DE69920247T2

DE69920247T2 - Veränderung der dns methyltransferase durch kombinationstherapie

Info

Publication number: DE69920247T2
Application number: DE69920247T
Authority: DE
Inventors: M. Jeffrey BESTERMAN; Robert Alan MACLEOD; M. William SIDERS
Original assignee: Methylgene Inc
Current assignee: Methylgene Inc
Priority date: 1998-10-19
Filing date: 1999-10-19
Publication date: 2005-09-29
Anticipated expiration: 2019-10-20
Also published as: WO2000023112A9; EP1123111A1; AU6519499A; JP2002528391A; WO2000023112A1; DE69920247D1; AU766084B2; ES2228119T3; CA2347003A1; ATE275956T1; EP1123111B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf die Modulierung von Genexpression, und auf die Modulierung von Genexpression bei Säugern, die durch Methylierung reguliert ist.
ZUSAMMENFASSUNG DES STANDES DER TECHNIK
Die Modulierung der Genexpression wurde lange erforscht. So sind z.B. viele Krankheiten bei Säugern mit der Über- oder Unterexpression bestimmter Gene assoziiert. Durch Modulierung der Expression des Gens, dessen aberrante Expression mit einer Krankheit assoziiert ist (oder mit einer Prädisposition zur Entwicklung einer solchen Krankheit) könnten die Krankheitssymptome gelindert werden.
Es wäre z.B. wünschenswert, das Enzym DNA-Methyltransferase (DNA MeTase) zu modulieren, welches die Methylierung von Säuger-DNA vermittelt.
Die Methylierung von Säuger-DNA wird enzymatisch durch die kovalente Modifikation der fünften Kohlenstoff-Position des Pyrimidinrings von Cytosin in CpG-Dinukleotiden vermittelt. Änderungen im Muster der DNA-Methylierung wurden mit einer Vielzahl von Vorgängen bei Eukaryoten in Verbindung gebracht. Holliday (1990), Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci 326:329-338 diskutiert die Rolle der Methylierung beim parentalen Imprinting. Antequera et al., (1989) Cell 58 : 509-517 diskutiert die Signifikanz der Methylierung bei der Regulierung der Entwickllung. Fedoroff et al., (1989) Cell 56:181-191 offenbaren, dass die Methylierung bei der Transposition beteiligt ist. Hare und Taylor (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82:7350-7354 offenbaren, dass die Methylierung auch an der DNA- Reparatur beteiligt ist. Zusätzlich bringen Gartler und Riggs (1983) Ann. Rev. Genet. 17:155-190 die Methylierung mit der Inaktivierung des X Chromosoms in Verbindung, während Bird et al., (1986) Nature 321:209-213 offenbaren, das die Methylierung auch eine wichtige Rolle bei der Organisation des Chromatins spielt.
Während durch einige Beobachtungen nahegelegt wurde, dass die DNA-Methylierung eine Rolle bei der Krebspathogenese spielt, gab es große Unstimmigkeiten über die beteiligten Mechanismen. Szyf et al. (1996) Pharmacol. Ther 70(1) :1-37offenbaren, dass Methylierungs- und Demethylierungsaktivitäten kritische Bestandteile einiger tumorigener Wachstumsformen sind. MacLeod und Szyf (1995) J Biol. Chem 270:8037-8043 offenbaren, dass der Level an DNA-Methyltransferase-Aktivität ein Knotenkontrollpunkt über das onkogene Wachstum sein könnte. Andererseits haben andere Forscher die Theorie, dass die DNA-Methyltransferase eine Schlüsselrolle bei der Onkogenese spielt, verworfen.
Ein signifikantes Hindernis bei der Untersuchung der Rolle der Methylierung liegt in dem Mangel an Verfahren, die Methylierung selbst zu modulieren. Bis heute verließen sich die meisten Untersuchungen auf 5-aza-C und/oder 5-aza-dC zur Hemmung von DNA-Methylierung durch Bildung eines stabilen Addukts mit DNA-Methyltransferase, wodurch der transiente kovalente intermediäre Komplex nachgeahmt wird, von dem man annimmt, dass er während der Methylierung gebildet wird (vgl. z.B. WU und Santi (1987) J. Biol. Chem. 262:4778-4786). Dieser Ansatz, der zwar zur Reduzierung der Aktivität von DNA-Methyltransferase und bei der Korrelation mit Hemmung von Tumorgenese wirksam ist, ist jedoch therapeutisch nicht geeignet. Leider wurde herausgefunden, dass Schwellenkonzentrationen von 5-azaC oder 5-aza-dC, die empirisch notwendig sind, die Aktivität von DNA-Methyltransferase zu hemmen, für Säuger toxisch sind (Juttermann et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:11797-11801; Laird (1997), Mol. Med. Today 3:223-229).
Kürzlich haben Szyf et al. (1995) J Biol. Chem. 267:12831-12836 eine vielversprechende Methode zur Modulierung der DNA-Methylierung unter Verwendung von Antisense-RNA, die zur mRNA von DNA-Methyltransferase komplementär ist offenbart, um die Auswirkungen von Methylierung auf Krebszellen zu untersuchen. US-PS Nr. 5,578,716 offenbart die Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden, die komplementär zum DNA-Methyltransferase-Gen sind, zur Hemmung von Genexpression. Diese Entwicklungen haben starke neue Werkzeuge zur Austestung der Rolle der Methylierung in zahlreichen zellulären Vorgängen bereitgestellt. Zusätzlich haben sie vielversprechende neue Ansätze zur Entwicklung von therapeutischen Verbindungen bereitgestellt, die Methylierungs-Level modulieren können.
Die Wirkung der Antisense-Hemmung ist aufgrund der Halbwertszeit des Enzyms DNA-Methyltransferase nicht unmittelbar. Somit kann, obwohl die Expression der DNA-Methyltransferase moduliert ist, verbleibendes Enzym weiter DNA methylieren, bis das Enzym abgebaut ist. Weiterhin kann mit Polysomen assoziierte DNA-Methyltransferase mRNA auch für einige Zeit persistieren, wodurch zusätzlich Translation zur Erzeugung zusätzlichen Enzyms ermöglicht wird. Zusätzlich legen die pharmakodynamischen Eigenschaften von Oligonunkleotiden nahe, dass niedrigere Dosen als die, die gegenwärtig verwendet werden, nützlich sein könnten (Agrawal et al., (1995) Clinical Pharmacokinetics 28:7-16; Zhang et al., (1995) Clinical Pharmacology and Therapeutics 58:44-53).
Deshalb bleibt ein Bedarf bestehen, wirksamere Verfahren zur Modulierung der Expression von Genen, wie DNA-Methyltransferase, zu entwickeln, die die erforderliche Dosis an Antisense-Oligonukleotiden, spezifischen Inhibitoren von Genprodukten, oder anderen Agenzien, die gegenwärtig verwendet werden, verringern, während sie gleichzeitig wirksam die Genexpression hemmen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die gegenwärtigen Erfinder haben sich einen Kombinationsansatz erdacht, durch den ein Gen, wie DNA-Methyltransferase (DNA MeTase) vom Säuger sowohl auf Genebene als auch auf Proteinebene gehemmt wird. Überraschenderweise hat man herausgefunden, dass dieser Kombinationsansatz die für Wirksamkeit erforderliche Dosis sowohl von Antisense-Oligonukleotiden gegen das Gen als auch von „small molecule"-Inhibitoren des Genprodukts reduziert.
Die Erfindung stellt auch verbesserte Verwendungen und Zusammensetzungen für die Modulierung von Säuger-DNA MeTase auf genetischer Ebene als auch auf Proteinebene und für die Modulierung der durch Methylierung regulierten Genexpression bei Säugern bereit. Die erfindungsgemäßen Verwendungen und Zusammensetzungen sind nützlich als analytische Werkzeuge für transgene Untersuchungen als auch als therapeutische Werkzeuge.
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung einer wirksamen synergistischen Menge eines Antisense-Oligonukleotids bereit, das die Expression eines Gens hemmt, und eine wirksame synergistische Menge eines Proteineffektors eines Produkts des Gens zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Hemmung der Expression des Gens in der Zelle.
In Ausführungsformen des ersten Aspekts der Erfindung wird die Zelle mit einer wirksamen synergistischen Menge wenigstens eines Antisense-Oligonukleotids für einen wirksamen Zeitraum in Kontakt gebracht. In bestimmten Ausführungsformen soll die Zelle mit einer wirksamen synergistischen Menge wenigstens eines Proteineffektors für einen wirksamen Zeitraum in Kontakt gebracht werden. In bestimmten Ausführungsformen werden sowohl das Antisense-Oligonukleotid als auch der Proteineffektor vor dem In Kontakt bringen mit der Zelle mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägermedium vermischt. In bestimmten Ausführungsformen werden das Antisense-Oligonukleotid und der Proteineffektor vor dem in Kontakt bringen mit der Zelle vermischt.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen des ersten Aspekts der Erfindung soll die Zelle getrennt sowohl mit dem Antisense-Oligonukleotid als auch mit dem Proteineffektor kontaktiert werden. In bestimmten Ausführungsformen soll die Zell vor dem Proteineffektor mit dem Antisense-Oligonukleotid kontaktiert werden. IN bestimmten Ausführungsformen kodiert das Gen für eine DNA-Methyltransferase und die Zelle, die vor dem Proteineffektor mit dem Antisense-Oligonukleotid kontaktiert werden soll, wird dazu induziert, Apoptose einzugehen oder wird in der S-Phase des Zellzyklus arretiert. In bestimmten Ausführungsformen soll die Zelle vor dem Antisense-Oligonukleotid mit dem Proteineffektor kontaktiert werden. IN bestimmten Ausführungsformen kodiert das Gen für eine DNA-Methyltransferase und die Zelle, die vor dem Antisense-Oligonukleotid mit dem Proteineffektor kontaktiert werden soll, wird in der G₁-Phase des Zellzyklus arretiert.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen des ersten Aspekts der Erfindung kodiert das Gen für eine DNA-Methyltransferase und die Zelle umfasst ein Gen, dessen Expression durch Methylierung inaktiviert wurde. In bestimmten Ausführungsformen wird das Gen, dessen Expression durch Methylierung inaktiviert wurde, in der kontaktierten Zelle reaktiviert. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Gen, dessen Expression durch Methylierung inaktiviert wurde, das p16^ink4 Tumorsuppressorgen.
In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines Inhibitors zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereit zur Behandlung einer Krankheit, die auf die Hemmung eines Gens reagiert. In der Verwendung gemäß diesem Aspekt der Erfindung soll eine therapeutisch wirksame synergistische Menge eines Antisense-Oligonukleotids, das die Expression eines Gens hemmt, und eine therapeutisch wirksame synergistische Menge eines Proteineffektors eines Produkt des Gens an einen Säuger, Menschen eingeschlossen, der wenigstens eine Zelle enthält, die von der Krankheit betroffen ist, verabreicht werden.
In Ausführungsformen des zweiten Aspekts der Erfindung wird dem Säuger eine therapeutisch wirksame synergistische Menge wenigstens eines Antisense-Oligonukleotids für einen therapeutisch wirksamen Zeitraum verabreicht. In bestimmten Ausführungsformen wird dem Säuger eine therapeutisch wirksame synergistische Menge wenigstens eines Proteineffektors für einen therapeutisch wirksamen Zeitraum verabreicht. In bestimmten Ausführungsformen werden sowohl das Antisense-Oligonukleotid als auch der Proteineffektor vor der Verabreichung an den Säuger mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägermedium vermischt. In bestimmten Ausführungsformen werden das Antisense-Oligonukleotid und der Proteineffektor vor dem Verabreichen an den Säuger vermischt.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen des zweiten Aspekts der Erfindung sollen das Antisense-Oligonukleotid als auch der Proteineffektor getrennt an den Säuger verabreicht werden. In bestimmten Ausführungsformen soll vor dem Proteineffektor das Antisense-Oligonukleotid an den Säuger verabreicht werden. In bestimmten Ausführungsformen kodiert das Gen für eine DNA-Methyltransferase und die Zelle, die im Säuger von der Krankheit betroffen ist, an den vor dem Proteineffektor das Antisense-Oligonukleotid verabreicht werden soll, wird dazu induziert, Apoptose einzugehen oder wird in der S-Phase des Zellzyklus arretiert. In bestimmten Ausführungsformen wird vor dem Antisense-Oligonukleotid der Proteineffektor an den Säuger verabreicht. In bestimmten Ausführungsformen kodiert das Gen für eine DNA-Methyltransferase und die Zelle, die in dem Säuger von der Krankheit betroffen ist, an den vor dem Antisense-Oligonukleotid der Proteineffektor verabreicht werden soll, wird in der G₁-Phase des Zellzyklus arretiert.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen des zweiten Aspekts der Erfindung kodiert das Gen für eine DNA-Methyltransferase und die Zelle, die von der Krankheit betroffen ist, umfasst ein Gen, dessen Expression durch Methylierung inaktiviert wurde. In bestimmten Ausführungsformen wird das Gen, dessen Expression durch Methylierung inaktiviert wurde, in der Zelle im Säuger reaktiviert, an den eine therapeutisch wirksame synergistische Menge eines Antisense-Oligonukleotids und eine therapeutisch wirksame synergistische Menge eines Proteineffektors verabreicht wurde. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Gen, dessen Expression durch Methylierung inaktiviert wurde, das p16^ink4 Tumorsuppressorgen.
In einem dritten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines Inhibitors zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereit zur Hemmung von Tumorwachstum in einem Säuger. Bei der Verwendung gemäß diesem Aspekt der Erfindung soll eine therapeutisch wirksame synergistische Menge eines Antisense-Oligonukleotids, das die Expression eines Gens hemmt, das an der Tumorentstehung beteiligt ist und eine therapeutisch wirksame synergistische Menge eines Proteineffektors des Produkts des Gens an einen Säuger, einschließlich einen Menschen verabreicht werden, der wenigstens eine neoplastische Zelle im Körper hat.
In Ausführungsformen des dritten Aspekts der Erfindung wird dem Säuger eine therapeutisch wirksame synergistische Menge von mehr als einem Antisense-Oligonukleotid für einen therapeutisch wirksamen Zeitraum verabreicht. In bestimmten Ausführungsformen wird dem Säuger eine therapeutisch wirksame synergistische Menge wenigstens eines Proteineffektors für einen therapeutisch wirksamen Zeitraum verabreicht. In bestimmten Ausführungsformen werden sowohl das Antisense-Oligonukleotid als auch der Proteineffektor vor der Verabreichung an den Säuger mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägermedium vermischt. In bestimmten Ausführungsformen werden das Antisense-Oligonukleotid und der Proteineffektor vor dem Verabreichen an den Säuger vermischt.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen des dritten Aspekts der Erfindung sollen das Antisense-Oligonukleotid als auch der Proteineffektor getrennt an den Säuger verabreicht werden. In bestimmten Ausführungsformen soll vor dem Proteineffektor das Antisense-Oligonukleotid an den Säuger verabreicht werden. In bestimmten Ausführungsformen kodiert das Gen für eine DNA-Methyltransferase und die neoplastische Zelle in dem Säuger, an den vor dem Proteineffektor das Antisense-Oligonukleotid verabreicht werden soll, wird dazu induziert, Apoptose einzugehen oder wird in der S-Phase des Zellzyklus arretiert. In bestimmten Ausführungsformen wird vor dem Antisense-Oligonukleotid der Proteineffektor an den Säuger verabreicht. In bestimmten Ausführungsformen kodiert das Gen für eine DNA-Methyltransferase und die neoplastische Zelle in dem Säuger, an den vor dem Antisense-Oligonukleotid der Proteineffektor verabreicht werden soll, wird in der G₁-Phase des Zellzyklus arretiert.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen des dritten Aspekts der Erfindung kodiert das Gen für eine DNA-Methyltransferase und die neoplastische Zelle umfasst ein Gen, dessen Expression durch Methylierung inaktiviert wurde. In bestimmten Ausführungsformen wird das Gen, dessen Expression durch Methylierung inaktiviert wurde, in der neoplastischen Zelle im Säuger reaktiviert, an den eine therapeutisch wirksame synergistische Menge eines Antisense-Oligonukleotids und eine therapeutisch wirksame synergistische Menge eines Proteineffektors verabreicht wurde. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Gen, dessen Expression durch Methylierung inaktiviert wurde, das p16^ink4 Tumorsuppressorgen.
In bestimmten Ausführungsformen der ersten drei Aspekte der Erfindung kodiert das Gen für eine DNA-Methyltransferase. In bestimmten Ausführungsformen ist der Proteineffektor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 5-aza-cytidin, 5-aza-2'-desoxycytidin, 5-fluor-2'-desoxycytidin und 5,6-dihydro-5-azacytidin.
In verschiedenen Ausführungsformen der ersten drei Aspekte der Erfindung steht das Antisense-Oligonukleotid in funktioneller Assoziation mit einem Proteineffektor. In bestimmten Ausführungsformen weist das Antisense-Oligonukleotid wenigstens eine Internukleotidverknüpfung auf, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phosphorthioat, Phosphordithioat, Alkylphosphonat, Alkylphosphonothioat, Phosphotriester, Phosphoramidat, Siloxan, Carbonat, Carboxymethylester, Acetamidat, Carbamat, Thioäther, verzweigtes Phosphoramidat, verzweigtes Methylenphosphonat, verzweigtes Phosphorthioat und Sulfon-Internukleotidverknüpfungen. In bestimmten Ausführungsformen ist das Antisense-Oligonukleotid ein chimäres Oligonukleotid umfassend einen Phosphorthioat-, Phosphodiester- oder Phosphordithioatbereich und einen Alkylphosphonat- oder Alkylphosphonothioatbereich. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Antisense-Oligonukleotid einen Ribonukleotid- oder einen 2'-O-substituierten Ribonukleotidbereich und einen Desoxyribonukleotidbereich.
In einem vierten Aspekt stellt die Erfindung einen Inhibitor eines Gens bereit, umfassend ein Antisense-Oligonukleotid, das die Expression des Gens hemmt, in funktioneller Assoziation mit einem Proteineffektor des Produkts des Gens. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist das Antisense-Oligonukleotid in funktioneller Assoziation mit zwei oder mehreren Proteineffektoren.
In bestimmten Ausführungsformen des vierten Aspekts der Erfindung kodiert das Gen für eine DNA-Methyltransferase. In bestimmten Ausführungsformen ist der Proteineffektor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 5-aza-cytidin, 5-aza-2'-desoxycytidin, 5-fluor-2'-desoxycytidin und 5,6-dihydro-5-azacytidin.
In bestimmten Ausführungsformen des vierten Aspekts der Erfindung weist das Antisense-Oligonukleotid wenigstens eine Internukleotidverknüpfung auf, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phosphorthioat, Phosphordithioat, Alkylphosphonat, Alkylphosphonothioat, Phosphotriester, Phosphoramidat, Siloxan, Carbonat, Carboxymethylester, Acetamidat, Carbamat, Thioäther, verzweigtes Phosphoramidat, verzweigtes Methylenphosphonat, verzweigtes Phosphorthioat und Sulfon-Internukleotidverknüpfungen. In bestimmten Ausführungsformen ist das Antisense-Oligonukleotid ein chimäres Oligonukleotid umfassend einen Phosphorthioat-, Phosphodiester- oder Phosphordithioatbereich und einen Alkylphosphonat- oder Alkylphosphonothioatbereich. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Antisense-Oligonukleotid einen Ribonukleotid-oder einen 2'-O-substituierten Ribonukleotidbereich und einen Desoxyribonukleotidbereich.
In einem fünften Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend einen Inhibitor eines Gens umfassend ein Antisense-Oligonukleotid, das die Expression des Gens hemmt, in funktioneller Assoziation mit einem Proteineffektor eines Produkt des Gens. In bestimmten Ausführungsformen umfasst die Zusammensetzung weiter einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
In einem sechsten Aspekt stellt die Erfindung eine Verwendung zur Untersuchung der Rolle eines Gens und/oder eines Produkts des Gens beim zellulärem Wachstum, einschließlich dem Wachstum von Tumorzellen bereit. Bei der Verwendung gemäß diesem Aspekt der Erfindung soll der interessierende Zelltyp mit einer synergistischen Menge eines Antisense-Oligonukleotids, das die Expression des Gens hemmt, und einer synergistischen Menge eines Proteineffektors eines Produkts des Gens, wie für den ersten erfindungsgemäßen Aspekt beschrieben, in Kontakt gebracht werden, was zur Hemmung der Expression des Gens in der Zelle führt. In bestimmten Ausführungsformen kodiert das Gen für das Produkt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer DNA-Methyltransferase. Die hier beschriebenen Kombinationen können zu verschiedenen Zeitpunkten im Zellzyklus, oder zusammen mit Promotoren oder Inhibitoren des Zellwachstums verabreicht werden, um die Rolle des Gens und/oder eines Produkts des Gens für das Wachstum des interessierenden Zelltyps zu bestimmen.
Die Verwendungen, Inhibitoren und Zusammensetzungen der Erfindung, die die Expression und/oder Aktivität eines Gens und/oder eines Genprodukts hemmen, können dazu verwendet werden. Patienten zu behandeln, die eine Krankheit haben, die auf die Hemmung des Gens anspricht oder eine entsprechende Prädisposition für eine Krankheit. So kann z.B. ein erfindungsgemäßer Inhibitor oder eine Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger (z.B. physiologische sterile Kochsalzlösung) über irgendeinen Verabreichungsweg an einen Patienten verabreicht werden, der an einer Krankheit leidet, die auf die Hemmung eines Gens anspricht, in einem Versuch, entstehende Krankheitssymptome zu lindern. So kann z.B. ein erfindungsgemäßer Inhibitor oder eine Zusammensetzung dazu verwendet werden, Krebssymptome in einem Krebspatienten zu lindern, eine beispielhafte, nicht beschränkende Krankheit, die auf die Hemmung von DNA-Methyltransferase anspricht.
Pharmazeutisch verträgliche Träger und deren Formulierung sind gut bekannt und werden allgemein z.B. in Remingtons Pharmaceutical Sciences (18. Ausgabe, Hrsg. A. Gennaro, Mack Publishing Co. Easton, PA, 1990) beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 22–25 werden lediglich beispielhaft gezeigt.
1: Darstellung des DNA-Methyltransferasegens (oben) und der Positionen der verschiedenen 20mer Phosphorthioat-Antisense-Oligonukleotide (dargestellt als gefüllte Kreise) auf dem Gen. Die Positionen zweier nicht-beschränkender synthetischer Oligonukleotide, MG88 und MG98 sind hervorgehoben.
2: Autoradiographien von Western Blot-Analysen; diese zeigen, dass Behandlung mit 40 nM oder 80 nM eines repräsentativen, nicht-beschränkenden Antisense-Oligonukleotids, MG88, zu einer Hemmung des in A549 und T24 Zellen exprimierten MeTase-Proteins führt.
3A: Autoradiographien einer Reihe von Immunpräzipitationen, gefolgt von Western Blot-Analysen von T24-Zelllysaten; diese zeigen, dass p16^ink4 Proteinkonzentration (oben) zunehmen, wenn die Konzentrationen von DNA MeTase Protein (unten) abnehmen, nach einer Behandlung der Zellen für 3, 5, 8 oder 10 Tage mit 40 oder 75 nM eines repräsentativen, nicht-beschränkenden Antisense-Oligonukleotids, MG88, wobei HeLa-Zellen als eine Positivkontrolle für Expression von p16^ink4-Expression dienten.
3B: graphische Darstellung der Konzentrationen des p16^ink4 Proteins, normalisiert auf eine Zellzahl von T24-Zellen, behandelt mit 40 nM oder 75 nM MG88 für 3, 5, 8 und 10 Tage.
4: Autoradiographie einer Western-Blot-Analyse von T24-Zellen, behandelt mit 40 nM oder 75 nM eines repräsentativen, nicht-beschränkenden erfindungsgemäßen Antisense-Oligonukleotids, MG88, unter Verwendung eines Antikörpers, der alle phosphorylierten Formen von Rb erkennt.
5: Autoradiographien einer Reihe von Western Blot-Analysen von T24 Zelllysaten, präpariert 3, 5 oder 7 Tage nach Abschluss einer 10-Tage Behandlung der Zellen mit Lipofectin alleine, 40 nm MG88 oder 40 nm oder 75 nM des Kontroll-Oligonukleotids MG208; diese zeigen, dass 5-7 Tage nach der Behandlung die Proteinexpression von DNA MeTase wieder eingesetzt hat und das die Expression von p16^ink4 verringert ist.
6: graphische Darstellung de Quantifizierung der DNA MeTase- und der p16^ink4-Proteinkonzentrationen in T24-Zellen während einer 10-tägigen Behandlung mit MG88 und 7 Tage (d.h., Tage 11-17) nach- Behandlungszeiträumen; diese zeigen die inverse Korrelation zwischen p16 Proteinkonzentrationen und DNA MeTase-Proteinkonzentrationen in diesem Zellen.
7: Serienphotographien der Methylierungs-spezifischen PCR (MSP) Produkte auf 2% Agarosegelen des pl6ink4 Genpromoters aus T24 Zellen, behandelt mit 40 oder 75 nm Mg88 oder MG208 für 3, 5, 8 oder 10 Tage mit PCR-Primern, die spezifisch für methyliertes p 16ink4 (M-Spuren) oder unmethyliertes p 16ink4 (U-Spuren) sind; es wird gezeigt, dass die Demethylierung von p16ink4 nur in mit MG88 behandelten Zellen auftrat, nach wenigstens 3 Tagen Behandlung.
8: Diagramm-Darstellung des p16ink4 proximalen Promoters aus T24-Zellen; die Methylierungsmuster nach 0, 3, oder 5 Tagen Behandlung der Zellen mit MG88 (links) oder Kontroll-Oligonukleotide MG208 (rechts) sind dargestellt; es zeigt sich, dass verminderte Methylierung nur mit MG88-Behandlung auftrat. Die Methylierungsmuster 3 Tage nach Behandlung sind unten auf der Abbildung dargestellt.
9A: Photographie der Ergebnisse der Bisulfit-Sequenzierung des p16ink4 Genpromoters im p 16ink4-exprimierenden Klon MG88 C4-5 30 Tage nachdem eine 5-tägige Behandlung mit 75 nM MG88 abgeschlossen wurde; es wird gezeigt, dass alle in diesem Klon ausgewerteten CpG-Stellen sogar nach 30 Tagen in Kultur nach MG88-Behandlung nicht methyliert waren.
9B: Wachstumskurve von T24-Zellen während Behandlung (Tage 0-5) und nach Behandlung (Tage 6-18) nur mit Lipofectin (Vierecke), 75 nM MG88, ein nichtbeschränkendes Antisense-Oligonukleotid der Erfindung (Kreise), oder 75 nM Kontroll-Oligonukleotid MG208 (Dreiecke); es wird der anti-proliferative Effekt von MG88 gezeigt.
9C: Wachstumskurve während der Nachbehandlung von T24-Zellklonen nach einer 5-tägigen Behandlung mit MG88 (Klon 4-5, Dreiecke), MG208 (Klon 2-4, Vierecke) oder nur mit Lipofectin (Klon 5, Diamant). Die Darstellung der beiden Autoradiographien zeigen die p 16ink4-Proteinkonzentration in jedem der Klone an den Tagen 36 und 49 nach Behandlung.
10A: Autoradiographien von Western Blot-Analysen von p12WAF1, MeTase und α-Actin-Proteinkonzentrationen in T24-Zellen, die für 24 Stunden (links) oder 48 Stunden (rechts) nur mit Lipofectin, oder 40 nM oder 75 nM MG88 oder MG208 behandelt wurden, wodurch sich zeigt, dass die Proteinexpression von p21WAF1 durch Hemmung der Expression von MeTase induziert wird.
10B: Autoradiographien von Western Blot-Analysen, die die Dosis-Reaktion von p21WAF1-Proteinkonzentrationen in T24-Zellen zeigen, die für 24 Stunden mit 20 nM, 40 nM oder 80 nM MG88 oder MG208 behandelt wurden. Die Actin-Proteinkonzentration werden als eine Kontrolle für die Proteinbeladung gezeigt.
11: Autoradiographie einer Northern Blot-Analyse von RNA aus T24-Zellen, die für 24 oder 48 Stunden mit MG88 oder MG208 behandelt wurden.
12: Autoradiographie einer Western Blot-Analyse, die die Reaktivierung von p16-Expression in T24-Zellen nach 3-tägiger Behandlung mit ansteigenden Konzentration eines repräsentativen, nicht-beschränkenden DNA MeTase Proteineffektors, 5-aza-dC, zeigt.
13: Autoradiographie einer Western Blot-Analyse, die die synergistische Reaktivierung von p16-Expression in T24-Zellen nach 3-tägiger Behandlung mit einem repräsentativen, nicht-beschränkenden synthetischem Antisense-Oligonukleotid (MG88) und/oder einem repräsentativen, nicht-beschränkenden DNA MeTase Proteineffektor (5-aza-dC) gemäß der Erfindung zeigt; die drei reihen zeigen variierende Kombinationen und Konzentrationen der repräsentativen Antisense-Oligonukleotide und der DNA MeTase-Proteineffektoren gemäß der Erfindung.
14: Autoradiographie einer Western Blot-Analyse, die die synergistische Reaktivierung von p16-Expression in T24-Zellen nach 3-tägiger Behandlung mit einem repräsentativen, nicht-beschränkenden synthetischem Antisense-Oligonukleotid (MG98) und/oder einem repräsentativen, nicht-beschränkenden DNA MeTase Proteineffektor (5-aza-dC) gemäß der Erfindung zeigt; die drei reihen zeigen variierende Kombinationen und Konzentrationen der repräsentativen Antisense-Oligonukleotide und der DNA MeTase-Proteineffektoren gemäß der Erfindung.
15: Autoradiographie einer Western Blot-Analyse, die die synergistische Reaktivierung von p16-Expression in T24-Zellen nach 3-tägiger Behandlung mit einem repräsentativen, nicht-beschränkenden synthetischem Antisense-Oligonukleotid (MG88) und/oder einem repräsentativen, nicht-beschränkenden DNA MeTase Proteineffektor (5-aza-dC) in niedrigen Konzentrationen gemäß der Erfindung zeigt; die drei Reihen zeigen variierende Kombinationen und Konzentrationen der repräsentativen Antisense-Oligonukleotide und der DNA MeTase-Proteineffektoren gemäß der Erfindung.
16: graphische Darstellung, die die Fähigkeit eines erfindungsgemäßen repräsentativen, nicht-beschränkenden synthetischen Antisense-Oligonukleotids (MG98) und eines repräsentativen, nicht-beschränkenden DNA MeTase Proteineffektors (5-aza-dC) zeigt, Krebszellwachstum von T24 menschlichem Blasenkrebs in einer synergistischen Weise zu hemmen, wodurch es zu einem erhöhten hemmenden Effekt kommt, verglichen zu dem Effekt, den man beobachtet, wenn man entweder nur die Antisense-Oligonukleotide oder nur die Protein-Effektoren verwendet.
17: graphische Darstellung, die die synergistische Hemmung von Krebszellwachstum von T24 menschlichem Blasenkrebs nach 7-tägiger Behandlung mit Lipofectin allein (erster Balken links); 1 μM eines repräsentativen, nichtbeschränkenden DNA MeTase Proteineffektors, 5-aza-dC (zweiten Balken von links); 40 nM synthetisches Kontroll-Oligonukleotid MG207 (dritter Balken von links); 40 nM eines repräsentativen, nicht-beschränkenden synthetischen MeTase Antisense-Oligonukleotids, MG98 (vierter Balken von links); MG207 plus 5-aza-dC (fünfter Balken von links); oder MG98 plus 5-aza-dC (sechster Balken von links) zeigt.
18: graphische Darstellung, die die Fähigkeit eines erfindungsgemäßen repräsentativen, nicht-beschränkenden synthetischen Antisense-Oligonukleotids (MG98) und eines repräsentativen, nicht-beschränkenden DNA MeTase Proteineffektors (5-aza-dC) zeigt, Krebszellwachstum von A549 menschlichem „nonsmall cell" Lungenkrebs in einer synergistischen Weise zu hemmen, wodurch es zu einem erhöhten hemmenden Effekt kommt, verglichen zu dem Effekt, den man beobachtet, wenn man entweder nur die Antisense-Oligonukleotide oder nur die Protein-Effektoren verwendet.
19: graphische Darstellung, die die Fähigkeit eines erfindungsgemäßen repräsentativen, nicht-beschränkenden synthetischen Antisense-Oligonukleotids (MG98) und eines repräsentativen, nicht-beschränkenden DNA MeTase Proteineffektors (5-aza-dC) zeigt, Krebszellwachstum von Colo205 menschlichem Darmkrebs in einer synergistischen Weise zu hemmen (ausgedrückt als Tumorvolumen über die Zeit), wodurch es zu einem erhöhten hemmenden Effekt kommt, verglichen zu dem Effekt, den man beobachtet, wenn man entweder nur die Antisense-Oligonukleotide oder nur die Protein-Effektoren verwendet.
20A: graphische Darstellung, die die Hemmung von Colo 205-Tumorzellwachstum in Nacktmäusen nach Behandlung der Mäuse mit Saline (Diamant); 0.5 mg/kg eines repräsentativen, nicht-beschränkenden MeTase synthetischem Oligonukleotid, MG98 (Viereck); 0.1 mg/kg eines repräsentativen, nicht-beschränkenden DNA MeTase Proteineffektor, 5-aza-dC (Dreieck); oder einer Kombination aus MG98 plus 5-aza-dC (X) zeigt.
20B: graphische Darstellung, die die Hemmung von Colo 205-Tumorzellwachstum (ausgedrückt als endgültiges Tumorvolumen) durch ein erfindungsgemäßes, nicht-beschränkendes synthetisches Antisense-Oligonukleotid (MG98) und durch einen repräsentativen, nicht-beschränkenden DNA MeTase Proteineffektor (5-aza-dC) in synergistischer Weise zeigt, was zu einem statistische erhöhten hemmenden Effekt (p<0.05), verglichen mit dem Effekt führt, den man beobachtet, wenn man entweder nur Oligonukleotid, Effektor oder Saline verwendet.
21: schematisches Diagramm einer Reihe von FACS-Histogramm-Analysen von T24-Zellen, die in verschiedenen Dosierungen mit einem erfindungsgemäßen, nicht-beschränkenden synthetischen Antisense-Oligonukleotid (MG88) und/oder einem repräsentativen, nicht-beschränkenden DNA MeTase Proteineffektor (5-aza-dC) behandelt wurden. Der obere Teil zeigt Zellen, die nach Schema A behandelt wurden, wo MG88 vor 5-aza-Dc verabreicht wurde. Der untere Teil zeigt Zellen, die nach Schema B behandelt wurden, wo 5-aza-dC vor MG88 verabreicht wurde.
22: Autoradiographie eines Western Blots, der die synergistische Hemmung von Thymidylat-Synthase-Proteinexpression in T24-Zellen zeigt, unter Verwendung der Kombination eines erfindungsgemäßen, nicht-beschränkenden synthetischen Antisense-Oligonukleotid (MG2605) und eines repräsentativen, nichtbeschränkenden TS-Proteineffektors (5-FU).
23: schematisches Diagramm einer Reihe von FACS-Histogramm-Analysen von T24-Zellen, die mit einem erfindungsgemäßen, nicht-beschränkenden synthetischen Thymidylatsynthase-Antisense-Oligonukleotid und/oder einem repräsentativen, TS Proteineffektor (5-FU) behandelt wurden. Die oberen Histogramme zeigen Zellen, die nur mit Lipofectin behandelt wurden; das zweite Histogramm zeigt Zellen, die mit 25nm Fehlpaarungs-Kontrolloligonukleotid behandelt wurden; das dritte Histogramm von oben zeigt Zellen, die mit 25 nM des TS-Antisense-Oligonukleotids, MG2605, behandelt wurden; das vierte Histogramm von oben zeigt Zellen, die mit 500 nM von 5-FU behandelt wurden und das fünfte Histogramm von oben zeigt Zellen, die mit 5-FU plus Fehlpaarungs-Oligonukleotide behandelt wurden; und das sechste Histogramm (unten) zeigt Zellen, die mit 5-FU plus TS-Antisense-Oligonukleotid MG2605 behandelt wurden.
24A: graphische Darstellung, die die Prozentsätze von T24-Zellen in der G1-Phase (graue Balken, Abschnitt M2 auf den eingefügten Histogrammen), S-Phase (schwarze Balken; Abschnitt M3 auf den eingefügten Histogrammen) und in der G2/M-Phase (weiße Balken; Abschnitt M4 auf den eingefügten Histogrammen) nach Behandlung mit 25 nM eines erfindungsgemäßen, nicht-beschränkenden synthetischen TS-Antisense-Oligonukleotid (MG2605), 25 nM des Kontroll-Oligonukleotids MG2606, 5 μM eines repräsentativen, nicht-beschränkenden TS-Proteineffektors (5-FU) oder einer Kombination aus Oligonukleotid plus 5-FU zeigt.
24B: graphische Darstellung, die Anzahl von verbleibenden T24-Zellen nach Behandlung ohne Behandlung; oder Behandlung mit 25 nM eines nichtbeschränkenden synthetischen TS-Antisense-Oligonukleotid (MG2605), 25 nM des Kontroll-Oligonukleotids MG2606, 5 μM eines repräsentativen, nichtbeschränkenden TS-Proteineffektors (5-FU) oder einer Kombination aus MG2605 oder MG2606 plus 5-FU zeigt.
25: Autoradiographie der Western Blot-Analyse, die die synergistische Induktion von p21WAF1 durch eine Kombination aus einem repräsentativen, nichtbeschränkenden, synthetischen HDAC Antisense-Oligonukleotid und einem repräsentativen, nicht-beschränkenden HDAC Proteineffektor (TSA) gemäß der Erfindung zeigt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die gegenwärtigen Erfinder haben einen Kombinationsansatz erdacht, durch den die Expression eines Gens sowohl auf genetischer Ebene als auch auf Proteinebene gehemmt wird. Überraschenderweise wurde gefunden, dass dieser Ansatz die für eine Wirksamkeit notwendige Dosis sowohl von Antisense-Oligonukleotiden gegen das Gen als auch von Protein-Effektoren gegen das Genprodukt verringert.
Die Erfindung stellt verbesserte Verwendungen, Verbindungen (z.B. Inhibitoren wie Antisense-Oligonukleotide und Proteineffektoren) und Zusammensetzungen für die Modulierung von Genexpression auf genetischer Ebene als auch auf Proteinebene bereit. Zusätzlich stellt die Erfindung, wenn das Gen DNA Methyltransferase ist (DNA MeTase), Verwendungen, Verbindungen und Zusammensetzungen zur Modulierung von Säugergen-Expression, die durch Methylierung reguliert ist, bereit. Die erfindungsgemäßen Verwendungen und Zusammensetzungen sind als analytische Werkzeuge für transgene Untersuchungen und als therapeutische Werkzeuge, einschließlich als Werkzeuge zur Gentherapie, nützlich. Die Erfindung stellt auch Verwendungen und Zusammensetzungen bereit, die an die zu behandelnden Zustände angepasst werden können, um geringere Nebenwirkungen zu erzielen. Standardwerke, die die allgemeinen Prinzipien der rekombinanten DNA-Technologie darlegen, sind Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York (1994); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989); Kaufmann et al., Hrsg., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Boca Raton (1995); McPherson, Hrsg. Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991). Die hier zitierten Patente und die wissenschaftliche Literatur, einschließlich Zugangsnummern zu GenBank Datenbank-Sequenzen, legen das Wissen des Fachmanns fest. Jeder Konflikt zwischen einer hier zitierten Referenz und der spezifischen Lehre dieser Beschreibung soll zugunsten Letzterer ausgelegt werden. Genauso soll jeder Konflikt zwischen einer im Stand der Technik verstandenen Definition eines Wort oder eines Satzes und einer Definition eines Satzes oder eines Wortes, wie spezifisch in dieser Beschreibung dargelegt, zugunsten Letzterer ausgelegt werden.
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung einer wirksamen synergistischen Menge eines Antisense-Oligonukleotids bereit, das die Expression eines Gens hemmt, und einer wirksamen synergistischen Menge eines Proteineffektors eines Produkts des Gens zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Hemmung der Expression eines Gens in einer Zelle. In bestimmten Ausführungsformen des ersten Aspekts der Erfindung soll die Zelle mit einer wirksamen synergistischen Menge wenigstens eines Antisense-Oligonukleotids und/oder wenigstens eines Proteineffektors für einen wirksamen Zeitraum in Kontakt gebracht werden.
Der hier verwendete Begriff „Protein-Effektor" bezeichnet einen aktiven Rest, der das angezeigte Protein oder Produkt eines Gens auf Proteinebene hemmen kann. Ein „DNA MeTase Protein-Effektor" oder ein „Protein-Effektor des Produkts des DNA MeTase Gens" hemmt die DNA MeTase auf Proteinebene. „Produkt eines Gens" bezeichnet ein Protein oder Polypeptide, ungeachtet von sekundären Modifikationen (z.B. Glykosylierung, Lipidierung oder Phosphorylierung), das vom Gen kodiert wird. Der Begriff Protein-Effektor umfasst somit ohne Einschränkung spezifische Enzyminhibitoren, die in der Lage sind, die Aktivität des angezeigten Proteins oder des Genprodukts zu hemmen. Ein Protein-Effektor ist ein Molekül, das die Aktivität des angezeigten Proteins in größerem Ausmaß hemmt, als es die Aktivität irgendeines nicht verwandten Proteins hemmt. Vorzugsweise hemmt ein Protein-Effektor das angezeigte Protein wenigstens 5-fach, insbesondere wenigstens 10-fach, noch bevorzugter wenigstens 50-fach und am besten wenigstens 100-fach mehr, als er irgendein nicht verwandtes Protein hemmt.
Die Begriffe „wirksame synergistische Menge" und „wirksamer Zeitraum" werden dazu verwendet, bekannte Konzentrationen des Antisense-Oligonukleotid und des Protein-Effektors zu benennen und für Zeiträume, die wirksam sind, um das gewünschte Ergebnis zu erreichen. Die wirksame synergistische Menge des Antisense-Oligonukleotids und/oder die wirksame synergistische Menge des Protein-Effektors ist/sind geringer als die Menge(n), die empirisch für notwendig gehalten werden, das Gen zu hemmen, wenn entweder das Antisense-Oligonukleotid oder der Protein-Effektor einzeln verwendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen ist der kombinierte inhibitorische Effekt des Antisense-Oligonukleotids und des Protein-Effektors gemäß der Erfindung mehr als additiv, d.h., der kombinierte hemmende Effekt ist größer als der erwartete Gesamtinhibitorische Effekt, der auf der Basis der Summe der einzelnen inhibitorischen Effekte berechnet wurde.
Die erfindungsgemäßen Antisense-Oligonukleotide sind komplementär zu einem Bereich doppelsträngiger DNA oder RNA (oder zu einem Bereich an der Intron/Exon Grenze der DNA oder RNA), die für ein Genprodukt kodiert. Für Zwecke der Erfindung beinhaltet der Begriff „Oligonukleotid" Polymere aus zwei oder mehreren Desoxyribonukleosiden, Ribonukleosiden oder 2'-O-substituierte Ribonukleosidreste, oder eine Kombination daraus. Vorzugsweise bestehen solche Oligonukleotide aus etwa 6 bis etwa 100 Nukleosidresten, bevorzugt aus etwa 8 bis etwa 50 Nukleosidresten, und insbesondere aus etwa 12 bis etwa 30 Nukleosidresten. Die Nukleosidreste können aneinander durch eine der zahlreichen bekannten Internukleosidverknüpfungen verbunden sein. Solche Internukleosidverknüpfungen umfassen ohne Beschränkung Phosphorthioat, Phosphordithioat, Alkylphosphonat, Alkylphosphonothioat, Phosphotriester, Phosphoramidat, Siloxan, Carbonat, Carboxymethylester, Acetamidat, Carbamat, Thioäther, verzweigtes Phosphoramidat, verzweigtes Methylenphosphonat, verzweigtes Phosphorthioat und Sulfon-Internukleotidverknüpfungen. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen können diese Internukleosidverknüpfungen Phosphodiester, Phosphotriester, Phosphorthioat- oder Phosphoramidatverknüpfungen sein, oder Kombinationen daraus. Der Begriff Oligonukleotid umfasst auch solche Polymere mit chemisch modifizierten Basen oder Zuckern und/oder mit zusätzlichen Substituenten, die ohne Einschränkung lipophile Gruppen, interkalierende Agenzien, Diamine und Adamantane einschließen. Für Zwecke der Erfindung bedeutet der Begriff „ 2'-O-substituiert" die Substitution der 2'-Position des Pentoserests mit einer -O-niederen Alkylgruppe, die 1-6 gesättigt oder ungesättigte Kohlenstoffatome enthält, oder mit einer -O-Aryl- oder Allylgruppe mit 2-6 Kohlenstoffatomen, wobei eine solche Alkyl-, Aryl- oder Allylgruppe unsubstituiert oder substituiert sein kann, z.B. mit Halo, Hydroxy, Trifluormethyl, Cyan, Nitro, Acyl, Acyloxy, Alkoxy, Carboxyl, Carbalkoxyl, oder Aminogruppen; oder eine solche 2'-Substitution kann mit einer Hyrdoxygruppe (zur Erzeugung eines Ribonukleosids), einer Amino- oder einer Halogruppe erfolgen, aber nicht mit einer 2'-H-Gruppe.
Besonders bevorzugte Antisense-Oligonukleotide, die in diesem Aspekt der Erfindung verwendet werden, schließen chimäre Oligonukleotide und hybride Oligonukleotide ein.
Für Erfindungszwecke bezieht sich ein „chimäres Oligonukleotid" auf ein Oligonukleotid, dass mehr als einen Typ von Internukleosidverknüpfung aufweist. Ein bevorzugtes Beispiel für solch ein chimäres Oligonukleotid ist ein chimäres Oligonukleotid, dass einen Phosphorthioat, Phosphodiester- oder Phosphordithioatbereich umfasst, der vorzugsweise von etwa 2 bis etwa 12 Nukleotide umfasst, und einen Alkylphosphonat- oder Alkylphosphonothioatbereich (vgl. z.B. Pederson et al., US-PS 5,635,377 und 5,366,878). Vorzugsweise enthalten solche chimären Oligonukleotide wenigstens drei aufeinanderfolgende Internukleosidverknüpfungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phosphodiester und Phosphorthioatverknüpfungen, oder Kombinationen daraus.
Für Erfindungszwecke bezieht sich ein „hybrides Oligonukleotid" auf ein Oligonukleotid, dass mehr als ein Typ von Nukleosid umfasst. Ein bevorzugtes Beispiel eines solchen hybriden Oligonukleotids umfasst ein Ribonukleotid oder einen 2'-O-substituierten Ribonukleotidbereich, vorzugsweise umfassend von etwa 2 bis etwa 12 2'-O-substituierte Nukleotide, und einen Desoxyribonukleotidbereich. Vorzugsweise enthält ein solches hybrides Oligonukleotid wenigstens drei aufeinanderfolgende Desoxyribonukleoside und enthält auch Ribonukleoside, 2'-O-substituierte Ribonukleoside, oder Kombinationen daraus (vgl. z.B. Metelev und Agrawal, US-PS 5,652,355).
Die genaue Nukleotidsequenz und die chemische Struktur eines in der Erfindung verwendeten Antisense-Oligonukleotid kann variiert werden, so lange das Oligonukleotid die Fähigkeit beibehält, die Expression des interessierenden Gens zu hemmen. Dies wird einfach bestimmt durch Austesten, ob das bestimmte Antisense-Oligonukleotid aktiv ist, durch Quantifizieren der mRNA, die ein Genprodukt kodiert, oder in einem Western Blot Test für das Genprodukt, oder in einem Aktivitätstest für ein enzymatisch aktives Genprodukt, oder in einem Softagar-Wachstumstest, oder in einem Reportergenkonstrukt-Test, oder in einem in vivo Tumorwachstumstest, die alle ausführlich in dieser Beschreibung oder in Ramchandani et al., (1997), Proc. Natl. Acad. Sci USA 94:684-689 beschrieben sind.
In dieser Erfindung verwendete Antisense-Oligonukleotide können leicht auf einem geeigneten festen Träger mit bekannten chemischen Ansätzen synthetisiert werden, einschließlich H-Phosphonatchemie, Phosphoramiditchemie oder einer Kombination aus H-Phosphonatchemie, Phosphoramiditchemie (d.h., H-Phosphonatchemie für einige Zyklen und Phosphoramiditchemie für andere Zyklen). Geeignete Feste Träger umfassen irgendeinen von den standardmäßigen festen Trägern, die für Festphasen-Oligonukleotidsynthese verwendet werden, wie Glas mit kontrollierter Porengröße (CPG) (vgl. z.B. Pon, R.T. (1993) Methods in Molec. Biol. 20:465-496).
In bestimmten Ausführungsformen aller Aspekte der Erfindung kann eines der Antisense-Oligonukleotide funktionell mit einem oder mit mehreren Proteineffektoren assoziiert sein. Eine bevorzugte funktionelle Kopplung ist eine hydrolysierbare Assoziation. Vorzugsweise ist die hydrolysierbare Assoziation eine kovalente Verknüpfung zwischen dem Antisense-Oligonukleotid und dem/den Protein-Effektor(en). Solch eine kovalente Verknüpfung kann vorzugsweise durch Esterased und/oder Amidasen hydrolysiert werden. Beispiele für eine solche hydrolysierbare Bindung sind in der PCT Veröffentlichung WO96/07392 gezeigt. Besonders bevorzugt sind Phosphatester.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen kann die kovalente Verknüpfung direkt zwischen dem Antisense-Oligonukleotid und dem Proteineffektor sein, um den Protein-Effektor in das Gerüst zu integrieren. Alternativ kann die kovalente Verknüpfung durch eine verlängerte Struktur erfolgen. Bindungen dieser Art können durch kovalentes Verknüpfen des Antisense-Oligonukleotids an den Protein-Effektor durch Koppeln sowohl des Antisense-Oligonukleotids als auch des Protein-Effektors an ein Trägermolekül wie ein Kohlenhydrat, ein Peptid, oder ein Lipid oder ein Glykolipid erfolgen. Andere bevorzugte funktionelle Bindungen umfassen lipophile Assoziierung, wie die Bildung eines Liposoms, das Oligonukleotid und den Protein-Effektor kovalent an ein lipophiles Molekül gekoppelt, und damit mit dem Liposom assoziiert, enthält- Solche lipophilen Moleküle umfassen ohne Einschränkung Phosphatidylcholin, Cholesterin und Phosphatidylethanolamin und synthetische Neoglykolipide, wie SyalyllacNAc-HDPE. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen kann die funktionelle Assoziierung keine physische Assoziierung sein, sondern einfach ein gleichzeitiges Vorkommen im Körper, z.B. wenn das Antisense-Oligonukleotid mit einem Liposom assoziiert ist und der Protein-Effektor mit einem anderen Liposom assoziiert ist.
Die Verwendungen und Zusammensetzung der Erfindung sind für eine Vielzahl von Zwecken nützlich. Sie können z.B. als Sonden der physiologischen Funktion eines Genprodukts verwendet werden, wobei sie dazu verwendet werden sollen, die Aktivität und/oder Expression des Genprodukts in einem experimentellen Zellkultursystem oder Tiermodell zu hemmen, um den Effekt dieser Hemmung auszuwerten. Dies wird durchgeführt, wobei ein Antisense-Oligonukleotid, das die Expression eines Gens hemmt und ein Protein-Effektor eines Genprodukts gemäß der Erfindung, an eine Zelle oder ein Tier verabreicht werden sollen, und durch Beobachten von phänotypischen Effekten. Diese erfindungsgemäße Verwendung ist vorzugsweise ein traditioneller „Gen Knockout"-Ansatzm da er einfacher durchzuführen ist, und dazu verwendet werden kann, das Gen und/oder das Genprodukt in verschiedenen ausgewählten Stadien der Entwicklung oder Differenzierung zu hemmen. Wenn das Gen z.B. für DNA MeTase kodiert, dann kann die erfindungsgemäße Verwendung als eine Sonde dienen, die Rolle der DNA-Methylierung in verschiedenen Stadien der Entwicklung zu testen.
Schließlich sind die erfindungsgemäßen Verwendungen und Zusammensetzungen auch nützlich in therapeutischen Ansätzen für menschliche Krankheiten wie benigne oder maligne Tumoren, an denen die Modulierung und/oder die Unterdrückung von Genexpression beteiligt ist. Die anti-Tumor-Verwendbarkeit von erfindungsgemäßen Antisense-Oligonukleotiden wird detailliert in dieser Beschreibung dargelegt.
Alle hier offenbarten Aspekte der Erfindung sind auf die synergistische Hemmung jedes Zielgens anwendbar. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Hemmung eines Zielgens durch die gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Hemmung des gleichen Zielgens sowohl auf Genebene (d.h., entweder DNA- oder mRNA-Ebene), und auf Proteinebene. Wie hier beispielhaft für DNA MeTAse dargestellt, sind die Verwendungen und Zusammensetzungen für eine Vielzahl von Zwecken nützlich. Die Erfindung resultiert in einem verbesserten hemmenden Effekt, wodurch die effektiven benötigten Konzentrationen von den Inhibitoren auf Genebene als auch auf Proteinebene verringert werden, die für einen gegebenen hemmenden Effekt nötig sind, verglichen mit den Konzentrationen, die notwendig sind, wenn einer der Inhibitoren einzeln verwendet wird.
Somit sind die Verwendungen und Zusammensetzungen der Erfindung in therapeutischen Ansätzen für menschliche Krankheiten nützlich, an denen die Modulation und/oder Suppression von Genexpression eines bestimmten Zielgens beteiligt ist. Besonders bevorzugte Krankheitsziele umfassen ohne Einschränkung verschiedene Arten von Krebs. Die Verwendungen und Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können auch dazu verwendet werden, ruhende Gene zu aktivieren, um fehlende Genfunktionen bereitzustellen und somit einen bestehenden Zustand zu verbessern. Die erfindungsgemäßen Verwendungen und Zusammensetzungen sind z.B. nützlich zum Herabregulieren und/oder Unterdrücken abnormer Onkogenexpression, wodurch Tumorentstehung verhindert wird.
In bestimmten Ausführungsformen werden sowohl das Antisense-Oligonukleotid als auch der Protein-Effektor vor dem Kontakt mit der Zelle mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger vermischt. In bestimmten Ausführungsformen werden das Antisense-Oligonukleotid und der Protein-Effektor vor dem Kontakt mit der Zelle vermischt.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen des ersten Aspekts der Erfindung soll die Zelle separat mit dem Antisense-Oligonukleotid und dem Protein-Effektor in Kontakt gebracht werden. So kann die Zelle z.B. vor dem Protein-Effektor mit dem Antisense-Oligonukleotid in Kontakt gebracht werden. Die Zelle kann mit einem wirksamen synergistischen Menge eines oder mehrerer erfindungsgemäßer Antisense-Oligonukleotide in Kontakt gebracht werden, gefolgt von Behandlung mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen Protein-Effektoren. Dies ist insbesondere nützlich, wenn das Gen für DNA MeTase kodiert und wo die Zelle, die kontaktiert werden soll, wünschenswerterweise Apoptose eingeht oder in der S-Phase des Zellzyklus arretiert werden soll.
In einem anderen Beispiel kann die Zelle vor dem Antisense-Oligonukleotid mit dem Protein-Effektor kontaktiert werden. Dies ist insbesondere nützlich, wenn das Gen für DNA MeTase kodiert, wobei die zu kontaktierende Zelle wünschenswerterweise in der G1-Phase des Zellzyklus arretiert wird.
Weiterhin, wenn das Gen z.B. für DNA MeTase kodiert, dann können die erfindungsgemäßen Verwendungen und Zusammensetzungen auch dazu verwendet werden, ruhende Gene zu aktivieren, um eine fehlende Genfunktion bereitzustellen und somit Krankheitssymptome zu lindern. So werden z.B. die Krankheiten β-Thalassämie und Sichelzellanämie durch die aberrante Expression des adulten β-Globingens oder eines mutierten Gens hervorgerufen. Die meisten Menschen, die an diesen Krankheiten leiden, haben normale Kopien des fötalen Gens für β-Globin. Das fötale Gen ist jedoch hypermethyliert und still. Die Aktivierung des fötalen Globingens könnte die benötigte Globinfunktion bereitstellen, und dadurch die Krankheitssymptome lindern. Zusätzlich können die erfindungsgemäßen Verwendungen und Zusammensetzungen als Gentherapiewerkzeuge dazu verwendet werden, die Expression von exogenen Sequenzen aufrechtzuerhalten, zu aktivieren und/oder zu modulieren, die ansonsten der Hemmung durch Methylierung unterliegen würde.
Daher kodiert in einer bestimmten Ausführungsform des ersten Aspekts der Erfindung das Gen für DNA MeTase. Besonders bevorzugte nicht-beschränkende Beispiele von Antisense-Oligonukleotiden, die komplementär zu Bereichen von RNA oder doppelsträngiger DNA sind, die für DNA MeTAse kodiert, die in der Verwendung gemäß der Erfindung verwendet werden, sind in Tabelle 1 dargestellt. DNA MeTase RNA (vgl. ZB Yen et al., (1992) Nucl. Acids Res. 9:2287-2291; Yoder et al., (1996) J. Biol. Chem. 271: 31092-31097; Bester et al., (1988) J. Mol. Biol. 203(4):971-983) oder doppelsträngige DNA-Bereiche umfassen ohne Einschränkung Intronsequenzen, untranslatierte 5'- und 3'-bereiche, Intron-Exon-Grenzen als auch kodierende Sequenzen des DNA MeTase Gens (siehe Ramchandani et al., (1998) Biol. Chem. 379(4-5):535-540).
Besonders bevorzugte Oligonukleotide haben Nukleotidsequenzen von etwa 13 bis etwa 35 Nukleotide, die die in Tabelle 1 gezeigten Nukleotidsequenzen einschließen. Zusätzliche besonders bevorzugte Oligonukleotide haben Nukleotidsequenzen von etwa 13 bis etwa 19 Nukleotide der in Tabelle 1 gezeigten Nukleotidsequenzen.
Tabelle 1
Ein DNA MeTase Protein-Effektor hemmt die DNA MeTase vorzugsweise wenigstens 5-fach, besonders bevorzugt wenigstens 10-fach, noch bevorzugter wenigstens 50-fach und insbesondere bevorzugt wenigstens 100-fach mehr, als er ein nicht verwandtes Protein hemmt.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der DNA MeTase Protein-Effektor ein Rest, der in der Lage ist, ein stabiles Addukt mit DNA Methyltransferase zu bilden, wodurch der transient kovalente intermediäre Komplex nachgeahmt wird, von dem man annimmt, dass er während der Methylierung gebildet wird (vgl. z.B. Wu und Santi (1987), J. Biol. Chem. 262:4778-4786). Bevorzugte Ausführungsformen von DNA MeTase Protein-Effektoren beinhalten ohne Einschränkung Nukleosidanaloga wie 5-aza-2'-desocxycytidin (5-aza-dC), 5-fluor-2'-desoxycytidin, 5-aza-Cytidin (5-aza-C) oder 5,6-dihydro-5-azacytidin oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon. Ein Verfahren zur Synthese von 5,6-Dihydro-5-Azacytidin aus 5'-aza-cytidin wird in US-PS 4,058,602 beschrieben. Zusätzliche DNA MeTase Protein-Effektoren umfassen die Inhibitoren des DNA Methyltransferase Enzym, einschließlich Haarnadelschleifenoligonukleotiden, wie beschrieben in PCT Veröffentlichung WO97/44346 (PCT Anmeldenummer PCT/IB97/00879).
IN bevorzugten Ausführungsformen aller Aspekte der Erfindung steht das Antisense-Oligonukleotid in funktioneller Assoziation mit einem Protein-Effektor. Der Begriff „funktionelle Assoziation" umfasst jede Assoziation zwischen dem Antisense-Oligonukleotid und dem Protein-Effektor, die es einem Antisense-Oligonukleotid ermöglicht, die Genexpression von DNA MeTase zu hemmen und die es dem/den Protein-Effektor(en) ermöglicht, die Enzymaktivität von DNA MeTase zu hemmen.
In bevorzugten Ausführungsformen des ersten Aspekts der Erfindung stellt die Erfindung eine Verwendung einer effektiven synergistischen Menge eines Oligonukleotids, das die Expression von DNA MeTase hemmt und einer effektiven synergistischen Menge eines DNA MeTase Protein-Effektors bereit zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Hemmung von DNA MeTase in einer Zelle.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen des ersten Aspekts der Erfindung kodiert das Gen für eine DNA MeTase und die Zelle umfasst ein Gen, dessen Expression durch Methylierung inaktiviert wurde. Somit wird die Expression des Gens in der behandelten Zelle gefördert und/oder reaktiviert. Vorzugsweise stellt die Erfindung Zusammensetzungen und Verwendungen zur Reaktivierung eines Tumorsuppressorgens bereit, das durch Methylierung in einer Zelle inaktiviert wurde, wie z.B. eine neoplastische Zelle oder einer Zelle, die dazu prädisponiert ist, neoplastisch zu werden. „Neoplastische Zelle" bedeutet eine Zelle, die ein aberrantes Zellwachstum zeigt, wie z.B. erhöhtes Zellwachstum. Eine neoplastische Zelle kann eine hyperplastische Zelle sein, eine Zelle, die in vitro eine mangelnde Kontaktinhibition des Zellwachstums zeigt, eine Tumorzelle, die in vivo nicht metastasieren kann, oder eine Krebszelle, die in vivo metastasieren kann. Jedes Wachstum von Krebszellen, sei es metastasierend oder gutartig, wird hier als ein Tumor oder Tumorwachstum bezeichnet.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen, wenn das Gen für DNA MeTase kodiert, stellt die Erfindung Verwendungen und Zusammensetzungen zur Reaktivierung eines Tumorsuppressorgens bereit, das durch Methylierung inaktiviert wurde. IN besonders bevorzugten Ausführungsformen stellet die Erfindung eine Verwendung zur Reaktivierung des p16 Tumorsuppressor-Gens bereit, das durch Methylierung inhibiert wurde.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, wenn das Gen für ein Produkt kodiert, dass nicht auf DNA MeTase beschränkt ist, werden Verwendungen und Zusammensetzungen bereitgestellt zur Modulierung von Zielonkogenen wie z.B. die mutierten Formen des RAS Onkogen-Familie, die bei etwa 75% menschlicher Pankreas-Krebserkrankungen beteiligt sind (vgl. z.B. Rodenhuis et al., (1992), Semin. Cancer Biol. 3(4):241-247; Brentnall et al., (1995) Cancer Res 55(19):4264-4267).
Zusätzlich können die gleichen Verwendungen und Zusammensetzungen auch dazu verwendet werden, eine beliebige Anzahl von Zielgenen und/oder Produkte dieser Gene zu hemmen. Folglich sind die Verwendungen und Zusammensetzungen nützlich für therapeutische Ansätze für viele menschliche Krankheiten wie Entzündung oder Asthma, wie hier beschrieben.
Demgemäss haben Oligonukleotide Nukleotidsequenzen mit etwa 15 bis etwa 26 Nukleotiden der beispielhaft in den Tabellen 2 und 3 gezeigten Nukleotidsequenzen.
Tabelle 2
Tabelle 3
In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines Inhibitors zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Krankheit bereit, die auf die Hemmung eines Gens anspricht. In dieser erfindungsgemäßen Verwendung soll ein Antisense-Oligonukleotid, das die Expression eines Gens hemmt, und eine therapeutisch wirksame synergistische Menge eines Protein-Effektors eines Produkts des Gens an einem Säuger, einschließlich an einen Menschen, verabreicht werden, der wenigstens eine Zelle aufweist, die von der Krankheit betroffen ist. Das Antisense-Oligonukleotid und er Protein-Effektor entsprechen denen, die für den ersten Aspekt der Erfindung beschrieben wurden. „Eine Krankheit, die auf die Hemmung eines Gens anspricht" ist eine Krankheit, die mit veränderter Aktivität, Konzentrationen oder Funktionen des Gens und/oder der Genprodukts assoziiert sind. Die Symptome einer solchen Krankheit werden durch die Modulierung der Aktivität des Gens oder des Genprodukts gelindert und/oder eliminiert. „Eine Zelle, die von der Krankheit betroffen ist" ist eine Zelle mit verminderter Aktivität, Konzentrationen oder Funktionen des Gens und/oder eines Produkt des Gens.
„Eine Krankheit, die auf die Hemmung von DNA MeTase anspricht, ist z.B. eine Krankheit, die mit einem veränderten Methylierungsmuster oder veränderter DNA MeTase Aktivität, Konzentrationen oder Funktionen assoziiert ist. Die Symptome einer solchen Krankheit werden durch die Modulierung von DNA MeTase Aktivität gelindert und/oder eliminiert. „Eine Zelle, die von einer Krankheit betroffen ist, die auf Hemmung von DNA MeTase anspricht" ist eine Zelle mit verändertem(n) Methylierungsmustern(n) oder veränderter DNA MeTase Aktivität, Konzentrationen oder Funktionen.
In bestimmten Ausführungsformen des zweiten Aspekts der Erfindung soll an den Säuger eine therapeutisch wirksame synergistische Menge wenigstens eines Antisense-Oligonukleotids und/oder wenigstens eines Protein-Effektors für einen therapeutisch wirksamen Zeitraum verabreicht werden.
Die Begriffe „therapeutisch wirksame synergistische Menge" und „therapeutisch wirksamer Zeitraum" werden dazu verwendet, Behandlungen in Dosierungen und Zeiträumen zu beschreiben, die wirksam sind, ein bestimmtes therapeutisches Ergebnis zu erzielen. Die therapeutisch wirksame synergistische Menge des Antisense-Oligonukleotids und/oder die therapeutisch wirksame synergistische Menge des Protein-Effektors ist/sind geringer als die Menge(n), die empirisch für notwendig gehalten werden, das Gen zu hemmen, wenn entweder das Antisense-Oligonukleotid oder der Protein-Effektor einzeln verwendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen ist der kombinierte inhibitorische Effekt des Antisense-Oligonukleotids und des Protein-Effektors gemäß der Erfindung mehr als additiv, d.h., der kombinierte hemmende Effekt ist größer als der erwartete Gesamtinhibitorische Effekt, der auf der Basis der Summe der einzelnen inhibitorischen Effekte berechnet wurde. Der Fachmann weiß, das ein solcher synergistischer Effekt, der zu einer niedrigeren wirksamen Konzentration entweder des Antisense-Oligonukleotids, des Protein-Effektors oder von beiden führt je nach zu behandelndem Organ, Gewebe, oder nach dem bestimmten Säuger oder Patienten sich deutlich unterscheiden kann. Der Fachmann weiß auch, dass die therapeutisch wirksame synergistische Menge entweder des Antisense-Oligonukleotids oder des Protein-Inhibitors durch Feineinstellung und Veränderung der Menge des anderen Bestandteils verringert oder erhöht werden kann. Die Erfindung stellt daher ein Verfahren bereit, die Verabreichung/Behandlung an die spezifischen Anforderungen des Patienten anzupassen. Wie in den folgenden Beispielen veranschaulicht, können therapeutisch wirksame Bereiche leicht bestimmt werden, z.B. auf empirische Weise, indem man mit relativ niedrigen Konzentrationen beginnt und mit schrittweisen Steigerungen mit gleichzeitiger Auswertung der Hemmung. In besonders bevorzugten Ausführungsformen soll die erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung systemisch in einer Dosierung verabreicht werden, die ausreicht, um einen Blutspiegel von Antisense- Oligonukleotid von etwa 0,01 μm bis etwa 20 μM und von Protein-Effektor von etwa 0,01 μM bis etwa 10 μM zu erreichen. In besonders bevorzugten Ausführungsformen soll die erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung systemisch in einer Dosierung verabreicht werden, die ausreicht, um einen Blutspiegel von Antisense-Oligonukleotid von etwa 0,05 μm bis etwa 15 μM und von Protein-Effektor von etwa 0,05 μM bis etwa 10 μM zu erreichen. In insbesondere bevorzugten Ausführungsformen beträgt der Blutspiegel von Antisense-Oligonukleotid von etwa 0,1 μM bis etwa 10 μM und von Protein-Effektor von etwa 0,1 μM bis etwa 7 μM. Für die lokalisierte Verabreichung können viel geringere Konzentrationen wirksam sein. Eine Gesamtdosis von Antisense-Oligonukleotid liegt vorzugsweise im Bereich von 0,1 mg bis 30 mg Oligonukleotid pro kg Körpergewicht pro Tag, während eine Gesamtdosis von Protein-Effektor im Bereich von 0,01 mg bis etwa 5 mg Protein-Effektor pro kg Körpergewicht pro Tag liegt. In bevorzugten Ausführungsformen liegt die Gesamtdosis von Antisense-Oligonukleotid vorzugsweise im Bereich von 1 mg bis 20 mg Oligonukleotid pro kg Körpergewicht pro Tag, während eine Gesamtdosis von Protein-Effektor im Bereich von 0,1 mg bis etwa 4 mg Protein-Effektor pro kg Körpergewicht pro Tag liegt. In insbesondere bevorzugten Ausführungsformen liegt die Gesamtdosis von Antisense-Oligonukleotid vorzugsweise im Bereich von 2 mg bis 10 mg Oligonukleotid pro kg Körpergewicht pro Tag, während eine Gesamtdosis von Protein-Effektor im Bereich von 0,1 mg bis etwa 1 mg Protein-Effektor pro kg Körpergewicht pro Tag liegt. In am besten bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Gesamtdosis von Antisense-Oligonukleotid 0,5 mg Oligonukleotid pro kg Körpergewicht pro Tag, während eine Gesamtdosis von Protein-Effektor im Bereich 0,1 mg Protein-Effektor pro kg Körpergewicht pro Tag beträgt.
In bestimmten Ausführungsformen werden sowohl das Antisense-Oligonukleotid als auch der Protein-Effektor vor der Verabreichung an den Säuger mit einem pharmazeutische verträglichen Träger vermischt. In bestimmten Ausführungsformen werden das Antisense-Oligonukleotid und der Protein-Effektor vor der Verabreichung an den Säuger vermischt.
Jedes erfindungsgemäße Antisense-Oligonukleotid und jeder Protein-Effektor können optional zusammen mit bekannten pharmazeutischen Trägern oder Verdünnungsmitteln formuliert werden. Pharmazeutisch verträgliche Träger und deren Formulierung sind gut beschrieben in Remingtons Pharmaceutical Sciences (18. Ausgabe, Hrsg. A. Gennaro, Mack Publishing Co. Easton, Pa, 1990). Erfindungsgemäße Formulierungen können weiterhin einen oder mehrere DNA MeTase Inhibitoren und/oder eines oder mehrere zusätzliche DNA MeTase Antisense-Oligonukleotide enthalten, oder sie können ein anderes pharmakologisch aktives Agens enthalten. Wenn ein Antisense-Oligonukleotid zusammen mit einem Protein-Effektor verabreicht werden soll, dann können beide mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger vermischt werden. Wenn das Antisense-Oligonukleotid getrennt von dem Protein-Effektor verabreicht wird, kann es mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger vermischt werden. Es ist klar dass nicht der gleiche pharmazeutisch verträglicher Träger für das Antisense-Oligonukleotid und den Protein-Effektor verwendet werden muss, wenn beide getrennt verabreicht werden. Der pharmazeutisch verträgliche Träger hängt eher von der Art der Verabreichung ab.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auf jede geeignete Weise verabreicht werden. Sie können z.B. an einem Säuger in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Exzipienten, in Einheiten-Dosierungsform gemäß herkömmlicher pharmazeutische Praxis verabreicht werden. Die Verabreichung kann beginnen, bevor ein Säuger für eine Krankheit, die auf die Hemmung eines Gens anspricht, symptomatisch wird. Wenn die Krankheit, wie z.B. Krebs, auf die Hemmung von DNA MeTase anspricht, dann kann die Verabreichung beginnen, bevor der Säuger symptomatisch ist.
Jede geeignete Art der Verabreichung kann verwendet werden, einschließlich ohne Einschränkung parenteral intravenös, intraarteriell, subkutan, sublingual, transdermal, topisch, intrapulmonal, intramuskulär, intraperitoneal, durch Inhalation, intranasal, durch Aerosol, intrerektal, intravaginal oder oral. Therapeutika können in der Form von wässrigen Lösungen oder Suspensionen vorliegen; für die orale Verabreichung können Formulierungen in Form von Tabletten oder Kapseln vorliegen, und für die intranasale Verabreichung in Form von Pudern, Nasentropfen oder Aerosolen. Die Zusammensetzungen können lokal auf den Bereich aufgetragen werden, der von einer Krankheit betroffen ist, die auf die Hemmung eines Gens anspricht. Wenn die Krankheit z.B. auf die Hemmung von DNA MeTase anspricht und Krebs ist, dann kann die Zusammensetzung direkt auf die Tumormasse aufgetragen werden. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können systemisch verabreicht werden.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen des zweiten Aspekts der Erfindung sollen das Antisense-Oligonukleotid und der Protein-Effektor getrennt an den Säuger verabreicht werden. Das Antisense-Oligonukleotid kann z.B. vor dem Protein-Effektor an den Säuger verabreicht werden. Der Säuger kann eine oder mehrere Dosierungen des Antisense-Oligos erhalten, bevor er eine oder mehrere Dosierungen des Protein-Effektors erhält. Wenn das Gen für eine DNA MeTase kodiert, dann ist dieses Verabreichungsschema besonders nützlich, wenn die von der Krankheit betroffene Zelle Apoptose eingehen soll oder in der S-Phase des Zellzyklus arretiert werden soll. Solch ein Verabreichungsschema kann nützlich sein, z.B., wenn das Gen für DNA MeTase kodiert und wenn die Krankheit eine aggressive zellproliferierende Krankheit wie metastasierender Krebs ist.
In einem anderen Beispiel kann der Protein-Effektor vor dem Antisense-Oligonukleotid an den Säuger verabreicht werden. Der Säuger kann eine oder mehrere Dosierungen des Protein-Effektors erhalten, bevor er eine oder mehrere Dosierungen des Antisense-Oligos erhält. Wenn das Gen für eine DNA MeTase kodiert, dann ist dieses Verabreichungsschema besonders nützlich, wenn die von der Krankheit betroffene Zelle G1-Phase des Zellzyklus arretiert werden soll. Solch ein Verabreichungsschema kann nützlich sein, z.B., wenn das Gen für DNA MeTase kodiert und wenn die Krankheit mit Zellen assoziiert ist, deren Wachstumsstop statt deren Tod erwünscht ist. Ein nicht-beschränkendes Beispiel für eine solche Krankheit ist die Abstoßung von Transplantaten, wobei die Immunzellen des Wirts (z.B. Leukozyten und Lymphozyten) als Reaktion auf die fremden Zellen im Transplantat proliferieren. Es wird eher der Wachstumsstop der Immunzellen des Wirts als deren Tod durch Apoptose gewünscht.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen des zweiten Aspekts der Erfindung kodiert das Gen für eine DNA MeTase und die durch die Krankheit betroffene Zelle umfasst ein Gen, dessen Expression durch Methylierung inaktiviert wurde. In bestimmten Ausführungsformen wird die Expression des Gens in der Zelle eines Säuger gefördert, wiederhergestellt und/oder reaktiviert, an den eine therapeutisch wirksame synergistische Menge eines Antisense-Oligonukleotid und eine therapeutisch wirksame synergistische Menge eines Protein-Effektors verabreicht wurde. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Gen das p16^ink4 Tumorsuppressorgen.
In bestimmten Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung kodiert das Gen für eine DNA Methyltransferase. In bestimmten Ausführungsformen ist der Protein-Effektor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 5-aza-cytidin, 5-aza-2'-desoxycytidin, 5-fluor-2'-desoxycytidin und 5,6-dihydro-5-azacytidin.
In einem dritten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines Inhibitors zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Hemmung von Tumorwachstum in einem Säuger bereit. In der Verwendung gemäß diesem erfindungsgemäßen Aspekt soll eine therapeutisch wirksame synergistische Menge eines Antisense-Oligonukleotid, dass die Expression eines Gens hemmt, dass an Tumorgenese beteiligt ist, und eine therapeutisch wirksame synergistische Menge eines Protein-Effektors eines Genprodukts an einen Säuger verabreicht werden, einschließlich eines Menschen, der wenigstens eine neoplastische Zelle im Körper hat. Der hier verwendete Ausdruck „ein Gen, das an Tumorgenese beteiligt ist" bezeichnet ein Gen, dessen aberrante Expression mit Tumorentstehung assoziiert ist. Beispielhafte Gene, die an der Tumorentstehung beteiligt sind, schließen das Gen ein, das für DNA Methyltransferase kodiert. „Tumorgenese" bezeichnet die genetischen und phänotypischen Effekte, die an der Entwicklung einer normalen Zelle in eine neoplastische Zelle beteiligt sind. Das Antisense-Oligonukleotid und der Protein-Effektor entsprechen denjenigen, die für den ersten Aspekt der Erfindung beschrieben wurden. Die Verabreichung und die Dosierungen entsprechen denen, die für den zweiten Aspekt der Erfindung beschrieben wurden.
Das Gen kodiert für eine DNA Methyltransferase. IN bestimmten Ausführungsformen ist der Protein-Effektor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 5-aza-cytidin, 5-aza-2'-desoxycytidin, 5-fluor-2'-desoxycytidin und 5,6-dihydro-5-azacytidin.
In Ausführungsformen des dritten Aspekts der Erfindung soll an den Säuger eine therapeutisch wirksame synergistische Menge wenigstens eines Antisense-Oligonukleotid und/oder wenigstens eines Protein-Effektors für einen therapeutisch wirksamen Zeitraum verabreicht werden. Die Begriffe „therapeutisch wirksame synergistische Menge" und „therapeutisch wirksamer Zeitraum" entsprechen denen für den zweiten Aspekt der Erfindung. In bestimmten Ausführungsformen des dritten Aspekts werden sowohl das Antisense-Oligonukleotid als auch der Protein-Effektor vor der Verabreichung an den Säuger mit einem pharmazeutische verträglichen Träger vermischt. In bestimmten Ausführungsformen werden das Antisense-Oligonukleotid und der Protein-Effektor vor der Verabreichung an den Säuger vermischt.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen des dritten Aspekts der Erfindung sollen das Antisense-Oligonukleotid und der Protein-Effektor getrennt an den Säuger verabreicht werden. Das Antisense-Oligonukleotid kann z.B. vor dem Protein-Effektor an den Säuger verabreicht werden. Dies ist wünschenswert, wenn das Gen für eine DNA MeTase kodiert, und wenn neoplastische Zelle im Säuger Apoptose eingehen soll oder in der S-Phase des Zellzyklus arretiert werden soll. Solch ein Verabreichungsschema ist besonders nützlich z.B. bei der Behandlung eines aggressiven, metastasierenden Tumors wie Melanom.
Alternativ dazu kann der Protein-Effektor vor dem Antisense-Oligonukleotid an den Säuger verabreicht werden. Dieses Schema ist wünschenswert, wenn das Gen für eine DNA MeTase kodiert, und wenn neoplastische Zelle im Säuger in der G1-Phase des Zellzyklus arretiert werden soll. Solch ein Verabreichungsschema ist besonders nützlich z.B., bei der Behandlung von langsamer wachsenden Tumoren (z.B. Prostatakrebs), oder in der Behandlung von schwachen Patienten, in denen die Anwesenheit von apoptotischen Zellen nicht wünschenswert ist.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen des dritten Aspekts der Erfindung, wenn das Gen für eine DNA MeTase kodiert, umfasst die neoplastische Zelle weiter ein Gen, dessen Expression durch Methylierung inaktiviert wurde. In bestimmten Ausführungsformen wird die Expression des Gens in der neoplastischen Zelle eines Säuger gefördert, wiederhergestellt und/oder reaktiviert, an den eine therapeutisch wirksame synergistische Menge eines Antisense-Oligonukleotid und eine therapeutisch wirksame synergistische Menge eines Protein-Effektors verabreicht wurde. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Gen das p16ink4 Tumorsuppressorgen.
In einem vierten Aspekt stellt die Erfindung einen Inhibitor eines Gens bereit, umfassend ein Antisense-Oligonukleotid, das die Expression eines Gens hemmt in funktioneller Assoziation mit einem Protein-Effektor eines Produkts des Gens. In bestimmten Ausführungsformen des Aspekts der Erfindung ist das Antisense-Oligonukleotid in funktioneller Assoziation mit zwei oder mehreren Protein-Effektoren.
Das Antisense-Oligonukleotid und der Protein-Effektor dieses Aspekts der Erfindung entsprechen denen, die im ersten Aspekt der Erfindung beschrieben wurden.
In besonderen Ausführungsformen des vierten Aspekts der Erfindung, kodiert das Gen für eine DNA Methyltransferase. In bestimmten Ausführungsformen ist der Protein-Effektor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 5-aza-cytidin, 5-aza-2'-desoxycytidin, 5-fluor-2'-desoxycytidin und 5,6-dihydro-5-azacytidin.
In einem fünften Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend einen Inhibitor eines Gens umfassend ein Antisense-Oligonukleotid in funktioneller Assoziation mit einem Protein-Effektor. In bestimmten Ausführungsformen umfasst die Zusammensetzung weiter einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
In einem sechsten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines Inhibitors zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Untersuchung der Rolle eines Gens und/oder eines Genprodukts dieses Gens beim zellulären Wachstum bereit, einschließlich des Wachstums von Tumorzellen. In der Verwendung gemäß diesem Aspekt soll der interessierende Zelltyp (z.B. eine neoplastische Zelle) mit einer synergistischen Menge eines Antisense-Oligonukleotid in Kontakt gebracht werden, die die Expression des Gens hemmt und mit einer synergistischen Menge eines Protein-Effektors des Produkts des Gens, wie beschrieben für den ersten Aspekt der Erfindung, was zur Hemmung der Expression des Gens in der Zelle führt. Die hier beschriebenen Kombinationen können zu verschiedenen Zeitpunkten während des Zellzyklus verabreicht werden (z.B., G1-Phase, S-Phase oder G2/M-Phase), oder zusammen mit Promotoren oder Inhibitoren des Zellwachstums, um die Rolle des Gens (z.B. des Gens, das für DNA MeTase kodiert) für das Wachstum des interessierenden Zelltyps zu bestimmen. In bestimmten Ausführungsformen ist die Zelle eine neoplastische Zelle.
Die folgenden Beispiele sollen bestimmte bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung weiter veranschaulichen und nicht beschränken. Der Fachmann kann mit Routine-Experimenten zahlreiche Äquivalente der hier beschriebenen spezifischen Substanzen und Verfahren bestimmen. Solche Äquivalente sind vom Umfang dieser Erfindung umfasst und durch die folgenden Ansprüche gedeckt. Beispiele 8-10 dienen lediglich der Veranschaulichung.
BEISPIEL 1
Auswahl von Antisense-Oligonukleotiden, die in neoplastischen Zellen die Expression von MeTase hemmen können
Zur Identifizierung von Antisense-Desoxynukleotiden, die Expression von DNA MeTase in menschlichen neoplastischen Zellen hemmen können, wurden 85 Phosphorthioat-Oligodesoxynukleotiden (jeweils 20 Basenpaare lang), die Sequenzen aufweisen, die zu den 5' und 3' Regionen menschlicher DNA MeTase mRNA und Sequenzen, die zur Intron/Exon-Übergängen komplementär sind, synthetisiert und auf Antisense-Aktivität untersucht. Wie in 1 gezeigt, wurden zwei DNA MeTase-mRNa-Bereiche als hoch sensitiv gegen Antisense-Hemmung identifiziert, wenn sie mit MG88 mit der Sequenz 5'-AAG CAT GAG CAC CGT TCU CC-3' (SEQ ID NO:48) (dieses Oligonukleotid ist auf die DNA MeTase mRNA 5'-UTR an den Nukleotiden 532-513) gerichtet) und mit MG98 mit der Sequenz 5'-UUC ATG TCA GCC AAG GCC AC-3' (SEQ ID NO:49) (dieses Oligonukleotid ist auf die DNA MeTase mRNA 3'-UTR an den Nukleotiden 5218-5199 gerichtet) in Kontakt gebracht wurden. Diese Oligonukleotide waren chemisch wie folgt modifiziert: A entspricht 2'-Desoxyriboadenosin; C entspricht 2'-Desoxyribocytidin; G entspricht 2'-Desocyruboguanosin; T entspricht 2'-Desoxyribothymidin; A entspricht Riboadenosin; U entspricht Uridin; C entspricht Ribocytidin; und G entspricht Riboguanosin. Die unterstrichenen Basen waren 2'-Methoxyribose-substituierte Nukleotide. Nicht-unterstrichene Basen zeigen Desoxyribosenukleoside an. Das Gerüst jedes Oligonukleotids bestand aus einer Phosphorthioatverknüpfung zwischen aufeinanderfolgenden Nukleotiden. MG88 und MG98 haben iC50 Werte von 40 nM und 45 nM für die Hemmung von DNA MeTase mRNA.
MG88 wurde danach auf die Fähigkeit getestet, DNA MeTase mRNA in zwei menschlichen neoplastischen Zellen, A549 (menschliche „non small" Lungenkarzinomzellen) und T24 (menschliche Blasenkrebszellen) zu hemmen. Die Zellen wurden nur mit Lipofectin transfiziert (6,25 μg/ml), oder mit Lipofectin plus 20, 40 oder 80 nM von MG88 oder Kontrolloligo MG208 mit der Sequenz 5'-AAC GAT CAG GAC CCT TGU CC-3' (SEQ ID NO:4). Mg 208 war wie folgt modifziert: A entspricht 2'-Desoxyriboadenosin; C entspricht 2'-Desoxyribocytidin; G entspricht 2'-Desocyruboguanosin; T entspricht 2'-Desoxyribothymidin; A entspricht Riboadenosin; U entspricht Uridin; C entspricht Ribocytidin; und G entspricht Riboguanosin. Die unterstrichenen Basen waren 2'-Methoxyribose-substituierte Nukleotide. Nicht-unterstrichene Basen zeigen Desoxyribosenukleoside an. Das Gerüst von MG208 bestand aus einer Phosphorthioatverknüpfung zwischen aufeinanderfolgenden Nukleotiden.
MG88 und Mg208 wurden ausgehend von einer 0,1 mM Vorratslösung im Transfektionsmedium auf die erwünschten Konzentrationen verdünnt. Die Zellen wurden mit Oligonukleotid plus Lipofectin (oder mit Lipofectin) allein für 4 Stunden am Tag 0 und für vier Stunden am Tag 1 behandelt ( nach jeder 4-stündigen Behandlung wurden die Zellen in Vollmedium zurücktransferiert). Am Tag 2 (d.h., 48 Stunden nach der ersten Behandlung am Tag 0) wurden die Zellen geerntet, Gesamt-Zelllysate wurden präpariert, und die DNA MeTase-Proteinkonzentrationen wurden durch Western Blot mit einem DNA MeTase-spezifischen Kaninchenpolyklonalen Antikörper analysiert (Antikörper wurde gemäß Standardverfahren eines Glutathion S-Transferase-Proteins, das die ersten 10 kDa vom Aminoterminus von DNA Methyltransferase Protein enthielt, erzeugt). Wie in 2 gezeigt, erzeugte die Behandlung mit MG88, aber nicht mit der Kontrolle MG208 eine Dosis-abhängige Reduktion der Proteinkonzentration von DNA MeTAse. Gleichmäßige Beladung aller Spuren wurde durch Blotting auf α-Actin Proteinkonzentrationen mit einem Actin-spezifischen Kaninchen-polyklonalen Antikörper bestimmt (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA).
BEISPIEL 2
Hemmung des Tumorsuppressors p16 durch „Targeting" der DNA MeTase
Der Cyklin-abhängige Kinase-Inhibitor (CDKI) p16^ink4A reguliert den Übergang von der G1 in die S-Phase des Zellzyklus (Serrano et aL., (1993), Nature 366:704-707). Die Inaktivierung von p16ink4 ist eine der am häufigsten beobachteten Abnormalitäten bei menschlichen Krebserkrankungen (Serrano et aL., supra). Die transkriptionelle Inaktivierung und die assoziierte Hypermethylierung des Promoterbereichs von p16^ink4A wurden in nahezu allen Arten von Krebs beobachtet (Gonzales-Zulueta et al., (1995) Cancer Res 55:4531-4535; Merlo et al., (1995) Nat. Med. 7:686-692; Costello et al., (1996) Cancer Res56:2405-2410; Lo et al., Cancer Res. 56:2721-2725). Zur Untersuchung des Effekts der spezifischen Verminderung der zellulären Konzentrationen an DNA MeTase auf die Expression und den Methylierungsstatus eines ruhenden p16^ink4A Gens, wurden T24 Zellen, die ein hypermethyliertes und ruhendes p16^ink4A Gen enthalten, mit 40 nM oder 75 nM MG88 oder Kontroll-Oligonukleotid MG208 mit 6,25 μg/ml Lipofectin für 4 Stunden jeden Tag bis zu 10 aufeinanderfolgenden Tagen transfiziert. An den Tagen 3, 5, 8 und 10 wurden die Proteinkonzentrationen von p16^ink4 durch Immunpräzipitation, gefolgt von Western Blot mit einem für p16^ink4 spezifischen Antikörper (PharminGen) analysiert. HeLa-Zellen wurden als eine positive (+) Kontrolle für die Expression von p16ink4 Protein verwendet.
Wie in 3A gezeigt, wurde die Expression von p16ink4 Protein nach 5 Tagen Behandlung mit entweder 40 nM oder 75 nM MG88, aber nicht nach Behandlung mit MG208 nachgewiesen. Da MG88 einen antiproliferativen Effekt hat, wurden die Konzentrationen von pl6ink4A auf die Zellzahl normalisiert (3B). Somit war die Induktion von p16ink4A Protein durch MG88 sowohl Dosis-Abhängig als auch Zeit-Abhängig. P16ink4A wurde nicht in Zellen nachgewiesen, die entweder mit 40 nM oder 75 nM der Fehlpaarungskontrolle MG208 oder mit Lipofectin allein behandelt wurden (3A).
Weiterhin führte die Reaktivierung von p16^ink4A Proteinexpression durch MG208 auch zur Akkumulation von hypophosphoryliertem Rn und zur Hemmung der Zellproliferation. P16ink4A reguliert den Fortschritt durch die G1-Phase des Zellzyklus durch Hemmung der Cyklin-abhängigen Kinase CDK4-vermittelten Phosphorylierung von pRB, so dass die hypophosphorylierte Form von Rb mit einem Wachstumsstop an G1/G0 assoziiert ist (Serrano et al., supra). Die Zelllysate von T24-Zellen, die dazu reaktiviert wurden, p16ink4A zu exprimieren nach der Transfektion mit MG88 wurden durch Western Blot auf phosphorytiertes Rb untersucht und zeigten einen Rückgang der Menge an phosphorylierten Formen von Rb„ wodurch der relative Überschuss der hypophosphorylierten Formen an Rb zunahm (4). Diese Ergebnisse zeigen, dass die hohen Konzentrationen von DNA MeTase in T24-Zellen die Genexpression von P16^ink4A aktiv unterdrücken und dass die Wiedereinsetzung der Expression von p16^ink4A stromabwärts liegende molekulare Ziele, wie pRb reguliert.
Als nächstes wurden zur Bestimmung, ob eine de novo Methylierung und ein Silencing des re-exprimierten p16^ink4A Gens auftraten, wenn die DNA MeTase auf normale Konzentrationen zurückkehrten, T24-Zellen an 10 aufeinanderfolgenden Tagen entweder mit 40 oder 75 nM MG88 oder MG208 transfiziert. Da die Transfektion der Zellen mit 75 nM MG88 einen signifikanten antiproliferativen und Zelltod-induzierenden Effekt hatte, wurden nur Zellen, die mit der niedrigeren Dosis (40 nM) von MG88 behandelt wurden, für den Rest des Experiments verwendet. Die Zelllysate der T24-Zellen, die für 10 Tage transfiziert wurden, wurden durch Western Blot auf die Expression des DNA MeTase-Proteins, p16^ink4A Proteins und des Aktin-Proteins (als Kontrolle für gleichmäßige Beladung) 3, 5, und 7 Tage nach der Transfektion mit MG88 untersucht. Wie in 5 gezeigt stiegen die Proteinkonzentrationen von DNA MeTase in Abwesenheit von MG88 an und kehrten zwischen den Tagen 5-7 (Mitte) auf Kontrollwerte zurück. Die Konzentration des p16^ink4A Proteins nahm während des Zeitraums nach der Behandlung konstant ab, bis er 7 Tage nach der Behandlung kaum mehr nachweisbar war (5, oben). 6 zeigt das inverse Verhältnis zwischen den Konzentrationen von DNA MeTase und p16^ink4A Protein während und nach der Behandlung mit MG88. Interessanterweise begann der Verlust der Expression des p16^ink4A Proteins am Tag 14, nachdem die Konzentrationen von DNA MeTase auf nahezu Kontrollwerte zurückgekehrt waren. Diese Verzögerung legt nahe, dass erhöhte Spiegel von DNA MeTase über mehrere Runden der Replikation erforderlich sind, um zu methylieren und die Genexpression von p16^ink4A zu inaktivieren. Das die Inaktivierung und die de novo Methylierung von p16^ink4A mit den erhöhten Konzentrationen von DNA MeTase (Dnmt1) zusammenfallen legt nahe, dass sie selbst zur de novo Methylierungsaktivität beiträgt.
