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Verfahren zur Gewinnung von Neomycin A und seinen Salzen In einer
Veröffentlichung von Waksman und Le Chevalier (Sience, 109, 305 bis 307 [z949])
ist erwähnt, daß gewisse Stämme von Actinomyces, insbesondere solche, welche zu
der Gattung Streptomyces gehören, beim Wachsen in geeigneten Nährmedien ein Material
liefern, das aktiv ist gegen streptomycinbeständige Bakterien, insbesondere gegen
streptomycinbeständige Stämme von M. tuberculosis. Weiterhin ist in der Arbeit erwähnt,
daß ein Organismus, der als Actinomyces fradii bzw. Streptomyces fradiae identifiziert
wurde, ein Produkt liefert, das als Neomycin bezeichnet wurde. Das Neomycin wurde
als basische Verbindung gekennzeichnet, welche in Wasser löslich und in organischen
Lösungsmitteln unlöslich, wärmebeständig und gegen zahlreiche grampositive und gram-negative
Bakterien, aber nicht gegen Pilze aktiv ist und bei alkalischer Reaktion besondere
Aktivität zeigt. Schließlich ist in der Veröffentlichung an Hand vergleichender
antibiotischer Spektren gezeigt, daß das rohe Neomycin verschieden ist vom Streptomycin
und Streptothrycin und sich auch mit Bezug auf Aktivität von diesen Verbindungen
unterscheidet.
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Im Gegensatz zu der vorstehend erwähnten Veröffentlichung, nach der
das rohe Neomycin eine einzige aktive Verbindung darstellt, wurde gefunden, daß
das Rohprodukt in Wirklichkeit eine Mehrzahl von antibiotischen Substanzen enthält.
Nach den Feststellungen
der Patentinhaberin sind dreiverschiedene
antibiotische Verbindungen zugegen, die als Neomycin A, Neomycin B und Neomycin
C bezeichnet werden. Der Anteil des Neomycin A ist größer als der an Neomycin C.
Der Anteil an Neomycin C ist größer als der an Neomycin B. Der Anteil an Neomycin
A ist geringer als die vereinigten Anteile von Neomycin B und Neomycin C. Im übrigen
variieren die Anteile der antibiotischen aktiven Fraktionen in den einzelnen Ansätzen
je nach dem Medium, das zur Herstellung des Rohneomycins Verwendung gefunden hat.
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Neomycin A unterscheidet sich von Neomycin B und Neomycin C durch
seine größere Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln. Neomycin B ist durch seine
geringe Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln gekennzeichnet. Neomycin C besitzt
eine Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln, welche zwischen der von Neomycin
A und Neomycin B liegt.
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Die Erfindung befaßt sich mit der Trennung der drei aktiven Neomycinkomponenten
und insbesondere mit der Isolierung von Neomycin A. Die Erfindung gestattet die
Gewinnung von praktisch reinem Neomycin A und von sauren Salzen dieser Verbindung
aus Kulturflüssigkeiten, die durch Wachsen ausgewählter Stämme von Actinomyces in
geeigneten Kulturmedien erhalten werden.
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Erfindungsgemäß wird zunächst ein pikrinsaures Salz hergestellt, indem
ein rohes, saures Neomycinsalz in wässeriger Lösung mit Pikrinsäure in Reaktion
gebracht wird und das so erhaltene Neomycinpikrat durch Einwirkung einer Mineralsäure
in ein mineralsaures Salz von Neomycin übergeführt wird. Das Pikrat oder das daraus
gewonnene mineralsaure Salz kann nun der chromatographischen Adsorption und Extraktion
unterworfen werden und das so erhaltene, weitgehend gereinigte Produkt mit einem
Arylazosulfonsäuresalz zwecks Bildung eines kristallinen Salzes von Neomycin A behandelt
werden, das dann in ein praktisch reines mineralsaures Neomycinsalz, z. B. Neomycin-A-Hydrochlorid,
übergeführt werden kann.
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Wenn ein Konzentrat von Neomycinhydrochlorid, das nach der eingangs
erwähnten Veröffentlichung von Waksman und Le Chevalier gewonnen worden ist, mit
Pikrinsäure in Reaktion gebracht wird und das so erhaltene pikrinsaure Salz bzw.
der so erhaltene Komplex in Neomycinhydrochlorid übergeführt wird, ist die Gesamtaktivität
des so erhaltenen Hydrochlorids fast immer erheblich größer als die Gesamtaktivität
des Ausgangsmaterials und oft zweibis dreimal so groß. Dies spricht dafür, daß die
Pikrinsäure eine chemische Veränderung bewirkt, z. B. die Spaltung einer kombinierten
bzw. komplexen Form von Neomycin unter Freimachung von aktiven Molekülen, welche
eine größere Aktivität besitzen als die komplexe Form des Neomycins. Die Zunahme
der Aktivität kann aber auch zum Teil auf einer Trennung der Komponenten mit antibiotischer
Aktivität von die Aktivität hemmenden Substanzen beruhen, welche in dem Kulturkonzentrat
vorhanden waren.
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Die Herstellung des pikrinsauren Salzes kann mit Vorteil derart erfolgen,
daß z Gewichtsteil Rohneomycinhydrochlorid, gelöst in etwa 6 Raumteilen Wasser,
auf etwa 7o° erwärmt und mit einer Lösung von etwa 1,5 Gewichtsteilen Pikrinsäure
in etwa 3o Raumteilen Wasser in Reaktion gebracht wird. Die Neomycinhydrochloridlösung
wird zweckmäßig rasch zu der nahezu kochenden Lösung der Pikrinsäure gegeben. Hierbei
scheidet sich unmittelbar ein öliger Niederschlag von Neomycinpikrat ab. Die Mischung
wird dann gekühlt und die Mutterlauge von dem gummiartigen Niederschlag durch Dekantieren
getrennt. Der Niederschlag wird in etwa 3 Teilen Aceton gelöst und die erhaltene
Lösung mit etwa 54 Teilen Aceton, das o,5 Teile Chlorwasserstoffsäure enthält, gemischt.
Hierbei erfolgt Fällung von Neomycinhydrochlorid. Das regenerierte Hydrochlorid
hat im allgemeinen eine Aktivität je Gewichtseinheit, die zumindest drei- bis viermal
so groß ist wie die Aktivität des Ausgangskonzentrats. Das Neomycin kann auch in
Form anderer mineralsaurer Salze gewonnen werden, z. B. derart, daß das pikrinsaure
Salz in Acetonlösung mit Mineralsäuren, wie Schwefelsäure, in Reaktion gebracht
wird.
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Die Reinigung von Neomycin und Isolierung von Neomycin A kann erfindungsgemäß
durch chromatographische Adsorption und Elution mit Hilfe geeigneter Adsorptionsmittel,
wie Holzkohle, mit Säure gewaschener Holzkohle, Tonerde, mit Säure gewaschener Tonerde,
Diatomeenerde und Silikagel, vorgenommen werden. Holzkohle und sauer gewaschene
Tonerde haben sich als besonders geeignet erwiesen.
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Das Neomycinsalz, das der chromatographischen Reinigung unterworfen
wird, soll genügend konzentriert und so weit vorgereinigt werden, daß es eine Aktivität
von Zoo bis 25o oder mehr Einheiten je Milligramm besitzt. Die gewünschte Aktivität
kann durch wiederholtes Ausfällen des Rohneomycinsalzes aus organischen Lösungsmitteln
erzielt werden. Vorteilhafter wird die Aktivitätserhöhung mit Hilfe des oben beschriebenen
Neomycinpikrats bewirkt.
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Zwecks Durchführung des chromatographischen Verfahrens wird das Neomycinsalz
in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Methanol oder wässerigem Methanol, gelöst
und die Lösung mit dem Adsorptionsmittel, das vorteilhaft in einer Kolonne vorgesehen
ist, in Berührung gebracht. Die Kolonne wird alsdann mit zusätzlichem Lösungsmittel
ausgewaschen und die abfließende Lösung von Zeit zu Zeit geprüft, indem ein paar
Tropfen der Lösung Aceton oder Äther zugefügt werden. Hierbei zeigt das Auftreten
eines Niederschlags an, daß antibiotische Substanzen begonnen haben, die Kolonne
zu verlassen. Die Kolonne kann in getrennte Zonen unterteilt und Fraktionen für
die Extraktion von antibiotischen Stoffen gewonnen werden. Es empfiehlt sich aber,
die Fraktionierung durch kontinuierliches Auswaschen der Kolonne mit einem Lösungsmittel,
wie Methanol, wässerigem Methanol oder saurem wässerigem Methanol, durchzuführen
und eine Anzahl verschiedener Fraktionen zu sammeln, aus denen das Neomycinsalz
entweder direkt oder nach Eindampfen auf ein geeignetes Volumen durch Zugabe eines
mit der Lösung mischbaren Lösungsmittels, in dem das Salz praktisch unlöslich ist,
wie z. B. Aceton oder Äther, ausgefällt wird.
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Das zum Auswaschen der Kolonne dienende Lösungsmittel ist dem verwendeten
Adsorptionsmittel
anzupassen. Bei Verwendung von mit Säure gewaschener
Tonerde als Adsorptionsmittelempfiehlt sich z. B. die Anwendung von Methanol mit
einem Wassergehalt bis zu etwa 13 °/o. Hierdurch wird der Hauptteil der Verunreinigungen
von dem adsorbierten Neomycin getrennt. Methanol, das etwa 15 bis 50 °/o Wasser
enthält, ist gut geeignet für das Auswaschen der Zone von aktivem Material. Bei
Verwendung von alkalischer Tonerde als Adsorptionsmaterial ist die Anwendung von
Methanol mit Wassergehalten bis zu 5o °/a zur Entfernung von löslichen Verunreinigungen
gut geeignet, während die aktiven Zonen hierbei vorteilhaft mit Methanol extrahiert
werden, das etwa 5o bis 70 °/o Wasser enthält.
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Bei Prüfung verschiedener Fraktionen von Auszügen durch das Gegenstromverteilungsverfahren
hat sich gezeigt, daß die Zusammensetzung von aufeinanderfolgenden Auszugsfraktionen
beträchtliche Schwankungen aufweisen kann. Bei Anwendung von sauer gewaschener Tonerde
als Adsorptionsmaterial und wässerigem Methanol als Extraktionsmittel enthalten
die ersten Fraktionen vorwiegend ein einziges antibiötisches Material, nämlich Neomycin
A. Die nachfolgenden Fraktionen enthalten noch beträchtliche Mengen von Neomycin
A neben zunehmenden Mengen von Neomycin B und Neomycin C. Anscheinend hat die Tonerde
die Neigung, Neomycin B und C zurückzuhalten. Diese Neigung kann aber durch Auswaschen
der Kolonne mit etwa o,i n-wässeriger Salzsäure weitgehend überwunden werden.
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Die selektive Extraktion unter Gewinnung von Fraktionen, welche vorwiegend
Neomycin A enthalten, und die Wirkung des Pikrinsäureverfahrens im Sinne der erhöhten
Gewinnung von Neomycin A sind aus den nachfolgenden Vergleichsdaten ersichtlich.
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Eine Probe von 2o g Neomycinhydrochlorid mit einer Aktivität von etwa
23o E/mg, welche nicht die Pikratstufe durchlaufen hatte, wurde in einer Kolonne
chromatographisch behandelt, die mit iooo g einer sauer gewaschenen Tonerde beschickt
war. Die Ergebnisse sind aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlich:
| Gewicht Aktivität |
| Extraktionsmittel der wieder- der |
| Fraktion gewonnenen Fraktions- |
| festen Fraktion einheften |
| Volumen # Methanol |
| ccm °/o . g Je mg |
| 1 140o go 4,53 304 |
| 2 2800 85 4,10 427 |
| 3 2020 8o 2,5o 31o |
| 4 1950 70 2,37 38o |
Zwei weitere Proben von 2o g Neomycinhydrochlorid mit einer Aktivität von
239 E/mg, welche durch Regeneration von Neomycinpikrat gewonnen worden sind,
wurden in gleicher Weise in zwei Kolonnen chromatographisch behandelt, welche je
iooo g sauer gewaschene Tonerde enthielten. Entsprechende Fraktionen aus den beiden
Kolonnen wurden miteinander vereinigt. Es wurden die nachstehenden Ergebnisse erhalten
| Geeicht Aktivität |
| Extraktionsmittel der wieder- der |
| Fraktion gewonnenen Fraktions- |
| festen einheiten |
| Volumen Methanol Fraktion |
| ccm % g je mg |
| 1 3200 ! go 18,i 29o |
| 2 582o 85 g,6 76o |
| 3 642o 8o 5,4 683 |
Aus Tabelle i ist ersichtlich, daß die Fraktionen 2 und 4 eine höhere Aktivität
besitzen als die Fraktion 3. Es hat also eine Trennung von zumindest zwei aktiven
Komponenten stattgefunden. Ein Vergleich der Aktivität des aus Fraktion 2 gewonnenen
Materials (Neomycin A) mit der erhöhten Aktivität der Fraktion 2 in Tabelle 2 zeigt,
daß die Pikratstufe zu einer erhöhten Ausbeute an Neomycin A geführt hat.
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Eine einfache chromatographische Reinigungsbehandlung liefert zumindest
einen Teil der Aktivität in Form eines gereinigten Materials, dessen Aktivität zwei-
bis fünfmal so hoch ist wie die Aktivität des Ausgangskonzentrats. Aufeinanderfolgende
chromatographische Behandlungen von aus den Auszugsfraktionen wiedergewonnenen Neomycinsalzen
ergeben eine weitere Reinigung und Trennung der verschiedenen Neomycinkomponenten.
Man kann mit Hilfe des chromatographischen Verfahrens Konzentrate von Neomycin A
erhalten, welche eine Aktivität von 5oo bis iooo E/mg aufweisen. Die durch chromatographische
Reinigung erhältlichen Neomycin-A-Salze, welche bereits einen beträchtlichen Reinigungsgrad
aufweisen, können in praktisch reine Produkte übergeführt werden. Diese Reinigung
kann durch Reaktion mit gewissen arylazosulfonsauren Salzen erfolgen, welche kristalline
Salze von Neomycin A bilden, die durch Umkristallisation leicht gereinigt und dann
in ein praktisch reines Neomycin-A-Mineralsäuresalz übergeführt werden können.
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Wie gefunden wurde, bildet u. a. das Natriump-(p'-oxyphenylazo)-benzolsulfonat
ein leicht zu reinigendes Salz mit Neomycin A, wenn ein Säuresalz von Neomycin A
mit einer Aktivität von mindestens 400 E/mg, vorzugsweise etwa 7oo E/mg, damit in
Wasser, Methanol oder einem wasserhaltigen Gemisch von niedrigen aliphatischen Alkoholen
in Reaktion gebracht wird. Vorteilhaft wird Wasser oder wässeriges Methanol verwendet.
Sehr befriedigende Ergebnisse werden erzielt, wenn das Umkristallisieren des arylazosulfonsauren
Salzes von Neomycin A aus wässerigem Methanol erfolgt, das 5 bis 5o °/o Methanol
enthält. Zwecks Bildung des Salzes wird vorteilhaft das mineralsaure Salz von Neomycin
A und das arylazosulfonsaure Salz in einem Gewichtsverhältnis von etwa 2 : 1 verwendet.
Die Reaktion kann bei Temperaturen zwischen . Raumtemperatur und ioo° durchgeführt
werden. Vorteilhaft wird bei etwa 6o bis 7o° gearbeitet. Hierbei verläuft die Reaktion
fast augenblicklich.
Das kristalline p-(p'-oxyphenylazo)-benzolsulfonsaure
Salz von Neomycin A hat nach Reinigung durch Umkristallisieren eine Aktivität von
etwa 65o E/mg; bei etwa 225° beginnt es, sich ohne zu schmelzen zu zersetzen; bei
ultravioletten Adsorptionsprüfungen zeigt sich ein ausgesprochenes Band bei 3700
(E i cm = 400).
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Verwendet man zur Herstellung des kristallinen Salzes z. B. Natrium-p-(p'-oxyphenylazo)-benzolsulfonat
in einer Menge, die geringer ist als die äquivalente Menge, so erhält man unmittelbar
einen kristallinen, verhältnismäßig reinen Niederschlag. Bei Anwendung größerer
Mengen der genannten Verbindung erhält man weniger reine Produkte, die anscheinend
kristalline Formen von Neomycin B und C enthalten. Auch das angewendete mineralsaure
Salz von Neomycin kann den Kristallisationsvorgang beeinflussen. Wenn z. B. das
mineralsaure Salz des Neomycins aus einer späteren Fraktion des chromatographischen
Verfahrens stammt und' wesentliche Mengen von Neomycin B und C enthält, so ist es
schwierig, ein kristallines reines Salz von Neomycin A zu erhalten. Wenn dagegen
ein mineralsaures Salz von Neomycin A, das eine Aktivität von wenigstens 7oo E/mg
aufweist, angewendet wird, so bleiben etwa noch anwesende geringe Mengen von Neomycin
B oder C während der Kristallisationsstufe anscheinend in Lösung. In diesem Fall
wird bei Zugabe von weiterem Natrium-p-(p'-oxyphenylazo)-benzolsulfonat zu der Mutterlauge
nach der Kristallisation von Neomycin A ein kristallines, nadelförmiges Produkt
erhalten, das bei der Elementaranalyse andere Werte ergibt als Neomycin A.
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Für die Tatsache, daß die Mutterlauge nach Auskristallisieren des
arylazosulfonsauren Salzes von Neomycin noch restliche Mengen von Neomycin A sowie
Neomycin B enthält, spricht auch folgender Versuch Eine Portion eines Materials,
das aus einem Auszug stammte, der zu Beginn der chromatographischen Behandlung in
einer Kolonne erhalten wurde, wurde mit der Hälfte ihres Gewichts an Natrium-p-(p'-oxyphenylazo)-benzolsulfonat
behandelt. Hierbei wurde ein im wesentlichen reines, kristallisiertes Neomycin-A-Salz
in einer Ausbeute von etwa 40 °/o des Ausgangsgewichts erhalten. Die Mutterlauge
des Salzes wurde durch Extraktion der angesäuerten Lösung mit Butanol von der Sulfonsäure
befreit. Die wässerige Lösung wurde dann neutralisiert und durch Behandlung mit
Pikrinsäure ein Pikrat erzeugt, das anschließend in das chlorwasserstoffsaure Salz
übergeführt wurde. Die nach Abtrennung des unlöslichen Pikrats verbleibende Mutterlauge
wurde von Pikrinsäure befreit und zu einem Sirup eingedampft, der mit Methanol verdünnt
und durch Eingießen der Lösung in Aceton niedergeschlagen" wurde. Das erhaltene
Produkt wurde getrocknet. Das Neomycin-A-Hydrochlorid, das aus dem Pikrat gewonnene
Hydrochlorid und das aus der Pikratmutterlauge gewonnene Produkt wurden mit Hilfe
von Verteilungsverfahren geprüft. Hierbei wurde für die Gegenstromverteilung ein
Zweiphasensystem verwendet, 'das aus den folgenden Phasen bestand: einer M/2-Borat-Puffer-Lösung
vom pn-Wert 7,3 als wässerige Phase und einer 5 °/Qigen Lösung von Stearinsäure
in Pentasol als zweite organische Lösungsmittelphase. Unter Pentasol wird eine Mischung
von fünf Alkoholen verstanden. Die beiden Phasen wurden vor dem Gebrauch miteinander
gesättigt. Die unter Vergleichsbedingungen in jedem Rohr erzielten Aktivitäten sind
aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlich:
| Aktivität in jedem Rohr am Ende der Verteilung |
| I 1I IN |
| Rohr Neomycin-A- Hydrochlorid Produkt aus der |
| Hydrochloridl) des Pikrats2) Pikratmutterlauge3) |
| E/ccm E/ccm E/ccm |
| I (Wasserlöslicher Rest) ......... 0 310 2740 |
| 2 .............................. 0 53 970 |
| 3 .... - ......................... 0 50 592 |
| 4 .........:.................... 54 145 733 |
| 5 .............................. 168 98o- 739 |
| 6 . « ............................ 517 1700 692 |
| 7 .............................. 742 2280 309 |
| 8 (Lösungsmittel löslicher Rest) . . . 410 |
| 1) 7,2 mg laufen in acht Röhren 2) 32,2 mg laufen in sieben
Röhren 3) roq,o mg laufen in sieben Röhren |
Aus Spalte I der vorstehenden Tabelle geht hervor, daß das aus p-(p'-oxyphenylazo)-benzolsulfonsaurem
Salz regenerierte Neomycin-A-Hydrochlorid eine einzelne homogene Komponente ist.
