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Verfahren zur Reinigung und Trennung der Vitamine der Bl2-Gruppe durch
Verteilungs chromatographie
Die zweidimensionale Verteilungschromatographie von Konzentraten
des Vitamin B12 bzw. der B2-Gruppe auf Zellulose ist unter dem Namen Papiefchromat,ographie
bekannt. W. A. ÄVinsten und E. Eigen (J. biol. Chem. I77, 989; I8I, I09 {1949])
trennten Vitamin B12 und Desoxyriboside unter Benutzung von n-Butanol als mobile
Phase. H. L. A.
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Tarr, B. A. Southcott und P. W. Ney (Food.
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Technol., 4, 354 [I9501) trennten ebenfalls Vitamin B12 und Desoxyriboside
unter den gleichen Versuchsbedingungen. E. Lester Smith et al.
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(deutsches Patent 890 265) benutzten die Papierchromatographie bzw.
die aus den Papierchromatogrammen errechneten Rf-Werte zur Unterscheidung zwischen
den Vitaminen B12, B12b und BI2C- Sie verwendeten wassergesättigten sec.-Butylalkohol
als Entwickler. E. Lester Smith, W.F.J.Cuthbertson, A. Walker und K. A. Lees (Feder.
Proc. 9, Nr. I [I950]) benutzten als Entwickler höhere Alkohole bzw. Ketone zur
papierchromatographischen Trennung der Vitamine B12 und B12b von Desoxyribosiden.
V. Kocher, R. Karrer und H. R. Müller (Intern. Z. Vitaminforschg. 2I, 403 [I950])
befaßten sich mit der papierchromatographischen Trennung von Vitamin B12 und Desoxyribosiden
unter Benutzung von Phenol, gesättigt mit einer wäßrigen 2 n-Na Cl-Lösung bzw. von
wassergesättigtem n-Butanol oder wassergesättigtem Col-
lidin. H.
B. Woodruff und J. C. Foster (J, biol.
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Chem. I83, 569 [Ig501) versuchten, durch Sättigung der papierchromatographischen
Streifen mit Salzlösungen die Wanderungsgeschwindigkeit der Vitamine BI2 und B12
a im n-Butanol-Wasser-Papierchromatogramm zu erhöhen. Sie erreichten das Ziel durch
Verwendung von o,66-molaren K H2 P 04 Lösungen, in die die Papierstreifen eingetaucht
und anschließend getrocknet wurden. So konnten die äußerst niedrigen Rf-Werte des
Vitamin B12 (0,03 bis 0,I0) bzw. des Vitamin B12 a (o,o bis 0,03) erhöht werden.
H. G. Wij menga (Dissertation, Utrecht 1951) trennte die Vitamine B12 und B12 b
sowie seine Bl2-Faktoren WAB, WR und B12 m unter Benutzung von n-Butanol-Wasser
bzw. n-Butanol-Eisessig-Wasser mit bzw. ohne KCN-Zusatz als Entwickler. Bei Verwendung
von n-Butanol-Wasser entwickelte er die Papierchromatogramme während 67 bis 72 Stunden
bei I6 bis I80. Der Trenneffekt war äußerst gering, was auch verständlich ist, weil
alle Vitamin-Bl2-Faktoren Wijmengas im allgemeinen einen niedrigeren Rf-Wert haben
als Vitamin B12 selbst. Durch Verwendung von n-Butanol-Eisessig-Wasser bzw. durch
Sättigung der Papierstreifen mit KH2PO4 (unter Benutzung von n-Butanol-Wasser als
Entwickler) konnte der Verfasser allerdings die Rf-Werte wesentlich steigern. Über
die Trennschärfe unter diesen Bedingungen kann man sich keine Vorstellung machen,
da die Substanzen dieses Verfassers nach späteren Ermittlungen nicht einheitlich
waren. J. E. Ford, S. K.