Zur Identifizierung von Veränderungen im Methylierungsstatus des p16^ink4A Promotors, die durch die MG88 Behandlung induziert sind, wurde eine methylierungsspezifische PCR (MSP) und eine Bisulfit-genomische Sequenzierung wie früher beschrieben durchgeführt (Caldas et al., (1994) Nat Gen 8: 27-32; Frommer et al., (1991) Proc Natl Acad Sci USA 89:1827-2831). MSP des pl6ink4A Promoters wurde an T24-Zellen durchgeführt, de mit 40 μM oder 75 μM Mg88 oder MG208 für 3, 5, 9 oder 10 Tage behandelt wurden. Das Oncor p16 Nachweissystem wurde verwendet (Oncor, Gaithersburg, MD). Die PCR wurde in einem Gesamtvolumen von 25 μl unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 100 ng Bisulfat-behandelte DNA (Oncor), 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 nM KCl, 1m5 mM MgCl2, 250 μM dNTPs, 80 ng jedes der folgenden Primer (5'-GTAGGTGGGGAGGAGTTTAGTTT-3' sense (SEQ ID NO:79) und 5'-TCTAATAACCAACCAACCCCTAA-3' Antisense (SEQ ID NO.80)) und 1 Einheit AmpliTaq Gold (Perkin-Elmer). Der Denaturierungszyklus war bei 95°C für 12 Minuten, gefolgt von 35 Zyklen bei 95°C für 45 Sekunden, 60°C für 45 Sekunden und 72°C für 60 Sekunden, und einem Verlängerungszyklus von 72°C für 10 Minuten. Das PCR-Produkt (5μl) wurde auf einem 2% Agarosegel analysiert. Die unmethylierten (U) und demethylierten (D) Primer (von Oncor erhältlich) wurden bei den gleichen Bedingungen wie die spezifischen Primer verwendet. PCR-Produkte wurden in PCR2.1 (erhältlich von Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert und sequenziert, um die Demethylierung von CpG-Stellen im proximalen p16 Promoter zu bestimmen.
Wie in 7 gezeigt, zeigte die MSP-Analyse mit PCR-Primern, die spezifisch für methyliertes p16^ink4A (M) oder unmethyliertes p16^ink4A (U) sind, dass die Demethylierung des Promoterbereichs von p16^ink4A bereits am Tag 3 der Behandlung mit MG88 auftrat. Die Behandlung mit MG208 oder mit Lipofektin allein hatte keine Auswirkungen auf die Methylierung des P16ink4A Gens (7) 8 zeigt, dass durch die genomische Sequenzierung mit Bisulfit am den Tagen 0, 3, 5 der Behandlung mit MG88 oder MG208 15 CpG-Stellen innerhalb des p 16ink4A Promoters als in unbehandelten T-24 Zellen als methyliert gefunden wurden. Die Hemmung von DNA MeTase durch mG88 führte zur Demethylierung von 5 von 15 CpG-Stellen am Tag 3 und Demethylierung an allen 15 Stellen am Tage 5 der Behandlung, wobei die Behandlung mit der Kontrolle MG208 keine Auswirkungen auf den Methylierungsstatus von p16^ink4A hatte (8). Drei Tage, nachdem die Behandlung mit MG88 abgesetzt wurde, zeigte der p16ink4A Promoter eine signifikante Re-Methylierung von 13 von 15 Stellen, was entweder eine de novo Methylierung dieser Stellen zeigt oder eine schnelle Expansion einer weniger betroffenen Population (8, unten).
Zur Untersuchung des Effekts von spezifischer Hemmung der DNA MeTase auf das Zellwachstum, wurden zelluläre Proliferationsraten während der Behandlung und während des Zeitraums nach der Behandlung überwacht, um die Dauer des Effekts zu bestimmen. T24-Zellen wurden für 0-5 Tage nur mit Lipofektin, 75 nM MG88 oder 75 nM MG208 behandelt. Während und nach der Behandlung wurden die Zellen gezählt. Wie man in 9B sehen kann hemmte während des Verlaufs der Behandlung MG88 die Zellproliferation dramatisch, während die Behandlung der Zellen mit der Kontrolle MG208 nur eine minimale Wachstumshemmung verglichen mit Lipofektin-behandelten Zellen hatte. Die Hemmung der Zellproliferation persistierte für etwa 1 Woche nach der Behandlung, übereinstimmend mit der Erkenntnis, dass die Expression von p16^ink4A bis zum Tage 7 nach der letzten Dosis von MG88 (siehe 5 und 6) aufrechterhalten wurde. Zur Bestimmung, ob die transiente Re-Expression von p16^ink4A und die wachstumshemmenden Effekte, die durch die Kurzzeit-Behandlung mit MG88 induziert wurden, auf die Expansion einer weniger betroffenen (weniger demethylierten) Population von Zellen innerhalb der behandelten Population von Zellen, oder auf eine schnelle Inaktivierung von p16^ink4A nach Entzug von MG88 zurückzuführen waren, wurden Einzelzellklone nach der Behandlung isoliert. Einige MG88-Klone waren tatsächlich negativ für p16^ink4A, was bestätigt, dass die Behandlung mit MG88 eine gemischte Population aus p16^ink4A positiven und -negativen Zellen erzeugte. Die Methylierungsanalyse durch Bisulfitsequenzierung des p16^ink4A Promoters eines der MG88-positiven Klone, Klon 4-5, 30 Tage nach der Behandlung mit einer 5-tägigen Behandlung mit MG88 zeigte, dass der Promoterbereich von p16^ink4A an allen untersuchten CpG-Stellen (9A) unmethyliert war, was zeigt, dass auch eine Kurzzeit-Hemmung der DNA MeTase durch MG88 eine verlängerte Re-Expression eines ruhenden Tumorsuppressorgens induzieren konnte. Wie in den 9B und 9C gezeigt, wuchs der Klon MG88 C4-5 anfänglich nach einer 5-tägigen Behandlung mit MG88 langsam, verglichen mit dem Lipofectin Klon C-5 (behandelt für 5 Tage mit Lipofectin) und MG208 C2-4 (behandelt für 5 Tage mit MG208); zwischen den Tagen 40 und 45 nach der Behandlung stieg die Wachstumsrate von MG88 C4-5-Zellen jedoch dramatisch an (9C). Die Bestimmung der p16^ink4A Proteinkonzentrationen in MG88 C4-5 Zellen zeigte eine signifikante Abnahme am Tag 49 (9C, eingesetzte Western Blot Analyse). Der Verlust an Expression von p16^ink4A nach verlängerter Kultivierung in Abwesenheit von MG88-Behandlung legt nahe, dass die DNA MeTase (von der man annimmt, dass sie für die Aufrechterhaltung der DNA MeTase Aktivität kodiert) eine de novo Methyltransferase Aktivität haben könnet und dass sie über die Zeit zuvor unmethylierte aktiv exprimierende Gene methylieren und inaktivieren kann.
BEISPIEL 3
Hemmung von DNA MeTase induziert schnell p21^WAF1
Ein weiteres Mitglied der Familie von Cyklin-abhängigen Kinase-Inhibitoren (CDKI), p21^WAF1 hemmt eine große Gruppe von Cyklin/CDK-Komplexen, die am Übergang von der G1 in die S-Phase beteiligt sind (Tam et al., (1994) Cancer Res 54:5816-5820; Baghdassarian und French (1996) Hematol. Cell Ther. 88:313-323; Gotz et al., (1996) Oncogene 13_391-398). Zur Untersuchung, ob die Konzentrationen von DNA MeTase und p21^WAF1 Protein durch einen regulatorischen Signalweg gekoppelt sind, wurden die Proteinkonzentrationen von p21^WAF1 in T24-Zellen gemessen, in denen die Konzentrationen von DNA MeTase schrittweise durch Behandlung mit MG88 reduziert wurden. Um dies auszuführen wurden die Proteinkonzentrationen von DNA MeTase, p21^Waf1 und α-Actin durch Western Blot in T24-Zellen gemessen, die entweder für 24 Stunden (d.h., eine 4-stündige Transfektionszeit) oder 48 Stunden (d.h., zwei 5-stündige Transfektionen, getrennt durch 24 Stunden) mit entweder 40 nM oder 75 nM von MG88 oder MG208 behandelt wurden. Wie in 10A gezeigt, nahm p21^WAF1 direkt mit der Abnahme der DNA MeTase zu, während weder Lipofectin noch MG208 einen Effekt entweder auf die Konzentrationen von DNA MeTase oder p21^WAF1 hatten.
T24-Zellen wurden ebenfalls für 24 Stunden (d.h. 4 Stunden Transfektion) nur mit Lipofectin behandelt, oder Lipofectin plus 20, 40 oder 80 nM von MG88 oder MG208. Nach der Behandlung wurden Zelllysate präpariert und mit einem α-Actinspezifischen Antikörper oder p21-spezifischen Antikörper durch Western Blot analysiert. Wie in 10B gezeigt, induzierte die Hemmung von DNA MeTase p21WAF1 in einer dosis-abhängigen Weise bereits 24 Stunden nach der Behandlung mit MG88, übereinstimmend mit der Rolle von p21^WAF1 bei dem antiproliferativen Effekt, den man mit der MG88 Behandlung beobachtet hat (siehe z.B. 3B und 9B).
Als nächstes wurde, um zu bestimmen ob p21^WAF1 auf transkriptioneller Ebene induziert wurde, ein RNase-Schutzassay an Zellen durchgeführt, die mit 40 nM von entweder MG88 oder MG208 für entweder 24 oder 48 Stunden behandelt wurden. Gesamt-zelluläre RNA wurde aus den Zellen isoliert und auf p21 mRNA, p27 mRNA und p18 mRNA mit dem menschlichen Zellzyklus-2 (hcc-2) Multisonden RNase-Schutzkit von PharMingen, San Diego, CA) analysiert. Die RNA-Beladung wurde mit dem Signal von zwei Haushaltsgenen, L32 und GAPDH, als gleich bestimmt- Wie in 11 gezeigt, wurde als Reaktion auf Behandlung mit MG88 keine Zunahme an p21^WAF1 mRNA beobachtet, was nahe legt, dass ein posttranslationelle Regulierung des p21^WAF1 Proteins beteiligt ist.
Dieses Beispiel zeigt, dass ein funktioneller Antagonismus zwischen DNA MeTase und p21^WAF1 auf die zelluläre Proliferation existiert. Somit können hohe Konzentrationen von DNA MeTase, die man in transformierten Zellen findet, die Proliferation durch Verminderung zellulärer p21^WAF1 Proteinkonzentrationen regulieren. Hohe Konzentrationen von DNA MeTase in transformierten Zellen können auch direkt um das stromabwärts gelegene Ziel PCDNA konkurrieren, da die menschliche DNA MeTase mit p21^Waf1 um Bindung an PCNA konkurrieren kann (Chuang et al., (1997) Science 277:1996-2000).
BEISPIEL 4
Synergistische Reaktivierung des Tumorsuppressors p 16
Der Zweck dieses Beispiels besteht darin, die Fähigkeit der Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung zu veranschaulichen, die Expression von Genen wiederherzustellen, die durch Methylierung inaktiviert wurden, wie z.B. der hier veranschaulichte Tumorsuppressor p16. ZU diesem Zweck wurden einem Tag vor der Transfektion T24-Zellen (ATCC Nr. HTB-4) auf 10 cm Platten mit 4×10⁵ Zellen/Schale ausplattiert. Zum Zeitpunkt der Transfektion wurden die Zellen mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) gewaschen, und 5 ml Opti-MEM Medium (Gibco-BRL), dass 6,25 μl/ml Lipofektin-Transfektionsreagenz (Gibco-BRL) enthielt, wurde zugegeben. Die verwendeten Oligonukleotide waren wie folgt: MG88 mit der Sequenz 5'-AAG CAT GAG CAC CGT TCU CC-3' (SEQ ID NO:48) (dieses Oligonukleotid ist auf die DNA MeTase mRNA 5'-UTR an den Nukleotiden 532-513) gerichtet) und MG98 mit der Sequenz 5'-UUC ATG TCA GCC AAG GCC AC-3' (SEQ ID NO:49) (dieses Oligonukleotid ist auf die DNA MeTase mRNA 3'-UTR an den Nukleotiden 5218-5199 gerichtet). Negativkontrollen waren: MG207 mit der Sequenz 5'-UUA ATG TAA CCT AAG GUC AA-3' (SEQ ID NO:3) und MG208 mit der Sequenz 5'-AAC GAT CAG GAC CCT TGU CC-3' (SEQ ID NO:4). Diese Oligonukleotide waren chemisch wie folgt modifiziert: A entspricht 2'-Desoxyriboadenosin; C entspricht 2'-Desoxyribocytidin; G entspricht 2'-Desocyruboguanosin; T entspricht 2'-Desoxyribothymidin; A entspricht Riboadenosin; U entspricht Uridin; C entspricht Ribocytidin; und G entspricht Riboguanosin. Die unterstrichenen Basen waren 2'-Methoxyribose-substituierte Nukleotide. Nicht-unterstrichene Basen zeigen Desoxyribosenukleoside an. Das Gerüst jedes Oligonukleotids bestand aus einer Phosphorthioatverknüpfung zwischen aufeinanderfolgenden Nukleotiden. Die Oligonukleotide wurden ausgehend von einer 01 mM Vorratslösung im Transfektionsmedium auf die gewünschte Konzentration verdünnt. Nach einer 4-stündigen Inkubation bei 37°C in einem 5% CO2 Inkubator wurden die Platten mit PBS gewaschen und 10 ml frisches Kulturmedium wurde zugegeben. Nach einer weiteren 2-stündigen Inkubation bei 37°C wurde frisch zubereitetes 5-aza-2'-desoxycytidin dem Gewebekulturmedium zugegeben. Zellen wurden für insgesamt 3 Tage transfiziert und jeden Tag geteilt, um optimale Transfektionsbedingungen zu gewährleisten. ZU den angezeigten Zeitpunkten wurden die Zellen durch Trypsinieren geerntet und durch Zentrifugation bei 1100 rpm und 4°C für 5 Minuten pelletiert. Das Zellpellet wurde in PBS resuspendiert und auf einem Coulter Teilchenzähler zur Bestimmung der Gesamtzellzahl gezählt. Nach einer zweiten Zentrifugation wurde das PBS vom Pellet abgesaugt und das Pellet wurde bei –70°C eingefroren.
Die Zellpellets wurden in 200 μl Zelllysepuffer (25 mM Tris pH 7.5, 5 mM EDTA, 0.5 % Natriumdesoxycholat und 1 % Triton X 100) resuspendiert, der mit Protease-Inhibitoren ergänzt war: Aprotinin, Leupeptin, Pepstatin, TLCK und PMSF. Die lysierten Zellen wurden für 10 Minuten auf Eis inkubiert und Zellteilchen wurden durch Zentrifugation bei 10000 rpm für 10 Minuten bei 4°C entfernt. Die Proteinkonzentration für jede Probe wurde mit dem BioRad Proteinassay bestimmt und 600 μg des Proteins wurden für jede Immunpräzipitation verwendet. Anti-p16 Antikörper (Santa Cruz) wurde zugegeben, 2.5 μg/ml, und jede Probe für bei 4°C für 1 Stunde auf einem rotierenden Schüttler inkubiert. Jede Probe wurde nach Zugabe von 20 μl äquilibriertem Protein G für weitere 45 Minuten bei 4°C inkubiert und 3 Mal mit Lysepuffer gewaschen, der keine Protease-Inhibitoren enthielt. Das Protein G-Pellet wurde in 15 μl 2 × Ladepuffer resuspendiert, der β-Mercaptoethanol enthielt und bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert. Nach Kochen für 5 Minuten wurden die Proben durch Gelelektrophorese auf 4-20 % Polyacrylamidgradientengelen aufgetrennt und auf eine PVDF Membran geblottet (Amersham Life Sciences, Cleveland, Ohio). Jede Membran wurde über Nacht in 1 × TBST Waschpuffer (10 mM tris ph 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20), der mit 5% Milch ergänzt war, inkubiert. Die Membranen wurden mit Maus- anti-Mensch p16 Antikörper (PharMingen Mississauga, Ontario), 1 μg/ml für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach drei Waschschritten in 1 × TBST und einer 1-stündigen Inkubation mit dem sekundären Antikörper, Ziege-Anti-Maus-IgG, wurden die Membranen zweimal in 1 × TBST und einmal in 1 × TBS gewaschen, und Chemilumineszenz wurde durchgeführt. 12 zeigt die Western Blot Analyse von T24-Zellen, die mit verschiedenen Konzentrationen von 5-aza-dC von 0,1 μM bis 0,75 μM behandelt wurden, und zeigt eine Reaktivierung von p16 im Bereich von 0,3 μM bis 0,75 μM 5-aza-dC. 13 zeigt die Western Blot Analyse von T24-Zellen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren mit dem Antisense-Oligonukleotid MG88 und 5-aza-dC behandelt wurden. Ein Vergleich der Anwesenheit der Banden und der Intensität in 13 zeigt, dass die Reaktivierung des p16-Gens durch die Verwendung einer Kombination des erfindungsgemäßen Oligonukleotids und des Protein-Effektors in Konzentrationen erfolgreich erreicht wird, bei denen weder das Oligonukleotid noch der Protein-Effektor allein effektiv wären (z.B., 40 nM Oligonukleotid MG88 und 0.1 μM 5-aza-dC).
14 zeigt die Western Blot Analyse von T24-Zellen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren mit dem Antisense-Oligonukleotid; MG98 und 5-aza-dC behandelt wurden. Wieder zeigt ein Vergleich der Anwesenheit der Banden und der Intensität in 14, dass die Reaktivierung des p16-Gens durch die Verwendung einer Kombination des erfindungsgemäßen Oligonukleotids und des Protein-Effektors in Konzentrationen erfolgreich erreicht wird, bei denen weder das Oligonukleotid noch der Protein-Effektor allein effektiv wären (z.B., 40 nM Oligonukleotid MG98 und 0.1 μM 5-aza-dC).
Die Western Blot Analyse in 14 wurde einer densitometrischen Analyse unterzogen und auf den Spiegel der Expression von p16 in HeLa-Zellen normalisiert. Die Ergebnisse der densitometrischen Analyse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5
Wie Tabelle 5 zeigt, hatte die Kombination aus MG98 plus 5-aza-dC einen viel größeren Effekt auf die Reaktivierung von p16 in T24-Zellen verglichen mit entweder MG98 oder 5-aza-dC alleine-
15 zeigt die Western Blot Analyse von T24-Zellen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren mit dem Antisense-Oligonukleotid MG88 und 5-aza- dC in niedrigeren Konzentrationen als MG88 behandelt wurden. Wieder zeigt ein Vergleich der Anwesenheit der Banden und der Intensität in 15, dass die Reaktivierung des p16-Gens durch die Verwendung einer Kombination des erfindungsgemäßen Oligonukleotids und des Protein-Effektors in Konzentrationen erfolgreich erreicht wird, bei denen weder das Oligonukleotid noch der Protein-Effektor allein effektiv wären (z.B., 20 nM Oligonukleotid MG88 und 0.2 μM 5-aza-dC).
