DE735334C - Verfahren zur Gewinnung gonadotroper Wirkstoffe - Google Patents

Description

• Verfahren zur Gewinnung gonadotroper Wirkstoffe In der Arbeit von Fevold und Hisaw (Proc. of Soc. exp. Biol. -and Med. Bd. 3.1., S.; 1a) ist die Gewinnung gonadotroper Wirkstoffe aus Schwangerenharn durch Extraktion mittels Kresol beschrieben. Die Autoren wollen nach dieser Methode aus roo 1 Schwangerenharn 6o bis 8o g Rohtrockenpulv er erhalten haben, wohingegen bei Verwendung von Kastratenharn oder dem Harn klimakterischer Frauen überhaupt keine Ausbeute an gonadotropem Wirkstoff erhalten worden sei.
• Die experimentelle Nachprüfung dieser Angaben hat nun ergeben, daß die von den genannten Autoren gemachten Angaben wohl in bezug auf den Harn von klimakterischen Frauen und von Kastratenharn stimmen, nicht aber in bezug auf das positive Resultat bei Verwendung von Schwangerenharn als Ausgangsmaterial: aus diesem konnte trotz wiederholter Versuche auf die beschriebene Weise nur unwirksame Substanz, aber kein gonadotropes Hormon extraliiert werden.
• Dagegen wurde nun gefunden, daß man aus sämtlichen genannten Harnen die gonadotropen Wirkstoffe in quantitativer Ausbeute mittels Kresolextraktion gewinnen kann, wenn man dem Verteilungssatz Rechnung trägt, indem man vor bzw. während der Extraktion die Löslichkeit der gonadotropen Hormone in der wäßrigen Phase verringert; dies kann z. B. durch Zusatz von im Wasser löslichen, im Extraktionsmittel aber schwer löslichen Stoffen geschehen, wie etwa Ammonsulfat, Ammonchlorid, Natriumchlorid, Natriumsulfat u. a. m. Die Methode hat in der vorliegenden Form den Vorteil, daß *Per den wasserlöslichen auch die im Harn vorhandenen lipoidlösliclien Wirkstoffe miterfaßt werden, deren Abtrennung von den wasserlöslichen gonaclotropen Stoffen zwangsläufig bei der weiteren Reinigung erfolgt.
• Es wurde weiterhin gefunden, daß auch anderes Material biologischen Ursprungs mit glcichein Erfolg an Stelle der genannten Harne verwendet werden kann, wie z. B. Harn trächtiger "fiere, besonders. von Stuten, Blut, Lymp:ie, Serum, ferner Extrakte aus bormonlialtigen Geweben, wie Placenta, Hypophyse, 1Kebenniere, Keimdrüse, Chorionepith .eliam, oder aus pflanzlichem hormonhaltigem -Material. Darüber hinaus ist die Methode von großer llodifil:ationsfäbig hext, indem man erstens keineswegs auf Kresol beschränkt ist, sondern andere Phenole (Isoniere und Homologe, wie Phenol, o- oder p-Kresol, Tlivmol u. a. in.) oder deren Gemische heranziehen kann, zweitens aber auch mit anderen organischen Flüssigkeiten den gewünschten Extraktionserfolg erzielt, soweit sie trotz teilweise geringeren Lösungsvermögens für die hormonalen Wirkstoffe dennoch auf Grund des Verteilungssatzes geeignet sind, dieselben aus in geeigneter Weise vorbereiteten Flüssigkeiten herauszuholen; z. B. kommt diese Fähigkeit unter anderem Basen vom Typ des Anilins oder des Chinolins zu. Drittens aber kann durch geeignete Abstufung der Zusatz-:topfe, z. B. der in den Harnen oder Extrakten aufgelösten Salze, und gegebenenfalls durch Beeinflussung der y,Vassc=rstoffionenlzonzentration von vornherein eine gewisse fraktionierte Aufteilung erzielt werden, sofern im Ausgangsmaterial ein Gemisch verschiedener wasserlöslicher oder lipoidlöslicher Hormone vorliegt.