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Kon und J. W. G. Porter (Biochem. J. 50, Proc. IX [I95I]) benutzten
die Papierchromatographie zum Nachweis und zur Trennung von Vitamin-B12-Faktoren
in Fäzes und Rumen. Unter Benutzung von sec.-Butanol als Entwickler und in Gegenwart
von Cyanid konnten sie zwei neue Vitamin-Bl2-Faktoren, nämlich Faktor A (Rf o,I3)
und Faktor B (Rf 0,54) neben Vitamin B12 (Rf 0,2g) bioautographisch mit E. Coli
nachweisen. M. F.
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Patte (aus. pharm. Franc. 9, 747 [I95I]) trennte die Vitamine B12
und B12 b unter Verwendung von n-Butanol-Eisessig-Wasser als Entwickler. E. A.
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Kaczka, R. G. Denkewalter, A. Holland und K. Folkers (J. Am. Chem.
Soc. 73, 335 [I95I]) untersuchten papierchromatographisch die Vitamine B12a und
B1Zb unter Benutzung eines Gemisches aus IO°/o Eisessig, 400/0 n-Butanol und 500/o
Wasser; sie stellten für die beiden Vitamine den gleichen Rt-Wert o,I4 fest. U.
J. Lewis, D. V.
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Tappanund CA. Elvehj em (J. biol. Chem. I94, 539; 199, 5I7 [1952])
untersuchten papierchromatographisch, unter Benutzung von wassergesättigtem n-Butanol
sowie wassergesättigtem sec.-Butanol als Entwickler, Extrakte aus Rattenfäzes, in
denen sie mit Hilfe dieser Methode einen neuen Vitamin-Bl2-Faktor, das Vitamin Bl2f,
fanden. E. Lester Smith et al. (Biochem. J. 52, 389 [1952]) geben für Whatman-4-Papier
und sec.-Butanol-Wasser folgende Rf-Werte an: 0,05 für Bl2b, etwa 0,2 für B12 und
etwa 0,25 für B,,,. Z. G. Bánhidiund L. E. Ericson (Acta Chem. Scand. 7, 7I3 [1953])
wiesen papierchromatographisch unter Benutzung von n-Butanol-Wasser-Eisessig-Gemisch
als Entwickler Vitamin B12 b in verschiedenen Algen nach. A. G. M.
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Sjöström und L. E. Ericson (Acta Chem.
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Scand. 7, 870 [I953]) trennten papierchromatographisch, unter Benutzung
von wassergesättigtem sec.-Butanol, enthaltend 3 O/o Eisessig und eine Spur KCN
als Entwickler, Extrakte aus Flechten und wiesen unter anderem die VitamineBl2,
Bl2s und den Faktor C nach.
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Die Papierchromatographie dient ganz allgemein lediglich analytischen
Zwecken und wird nur vereinzelt für präparative Zwecke verwendet; in diesen Fällen
werden entweder dicke Kartons oder sogar Kolonnen, bestehend aus aufeinandergelegten
Papierscheiben, verwendet. Beide Methoden können selbstverständlich nur besonderen
wissenschaftlichen Zwecken dienen und fanden bis jetzt wegen ihrer Umständlichkeit
bzw. Kostspieligkeit keinen allgemeinen Eingang in das Laboratorium; von ihrer Anwendung
in der Technik kann wohl vorläufig keine Rede sein.
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Es ist auch bekannt, verschiedene Stoffgemische auf Chromatographiersäulen
zu trennen, die aus Zellulosebrei bestehen (vgl. H. G. Cassidy, »Adsorption and
Chromatography«, New York I95I) bzw. aus Zellulosepulver (J. N. Balston und B. E.