BEISPIEL 5
Synergistische Hemmung von neoplastischem Zellwachstum in vitro
Zur Veranschaulichung der Fähigkeiten der Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung, DNA MeTase und neoplastisches Zellwachstum in einer synergistischen Weise zu hemmen, wurden T24.Blasenkarzinomzellen (ATCC Nr. HTB-4, American Type Culture Collection, Manassas, vA) oder A549 menschliche Lungenkarzinomzellen (ATCC Nr. CC1-185) erfindungsgemäß behandelt und ihr Wachstumsmuster beobachtet und mit unbehandelten Kontrollzellen verglichen. ZU diesem Zweck wurden einem Tag vor der Transfektion die Zellen auf 10 cm Platten mit 4 × 105 Zellen/Schale ausplattiert. Zum Zeitpunkt der Transfektion wurden die Zellen mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) gewaschen, und 5 ml Opti-MEM Medium (Gibco-BRL), dass 6,25 μl/ml Lipofektin-Transfektionsreagenz (Gibco-BRL) enthielt, wurde zugegeben. Die verwendeten Oligonukleotide waren wie folgt: MG98 mit der Sequenz 5'-UUC ATG TCA GCC AAG GCC AC-3' (SEQ ID NO:49) (dieses Oligonukleotid ist auf die DNA MeTase mRNA 3'-UTR an den Nukleotiden 5218-5199 gerichtet). Negativkontrollen waren: MG207 mit der Sequenz 5'-UUA ATG TAA CCT AAG GUC AA-3' (SEQ ID NO:3). Diese Oligonukleotide waren chemisch wie folgt modifiziert: A entspricht 2'-Desoxyriboadenosin; C entspricht 2'-Desoxyribocytidin; G entspricht 2'-Desocyruboguanosin; T entspricht 2'-Desoxyribothymidin; A entspricht Riboadenosin; U entspricht Uridin; C entspricht Ribocytidin; und G entspricht Riboguanosin. Die unterstrichenen Basen waren 2'-Methoxyribose-substituierte Nukleotide. Nicht-unterstrichene Basen zeigen Desoxyribonukleoside an. Das Gerüst jedes Oligonukleotids bestand aus einer Phosphorthioatverknüpfung zwischen aufeinanderfolgenden Nukleotiden. Die Oligonukleotide wurden ausgehend von einer 0,1 mM Vorratslösung im Transfektionsmedium auf die gewünschte Konzentration verdünnt. Nach einer 4-stündigen Inkubation bei 37°C in einem 5% CO2 Inkubator wurden die Platten mit PBS gewaschen und 10 ml frisches Kulturmedium wurde zugegeben. Nach einer weiteren 2-stündigen Inkubation bei 37°C wurde frisch zubereitetes 5-aza-2'-desoxycytidin dem Gewebekulturmedium zugegeben. Zellen wurden für insgesamt 3 Tage transfiziert und jeden Tag geteilt, um optimale Transfektionsbedingungen zu gewährleisten. Zu den angezeigten Zeitpunkten wurden die Zellen durch Trypsinieren geerntet und durch Zentrifugation bei 1100 rpm und 4°C für 5 Minuten pelletiert. Das Zellpellet wurde in PBS resuspendiert und auf einem Coulter Teilchenzähler zur Bestimmung der Gesamtzellzahl gezählt. Nach einer zweiten Zentrifugation wurde das PBS vom Pellet abgesaugt und das Pellet wurde bei –70°C eingefroren. Behandelte und unbehandelte Zellen wurden durch Zählen der Zellen gemäß Standardverfahren analysiert. Die Ergebnisse repräsentativer Experimente sind in den 16, 17 und 18 gezeigt. 16 zeigt eine Wachstumskurve von T24-Zellen, die für 1-7 Tage mit Lipofectin (Diamant); 0,05 μM 5-aza-dC(Viereck); 40 nM MG98 (Dreieck), 0,05 μM 5-aza-dC plus 40 nM MG98 (Kreuz); 40 nM MG207 (Stern); oder 0,05 μM 5-aza-dC plus 40 nM MG207 (Kreis) behandelt wurden. 17 zeigt die Anzahl von verbleibenden T24-Zellen nach Behandlung der Zellen für 7 Tage mit Lipofectin; 0,1 μM 5-aza-dC; 40 nM MG207, 40 nM MG98; 0,1 μM 5-aza-dC plus 40 nM MG207 oder 0,1 μM 5-aza-dC plus 40 nM MG98. 18 zeigt eine Wachstumskurve von A549-Zellen, die für 1-7 Tage mit Lipofectin (Diamant); 40 nM MG98 (Viereck); 0,05 μM 5-aza-dC plus 40 nM MG98 (Dreieck); 40 nM MG207 (X); oder 0,05 μM 5-aza-dC plus 40 nM MG207 (Stern) behandelt wurden. Dies Ergebnisse zeigen, dass die erfindungsgemäßen Oligonukleotide und Protein-Effektoren die enzymatische Aktivität von DNA MeTase und neoplastisches Zellwachstum in einer synergistischen Weise hemmen können, was zu einem erhöhten hemmenden Effekt führt, verglichen damit, wenn man nur das Oligonukleotid oder den Protein-Effektor verwendet. Die Ergebnisse attestieren daher der Erfindung die Fähigkeit, DNA MeTase durch Verwendung wirksamer synergistischer Mengen des erfindungsgemäßen Antisense-Oligonukleotids und/oder des Protein-Effektors zu hemmen.
BEISPIEL 6
Synergistischer Effekt auf neoplastische Zellen in vivo
Der Zweck dieses Beispiels besteht darin, die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen zu zeigen, Krankheiten zu behandeln, die in Säugern auf DNA MeTase Hemmung ansprechen. Dieses Beispiel stellt weitere Beweise dafür bereit, dass die erfindungsgemäßem Verfahren und Zusammensetzungen in einem Säuger Tumorwachstum hemmen können. Acht bis zehn Wochen alte weibliche BALB/C Nacktmäuse (Taconic Labs, Great Barrington, NY) erhielten in die Flanke eine subkutane Injektion von 2 × 10⁶ präkonditionierten Colo 205 menschlichen Darmkrebszellen (ATCC Nr. CC1-222). Die Präkonditionierung dieser Zellen wurden durch ein Minimum von drei aufeinanderfolgenden Tumortransplantationen im gleichen Stamm von Nacktmäusen durchgeführt. Nachfolgend wurden Tumorfragmente von etwa 30 mg herausgeschnitten und subkutan in die Mäuse implantiert, in den Bereich der linken Flanke unter Foren-Betäubung (Abbott Labs, Genf, Schweiz). Sobald die Tumoren ein mittleres Volumen von 100 mm³ erreicht hatten, wurden die Mäuse für 7 aufeinanderfolgende Tage durch eine tägliche Bolus-Infusion in die Schwanzvene mit Oligonukleotid-Salinezubereitungen behandelt, die 0.1-6mg/kg Antisense-Oligonukleotid und/oder 5-aza-dC (Sigma, St. Louis, MO) ebenfalls in Salinezubereitungen enthielten. Die optimale Endkonzentration wird durch Dosis-Reaktionsexperimente gemäß Standardprotokollen bestimmt. Das Tumorvolumen wurde jeden zweiten Tag nach der Infusion gemäß Standardverfahren berechnet (siehe z.B. in Meyer et al., (1989) Int. J. Cancer 43:851-856). Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Oligonukleotiden und Protein-Effektoren führte zu einer signifikanten Verringerung des Tumorgewichts und des Volumens verglichen mit Kontrollen, die mit Saline behandelt wurden, wie gezeigt in den 19, 20A und 20B. 19 zeigt, dass Tiere, die nur mit Saline behandelt wurden (Diamant) oder mit 0,5 mg/kg MG98 (Dreieck) für 7 Tage, eine Zunahme des Tumorvolumens zeigten, während Tiere, die 0,1 mg/kg 5-aza-dC (Dreieck) erhielten, einen geringeren Anstieg des Tumorvolumens zeigten. Die stärkste Reduktion des Tumorvolumens sah man in Tieren, die sowohl 0,5 mg/kg MG98 und 0,1 mg/kg 5-aza-dC (19, X) für sieben Tage erhielten.
20A und 20B zeigen die Ergebnisse eines ähnlichen Experiments, wobei das Tumorvolumen für 25 Tage aufgezeichnet wird (d.h., 19 zusätzliche Tage nach der letzten Behandlung). 20A zeigt eine Tumorvolumen-Wachstumskurve gegen die zeit, während 20B das Tumorvolumen in diesem Mäusen am Tag 25 zeigt. Wie in 20B gezeigt, hatten Mäuse, die sowohl 0,5 mg/kg MG98 als auch 0,1mg/kg 5-aza-dC erhalten hatten, statistisch kleinere Tumoren (p<0,05) als Mäuse, die nur mit Saline oder 5-aza-dC behandelt wurden. Zusätzlich wird erwartet, dass die Aktivität des DNA MeTase Enzym, signifikant reduziert im Vergleich zu mit Saline behandelten Kontrollen ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass die erfindungsgemäßen Oligonukleotide und Protein-Effektoren Tumorwachstum in einer synergistischen Weise hemmen können.
BEISPIEL 7
Unterschiedliche synergistische Effekte auf die Hemmung des Fortschreitens des Zellzyklus durch Unterschiede im Zeitplan
Der Zweck dieses Beispiels besteht darin, zu veranschaulichen, dass der synergistische Effekt auf die Hemmung des Fortschreitens des Zellzyklus durch ein erfindungsgemäßes Antisense-Oligonukleotid, kombiniert mit einem erfindungsgemäßen Protein-Effektor, durch unterschiedliche Zeitpläne erreicht werden kann. In diesem Beispiel wurden T24-Zellen verwendet.
In Schema A wurden die Zellen für 4 Stunden am Tag 0 mit 75 nM MG88 transfiziert. AM nächsten Tag wurden die Zellen nochmals für 4 Stunden mit 75 nM MG88 transfiziert. Am folgenden Tag wurden die Zellen mit 1 μM 5-aza-dC behandelt. Nach 24 Stunden wurde das Medium mit frischem Medium ersetzt, dass 1 μM aza-dC enthielt. Für Kontrollen erhielten die Zellen entweder keine Behandlung, Behandlung nur mit aza-dC (wobei die Zellen für die ersten zwei Tage unberührt blieben); oder Behandlung nur mit MG88 (wobei die Zellen an den dritten und vierten Tagen unberührt blieben).
In Schema B wurden die Zellen mit 1 μM 5-aza-dC behandelt. Nach 24 Stunden wurde das Medium mit frischem Medium ersetzt, das 1 μM aza-dC enthielt. 24 Stunden später wurden die Zellen für 4 Stunden mit 75 nM MG88 transfiziert. Am nächsten Tag wurden die Zellen wieder für vier Stunden mit 75 mM MG88 transfiziert. Für Kontrollen erhielten die Zellen entweder keine Behandlung, Behandlung nur mit aza-dC (wobei die Zellen für den dritten und vierten Tag unberührt blieben); oder Behandlung nur mit MG88 (wobei die Zellen an den ersten und zweiten Tagen unberührt blieben).
Am fünften Tag wurden die Zellen geerntet, fixiert und in eiskaltem 70% Ethanol permeabilisiert, und gemäß Standardverfahren mit Propidiumiodid gefärbt (vgl. z.B. Ausubel et al., supra, Sambrook et al., supra). Die gefärbten Zellen wurden danach mit Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierungsanalyse (FACS) analysiert. Gemäß FACS Analyse von mit Propidiumiodid gefärbten Zellen, können Zellen typischerweise in 4 Gruppen aufgeteilt werden, abhängig von der Menge an DNA, die sie enthalten, die mit Propidiumiodid gefärbt wird. Typischerweise sind 4N Zellen (d.h., G2/M-Phasezellen, die in der Teilung begriffen sind) am weitesten rechts im Histogramm). Der nächste Satz an Zellen mit der zweithöchsten Färbung sind die Zellen in der S-Phase. Der dritthellste Satz an Zellen sind die 2N-Zellen in der G1-Phase des Zellzyklus. Die am wenigsten hellen Zellen (d.h., Zelle am äußeren linken Rand des FACS Histogramm) sind jene, die Apoptose eingehen.
Wie in 21 gezeigt, zeigten Zellen, die sowohl MG88 als auch 5-aza-dC in Schema A (oben rechts) erhielten, eine Abnahme der Zellen in der S-Phase (27% in Abschnitt 2) und Zunahmen in apoptotischen Zellen (16% in Abschnitt M1) und Zellen in der S-Phase (22% IN Abschnitt M3). IM Gegensatz dazu zeigten Zellen, die in Schema B sowohl MG88 als auch 5-aza-dC erhielten (21, unten, rechts) einen deutlicheren Block in G1 (55% in Abschnitt M2 in 21) und weniger 4N Zellen in der G2/m Population (13% in Abschnitt M4). Weder Schema A noch Schema B führten jedoch zu einer stärkeren Hemmung des Fortschreitens des Zellzyklus wenn sowohl MG88 als auch 5-aza-dC erhalten wurden, verglichen mit Zellen die nur MG88 oder nur 5-aza-dC erhielten (vergleiche rechte Abschnitte mit mittleren Abschnitten oben für Schema A und unten für Schema B).
Die folgenden Beispiele sind nicht Teil der vorliegenden Erfindung und lediglich zur Veranschaulichung gedacht.
BEISPIEL 8
Synergistischer Effekt auf die Hemmung der Thymidylat-Synthase mit einer Kombination aus TS-Antisense-Oligonukleotid und TS-Protein-Effektor.
Das Enzym Thymidylatsynthase (TS) katalysiert einen wichtigen Schritt in der DNA-Synthese und ist insbesondere wichtig für Zellen, die unkontrollierte Proliferation eingehen. Das Beispiel veranschaulicht die Fähigkeit eines TS-Antisense-Oligonukleotids und eines TS-Protein-Effektors, synergistisch in Zellen zu wirken, um die Proteinexpression von TS zu hemmen und um die Rolle von TS beim Fortschreiten des Zellzyklus zu hemmen. Die in diesem Beispiel verwendeten repräsentativen nicht-beschränkenden Oligonukleotide waren MG2605 mit der folgenden Sequenz: 5' UUC ATA ACC TCA GCA TUG UC-3' (SEQ ID NO:88, diese Oligonukleotid ist auf die Thymidylatsynthase mRNA Sequenz gerichtet, wie in GenBank Zugangsnr. X02308 an den Nukleotiden 1267-1286 bereitgestellt) und Kontroll-Oligonukleotid MG2606 mit der Sequenz 5' GUC UTA AGC TCA ACA TUC UA 3' (SEQ ID NO:81). Diese Oligonukleotide waren chemisch wie folgt modifiziert: A entspricht 2'-Desoxyriboadenosin; C entspricht 2'-Desoxyribocytidin; G entspricht 2'-Desocyruboguanosin; T entspricht 2'-Desoxyribothymidin; A entspricht Riboadenosin; U entspricht Uridin; C entspricht Ribocytidin; und G entspricht Riboguanosin. Die unterstrichenen Basen waren 2'-Methoxyribose-substituierte Nukleotide. Nicht-unterstrichene Basen zeigen Desoxyribosenukleoside an. Das Gerüst jedes Oligonukleotids bestand aus einer Phosphorthiaotverknüpfung zwischen aufeinanderfolgenden Nukleotiden.
Der in diesem Beispiel verwendete nicht-beschränkende TS-Protein-Effektor ist das Nukleosidanalog 5-Fluoruracil (5-FU)
Um sich die Fähigkeit von MG2605 anzuschauen, die Proteinexpression von TS zu hemmen, wurden T24-Zellen, die in Kultur wuchsen, mit Lipofectin allein (6,25 μg/ml) oder Lipofectin plus 10 nM, 25 nM oder 50 nM MG2605 oder MG2606 für 72 Stunden behandelt (d.h., Transfektion für 4 Stunden pro Tag an drei aufeinanderfolgenden Tagen). Nach der Behandlung wurden die Zellen lysiert und durch Western Blot Analyse auf Thymidylatsynthase-Proteinkonzentrationen mit einem Thymidylatsynthase-spezifischen Antikörper untersucht (Chemicon Int., Temecula, CA).
Wie in 22 gezeigt, zeigten T24-Zellen, die für 72 Stunden mit 25 oder 50 nM MG2605, aber nicht mit der Kontrolle MG2606 transfiziert wurden, verringerte Konzentrationen von Thymidylatsynthaseprotein verglichen zu Zellen, die nur mit Lipofectin behandelt wurden. Gleichmäßige Beladung aller Vertiefungen wurde durch gleiche Mengen an Actin (22) gezeigt.
Um sich die Fähigkeit von MG2605 anzuschauen, die Rolle von TS beim Fortschreiten des Zellzyklus zu hemmen, wurden in Kultur wachsende T24-Zellen nur mit Lipofectin (6,24 μg/ml), oder Lipofectin plus 25 nm MG2605 oder mG2606, oder Lipofectin plus 25 nM MG2605 oder MG2606 plus 500 nM 5-FU für 72 Stunden behandelt (d.h., Transfektion für 4 Stunden pro Tag an drei aufeinanderfolgenden Tagen, jede Transfektion gefolgt von Inkubation mit 500 nM 5-FU). Nach der Behandlung wurden die Zellen wie in Beispiel 7 beschrieben für die Zellzyklusanalyse durch FACS verarbeitet.
23 zeigt, dass T24-Zellen, die mit 500 nM 5-FU in Kombination mit MG2605 behandelt wurden, eine Größere Zahl von Zellen zeigten, die in der S-Phase arretiert waren (Abschnitt M3; unten), verglichen mit Zellen, die nur mit MG2605 behandelt wurden (dritte Reihe von oben) oder nur mit 5-FU (vierte Reihe von oben).
In einem ähnlichen Experiment wurden T24-Zellen für 4 Stunden mit 25nM TS-Antisense-Oligonukleotid MG2605 oder Kontroll-Oligonukleotid MG2606 bei 0 und 24 Stunden transfiziert. Nach 4 Stunden Kontakt mit dem Oligonukleotid wurden die Zellen in serum-enthaltendes Medium zurückgebracht. Einige der Zellen wurden in serum-enthaltendes Medium zurückgebracht, dass 5 μM 5-FU enthielt. Nach 722 Stunden wurden die Zellen geerntet, fixiert und in eiskaltem 70% Ethanol permeabilisiert. Die Zellen wurden dann mit Propidiumiodid gefärbt und Zellzyklusanalyse wurde wie in Beispiel 7 beschrieben mit Flußzytometrieanalyse durchgeführt.