Die Spalte 1I zeigt, daß die Behandlung der Mutterlauge aus der Bildung des kristallinen
arylmosulfonsauren Salzes von Neomycin A mit Pikrinsäure und anschließende Reaktion
des Pikrats zu Hydrochlorid eine weitergehende Trennung von Neomycin A aus der Mutterlauge
bewirkt, daß aber das so gewonnene Material zumindest noch eine andere aktive Komponente
enthält. Spalte III veranschaulicht die trennende Wirkung der Pikratbehandlung,
da die Spitzenaktivitäten in den Rohren I und 5 die Gegenwart von zwei aktiven Komponenten
anzeigen
und der niedrige Wert in Rohr 7 anzeigt, daß der Neomycin-A-Gehalt dieses Materials
sehr niedrig ist. Der nachfolgende Vergleich der Aktivitäten gegen verschiedene
Mikroorganismen zeigt die verschiedenen spezifischen Wirkungen des Neomycin-A-Hydrochlorids
und des aus der Pikratmutterlauge gewonnenen Hydrochlorids:
| Anzahl ccm, die für die Hemmung |
| erforderlich sind |
| Neomycin-A- Produkt |
| Hydrochlorid aus Pikrat- |
| E#mg mutterlauge |
| r7oo |
| 300 E/mg |
| 1. Aspergillus niger |
| MF 442 ......... < 59 < 150 |
| 2. Trichophyton |
| mentogrophytes |
| MF 1932 ........ < 59 < 150 |
| 3. Bodenheimers |
| bacillus MB 265.- 15 1g |
| 4. B. cereus MG 1g 1,5 37 |
| 5. M. Lisodeikticus |
| MB 79 . . . . . . . . . 1,5 3,7 |
| 6. B. subtilis MB 249 2,0 15 |
| 7. E. coli W MB 2o8 7,4 7,5 |
| B. E. coli W, strepto- |
| mycin resistant . . 30 1g |
| g. E. coli C |
| MB 61/MB 273. . 7,4 7,5 |
| 1o. E. coli C neomy- |
| cin resistant ..... 59 75 |
| 11. S. aureus MB log 0,74 15 |
Aus den gereinigten kristallinen arylazosulfonsauren Salzen von Neomycin A können
im wesentlichen reine mineralsaure Salze des Neomycin A dadurch berggestellt werden,
daß das komplexe Salz mit einem Überschuß einer Mineralsäure, z. B. Chlorwasserstoffsäure
oder Schwefelsäure in Wasser, Methanol oder einer wässerigen Mischung von niederen
aliphatischen Alkoholen in Reaktion gebracht wird. Die hierbei in Freiheit gesetzte
Arylazosulfonsäure wird durch Filtration oder Extraktion mit Butanol entfernt und
das mineralsaure Salz von Neomycin A, das im Filtrat oder in der wässerigen Phase
verblieben ist, nach erfolgter Extraktion durch Eingießen des Filtrats oder der
wässei i en Lösung in ein Lösungsmittel, z. B. Aceton oder tgher oder ein Gemisch
beider, das mit der zu behandelnden Lösung mischbar ist, aber nicht lösend auf das
antibiotische Salz wirkt, niedergeschlagen. Der so erhaltene Niederschlag ist nach
Befreiung von den Lösungsmitteln und Trocknen ein praktisch reines mineralsaures
Salz von Neomycin A, das eine Aktivität von etwa 17oo E/mg besitzt und nach Trocknen
bei Raumtemperatur und Erhitzen auf dem Mikroblock (Koller Mikroschmelzblock) bei
etwa 2oo° zu dunkeln beginnt und bei etwa 25o bis 26o° unter Zersetzung schmilzt.
Das Salz hat eine Drehung im Wasser von etwa [a] D -f- 83° (c, 1,o in Wasser). Eine
wässerige Lösung zeigt im wesentlichen nur eine Absorption im ultravioletten Gebiet.
Die potentiometrische Titration von Neomycin-A-Hydrochlorid ergibt ein Äquivalentgewicht
von 128. Der Mittelpunkt der Titrationsspanne ist bei pH 7,7o bis 7,8o. Neomycin-A-Hydxochlorid
ergibt einen positiven Ninhydrintest; dagegen sind der Sakaguchitest für Guanidingruppen,
der Elson-Morgan-Test für Glukosamine und Teste für Maltol negativ.
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Eine Gegenstromverteilung von Neomycin-A-Hydrochlorid in gegenseitig
gesättigten Phasen mit M/2 PH 7,3 Borat-Puffer und einer Lösung von 5 °/o Stearinsäure
in Pentasol zeigt die Anwesenheit einer einzigen Komponente durch Teste für biologische
Aktivität und quantitative Ninhydrinversuche an. Der Teilungskoeffizient bei diesem
System ist etwa 5. Elementaranalysen von Neomycin-A-Hydrochlorid ergaben: C = 32,52;
H = 6,86; N = 11,57; Cl = 28,65. Der Gewichtsverlust beim Trocknen der analytischen
Probe während 2 Stunden bei ioo° im Vakuum betrug 9,7 %. Eine analytische Bestimmung
des Aminostickstoffs ergab einen Wert von 11,25 °/o. Die Tatsache, daß der Aminostickstoff
gleich dem Totalstickstoff ist, ist eine charakteristische Eigenschaft des Neomycin
A. Eine weitere charakteristische Eigenschaft ist das Infrarot-Absorptionsspektrum
des wasserfreien Neomycin-A-Hydrochlorids, welches charakteristische Absorptionsstreifen
von - O H- und > N H+- Gruppen zeigt, und die Abwesenheit von Absorption in dem
Bereich, der für Ester, Carbonyl und monosubstituierte Aminogruppen charakteristisch
ist.
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Das Acetyl-Neomycin-A zeigt Absorptionsstreifen, die charakteristisch
sind für NH-Gruppen, Estergruppen, Carbonylgruppen und monosubstituierte Amidogruppen,
zusammen mit einem scharfen reinen Absorptionsstreifen bei 9,3 ,cc. Der letztgenannte
Streifen ist auch in dem Spektrum des Hydrochlorids vorhanden, aber durch Hydroxylabsorption
etwas maskiert.
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Neomycin-A-Sulfat hat eine Aktivität von @ etwa 17oo E/mg. Die optische
Drehung des bei Raumtemperatur getrockneten Materials war [a] D + 72° (c, 1,0 in
Wasser) ; Neomycin-A-Sulfat, im Vakuum bei ioo° getrocknet, zeigt bei der Analyse
einen Stickstoffgehalt von etwa 11,25 °/o.