• Man bat zwar schon IIypopbysenextral:te a-jer einen durch Zerkleinern der Drüsen hergestellten Brei durch Zusatz wasserbindender Salze zu einem Trockenpulver verarbeitet und rttis diesem durch Extraktion mit Chloroform und Alkohol Hormone des Hypophysenhinterlappens gewonnen, z. I3. gemäß der Patentschrift :282 202. Erfindungsgemäß werden jedoch die gonaclotropen Hormone des Hypophy-senvorderlappens aus wäßrigen Lösungen nach Zusatz wasserlöslicher anorganischer Salze mit mit Wasser nicht oder nur begrenzt mischbaren, geeigneten organischen Verbinclungen extrahiert, wobei der Salzzusatz die Löslichkeit der Wirkstoffe in Wasser verringert.
• 'Jon dein Verfahren der Patentschrift ;;8 21_t, g<inäß welchem man im Harn ein Gemisch von Isobutanot und Isopropanol durch Schütteln zur Lösung bringt und nach einiger Zeit dieses Lösungsmittelgemisch durch Sättig ung finit calciiiiertein Soda wieder zur Abscheidung bringt, worauf man aus der organischen Flüssigkeit die im Harn vorhandenen Keimdrüsenhormone gewinnt, unterscheidet sich das erfindungsgemäße Verfahren grundsätzlich dadurch, daß man stets mit einem zweiphasigen Flüssigkeitssystem arbeitet und neben den Keimdrüsenhormonen auch die gonadotropen Hormone des Hy-pophysenvorderlappens gewinnt.
• Die nachfolgenden Beispiele trögen die Anwendung des Verfahrens in einigen speziellen Fällen erläutern. Beispiel i io 1 Schwangerenharn werden mit 5 kg Amnionsulfat und 21 m-Kresol versetzt. bis zur Lösung des Sulfats kräftig geschüttelt und dann so lange stehengelassen, bis die obenauf schwimmende dunkle Kresolschicht sich vo:i dein stark entfärbten Harn völlig abgetrennt hat; dieser wird dann abgelassen und noch i- bis 2mal in der gleichen Weise extrahiert. Die vereinigten Kresolauszüge werden wasserklar zentrifugiert und dänn in dein .fachen Volumen. Äther oder eines anderen organischen Lösungsmittels, z. B. Benzol, L igroin. Aceton, Methanol u. a. in., aufgenommen. wobei die gonadotropen Wirkstoffe ungelöst zurückbleiben, während die lipoidlöslichen (Follikelliorinon u. a.) mit dein Kresol vorn ,ither gelöst werden. Die letzteren werden durch Abdestillieren des Äthers und Abblasen des Kresols mit Dampf, zwecks Wiedergewinnung der beiden Stoffe, zwangsläufig als Rückstand erhalten, während die gonadotropen Wirkstoffe nach einem- der bekannten Verfahren weiter gereinigt werden können. 'lau erhält aus io I Harn mit einem Gehalt von etwa 12 ooo RE pro Liter 2,i6 g Trockenpulver, dessen biologische Prüfung o,oi8 fing als Ratteneinheit ergibt.
• Aus dem Rückstand läßt sich das Follikelhormon nach an sich bekannten Methoden gewinnen. So erhält man nach seiner alkalischen Verseifung und Extraktion der Verseifungsflüssig@eit mit Benzol etwa. 6 g eines rollen Öles mit rund 40 ooo RE, das weiter gereinigt werden kann.
• Beispiel Die nach Beispiel i erhaltene Hormonkresollösung wird außer mit (lern .1fachen Volumen :ltlier auch noch mit 21 Wasser versetzt, die Mischung kräftig durchgeschüttelt und weiter -wie nach Beispiel i verfahren. In dieseln Falle gellen die gonadotropen Hormone in die wäßrige Phase zurück, die nach dein Abtrennen und nach Befreiung vo:i Ätherresten mittels durchgeblasener Preßluft ui-ne bräunlich trübe Lösung bildet, welche in Kubikzentimeter etwa 6o RE oder die Ratteneinheiten in l/co ccm enthält und nach bekannten Verfahren weiter gereinigt werden kann. Die lipoidlöslichen Wirkstoffe fallen wiederum wie bei Beispiel i bei der Regeneration von Äther und Kresol an. Beispiel 3 1,5 kg Schafshypophysenwerden imFleisch--volf fein zermahlen und in einer Kugelmühle mit 31 Wasser vom pH = io- io,5 bei niedriger Raumtemperatur während 12 bis r5 Stunden vermahlen und auf diese Weise extrahiert. Der dünne Brei wird zentrifuiert, die überstehende Flüssigkeit zum Prr = 5,5 angesäuert und der sich bildende Niederschlag abermals abzentrifugiert. Die vereinigten Niederschläge werden noch zweimal in der gleichen Weise extrahiert, danach stellen die vereinigten wäßrigen Extrakte eine rötliche klare Flüssigkeit von 9 1 Volumen dar. Hierzu werden nun 1,5 1 flüssiges Kresol und nach und nach noch 1,5 kg Ammonsulfat g.egeben. Nach r/,stündigem Schütteln -wird im Scheidetrichter das Kresol abgehoben und die Extraktion -wiederholt. Die vereinigten Kresolextrakte werden mit 1Tatriumsulfat getroclcnet."zentrifugiert und der abgeschleuderte Niederschlag, aus Salz und Verunreinigungen bestehend, nochmals mit Kresol gewaschen und abermals abgeschleudert. Die vereinigten klaren Kresolmengen werden mit dem a.fachen Volumen Äther versetzt, worauf die gonadotropen Wirkstoffe ausfallen. Dieser Niederschlag wird abzentrifugiert, mit Äther kresolfreip gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 4,0 g Trockenpulver; i mg davon ruft beim infantilen Rattenweibchen noch Corpusluetum-Bildung hervor. Beispiel ¢ 51 Serum trächtiger Stuten welches pro Liter 25 ooo RE gonadotropen Wirkstoff enthält, wird mit io 1 Wasser verdünnt und unter gutem Rühren mit 31 ro°/oiger Salicylsäure versetzt. Der Niederschlag, der in der Hauptsache aus unwirksamen Eiweißsubstanzen besteht, wird abzentrifugiert und die klare Lösung mit Natronlauge genau auf pA = 7 eingestellt. Man setzt nun unter lebhaftem Schütteln erst 31 flüssiges Kresol und dann nach und nach noch 3 kg Ammo:nsulfat zu und trennt nach einiger Zeit im Scheidetrichter ab. Der wäßrige Anteil wird noch einmal in der gleichen Weise behandelt. Die vereinigten, Kresolauszüge werden durch Filtrieren über -wasserfreies N atritunsulfat, unter Nachwaschen mit reinem Kresol, getrocknet und dann mit dem 4fachen Volumen Äther versetzt. Der gebildete Niederschlag enthält die gonadotropen Wirkstoffe und wird durch Zentrifugieren und Waschen mit Äther trocken und kresolfrei erhalten. Die Ausbeute beträgt 1,27 g; die Ratteneinheit -wird in 12,5 Gamma (o,oi25 fing) festgestellt.
• Aus der Kresoläthermischung lassen sich in diesem -wie im vorhergehenden Beispiel noch geringe Mengen lipoidlöslicher Wirkstoffe und Begleitstoffe nachweisen.