24A zeigt den Prozentsatz an Zellen in der G1 Phase (Abschnitt M1), S-Phase (Abschnitt M2), und G2/M-Phase (Abschnitt M3) nach Behandlung mit gar nichts, nur MG2606m nur MG2605m nur 5-FU, MG2606 plus 5-FU, oder MG2605 plus 5-FU. Behandlung mit MG2605 plus 5-Fu führte zu einer größeren Anzahl von Zellen, die in der S-Phase des Zellzyklus arretiert waren und weniger Zellen in der G1-Phase des Zellzyklus verglichen mit Behandlung entweder mit MG2605 allein oder 5-FU allein (24A). Weiterhin führte die Behandlung mit einer Kombination aus MG2605 plus 5-FU zu einer geringeren Anzahl von Zellen verglichen mit der Anzahl von Zellen, die nach einer Behandlung mit 5-FU allein oder nur mit MG2605 anwesend waren (24B).
Dieses Beispiel zeigt, dass die Expression der Thymidylatsynthase, und ihre Rolle im Fortschreiten des Zellzyklus, in T24-Zellen durch eine Kombination eines TS-Antisense-Oligonukleotids plus einem TS-Protein-Effektor zu einem höheren Ausmaß gehemmt werden kann als in T24-Zellen, die entweder das TS-Antisense-Oligonukleotid oder den TS-Protein-Effektor allein erhielten.
BEISPIEL 9
Synergistischer Effekt auf die Hemmung von HDAC Aktivität mit HDAC Antisense- Oligonukleotid und HDAC Protein-Effektor
Funktionelle Histon-Deacetylasen (HDACs) wurden als Erfordernis für das Fortschreiten des Zellzyklus sowohl in normalen als auch in neoplastischen Zellen beschrieben. Dieses Beispiel veranschaulicht die Fähigkeit eines HDAC Antisense-Oligonukleotids und HDAC Protein-Effektors, synergistisch in Zellen zu wirken, um die Proteinexpression von HDAC zu hemmen und um die Zyklin-abhängigen Kinase-Inhibitor (CDKI) Familie, p21WAF1, zu induzieren.
Dazu wurden die folgenden repräsentativen, nicht-beschränkenden Antisense-Oligonukleotide, die sowohl auf HDAC-1 als auch auf HDCA-2 gerichtet sind, verwendet:
5'-CAG CAA ATT ATG GGT CAT GCG GAU UG-3' (SEQ ID NO:82); 5'-CAG CAA GTT ATG GGT CAT GCG GAU UG-3' (SEQ ID NO:89); 5'-CAG CAA ATT ATG AGT CAT GCG GAU UG-3' (SEQ ID NO:90); und 5'-CAG CAA GTT ATG CAT GCG GAU UG-3' (SEQ ID NO:83). Dieses HDAC-1,2 Antisense-Oligonukleotid (MG2610) war wirklich ein 1:1:1:1-Gemisch aus jedem Oligonukleotid (d.h., jeweils 25%). Das Kontrolloligo (MG2637) war ähnlicherweise ein 1:1:1:1 Gemisch aus den folgenden vier verschiedenen Oligonukleotiden:
5'-AAG GAA GTC ATG GAT GAT GCG CAU UG-3' (SEQ ID NO:84) und 5'- AAG GAA ATC ATG AAT GAT GCG CAU UG-3' (SEQ ID NO:85); 5'-AAG GAA GTC ATG AAT GAT GCG CAU UG-3' (SEQ ID NO:86) und 5'-AAG GAA ATC ATG GAT GAT GCG CAU UG-3' (SEQ ID NO:87). Diese Oligonukleotide waren chemisch wie folgt modifiziert: A entspricht 2'-Desoxyriboadenosin; C entspricht 2'-Desoxyribocytidin; G entspricht 2'-Desocyruboguanosin; T entspricht 2'-Desoxyribothymidin; A entspricht Riboadenosin; U entspricht Uridin; C entspricht Ribocytidin; und G entspricht Riboguanosin. Die unterstrichenen Basen waren 2'-Methoxyribosesubstituierte Nukleotide. Nicht-unterstrichene Basen zeigen Desoxyribosenukleoside an. Das Gerüst jedes Oligonukleotids bestand aus einer Phosphorthioatverknüpfung zwischen aufeinanderfolgenden Nukleotiden.
T24-Zellen wurden für 24 Stunden (d.h., 4 Stunden, gefolgt von Inkubation in frischem Medium für 20 Stunden) nur mit Lipofectin, Lipofectin plus 50 nM MG2610 (d.h., HDAC-1,2 Antisense-Oligonukleotid) oder MG2637 Kontroll-Oligonukleotid, oder Lipofectin plus HDAC Antisense-Oligonukleotid oder Kontroll-Oligonukleotid plus 10 ng/ml oder 25ng/ml TSA behandelt. Die behandelten Zellen werden dann lysiert und die zellulären Lysate werden durch Western Blot auf die Proteinkonzentration von p12WAF1 untersucht. Wie in 25 gezeigt, zeigten die Zellen, die mit einer Kombination aus HDAC-1,2 Antisense-Oligonukleotid plus TSA behandelt wurden, einen größere Zunahme in der Proteinkonzentration von p21^WAF1 verglichen mit Zellen, die entweder mit dem HDAC-1,2 Antisense-Oligonukleotid allein oder mit TSA allein behandelt wurden.
Dieses Beispiel zeigt, dass die Behandlung von Zellen mit einer Kombination aus HDAC-1,2-Antisense-Oligonukleotid plus einem TSA Protein-Effektor eine synergistische Fähigkeit aufwies, die Proteinkonzentrationen von p21^WAF1 zu erhöhen verglichen mit der Behandlung mit entweder einem HDAC-1,2 Antisense-Oligonukleotid allein oder mit HDAC Protein-Effektor allein.
BEISPIEL 10
Synergistischer anti-neoplastischer Effekt von Histon-Deacetylase Antisense-Oligonukleotid und HDAC-Protein-Effektor auf Tumorzellen in vivo
Der Zweck dieses Experiments besteht darin, die Fähigkeit von Histon-Deacetylase Antisense-Oligonukleotid und HDAC-Protein-Effektor der Erfindung zu zeigen, das Tumorwachstum in einem Säuger zu hemmen. Dieses Beispiel liefert weiterhin Beweise für die Fähigkeit der Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung, Tumorwachstum in einem domestizierten Säuger zu hemmen. Acht bis zehn Wochen alte weibliche BALB/C Nacktmäuse (Taconic Labs, Great Barrington, NY) erhielten in die Flanke eine subkutane Injektion von 2 × 106 präkonditionierten A549 menschlichen Lungenkarzinomzellen. Die Präkonditionierung dieser Zellen wurden durch ein Minimum von drei aufeinanderfolgenden Tumortransplantationen im gleichen Stamm von Nacktmäusen durchgeführt. Nachfolgend wurden Tumorfragmente von etwa 30 mg herausgeschnitten und subkutan in die Mäuse implantiert, in den Bereich der linken Flanke unter Foren-Betäubung (Abbott Labs, Genf, Schweiz). Sobald die Tumoren ein mittleres Volumen von 100 mm3 erreicht hatten, wird eine Gruppe von Mäusen täglich mit Oligonukleotidsalinezubereitung behandelt, die von etwa 0,1 mg bis etwa 30 mg pro kg Körpergewicht Histon-Deacetylase Antisense-Oligonukleotid enthalten. Eine zweite Gruppe von Mäusen wird täglich mit pharmazeutisch verträglichen Zubereitungen behandelt, die von etwa 0,01 mg bis etwa 5 mg pro kg Körpergewicht HDAC Protein-Effektor enthalten. Eine weitere Gruppe von Mäusen erhält sowohl das Antisense-Oligonukleotid als auch den Protein-Effektor.
Von dieser dritten Gruppe erhält Gruppe A das Antisense-Oligonukleotid und den Protein-Effektor zusammen gleichzeitig intravenös in die Schwanzvene. Gruppe B erhält zwei Infusionen des Antisense-Oligonukleotid über die Schwanzvene an den Tagen 1 und 2, gefolgt an den Tagen 3 und 4 von zwei intravenösen Infusionen des HDAC Protein-Effektors. Gruppe C erhält zwei Infusionen des HDAC Protein-Effektors, gefolgt von zwei Infusionen des Antisense-Oligonukleotid an den Tagen 3 und 4.
Kontrollgruppen von Mäusen werden ähnlich etabliert, die keine Behandlung (d.h., nur Saline), nur ein Fehlpaarungs-Antisense-Oligonukleotid, eine Kontrollverbindung, die die Aktivität von Histon-Deacetylase nicht hemmt und Fehlpaarungs-Antisense-Oligonukleotid mit Kontrollverbindung erhalten.
Das Tumorvolumen wird mit Schieblehren gemessen. Die Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Antisense-Oligonukleotid plus dem HDAC Protein-Effektor ruft eine signifikante Verringerung der Tumorgröße und des -volumens verglichen mit den Kontrollen hervor. Vorzugsweise hemmen das Antisense-Oligonukleotid und der HDAC Protein-Effektor die Expression und die Aktivität der gleichen Histon-Deacetylase.

Claims

Verwendung einer therapeutisch wirksamen, synergistischen Menge eines Antisense-Oligonukleotids, das die Expression des Gens hemmt, das für DNA-Methyltransferase kodiert und einer therapeutisch wirksamen, synergistischen Menge eines Restes, der das Produkt eines Gens hemmen kann, das für DNA-Methyltransferase kodiert, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs, β-Thalassämie, Sichelzellanämie und Transplantat-Abstoßung in einem Säuger, wobei die Zusammensetzung an den Säuger, einschließlich Menschen, zu verabreichen ist, wobei wenigstens eine Zelle im Körper des Säugers von der Krankheit betroffen ist.
Verwendung einer therapeutisch wirksamen, synergistischen Menge eines Antisense-Oligonukleotids, das die Expression eines Gens hemmt, das für DNA-Methyltransferase kodiert und an der Tumorentstehung beteiligt ist, und einer therapeutisch wirksamen synergistischen Menge eines Restes, der ein Produkt des Gens hemmen kann, das für DNA-Methyltransferase kodiert, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Hemmung von Tumorwachstum in einem Säuger, wobei die Zusammensetzung an den Säuger, einschließlich Menschen, zu verabreichen ist, wobei der Säuger in seinem Körper wenigstens eine neoplastische Zelle aufweist.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Antisense-Oligonukleotid in funktioneller Assoziation mit einem Rest steht, der das Produkt eines Gens hemmen kann, das für DNA-Methyltransferase kodiert.
Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei der Rest, der das Produkt eines Gens hemmen kann, das für DNA-Methyltransferase kodiert, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 5-aza-cytidin, 5-aza-2'-desoxycytidin, 5-fluor-2'-desoxycytidin und 5,6-dihydro-5-azacytidin.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Antisense-Oligonukleotid wenigstens eine Internukleotidverknüpfung besitzt, ausgewählt aus der Gruppe der Internukleotidverknüpfungen bestehend aus Phosphorthioat, Phosphordithioat, Alkylphosphonat, Alkylphosphonothioat, Phosphotriester, Phosphoramidat, Siloxan, Carbonat, Carboxymethylester, Acetamidat, Carbamat, Thioether, überbrücktes Phosphoramidat, überbrücktes Methylenphosphonat, überbrücktes Phosphorthioat und Sulfon.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Antisense-Oligonukleotid ein chimäres Oligonukleotid ist, umfassend einen Phosphorthioat-, einen Phosphodiester- oder Phosphordithioatbereich und einen Alkylphosphonat- oder einen Alkylphosphonothioatbereich.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Antisense-Oligonukleotid einen Ribonukleotid- oder einen 2'-O-substituierten Ribonukleotidbereich und einen Desoxyribonukleotidbereich umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Zelle mit einer wirksamen, synergistischen Menge wenigstens eines Antisense-Oligonukleotids für einen wirksamen Zeitraum in Kontakt zu bringen ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei eine therapeutisch wirksame, synergistische Menge wenigstens eines Antisense-Oligonukleotids für einen therapeutisch wirksamen Zeitraum an einen Säuger zu verabreichen ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Zelle mit einer wirksamen synergistischen Menge wenigstens eines Restes, der das Produkt eines Gens hemmen kann, das für DNA-Methyltransferase kodiert, für einen wirksamen Zeitraum in Kontakt zu bringen ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei eine therapeutisch wirksame, synergistische Menge wenigstens eines Restes, der das Produkt eines Gens hemmen kann, das für DNA-Methyltransferase kodiert, für einen therapeutisch wirksamen Zeitraum an den Säuger zu verabreichen ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei sowohl das Antisense-Oligonukleotid als auch der Rest, der ein Produkt des Gens hemmen kann, das für DNA-Methyltransferase kodiert, vor dem In-Kontakt-bringen mit der Zelle mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger vermischt werden.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei sowohl das Antisense-Oligonukleotid als auch der Rest, der ein Produkt des Gens hemmen kann, das für DNA-Methyltransferase kodiert, vor dem Verabreichen an den Säuger mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger vermischt werden.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Antisense-Oligonukleotid und der Rest, der ein Produkt des Gens hemmen kann, das für DNA-Methyltransferase kodiert, vor dem In-Kontakt-bringen mit der Zelle vermischt werden.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Antisense-Oligonukleotid und der Rest, der ein Produkt des Gens hemmen kann, das für DNA-Methyltransferase kodiert, vor dem Verabreichen an den Säuger vermischt werden.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Zelle sowohl mit dem Antisense-Oligonukleotid, als auch mit dem Rest, der ein Produkt des Gens hemmen kann, das für DNA-Methyltransferase kodiert, getrennt in Kontakt zu bringen ist.
Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei die Zelle mit dem Antisense-Oligonukleotid vor dem Rest, der ein Produkt des Gens hemmen kann, das für DNA-Methyltransferase kodiert, in Kontakt zu bringen ist.
Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei das Gen für eine DNA-Methyltransferase kodiert und wobei die in Kontakt zu bringende Zelle zur Apoptose induziert wird oder in der S-Phase des Zellzyklus arretiert ist.
Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei die Zelle mit dem Rest, der ein Produkt des Gens hemmen kann, das für DNA-Methyltransferase kodiert, vor dem Antisense-Oligonukleotid in Kontakt zu bringen ist.
Verwendung gemäß Anspruch 19, wobei das Gen für eine DNA-Methyltransferase kodiert und wobei die in Kontakt zu bringende Zelle in der G1-Phase des Zellzyklus arretiert ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Antisense-Oligonukleotid und der Rest, der ein Produkt des Gens hemmen kann, das für DNA-Methyltransferase kodiert, getrennt an den Säuger zu verabreichen sind.
Verwendung gemäß Anspruch 21, wobei das Antisense-Oligonukleotid vor dem Rest, der ein Produkt des Gens hemmen kann, das für DNA-Methyltransferase kodiert, an den Säuger zu verabreichen ist.
Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei das Gen für eine DNA-Methyltransferase kodiert und wobei die Zelle in dem Säuger, an den das Antisense-Oligonukleotid vor der Verabreichung des Restes, der ein Produkt eines Gens hemmen kann, das für DNA-Methyltransferase kodiert, zu verabreichen ist, zur Apoptose induziert wird oder in der S-Phase des Zellzyklus arretiert ist.
Verwendung gemäß Anspruch 21, wobei der Rest, der ein Produkt des Gens hemmen kann, das für DNA-Methyltransferase kodiert, vor dem Antisense-Oligonukleotid an den Säuger zu verabreichen ist.
Verwendung gemäß Anspruch 24, wobei das Gen für eine DNA-Methyltransferase kodiert und wobei die Zelle in dem Säuger, an den der Rest, der ein Produkt eines Gens hemmen kann, das für DNA-Methyltransferase kodiert, vor dem Antisense-Oligonukleotid zu verabreichen ist, in der G1-Phase des Zellzyklus arretiert ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Gen für eine DNA-Methyltransferase kodiert und wobei die Zelle ein Gen umfasst, dessen Expression durch Methylierung inaktiviert wurde.
Verwendung gemäß Anspruch 26, wobei die Expression des Gens, dessen Expression durch Methylierung inaktiviert wurde, in der kontaktierten Zeile reaktiviert wurde.
Verwendung gemäß Anspruch 26, wobei die Expression des Gens, dessen Expression durch Methylierung inaktiviert wurde, in dem Säuger reaktiviert wird, an den die therapeutisch wirksame, synergistische Menge eines Antisense-Oligonukleotids und die therapeutische wirksame, synergistische Menge eines Restes, der ein Produkt eines Gens hemmen kann, wobei das Gen für DNA-Methyltransferase kodiert, verabreicht wurde.
Verwendung gemäß Anspruch 26, wobei das Gen, dessen Expression durch Methylierung inaktiviert wurde, das Tumorsuppressorgen p16^ink4 ist.
Inhibitor eines Gens, das für DNA-Methyltransferase kodiert, umfassend ein Antisense-Oligonukleotid, das die Expression des Gens hemmt, das für DNA- Methyltransferase kodiert, in funktioneller Assoziation mit einem Rest, der ein Produkt eines Gens hemmen kann, das für DNA-Methyltransferase kodiert.
Inhibitor gemäß Anspruch 30, wobei das Antisense-Oligonukleotid in funktioneller Assoziation mit zwei oder mehreren Resten steht, die ein Produkt des Gens hemmen können, das für DNA-Methyltransferase kodiert.
Inhibitor gemäß Anspruch 31, wobei der Rest, der ein Produkt des Gens hemmen kann, das für DNA-Methyltransferase kodiert, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 5-aza-cytidin, 5-aza-2'-desoxycytidin, 5-fluor-2'-desoxycytidin und 5,6-dihydro-5-azacytidin.
Inhibitor gemäß Anspruch 30, wobei das Antisense-Oligonukleotid wenigstens eine Internukleotidverknüpfung besitzt, ausgewählt aus der Gruppe der Internukleotidverknüpfungen bestehend aus Phosphorthioat, Phosphordithioat, Alkylphosphonat, Alkylphosphonothioat, Phosphotriester, Phosphoramidat, Siloxan, Carbonat, Carboxymethylester, Acetamidat, Carbamat, Thioether, überbrücktes Phosphoramidat, überbrücktes Methylenphosphonat, überbrücktes Phosphorthioat und Sulfon.
Inhibitor gemäß Anspruch 30, wobei das Antisense-Oligonukleotid ein chimäres Oligonukleotid ist, umfassend einen Phosphorthioat-, Phosphodiester- oder Phosphordithioatbereich und einen Alkylphosphonat- oder Alkylphosphonothioatbereich.
Inhibitor gemäß Anspruch 30, wobei das Antisense-Oligonukleotid einen Ribonukleotid- oder einen 2'-O-substituierten Ribonukleotidbereich und einen Desoxyribonukleotidbereich umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den Inhibitor gemäß Anspruch 30.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 36, weiter umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger.