8796009B2 (en) * 2010-06-21 2014-08-05 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Clearcoat containing thermolysin-like protease from Bacillus stearothermophilus for cleaning of insect body stains
CN103502420B (zh) 2011-04-15 2020-02-04 诺维信公司 生产啤酒麦汁的方法
WO2013167573A1 (en) 2012-05-11 2013-11-14 Novozymes A/S A brewing method
EP2909320A1 (de) 2012-10-17 2015-08-26 Novozymes A/S Verfahren zur herstellung von brauwürze
CN119137280A (zh) 2022-05-04 2024-12-13 诺维信公司 用热稳定amg变体酿造
CA3257053A1 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE PREVENTION, TREATMENT, SUPPRESSION AND/OR ELIMINATION OF PHYTOPATHOGENIC INFESTATIONS AND INFECTIONS
JP2025528433A (ja) 2022-09-01 2025-08-28 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 熱安定性ａｍｇグルコシダーゼバリアント（ｅｃ３．２．１．３）及び乳化剤の低添加又は無添加による焼成
CA3262292A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 Novozymes A/S COOKING USING THERMOSTABLE (EC 3.2.1.3) AND LOW ADDED SUGAR AMYLOGLUCOSIDASE VARIANTS
US20260053148A1 (en) * 2022-09-08 2026-02-26 Novozymes A/S A Method for Preparing a Baked Product with Reduced Fat

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE64284B1 (en) * 1987-08-03 1995-07-26 Ddi Pharmaceuticals Conjugates of superoxide dismutase
WO1994013311A1 (en) * 1992-12-10 1994-06-23 Enzon, Inc. Glycolipid enzyme-polymer conjugates
FI972443A7 (fi) * 1994-12-07 1997-06-09 Novozymes As Polypeptidi, jonka allergeenisuus on vähentynyt
AU5893796A (en) * 1995-06-07 1996-12-30 Novo Nordisk A/S Modification of polypeptides
EP0874893A2 (de) * 1995-12-29 1998-11-04 The Procter & Gamble Company Waschmittelzusammensetzungen enthaltend immobilisierte enzyme
JP2000506119A (ja) * 1996-02-15 2000-05-23 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ ポリペプチドのコンジュゲーション

Also Published As

Publication number Publication date
ATE276358T1 (de) 2004-10-15
AU768765B2 (en) 2004-01-08
JP2002518044A (ja) 2002-06-25
DE69920221D1 (de) 2004-10-21
EP1088059A1 (de) 2001-04-04
CN1312857A (zh) 2001-09-12
CA2332334A1 (en) 1999-12-29
WO1999067370A1 (en) 1999-12-29
AU4603099A (en) 2000-01-10
EP1088059B1 (de) 2004-09-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69838551T2 (de) Modifiziertes polypeptid
AU725287B2 (en) Conjugation of polypeptides
DE69916306T2 (de) Niedrigallergene proteinvarianten
US6106828A (en) Conjugation of polypeptides
DE69936351T2 (de) Glykosylierte proteine mit reduzierter allergenität
AU697440B2 (en) Polypeptide with reduced allergenicity
AU736806B2 (en) A modified enzyme for skin care
DE69433032T2 (de) VERFLÜSSIGENDE -[alpha]-AMYLASE, VERFAHREN ZU IHRER HERSTELLUNG, UND SIE ENTHALTENDE WASCHMITTELZUSAMMENSETZUNG
DE69920221T2 (de) Polypeptid-polymer konjugat
WO1996040791A1 (en) Modification of polypeptides
DE2600514A1 (de) Zusammensetzung zum schutz keratinartigen materials
US6416756B1 (en) Modified protease having 5 to 13 covalently coupled polymeric molecules for skin care
US6638526B1 (en) Polypeptides conjugated to copolymers of ethylene oxide and propylene oxide to reduce allergenicity
AU731076B2 (en) Composition comprising polypeptide with reduced allergenicity

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee