-
Verfahren zur Gewinnung von Streptomycin aus wäßrigen Lösungen Zusatz
zum Patent 916 904
Gegenstand des Patents 9I6 904 ist ein Verfahren zur Gewinnung
von Streptomycin aus wäßrigen Lösungen durch Behandlung derselben mit ionenaustauschenden
Harzen, deren Austauschfähigkeit auf der Anwesenheit von Carboxylgruppen beruht.
Bei diesem Verfahren wird das Streptomycin durch die ionenaustauschenden Harze adsorbiert
und alsdann wieder den Harzen durch Extraktion entzogen.
-
Nach der Erfindung erfolgt die Gewinnung von Streptomycin aus wäßrigen
Lösungen unter Verwendung von carboxylischen, ionenaustauschenden Harzen, die durch
Copolymerisation einer Divinylverbindung und einer polymerisierbaren Säure entstanden
sind.
-
Durch Copolymerisation von Divinylverbindungen mit polymerisierbaren
Säuren entstandene Harze sind durch die allgemeine Eigenschaft gekennzeichnet, daß
ihre Ionenaustauschfähigkeit auf der Anwesenheit von Carboxylgruppen in dem Kunstharzmolekül
beruht.
-
Für die praktische Durchführung der Erfindung kommen vorzugsweise
Copolymere von Acrylsäure oder Methacrylsäure und Divinylbenzol in Betracht.
-
Derartige Harze besitzen eine größere Anzahl von Carboxylgruppen per
Gewichtseinheit und infolgedessen eine höhere Kapazität für die Adsorption von Ionen.
Wie gefunden wurde, hängt aber die Fähigkeit der ionenaustauschenden Harze mit Bezug
auf die Adsorption von Streptomycin nicht allein von der Anzahl polarer Gruppen
in einem gegebenen Gewicht oder Volumen des Harzes ab. Die Ionenaustauschfähigkeit
ist außerdem abhängig von der Porosität
des Harzes. Bei einem Kunstharz
von größerer Dichtigkeit wirken im wesentlichen nur die polaren Gruppen adsorbierend
auf das Streptomycin, welche sich an den auf der äußeren Oberfläche des Harzes befindlichen
Teilchen befinden, wogegen bei Verwendung eines Kunstharzes von poröser Struktur
die Streptomycinmoleküle befähigt sind, in erheblichem Ausmaß in die Poren des Harzes
einzudringen und dort mit den polaren Gruppen in Reaktion zu treten.
-
Bei Copolymeren von polymerisierbaren Säuren und Divinylverbindungen
ist die Porosität in großem Ausmaß abhängig von dem Grad der Vernetzung, welche
durch die Divinylkomponente hervorgerufen wird. In diesen Mischpolymerisaten verleiht
die Divinylkomponente dem Harz Wasserunlöslichkeit und einen gewissen Grad von Härte.
Sie bewirkt aber gleichzeitig eine Beeinträchtigung der Porosität des Harzes. Es
empfiehlt sich infolgedessen, zur Adsorption des Streptomycins Ionenaustauschharze
der oben gekennzeichneten Art zu verwenden, deren Gehalt an Divinylverbindungen
so gering bemessen ist, daß er gerade ausreicht, um dem Harz die erforderlichen
physikalischen Eigenschaften zu verleihen.
-
Wie gefunden wurde, haben sich für die praktische Verwirklichung
der Erfindung Mischpolymerisate von Acrylsäure oder Methacrylsäure und Divinylbenzol,
deren Divinylbenzolkomponente nur etwa 21/,, bis 5 Olo des Kunstharzes beträgt,
als besonders geeignet erwiesen. Derartige Harze haben eine besonders hohe Kapazität
für Streptomycin; in manchen Fällen vermögen sie ihr Eigengewicht an Streptomycin
aus der streptomycinhaltigen Flüssigkeit zu adsorbieren. Ihre Fähigkeit zur Adsorption
von Streptomycin ist mehr als 30mal so hoch wie die Fähigkeit eines entsprechenden
Gewichtes der gebräuchlichen Aktivkohle und IO-bis zumal so hoch wie die Adsorptionsfähigkeit
von Austauschharzen vom Sulfonsäuretypus. Für die Herstellung der erfindungsgemäß
anzuwendenden Austauschharze kann Divinylbenzol auch in größeren als den vorstehend
genannten Mengen verwendet werden.