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Neomycin-A-Sulfat kann in die freie Neomycin-A-Base durch Reaktion
mit einer verdünnten wässerigen Lösung von z. B. etwa o,2 n-Bariumhydroxyd, Abtrennen
des Bariumsulfatniederschlags und Zugabe von Methanol und Aceton im Verhältnis von
etwa i : 1o zu der resultierenden Lösung gewonnen werden. Die freie, bei Raumtemperatur
getrocknete Base hat eine Aktivität von etwa 2345 E/mg und eine optische Drehung
von [a1 2D5 + 79° (c, 0,57 in Wasser). Beim Erhitzen 'auf dem Mikroblock
beginnt die Verbindung bei 21o° zu dunkeln; bei 27o° findet Zersetzung ohne Schmelzen
statt. Die Lösung der freien Base zeigt eine stark alkalische Reaktion.
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Alle in der vorliegenden Beschreibung gegebenen Konzentrationen (c)
bedeuten Gramm je Zoo ccm Lösungsmittel. Reines Neomycin-A-Hydrochlorid zeigt Aktivität
gegen verschiedene Mikroorganismen, insbesondere auch gegen Mikroorganismen, welche
beständig sind gegen Streptomycin (vgl. hierzu die folgende Tabelle)
| Neomycin-A- |
| Hy drochlorid |
| Konzentration |
| 14likroorganismen mg/ccm er- |
| forderlich für |
| vollständige |
| Hemmung |
| Staph. aureus MB zog ........... .0007q |
| B. subtilis MB 249 . . . . . . . . . . . . . . .002 |
| E. coli W (streptomycinbeständig) .030 |
| B.cereus MB ig ....... ....... .0015 |
| E. coli C (neomycinbeständig) .... .059 |
Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die verschiedenen Stufen der Herstellung
von reinen mineralsauren Salzen von Neomycin A gemäß Erfindung. Beispiele 1.
50 g Rohneomycinhydrochlorid (8o E/mg) würden in 30o ccm Wasser gelöst und
die Lösung auf 7o° erwärmt. Diese Lösung wurde auf einmal zu einer nahezu kochenden
Lösung von 75 g Pikrinsäure, die io °/fl Feuchtigkeit enthielt, in 1400 ccm Wasser
gegeben. Hierbei bildete sich sofort ein öliger Niederschlag von Neomycinpikrat.
Beim Abkühlen bis auf etwa 6o° wurde der Niederschlag viskos. Nunmehr wurde die
Flüssigkeit durch Dekantation entfernt und das gummiartige Produkt mit
50 ccm Wasser gewaschen. Die abgetrennte Lösung und die Waschflüssigkeit
wurden auf o bis 5° gekühlt, wobei ein weiterer dicker gummiartiger Niederschlag
erhalten wurde, der durch Pikrinsäurekristalle verunreinigt war. Die Mutterlauge
wurde durch Dekantatiön entfernt und der Rückstand mit ioo ccm Wasser gewaschen.
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Der zuerst erhaltene ölige Niederschlag von Neomycinpikrat aus zwei
5o-g-Ansätzen, die in der vorstehend beschriebenen Weise verarbeitet wurden, wurde
in etwa Zoo ccm Aceton gelöst. Die Lösung jedes öligen Niederschlags in etwa 75
ccm Aceton unter Rühren ging glatt vonstatten. Die vereinigten Lösungen wurden mit
Aceton auf etwa 6oo-ccm verdünnt und der so erhaltenen Lösung eine Lösung von 2o
ccm konzentrierter Chlorwasserstoffsäure in 28o ccm Aceton unter Rühren zugefügt.
Hierbei fand sofort Ausfällung von Neomycinhydrochlorid statt. Der Niederschlag
war gegen Ende der Reaktion gummiartig. Durch Zufügung von 2o ccm Wasser wurde die
Lösung des gummiartigen Produktes vervollständigt. Die wässerige Lösung wurde mit
z80 ccm Methanol verdünnt und dann in 2 1 Aceton gegossen, wobei Neomycinhydrochlorid
als rötlichgelbes Pulver ausgeschieden wurde. Im allgemeinen wird bei der ersten
Abtrennung des Hydrochlorids ein fester Niederschlag erhalten. Das Gewicht des Neomycinhydrochlorids,
das aus der ersten Pikratfraktion aus zwei vereinigten Ansätzen gewonnen wurde,
betrug 28,6 g, die Aktivität 250 E/mg.
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Der zweite ölige Niederschlag von Neomycinpikrat, der durch Kühlen
der von dem ersten Pikrat abgegetrennten Flüssigkeit auf o bis 5° erhalten wurde,
wurde in gleicher Weise aufgearbeitet. Diese durch Vereinigung von zwei 5o-g-Ansätzen
entstandene Fraktion wurde in das Hydrochlorid übergeführt. Die Ausbeute betrug
22,7 g, die Aktivität 29o E/mg. Die Ausbeuten sind aus der nachfolgenden Zusammenstellung
ersichtlich
| Fraktion |
| Gewicht Aktivität Gesamt- |
| in Gramm E/mg einheften |
| Ausgangsmaterial . . . . . . . . . . . . . . . ioo 8o
8000000 |
| Erste Pikratfraktion umgewandelt |
| in Hydrochlorid . . . . . . . . . . . . . . . 28,6
250 7150000 |
| Zweite Pikratfraktion umgewandelt |
| in Hydrochlorid............... 22,7 29o 6 60o ooo |
Die Diskrepanz der Aktivitäten beruht vermutlich nicht auf Variationen bei Durchführung
der Versuche, da es sich um Durchschnittswerte handelt. Möglicherweise wurde durch
Einwirkung der Pikrinsäüre aus einer gebundenen Form von Neomycin eine aktivere
Form in Freiheit gesetzt. Weiterhin besteht die Möglichkeit, daß hemmende Substanzen
zugegen waren, das Neomycin als Pikrat niedergeschlagen wurde und die hemmenden
Stoffe in Lösung verblieben sind.
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2. ioo g Neomycinhydrochlorid (8q. E/mg) wurden in 60o ccm Wasser
gelöst und die Lösung auf 7o° erwärmt. Hierauf wurde eine nahezu kochende Lösung
von 15o g Pikrinsäure in 3 1 Wasser zugefügt, die Mischung auf etwa io° gekühlt
und die Mutterlauge durch Dekantieren von dem gummiartigen Niedarschlag von Neomycinpikrat
getrennt. Der Niederschlag wurde in etwa
300 ccm Aceton gelöst und die Lösung
mit 3400 ccm Aceton, enthaltend
50 ccm konzentrierter Chlorwasserstoffsäure,
vermischt. Das ausgefällte Neomycinhydrochlorid wog 64,7 g. Nach Waschen mit Aceton
und Trocknen zeigte das Produkt eine Aktivität von etwa 240 E/1119-3. Eine 2-g-Probe
von zwei verschiedenen Röhneomycinkonzentraten wurde in 12 ccm Wasser gelöst und
die Lösung auf 6o° erhitzt. Zu jeder Probe wurde eine Lösung von 5 g Pikrinsäure
in 6o ccm auf go° erhitztem Wasser zugegeben. Jede Probe wurde dann auf 5° gekühlt
und die Flüssigkeit von dem ausgeschiedenen gummiartigen Pikrat getrennt. In jedem
Falle wurden die Pikrate in je 15 ccm Aceton gelöst und die Acetonlösung unter heftigem
Rühren in i50 ccm Aceton, enthaltend 1,5 ccm konzentrierte Salzsäure, gegossen.
Das niedergeschlagene Neomycinhydrochlorid wurde auf einem Filter gesammelt, mit
Aceton und Äther gewaschen. und im Vakuum getrocknet.
Die Ergebnisse
von sorgfältig durchgeführten Vergleichsversuchen mit Originalmaterialien und regenerierten
Hydrochloriden sind aus der nachfolgenden Zusammenstellung ersichtlich:
| Probe Produkt |
| Gewicht Original- Gewicht Parallel- Prozentuale |
| in Gramm Versuche versuch in Gramm versuch Wieder- |
| gewinnung der |
| E/mg E/mg E/mg Aktivität |
| 1 2,0 195 84 1.32 310 105 |
| 2 |
| 2,0 |
| 157 |
| ioo |
| o,88 |
| 336 |
| 94 |
Die vergleichenden Prüfungen zeigen eine etwa quantitative Erhaltung der Aktivität;
auf der Basis von früheren Prüfungen des Ausgangsmaterials sind bei der vorliegenden
Prüfung über ioo % in der Mutterlauge erhalten geblieben. Diese Erhaltung der Aktivität
ist ausnahmsweise hoch. Es besteht infolgedessen die Möglichkeit einer Spaltung
von weniger aktiven Formen von Neomycin A oder der Beseitigung von hemmend wirkenden
Stoffen.
-
4. 22g Neomycinhydrochlorid (Aktivität 29o E/mg), hergestellt über
das Pikrat wie im Beispiel 1 beschrieben, wurden in 18 ccrn Wasser gelöst und die
Lösung in eine chromatographische, mit 1 kg Tonerde beschickte Kolonne eingeführt,
welche durch Waschen mit Schwefelsäure auf pli 4,5 gebracht worden ist. Die Kolonne
wurde mit absolutem Methanol beschickt und aufeinanderfolgend 25oo ccm go%iges Methanol,
5000 ccm 85%iges Methanol und 2ooo ccm 8o%iges Methanol eingeführt. Nachdem die
durch Pikrinsäure verursachte gelbe Färbung in Erscheinung trat, wurden drei entsprechende
Fraktionen aufgefangen und im Vakuum zu einem dünnen Sirup konzentriert. Die sirupösen
Produkte wurden unter absolutem Äthanol zerrieben, filtriert und getrocknet. Die
Ergebnisse sind nachstehend zusammengefaßt
| Gewicht Prozent der |
| Fraktion Volumen in Gramm Aktivität Gesamt- Ausgangs- |
| von Fest- einheiten aktivität |
| ccm körpern E/mg |
| 1 1700 5,69 300 1700000 26 |
| 2 - 3000 4,77 700 3340000 52 |
| 3 2000 2,12 500 1 o6o ooo 16 |
| Ausgangs- |
| probe ... |
| 22,0 290 |
| 6400000 |
| ioo |
Eine 2-g-ProbevonNeomycinhydrochlorid (175E/mg) wurde in 2 ccm Wasser gelöst und
die Lösung mit 18 ccm Methanol verdünnt. Diese Lösung wurde chromatographisch in
einer Kolonne behandelt, die mit ioo g nicht sauer gewaschener, mit Methanol behandelter
Tonerde beschickt war. Der Vorgang in der Kolonne wurde mit 25o-ccm-Portionen von
go%igem, 85%igem, 8o%igem, 7o%igem, 50%igem und 30%igem Methanol und schließlich
mit Wasser durchgeführt. Erst in dem 70%igen Methanolauszug trat Aktivität schwach
in Erscheinung. Infolgedessen wurden Feststoffe nur aus den 5o%igen und 30%igen
Methanolauszügen und dem Wasserauszug gewonnen. Folgende Ergebnisse wurden erzielt:
| Fraktion Gewicht Aktivität |
| in Gramm I E/mg |
| 50 % Methanolauszug ..... o,287 242 |
| 3o 0/0 Methanolauszug . . . -. 0,287 315 |
| Wasserauszug ........... 01155 285 |
Mit einem Präparat von rohem Neomycinhydrochlorid (loo E/mg) wurde eine sehr zufriedenstellende
Reinigung durch direkte chromatographische Behandlung mit sauer gewaschener Tonerde
in wässerigem Methanol erzielt. Es wurde eine Spitzenfraktion mit
700 E/mg
erhalten. Diese Fraktion erschien in einem 70%igen Methanolauszug; eine Fraktion
mit 40o bis 5oo E/mg wurde durch weitere Extraktion mit 50%igem Methanol erhalten.
-
5. 2 g Rohneomycinhydrochlorid (loo E/mg) wurden in 20 ccm 85%igem
Methanol gelöst und chromatographisch mit ioo g sauer gewaschener Tonerde behandelt.
Die erhaltenen Auszüge, die Gewichtsausbeuten nach Isolierung der festen Fraktionen
und die Aktivitäten der festen Fraktionen sind aus der nachfolgenden Zusammenstellung
ersichtlich (Tabelle s. Seite 8, oben).
-
6. Eine Kolonne wurde mit einer Mischung von Zoo g aktiver Holzkohle
und 75 g Fasern beschickt. Die Trockenmischung wurde portionsweise eingefüllt und
nach jeder Zugabe festgestampft. Hierauf wurde eine Lösung von ioo g Rohneomycinhydrochlorid
in 6oo ccm 75%igem Methanol eingeführt. Anschließend wurden 21 Methanol (75 0/0)
und darauf 1 1 Methanol (5004) in die Kolonne eingeführt. Vier Fraktionen von je
5oo ccm (75 % Methanol) wurden gesammelt und dann eine Fraktion von 1 1 (Methanol
5004) abgenommen. Die ersten beiden Fraktionen wurden in etwa die zehnfache
Menge Aceton eingegossen, wobei eine gummiartige Ausfällung
| Gewicht |
| Fraktion Lösungsmittel Extrakt- der festen Volumen Fraktionen
@tät |
| in Gramm E/mg |
| 1 go °/a Methanol ....... 250 0505 < io |
| 2 850/, Methanol ....... 250 0,125 < 20 |
| 3 8o0/, Methanol ....... 500 0,232 250 |
| 4 7o"/, Methanol ....... 250 o,126 700 |
| 5 50°/o Methanol ....... 250 o,ig6 400 |
| 6 Wasser............... 250 0,170 125 |
erhalten wurde, die beim Verrühren mit absolutem Äthanol körnige Beschaffenheit
annahm. Die letzten beiden 5oo-ccm-Fraktionen wurden nach Ausfällung und Körnung
miteinander vereinigt. Die 5o°/oigen Methanolauszüge wurden nicht aufgearbeitet,
da sie nur eine Gesamtaktivität von 75 ooo E enthielten. Die Gewichte und Aktivitäten
der drei festen Fraktionen waren: 1. 5397 g, 94 E/mg,
2. 27,67 g,
143 E/mg;
3. und 4. vereinigt 2,o g,
97 E/mg. Die Farbe der Feststoffe war blaß gelbrot.
-
7.
500 mg von Neomycin-A-Konzentrat (75o E/mg), erhalten durch
chromatographische Behandlung, wurden einer nochmaligen chromatographischen Behandlung
in einer Kolonne unterworfen, welche mit 25 g sauer gewaschener Tonerde beschickt
war. Die aufgefangenen Extraktfraktionen wurden zu Sirupen eingedampft, unter Äthanol
gekörnt und getrocknet.
| . Auszug Feststoffe aus dem Auszug |
| Fraktion Volumen Methanol Gewicht Aktivität |
| ccm I_ °@a mg E/mg |
| 1 6o go 199 710 |
| 2 go 85 118 1220 |
| 3 ioo 80 58 925 |
| 4 ioo 70 75 300 |
Die Fraktion 2 war sehr reich an Neomycin A; sie dürfte mindestens 6o °/o Neomycin
A enthalten.
-
B. 1 g Neomycin-A-Hydrochlorid (70o E/mg), das nach den vorstehenden
Beispielen erhalten wurde, wurde in 15 ccm 4o°/oigen Methanols gelöst und die Lösung
auf 70° erwärmt. Alsdann wurde eine heiße Lösung (etwa go°) von o,5 g Natrium-p-(p'-oxyphenylazo)-benzolsulfonat
in 15 ccm Wasser zugegeben. Aus der zunächst klaren Mischung schieden sich bald
gelbe, durchscheinende Rosetten ab. Nach zweistündigem Stehen bei Raumtemperatur
wurde das kristalline Produkt auf einem Filter gesammelt, mit Wasser gewaschen und
im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug etwa
500 mg von kristallinem Neomycin-A-p-(p'-oxyphenylazo)-benzolsulfonat.
Das Produkt war praktisch rein. Beim Erhitzen begann Zersetzung bei etwa 225°. Die
Aktivität betrug etwa 65o E/mg. Spuren von noch vorhandenen Verunreinigungen konnten
durch Umkristallisieren entfernt werden, z. B. derart, daß die Verbindung in heißem
5- bis 50°/oigem Methanol gelöst wurde, die Lösung abkühlen gelassen wurde, die
Verbindung auf einem Filter in Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet wurde.
Die Analyse ergab: C = 50,42; H = 5,0z; N = ii,2o. Die Ergebnisse wiederholter Umkristallisationen
sind nachstehend zusammengestellt:
| Ultraviolette |
| Umkristallisation Beginn der Biologische Absorption |
| Lösungsmittel beiretwa°C Aktivität Intensität |
| E/mg E r lm |
| 200/, Methanol |
| i. Kristallisation 225 645 419 |
| 5o0/, Methanol |
| 2. Kristallisation 225 625 403 |
| 50/, Methanol |
| 3. Kristallisation 225 66o 400 |
| 504 Methanol |
| 4. Kristallisation 225 645 395 |
Bei dem vorstehend beschriebenen Verfahren, bei dem das Natrium-p-(p'-oxyphenylazo)-benzolsulfonat
in einer Menge angewendet wurde, die geringer war als die äquivalente Menge, wurde
ein kristalliner Niederschlag in praktisch reiner Form erhalten. Bei Verwendung
größerer Mengen kann man einen größeren Betrag der ursprünglich vorhandenen Aktivität
erhalten.- Es empfiehlt sich, für dieses Verfahren Neomycinkonzentrate mit mindestens
70o E/mg anzuwenden.
-
9. 14M9 Neomycin-A-Hydrochlorid wurden in 1,5 ccm 3o°/oigen Methanols
gelöst, die Lösung auf etwa- 6o° erwärmt und mit einer heißen Lösung von 12,2 mg
Methylorange in i ccm Wasser gemischt. Hierbei bildet sich sofort ein Niederschlag,
der nach Abkühlung auf Raumtemperatur auf einem Filter
gesammelt
wird. Ausbeute 12,6 mg. Das Produkt wurde aus 2 ccm 5o°/oigem Methanol umkristallisiert,
wobei 3 mg kurze Nadeln erhalten wurden, die sich beim Erwärmen in dem Bereich von
235 bis 285° zersetzen. Die Aktivität betrug 500 E/mg.
-
io. i g Neomycin-A-p-(p`-oxyphenylazo)-benzolsulfonat wurde in io
ccm Wasser und 2o ccm n-Butanol suspendiert und etwa 2,5 ccm 2,5 n-Schwefelsäure
zugemischt. Das Butanol, das viel frei gewordene Schwefelsäure enthält, wurde abgetrennt.
Drei Portionen von frischem n-Butanol wurden zur Extraktion der verbliebenen Schwefelsäure
verwendet. Die rückständige farblose wässerige Lösung wurde in die zwanzigfache
Menge Aceton gegossen. Der entstehende weiße amorphe Niederschlag von Neomycin-A-Sulfat
wurde durch Zentrifugieren gesammelt, mit Aceton ausgewaschen und getrocknet. Ausbeute:
282 mg [a] D -I-- 72° (Konzentration: i g in ioo ccm Wasser) ; Aktivität etwa i7oo
E/mg. Analyse: N 11,25.
-
ii. Eine Lösung von 57,3 mg Neomycin-A-Sulfat in 3 ccm Wasser wurde
auf etwa 7o° erwärmt und ziemlich rasch mit 2,i8 ccm von o,193 n-Bariumhydroxydlösung
vermischt, wobei ein körniger Niederschlag von Bariumsulfat ausfiel. Nach Kühlen
wurde die Mischung filtriert und das klare farblose Filtrat und das Waschwasser
mit Methanol auf ein Volumen von 2o ccm aufgefüllt und das Ganze in Zoo ccm Aceton
gegossen, wobei ein amorpher weißer Niederschlag von freiem Neomycin A entstand.
Das Produkt wurde durch Zentrifugieren gesammelt, mit Aceton ausgewaschen und getrocknet.