• Beispiel 5 25o g gefrorene Walfischhypophyse werden im Fleischwolf zerkleinert, darauf in einer geräumigen Kugelmühle mit ioo g festem Ammonsulfat und 75o ccm m-Kresol versetzt und über Nacht vermahlen. Durch scharfes Zentrifugieren wird möglichst vollständig von Gewebsresten und Schleimstoffen getrennt und das klare Kresol abgehoben. Die abgetrennten breiigen Reste werden nochmals mit Kresol durchgearbeitet und erneut zentrifugiert. DievereinigtenKreso:lmengeii (i ioo ccm) werden mit 5 1 Methanol versetzt, wobei die gelösten Stoffe als grobflockiger, schwach rötlicher Niederschlag ausfallen, der sich leicht zentrifugieren und mit Methanol kresolfrei waschen läßt. Ausbeute: 53 g scharf getrocle. nete Substanz. Die physiologische Prüfung zeigt, daß in 5o nig des Präparates bereits eine bedeutende Menge von gonadotropem Wirkstoff vorhanden ist. Beispiel 6 ro 1 Schwangerenharn werden mit 5 kg Ammonsulfat und 21 Anilin versetzt, bis zur Lösung 'des Salzes geschüttelt und dann bis zur Abtrennung der dunkelgefärbten Anilinschicht der Ruhe überlassen. Nach Ablassen des Harns wird dieser noch zweimal in gleicher Weise mit Anilin extrahiert. Die: vereinigten Anilinauszüge werden zentrifugiert, finit dein 6fachen ihres Volumens an Äther versetzt, wobei sich die gonadotropen Wirkstoffe in fester Form ausscheiden, während das Follikelhormon und andere lipoidlische Stoffe in der organischen Lösung verbleiben. Die weitereAufarbeitung erfolgt gemäß Beispiel i. Aus io 1 Schwangerenharn wurden so etwa i,5 bis 2 g eines grauen Pulvers mit 4o ooo bis 6ö ooo RE an gonadotropen Hormon erhalten und aus der organischen Lösung etwa 5 bis 6 g eines Rohöls, in dem 30 ooo bis -4o ooo RE an oestrogenen Wirkstoffen nachweisbar waren. Beispiel 7 5 1 des in Beispiel q. verwendeten Serums trächtiger Stuten wird nach Enteiweisung und Einstellung auf PH = 7 gemäß Beispiel 4 unter lebhaften Schütteln mit 3 1 Chinolin und an-#zchließend mit 3 kg Ammonsulfat in kleinen Teilen versetzt. Nach Abtrennung der Schichten wird die wäßrige Phase nochmals in gleicher Weise mit der gleichen Menge Chinolin extrahiert. Die vereinigten Chinolinauszüge «-erden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und mit dem 4fachen ihres Volumens in' Äther versetzt. Dabei fallen die gonadotropen Wirkstoffe in fester Form aus. Sie werden abzentrifugiert und mit Äther gewaschen. So erhält man i bis 2 g eines trockenen Pulvers mit 40 000 bis 6o ooo RE je Gramm an gonadotropen Hormon.

Claims (1)

1. PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Gewinnung hormonaler Wirkstoffe von der Wirkungsweise der gonadotropen Hypophysenvorderlappenhormone durch Extraktion von diese enthaltenden biologischen Flüssigkeiten oder Extrakten mittels mit ZVasser nicht oder nur begrenzt mischbarer organischer Verbindungen, welche die gonadotropen Wirkstoffe und vorhandene lipoidlösliche Hormone zu lösen vermögen, oder mittels Gemischen derselben, dadurch gekennzeichnet, daß man vor oder während der Extraktion die Löslichkeit der hormonalen Wirkstoffe in der wäßrigen Phase durch Zusatz wasserlöslicher anorganischer Salze, die im Extraktionsmittel schwer löslich sind, vorzugsweise von Ammonstilfat, verringert, aus dem Extrakt die gonadotropen Hormone durch Zusatz eines organischen Lösungsmittels, vorzugsweise Äther, fällt und aus der Lösung die lipoidlöslichen Wirkstoffe in an sich bekannter Weise abscheidet. Ausführungsform des Verfahrens nach Anspruch r, dadurch gekennzeichnet, daß man als Extraktionsmittel Phenole oder Phenolgemische, vorzugsweise in=hresol, verwendet. Ausführungsform des Verfahrens nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man als Extraktionsmittel aromatische Lasen vom Typ des Anilins oder Chinolins heranzieht.