-
Hierdurch wird aber die Adsorptionsfähigkeit für Streptomycin etwas
herabgesetzt. Eine Erhöhung des Divinylbenzolgehalts des Harzes über IO 0/, ist
nicht empfehlenswert.
-
Für die Adsorption des Streptomycins wird das Ionenaustauschharz
vorteilhaft in Form seines Natriumsalzes angewendet. Das Natriumsalz ist wirtschaftlich,
in der Verwendung sehr gut wirksam und nicht giftig. An Stelle des Natriumsalzes
können auch Salze von anderen einwertigen Metallen verwendet werden, die ebenso
wirksam sind wie das Natriumsalz, aber in der Verwendung nicht so wirtschaftlich
sind.
-
In zweiter Linie kommt das Ammoniumsalz in Betracht. Das Austauschharz
kann auch in Form seiner Salze mit zweiwertigen Metallen Verwendung finden.
-
Diese Metalle werden aber nicht ganz so gut durch Streptomycin ersetzt
wie monovalente Ionen.
-
Das Calciumsalz des Austauschharzes besitzt eine verhältnismäßig
geringe Adsorptionsfähigkeit von Streptomycin und sollte infolgedessen nicht oder
nur dann Verwendung finden, wenn der streptomycinhaltigen Flüssigkeit Mittel zugesetzt
werden, die befähigt sind, die Adsorption zu begünstigen. Die Magnesiumsalze und
Kupfersalze weisen eine etwas geringere Austauschfähigkeit auf als die Salze von
einwertigen Metallen. Die ionenaustauschenden Harze können auch in der Wasserstofform
oder in Mischform verwendet werden, bei der einige Carboxylgruppen in Salzform und
andere in der Wasserstofform vorhanden sind.
-
Der pj3-Wert der streptomycinhaltigen Flüssigkeit wird zweckmäßig
oberhalb 4,5 und vorzugsweise etwa beim Neutralpunkt gehalten und das Harz vorteilhaft
in Form eines Salzes einer stärkeren Base angewendet.
-
Bei Behandlung der Flüssigkeit, z. B. in einer Kolonne, steigt der
pE-Wert an, insbesondere bei Anwendung einer sauren Flüssigkeit. Selbst wenn eine
Flüssigkeit zur Anwendung gelangt, deren pH-Wert unter 4,5 liegt, wird der p11-Wert
infolge der Neutralisation der überschüssigen Säure durch das Austauschharz rasch
in den für die Operation günstigen Bereich gebracht.
-
Es ist jedoch zu berücksichtigen, daß das für die Neutralisation der
Säure verwendete Kunstharz nicht für die Adsorption von Streptomycin in Betracht
kommt.
-
Infolgedessen empfiehlt es sich, den Säureüberschuß der Flüssigkeit
durch andere Mittel zu neutralisieren.
-
Die carboxylischen Harze sind befähigt, Streptomycin auch aus ganz
alkalischer Flüssigkeit zu adsorbieren.
-
Anscheinend ist die obere Grenze des p,-Wertes allein durch die Stabilität
des Streptomycins bestimmt. Man kann z. B. einer Kulturflüssigkeit, deren p-Wert
II,5 beträgt, mit Hilfe der beanspruchten Kunstharze das Streptomycin entziehen.
In einem derartigen Falle wird man vorzugsweise das Kunstharz in der Wasserstofform
verwenden. Die Verarbeitung von Flüssigkeiten mit derartig hohen pil-Werten ist
aber im allgemeinen nicht empfehlenswert.
-
Während die Gegenwart von Natriumionen in den vergorenen Flüssigkeiten
die Kapazität des carboxylischen Austauschers für Streptomycin nicht wesentlich
beeinflußt, vermag die Anwesenheit einiger anderer Ionen, insbesondere von Calciumionen,
eine deutliche Wirkung auszuüben. In Fällen, in denen das angewendete Fermentationsverfahren
zu hohen Konzentrationen von gegebenenfalls störenden Kationen führt, empfiehlt
es sich, die störende Wirkung solcher Ionen durch Maßnahmen wie Verdünnung oder
Bildung von Komplexen mit Hilfe von Zusatzstoffen oder durch Beseitigung störender
Ionen durch Niederschläge oder durch Ersatz derselben durch Natriumionen zu beseitigen.
-
In Ausübung der Erfindung wird die vergorene, das Streptomycin enthaltende
Flüssigkeit nach Maßnahmen wie Filtrieren und Einstellen des p-Wertes auf den gewünschten
Grad in Kontakt mit einem carboxylisch en Ionenaustauschharz gebracht, das durch
Copolymerisation einer Divinylverbindung mit einer polymerisierbaren Säure entstanden
ist. Dies geschieht vorzugsweise derart, daß die Flüssigkeit durch eine mit dem
Austauschharz beschickte Kolonne oder mehrere derartige Kolonnen geleitet wird.
-
Wenn eine einzige Kolonne verwendet wird, kann die Adsorptionsstufe
diskontinuierlich durchgeführt werden und jeweils abgebrochen werden, wenn Streptomycin
in der die Kolonne verlassenden Flüssigkeit erscheint. Hierbei wird die Kapazität
der Kolonne für
die Adsorption von Streptomycin nicht voll ausgenutzt.
Durch Weiterführung des Adsorptionsvorgangs über diesen Punkt hinaus entsteht ein
Verlust von Streptomycin; es werden aber größere Mengen von Streptomycin durch das
Kunstharz adsorbiert.
-
Die die Kolonne verlassende Flüssigkeit kann alsdann durch eine zweite,
mit frischem Kunstharz beschickte Kolonne geleitet werden und die erste Kolonne
so lange in Betrieb gehalten werden, bis kein Streptomycin mehr adsorbiert wird.
Durch Arbeiten mit zwei oder mehr Kolonnen, derart, daß die aus einer teilweise
erschöpften Kolonne abgehende Flüssigkeit durch ein Bett von frischem Kunstharz
geleitet wird, kann die gesamte Kapazität des Kunstharzes ausgenutzt werden, ohne
daß Streptomycinverluste entstehen. Nach Erschöpfung des Adsorptionsvermögens einer
Kolonne wird Wasser durchgeleitet, um die in dem Kunstharzbett noch vorhandene Kulturflüssigkeit
zu verdrängen. Alsdann kann das adsorbierte Streptomycin durch Leiten einer wäßrigen
Lösung eines Elektrolyts durch die Kolonne gewonnen werden.
-
Mit Vorteil wird eine wäßrige Lösung einer Säure, insbesondere einer
starken anorganischen Säure, z. B.
-
Chlorwasserstoffsäure, verwendet. An Stelle einer wäßrigen Lösung
einer Säure kann auch eine Methanollösung oder eine Lösung, welche Wasser und Methanol
enthält, verwendet werden. Die carboxylischen, ionenaustauschenden Harze gemäß Erfindung
haben eine so hohe Affinität für Wasserstoff, daß das Streptomycin leicht von dem
Harz abgetrennt werden kann, wenn nur ein geringer Überschuß von starker Säure verwendet
wird. Da die Säure auch Metallionen, welche während der Adsorptionsstufe nicht durch
Streptomycin verdrängt worden sind, aus dem Kunstharz entfernt, wird eine schwach
saure, wäßrige Lösung erhalten, die auch einige Metallsalze enthält.
-
Wenn der Adsorptionsvorgang in der oben beschriebenen Weise derart
durchgeführt wird, daß die Austauschkapazität des Harzes möglichst vollständig ausgenutzt
wird, ist der Gehalt der Lösung an Metallsalzen so gering, daß er keine Schwierigkeiten
verursacht. Die Gewinnung des Streptomycins aus der Lösung kann derart stattfinden,
daß neutralisiert wird, alsdann vorzugsweise durch Eindampfen unter vermindertem
Druck auf ein kleines Volumen oder zur Trockne konzentriert wird, der Rückstand
in Methanol oder einem anderen Lösungsmittel für Streptomycin, das keine nennenswerten
Mengen von Salzen aufnimmt, aufgenommen, die Lösung von den Salzen durch Filtration
abgetrennt wird und das Streptomycin aus der Methanollösung durch Zugabe von Aceton
oder eines anderen Fällungsmittels niedergeschlagen, abfiltriert und getrocknet
wird.
-
Der so erhaltene Streptomycinniederschlag kann leicht in das kristalline
Calciumchloridkomplexsalz übergeführt werden, indem das Produkt in Methanol gelöst
und die erforderliche Menge von Calciumchlorid zugegeben wird.
-
Wenn eine Säure für die Extraktion verwendet wird, verbleibt das
Harz in Wasserstofform. Zwecks Überführung in die Natriumform wird eine wäßrige
Lösung von Natriumhydroxyd durch die Kolonne geleitet oder eine Zeitlang stationär
in der Kolonne gehalten.
-
Nach Beseitigung der Regenerationslösung durch Auswaschen ist die
Kolonne wieder gebrauchsfähig für die Adsorption von Streptomycin.
-
Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Dreistufenzyklus,
nämlich Adsorption, Extraktion und Regeneration, durchgeführt, indem durch die mit
dem Austauschharz beschickte Kolonne zunächst die vergorene Flüssigkeit, alsdann
die Extraktionslösung und schließlich die Regenerationslösung aufeinanderfolgend
geleitet werden. Der Vorgang kann aber auch in anderen Apparaturen als Kolonnen
erfolgreich durchgeführt werden.
-
Wenn das Austauschharz in seiner Wasserstofform zur Adsorption von
Streptomycin verwendet wird, dient die saure Extraktionslösung zugleich für die
Regenerierung des Harzes. Für die Extraktion kann unter anderem auch eine Calciumchloridlösung
verwendet werden. Hierdurch kann man verhältnismäßig reines Streptomycin unmittelbar
aus dem Auszug durch übliche Kristallisationsvorgänge gewinnen. In diesem Falle
verbleibt das Harz nach der Extraktion in der Calciumform. Durch Leiten einer Lösung
von Natriumchlorid durch die Kolonne kann es leicht in die Natriumform übergeführt
werden.
-
Beispiele I. Ein granuliertes Copolymerisat von Methacrylsäure und
Divinylbenzol, das 5 °/0 Divinylbenzol enthält, wird mit Wasser aufgeschlemmt und
derart in eine geeignete Adsorptionskolonne eingefüllt, daß eine Schicht von Austauschharz
von etwa 7,5 cm Höhe entsteht. Das Harz wird zunächst mit 2,5 n-Salzsäure und dann
mit Wasser gewaschen, alsdann mit einer Lösung von 2,5 n-Ammoniumhydroxyd behandelt
und wieder mit Wasser gewaschen. Da infolge der Ammoniumhydroxydbehandlung eine
Schwellung des Harzes stattfindet, beträgt die Höhe des Filterbettes nunmehr etwa
I3 cm. Die Kolonne wird alsdann mit Wasser rückgewaschen, bis der p-Wert der abgehenden
Flüssigkeit etwa 10,5 beträgt. Die Kolonne ist nunmehr gebrauchsfertig für die Adsorption
des Antibioticums aus wäßriger Lösung.
-
Die aus der Fermentierung von Streptomyces griseus in einem flüssigen
Medium stammende Flüssigkeit, welche Nährmittel für die Mikroorganismen enthält,
wird nach Filtration einer Klärbehandlung unterworfen und dann in die Kolonne derart
eingefüllt, daß ein Flüssigkeitskopf von etwa go cm in der Kolonne vorhanden ist.
Die Durchflußgeschwindigkeit wird so geregelt, daß die Berührungsdauer der Flüssigkeit
mit dem Kunstharz etwa I Minute beträgt. Nach Beendigung der Adsorption wird die
Kolonne einer Verdrängungswaschung mit Wasser unterworfen und der Flüssigkeitsspiegel
bis zum oberen Ende des Harzbettes absinken gelassen. Nunmehr wird etwa I,0 bis
I,5 n-Salzsäure in den Oberteil der Kolonne eingeführt und die unten abfließendeExtraktionslösunggesammelt.
-
Da die später abgehenden Fraktionen der Lösung stark sauer sind (unter
PH = 1,0), werden sie sofort durch Zufügung von 2,5 n-Natriumhydroxydlösung neutralisiert.
Der neutralisierte Auszug wird unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen
reduziert, durch
Zufügung von Methanol verdünnt, filtriert und das
Streptomycin aus der Methanollösung niedergeschlagen. Das feste Produkt wird durch
Filtration abgetrennt und unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet.
Das erhaltene Streptomycin besitzt einen für therapeutische Zwecke ausreichenden
Reinheitsgrad.
-
Nach Beendigung der Extraktion wird die Kolonne mit einer zusätzlichen
Menge von 2,5 n-Salzsäure ausgewaschen und eine Waschung mit Wasser angeschlossen.
Die Kolonne wird alsdann durch Behandlung mit Ammoniumhydroxydlösung regeneriert
und wieder gebrauchsfähig gemacht.
-
Bezogen auf die durch das Harz adsorbierte Streptomycinmenge betrug
die Ausbeute an Streptomycin nach der Extraktion 960/0. Die Potenz des Produktes
betrug 500 Einheiten/mg. Der Verlust beim Extraktionsvorgang betrug nur I,6 0/o.
-
2. Zwei Kolonnen, enthaltend 50 g des Austauschharzes gemäß Beispiel
I, wurden auf den Natriumzyklus eingestellt, indem durch jede Kolonne IOOO ccm einer
10%uigen wäßrigen Natriumhydroxydlösung geleitet wurden. Nach Auswaschen der Kolonne
mit je 2000 ccm Wasser wurden sie durch Gummischlauchverbindung miteinander vereinigt.
64,8 1 Streptomycinflüssigkeit wurden auf PB 2 mit Phosphorsäure angesäuert, filtriert,
mit wäßriger Natriumhydroxydlösung auf pH 7 neutralisiert und wiederum filtriert.
-
Die behandelte Brühe zeigte 360 Einheiten/ccm. Die erhaltene Flüssigkeit
wurde dann unter etwa 0,07 kg/cm Druck durch die beiden Kolonnen geleitet, in einem
Ausmaß von I50 ccm/min. Nach erfolgter Durchfluß zeigte die Flüssigkeit 4,3 Einheiten/ccm
oder einen Streptomycingehalt von 2,I °1O. Die Kolonnen wurden alsdann mit IOOO
ccm Wasser ausgewaschen und anschließend ausgezogen, indem durch jede Kolonne IOOO
ccm einer wäßrigen I,o n-Salzsäure geleitet wurden. Der reiche Auszug aus der ersten
Kolonne betrug 670 ccm und zeigte 25 000 Einheiten/ccm. Der reiche Auszug aus der
zweiten Kolonne betrug 235 ccm und wies 28 ooo Einheiten/ccm auf.
-
Die Wiedergewinnung des Streptomycins berechnet sich auf 100,5 0/o.
-
Der Auszug aus der ersten Kolonne wurde im Vakuum bei 30° fast bis
zur Trockne konzentriert, mit 100 ccm Methanol behandelt und filtriert. Die durch
Filtration entfernten Feststoffe wogen 2,75 g.
-
Die Methanollösung wurde in 500 ccm Aceton ausgefällt, die Feststoffe
abfiltriert, mit 50 ccm Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das Gewicht betrug
26,3 g, die Potenz 650 Einheiten/mg, der Gehalt an Asche 15 0/o. Die Ausbeute berechnet
sich bei diesem Punkt auf 101,5 0/o.
-
Die mit Aceton ausgefällten Feststoffe wurden in 8I ccm Methanol
gelöst und der Lösung 23,6 g wasserfreies Calciumchlorid zugesetzt. Die Lösung wurde
40 Stunden lang gerührt und dann filtriert. Der Niederschlag wurde mit einer Io°/Oigen
Lösung von Calciumchlorid in Methanol gewaschen, dann mit Äthanol gewaschen und
getrocknet. Das Produkt wog 17,5 g und zeigte 780 Einheiten/mg (theoretisch für
reines Streptomycin-Calciumchlorid-Komplexsalz 779 Einheiten/mg). Die Gesamtausbeute
aus der Flüssigkeit der ersten Kolonne betrug 80 0/o.
-
3. Eine Kolonne, enthaltend 2 g eines Resorcinsäure - Formaldehyd
- Kondensationsprodukts, wurde dem Natriumzyklus unterworfen, indem 100 ccm einer
10 0/0igen Natriumhydroxydlösung durchgeleitet wurde und mit 200 ccm Wasser nachgewaschen
wurde. 1 1 Streptomycinflüssigkeit wurde mit Phosphorsäure auf p 2 angesäuert, filtriert,
mit Natriumhydroxyd neutralisiert und wieder filtriert; die behandelte Flüssigkeit
zeigte 537 Einheiten/ccm.
-
Die so erhaltene Flüssigkeit wurde durch die mit Austauschharz beschickte
Kolonne geleitet (0,64 ccm/min). Die behandelte Flüssigkeit, welche I98 Einheiten/ccm
zeigte, würde normalerweise durch eine zweite Kolonne geleitet werden, was aber
im vorliegenden Falle nicht geschah. Die Kolonne wurde dann mit 100 ccm Wasser ausgewaschen
und mit 200 ccm wäßriger I,on-Salzsäure extrahiert.
-
Der reiche Auszug betrug 172 ccm und zeigte 1,750 Einheiten/ccm. Dies
entspricht einer 8o0/0igen Wiedergewinnung des beim Durchgang der Flüssigkeit durch
die Kolonne adsorbierten Streptomycins. Der Auszug wurde im Vakuum bei 25° fast
bis zur Trockne konzentriert und das Konzentrat mit 5 ccm Methanol verdünnt. Die
Lösung wurde filtriert und in 25 ccm Aceton eingeführt. Der Niederschlag wurde filtriert
und im Vakuum getrocknet; Gewicht = 580 mg, Potenz = 500 Einheiten/mg. Dies entspricht
einer 86,5%igen Wiedergewinnung der durch das Harz adsorbierten Einheiten.
-
4. Die nachfolgende Tabelle veranschaulicht vergleichsweise die Ergebnisse,
welche mit verschiedenen allgemein gebräuchlichen Adsorbentien und carboxylischen
Harzen bei der Adsorption und Wiedergewinnung von Streptomycin aus wäßrigen Lösungen
erzielt wurden. Diese Ergebnisse wurden erhalten durch Leiten einer verhältnismäßig
armen wäßrigen Lösung, die etwa 0,1 0/o Streptomycin enthielt, durch Kolonnen, welche
mit den verschiedenen Adsorbentien beschickt waren. Das Silikataustauschharz wird
z. B. durch Säure zerstört; infolgedessen kann dieses Mittel nicht als Extraktionsmittel
verwendet werden.
-
In jedem Falle sind die optimalen Resultate angegeben.
-
Vergleich von verschiedenen, ionenaustauschenden Harzen und Adsorbentien
bei der Gewinnung von Streptomycin aus wäßrigen Lösungen
| Kapazität des Adsorptionsmlttels Iapazität des Angewendetes
Gewonnenes Potenz |
| Art des Adsorptionsmittels Adsorptionsmittels Extraktionsmittel
Streptomycin in des erhaltenen |
| mg/g % Produkts |
| Sulfoniertes Phenolformaldehydharz 10 Na ClAq 30 bis 50 etwa
100 E/mg |
| H2SQAq 40 |
| Silikataustauschharz.............. 40 NaClAq 100 etwa 50 E/mg |
| Kapazität des Gewonnenes Potenz |
| Art des Adsorptionsmittels Adsorptionsmittels Streptomycin
in des erhaltenen |
| Extraktionsmittel |
| mg/g % Produkts |
| Sulfoniertes Kohleharz.............. 12 NaClAq 40 bis 60 etwa
100 E/mg |
| H2SO4Aq 40 |
| A-Kohle............................. 20 Angesäuertes 60 bis
75 200 bis 350 E/mg |
| Methanolwasser |
| Fullererde.......................... 50 Pyridin- 30 bis 40
75 E/mg |
| hydrochlorid Aq |
| Copolymerisat von Methacrylsäure |
| und Divinylbenzol, enthaltend |
| 5% Divinylkbenzol .................. 600 bis 1500 HClAq 100
600 E/mg |
| Copolymerisat vn Methacrylsäure |
| und Divinylbenzol, enthaltend |
| 10 % Divinylbenzol.................. 300 bis 800 HClAq 100
600 E/mg |
| Permutit XHIC, vermutlich ein |
| carboxylisches Harz von Phenol- |
| formaldehyd......................... 500 bis 900 HClAq 100
600 E/mg |