Ausbeute: 15 mg, [a] D + 72° (Konzentration: i g in ioo ccm Wasser); Aktivität etwa
2345 E/mg. Eine wässerige Lösung zeigt stark alkalische Reaktion. Beim Erhitzen
auf dem Mikroblock beginnt das Neomycin A bei 21o° zu dunkeln und zersetzt sich
allmählich beim Weitererhitzen auf 27o°, ohne zu schmelzen.
-
12. 240 mg reines Neomycin-A-p-(p'-oxyphenylazo)-benzolsulfonat wurden
in io ccm n-Butanol und io ccm Wasser suspendiert und 3 ccm n-i-Chlorwasserstoffsäure
unter Umrühren zugegeben. Das Salz ging hierbei sehr rasch in Lösung. Die die freie
Sulfonsäure enthaltende Butanolschicht wurde abgetrennt und zwei Portionen von frischem
Butanol nach und nach verwendet, um die verbliebene p-(p'-Oxyphenylazo)-benzolsulfonsäure
zu extrahieren. Die verbliebene wässerige Lösung von Neomycin-A-Hydrochlorid wurde
in die zwanzigfache Menge Aceton gegossen, wobei ein schneeweißes Pulver ausfällt.
Der Niederschlag von Neomycin-A-Hydrochlorid wurde durch Zentrifugieren gesammelt,
mit Aceton ausgewaschen und getrocknet. Ausbeute 6o mg. Aktivität etwa 1420 E/mg.
[a] D + 81° (Konzentration: i g in ioo ccm Wasser).
-
13. 2 g von einmal umkristallisiertem Neomycin-A-p-(p'-oxyphenylazo)-benzolsulfonat
wurden in 40 ccm Methanol suspendiert und die Suspension auf 5o bis 6o° erwärmt.
Zu der heißen Suspension wurden 16o ccm kochenden Wassers schnell zugegeben, um
Lösung herbeizuführen. Beim Kühlen schied sich ein voluminöses Produkt aus, das
auf einem Filter gesammelt wurde. Eine im Vakuum getrocknete Portion zeigte eine
Aktivität von etwa 6oo E/mg und zersetzte sich bei etwa 22o bis 24o°. Der Rest des
Materials wurde in noch feuchtem Zustand in 30 ccm heißem Methanol suspendiert
und die Suspension mit 120 ccm kochendem Wasser gemischt. Aus der so erhaltenen
klaren Lösung schied sich ein voluminöses Produkt aus; ein kleiner Teil desselben
wurde getrocknet. Aktivität etwa 730 E/mg; Zersetzung zwischen 225 und 245°.
Der Rückstand des voluminösen Materials wurde zweimal in der gleichen Weise umkristallisiert
unter Verwendung von 2o ccm Methanol und 8o ccm kochendem Wasser. Das erhaltene
feinkristalline Produkt wog 6oo mg, zeigte eine Aktivität von 75o E/mg und zersetzte
sich bei 22o bis 25o°.
-
Analyse: C =.5o,62; H = 5,o5; N = 1131; Gewichtsverlust beim Trocknen
während 2 Stunden bei ioo° im Trockenschrank 5,8; 4,8.
-
Zwecks Rückführung von 540 mg des vorstehend beschriebenen Salzes
in Hydrochlorid wurde die Trockenprobe in 3 ccm 2,5 n-Chlorwasserstoffsäure suspendiert
und 2o ccm n-Butanol in io ccm Wasser unter kräftigem Rühren zugegeben. Es bildeten
sich zwei Phasen, von denen die Butanolphase am meisten gefärbt war. Die Butanolphase
wurde abgetrennt und die wässerige Phase mit drei weiteren Portionen von mit Wasser
gesättigtem n-Butanol extrahiert. Diese Extrakte wurden zwecks Wiedergewinnung von
darin vorhandenem Neomycin-A-Hydrochlorid mit dem ersten Extrakt vereinigt. Die
farblose wässerige Phase wurde in 25o ccm Aceton gegossen, wobei ein körniges Material
erhalten wurde. Ausbeute: 162 mg; Aktivität i7oo E/mg [a] D -(- 83° (Konzentration:
i g in ioo ccm Wasser) ; Durchschnittsaktivität i7oo E/mg. - Analyse: C = 32,40;
H = 6,42; Gewichtsverlust bei 2stündigem Trocknen bei ioo° im Trockenschrank 9,6;
1o,4.
-
Da die Probe nur schwierig ohne Inkaufnahme von Verlusten durch Zerkleinerung
der Körner zu trocknen war, wurde sie in 5 ccm go°/@gem Methanol gelöst, die Lösung
durch 50 mg Aktivholzkohle geleitet und in 70 ccm Aceton gegossen,
wobei ein typisch flockiger Niederschlag entstand. Die so erhaltene Probe hatte
eine Aktivität von 1723 E/mg. Beim Erhitzen auf dem Mikroblock dunkelte die Verbindung
von 22o° an und schmolz bei 25o bis 26o° unter Bildung eines schwarzen Teers.
-
Analyse: C = 32,52; H = 6,86; N = 11,57; primärer Aminostickstoff
=11,25 ; Cl = 28,65; Gewichtsverlust bei 2stündigem Trocknen bei ioo° im
Trockenschrank 5,9; 9,7; 6,9.
-
Die folgenden Teste gaben negative Resultate Sakaguchi (Guanidingruppen),
Elson-Morgan (Glukosamine; Maltol). Der Ninhydrintest war positiv. Absorption wurde
nur im Ende des ultravioletten Gebiets beobachtet.
-
Durch Gegenstromverteilung, quantitative Ninhydrinbestimmungen und
biologische Prüfungen wurde festgestellt, daß Neomycin A eine einheitliche Substanz
darstellt und die geprüfte Probe als rein anzusehen war. Auf Grund von Prüfungen,
die mit acetyliertem Neomycin A durchgeführt wurden; dürfte das Molekulargewicht
von Neomycin-A-Hydrochlorid etwa 35o bis 40o betragen.
Das Acetyl-Neomycin-A
wurde wie folgt hergestellt: 1q.. Eine Mischung von 105,5 mg reinem Neomycin-A-Hydrochlorid,
75 mg geschmolzenem Natriumacetat und 15 ccm Essigsäureanhydrid wurde 1'/2 Stunden
unter Rückfluß erhitzt. Die farblose Lösung wurde zwecks Entfernung von gebildetem
unlöslichem Natriumchlorid filtriert, das Filtrat -zur Trockene gedampft,
der Rückstand in Chloroform gelöst, durch 1o8 mg aktive Tierkohle filtriert und
das Filtrat und das Chloroformwaschmittel in 6o ccm Petroläther gegossen. Erhalten
wurde Acetyl-Neomycin-A in Form eines weißen amorphen Produktes, das bei 1q.5° zu
erweichen beginnt und bei etwa 15o bis 16o° schmilzt.
-
Analyse: N = 7,78; Acetyl = 56,43. Eine Molekulargewichtsbestimrnung
ergab einen Wert von 570 -- 10.