Talbot, »Aguideto filter paper and cellulose powder chromatography«, London I952;
F. Cramer, »Papierchromatographie«, 2. Aufl., Heidelberg 1953).
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In manchen zusammenfassenden Werken (siehe F. Cramer, »Papierchromatographie«)
wird die Ansicht vertreten, daß in der Regel auf der Säule die gleichen Rf-Werte
erhalten werden wie im gewöhnlichen Papierchromatogramm. Danach müßte erwartet werden,
daß die Trennung von Vitaminen der Bl2-Gruppe auf Säulen, bestehend aus Zellulose,
n-Butanol und Wasser, praktisch undurchführbar ist- in Analogie zu den papierchromatographischen
Erfahrungen. Im Gegensatz zu dieser Annahme wurde die völlig überraschende und unerwartete
Beobachtung gemacht, daß bei Verwendung von entsprechend zubereiteten Chromatographiersäulen
aus Zellulosepulver bzw. Zelluloseflocken, n-Butanol und Wasser sowie von wassergesättigtem
n-Butanol (erforderlichenfalls mit Cyanidionenzusatz) als Entwickler ausgezeichnete
Trennungen von Vitaminen der Bl2-Gruppe bei sehr großerLaufgeschwindigkeit der Zonen
erreicht werden. Abgesehen von der großen Schärfe der Zonen werden bei der neuen
chromatographischen Methode relative R-Werte R-Wet - Verschiebung der Bande Senkung
der Flüssigkeitssäule über der Kolonne) .erzielt, die bei keiner der bisher bekannten
papierchromatographischen bzw. chromatographischen Methoden zur Trennung der Vitamin-B12-Komponenten
erreichbar waren. Die neue Beobachtung ist deshalb völlig überraschend, weil die
Trennung der gleichen Gemische der Vitamin-Bl2-Gruppe mit Hilfe der papierchromatographischen
Methode unter
Verwendung des gleichen Entwicklers völlig versagt
(was mit dem Stand der Technik auf Grund der obigen Literaturangaben übereinstimmt).
Die Tatsache des sehr unterschiedlichen Verhaltens der gleichen Gemische von Vitamin-Bl2-Faktoren
bei der verteilungschromatographischen Trennung auf dem Papier und in der Zellulosesäule
bei Verwendung des gleichen Entwicklers ist wohl dadurch zu erklären, daß es sich
hier um zwei verschiedenartige Trennungsmechanismen handelt.
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I. Bei der papierchromatographischen Trennung bewegt sich das Lösungsmittel
im Papier dank der kapillaren Kräfte der Zellulosefaser. Dabei werden vermutlich
die beiden Bestandteile des Lösungsmittelgemisches nicht in gleichem Maße aufgesaugt,
so daß die Zusammensetzung des Entwicklers im Papier anders ist als in der Vorratsflüssigkeit.
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2. Bei der Säulenchromatographie wird erfindungsgemäß die Zellulose
vor der Einfüllung in die Säule mit genügend n-Butanol und Wasser gemischt. Bei
der Entwicklung des Chromatogrammes kommen keine kapillaren Kräfte zur Geltung,
es kann also keine Entmischung des Entwicklers stattfinden.
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Es ist natürlich möglich, daß noch weitere Faktoren für den Unterschied
in der Wirksamkeit dieser beiden Methoden verantwortlich sind. Es erscheint jedenfalls
völlig ausgeschlossen, daß dafür Unterschiede in der Zellulosequalität verantwortlich
sind, denn es konnten bei der Säulenchromatographie praktisch mit jeder gut gereinigten
und nicht zu stark abgebauten Zellulosesorte - sowohl aus Baumwolle als auch aus
Holz - die gleichen Effekte erzielt werden.
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Es wurde versucht, durch Variation der Arbeitsbedingungen bei der
Papierchromatographie von Vitamin-B12-Faktoren den Trenneffekt zu erhöhen in der
Annahme, daß durch teilweise Sättigung der Papierstreifen mit Wasser ähnliche Bedingungen
erzielt und auch ähnliche Trenneffekte geschaffen werden wie bei der Säulenchromatographie.
Wie aus der Tabelle I zu ersehen ist, schlugen diese Versuche fehl. Auch bei Sättigung
der Papierstreifen mit Salzen konnten keine der erfindungsgemäßen Säulenchromatographie
annähernd gleichen Effekte erzielt werden.
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Durch diese Versuche erscheint ausreichend bewiesen, daß die Säulenchromatographie
in ihrem Wesen von der Papierchromatographie verschieden ist und daß unter keinen
Versuchsbedingungen eine Angleichung der beiden Methoden möglich ist.
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Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der Tabelle I zusammengestellt.
Wie aus dieser Tabelle zu ersehen ist, konnte durch Erhöhung des Feuchtigkeitsgrades
der Papierstreifen kein Effekt erzielt werden. Durch Sättigung der Papierstreifen
mit Phosphatpuffer vom PH 7,0 konnte zwar eine schnellere Wanderung der Zonen erreicht
werden, dieselben waren jedoch sehr undeutlich und gingen zum Teil ineinander über.
Eine Übertragung dieser Arbeitstechnik auf die Zellulosesäule wäre - abgesehen von
der mangelhaften Trennung - durch die Notwendigkeit der Verwendung von puffernden
Salzen praktisch wertlos, da die Salze von den Vitamin-Bl2-Faktoren schwer abtrennbar
sind. Die Trennbarkeit der Vitamin-Bl2-Faktoren I und II mit Hilfe von sec.-Butanol
ist bei Verwendung von unbehandeltem Papier verhältnismäßig gut; die Faktoren III
und V lassen sich aber im allgemeinen nicht gut trennen; auf mit Phosphatpuffer
vom PH 7,0 imprägniertem Papier lassen sich zwar auch die Faktoren III und V trennen,
die Zonen sind jedoch viel weniger scharf als ohne Verwendung von Salzen.
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Tabelle I Papierchromatographie eines Gemisches der Vitamin-Bl2-Faktoren
I, II, III und V, gewonnen aus Faulschlamm.
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Papier Whatman I. Temperatur I8-20°C.
| Lauf- Rf-Werte der Faktoren |
| Vorbehandlung des Papiers zeit Entwickler Beschaffenheit der
Zonen |
| Std. I Papiers zeit 1 i II III+ V |
| nicht vorbehandelt, lufttrocken 48 n-Butanol, 0,03 nicht getrennt,
keine Zonen |
| gesättigt mit Rf-Wert sehr |
| Wasser + 0,005 01o ' gering |
| NaCN (+) |
| in Wasser getaucht, dann I Std. 48 desgl. o,o58 0,025; etwa
3 mm Faktor I gut abgetrennt |
| bei 200 zum Teil getrocknet gewandert, |
| nicht ge- |
| trennt |
| in eine o,66 molare Lösung von 48 desgl. keine Trennung, Banden
keine Zonen |
| NIl P O4 (pH 4,6) getaucht, II mm gewandert |
| dann 24 Std. bei 20° getrocknet |
| in einen 0,66 molaren Phosphat- 24 desgl. 0,225 0,I58 1 0,I20
0,OI5 diffus verschmiert, |
| puffer vom pH 7,0 getaucht, Zonen ineinander |
| dann I Std. bei 200 getrocknet verlaufend |
(t) angewendet als wäßrige Lösung vom PH 7.0
| Lauf- Rf-Werte der Faktoren |
| Vorbehandlung des Papiers zeit Entwickler Beschaffenheit der
Zonen |
| Std. I ( II 1 III V |
| nicht vorbehandelt, lufttrocken 24 secundäres 0,29 o,23 0,I55
scharfe Zonen, jedoch |
| Butanol, ge- III und V nicht |
| sättigt mit getrennt |
| Wasser +0,005 0Io |
| NaCN (+) |
| in eine o,66 molare Lösung von 48 desgl. Fleck verschmiert,
keine Zonen |
| KH2PO4 (pH 4,6) getaucht, etwa 4,5 cm gewandert |
| dann 24 Std. bei 200 getrocknet |
| in einen 0,66 molaren Phosphat- 24 desgl. 0,42 0,34 0,27 o,I2
Faktor V stark diffus |
| puffer vom pil 7,0 getaucht, verschmiert, etwas |
| dann I Std. bei 200 getrocknet schärfere Zonen bei |
| I bis III |
(+) angewendet als wäßrige Lösung vom PH 7,0 Versuche mit Zellulosekolonnen unter
Verwendung von verschiedenen Alkoholen bzw. Ketonen einerseits und verschiedenen
Zellulosesorten andererseits ergaben, daß sich nur n-Butanol und zum Teil auch sec.-Butanol
für eine Trennung der Vitamin-Bl2-Faktoren eignen. Mit Wasser völlig mischbare Alkohole
und Ketone - mit verschiedenen Wassermengen gemischt - ergeben gar keine bzw. stark
diffuse Zonen. Benzylalkohol, Amylalkohol und Methyläthylketon eignen sich bereits
wegen ihrer beschränkten Wasseraufnahme nicht.
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Aus höheren Alkoholen bzw. Ketonen plus niederen Alkoholen kann man
Gemische herstellen, deren Aufnahmefähigkeit für Wasser derjenigen für n-Butanol
ähnlich ist und die daher etwa gleiche Trenneffekte wie n-Butanol ergeben. Die Verwendung
von Lösungsmittelmischungen bietet jedoch gegenüber n-Butanol keine Vorteile.
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Von den geprüften Zellulosesorten eignen sich sowohl solche aus Baumwolle
als auch solche aus Holzzellstoff. Gewisse Unterschiede in der Wirksamkeit sind
offenbar durch den Reinheitsgrad und die unterschiedliche Nachbehandlung bedingt.
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Die mit Hilfe von sec.-Butanol in der Zellulosesäule erzielten Trenneffekte
übertrafen die entsprechenden papierchromatographischen Ergebnisse. Die Trennung
der B12-Komponenten III und V war jedoch trotzdem mangelhaft, wie folgender Versuch
zeigt: 5 g Zellulosepulver wurden mit 50 ccm cyanidhaltigem wäßrigem sec.-Butanol
geschüttelt und über Nacht stehengelassen. Sodann wurde dieses Gemisch in der weiter
unten näher beschriebenen Weise in eine Kolonne eingefüllt. Als Entwickler diente
ein Gemisch aus I60 ccm sec.-Butanol, 35 ccm Wasser und 5 ccm einer o,z0/oigen wäßrigen
NaCN-Lösung vom pA 7,0. Bei der Entwicklung wurden folgende R-Werte beobachtet:
Vitamin-Bl2-Faktor R-Wert I 0,35 - 0,46 II 0,11-0,18 III 0,04 - 0,07 V 0,03 - 0,05
Ein Vergleich dieser Werte mit den entsprechenden Werten der Tabelle I zeigt, daß
unter Benutzung von sec.-Butanol die Säule-einen besseren Trenneffekt verursacht
als das Papier. Infolge der zu geringen Unterschiede der R-Werte der beiden letzten
Zonen gehen hier aber die Bl2-Faktoren III und V ineinander über.
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Dagegen ergab die verteilungschromatographische Trennung der Vitamin-B12-Faktoren
mit Hilfe von Zellulosesäulen unter Verwendung von n-Butanol-Wasser als Entwickler
ausgezeichnete Ergebnisse, die weitaus besser sind als bei Benutzung aller anderen
geprüften Alkohole und die daher die Basis für das erfindungsgemäße Verfahren vorstellen,
das nachfoi gen d genau beschrieben wird.
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Entwickler. IOOO ccm n-Butanol werden mit 25 ccm einer z. B. o,20/oigen
Natriumcyanidlösung vom p, 7,0 gemischt und dann mit kohlensäurefreiem Wasser bis
zur Sättigung geschüttelt. Der Entwickler wird dann durch Stehenlassen oder Filtration
geklärt. n-Butanol, das kleinere Mengen an Wasser enthält, z. B. IoO/o, eignet sich
infolge der viel langsameren Entwicklung weniger als wassergesättigtes n-Butanol.
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Bereitung der Säule. Es werden z. B. 50 g Zellulosepulver mit 500
ccm n-Butanol, gesättigt mit kohlensäurefreiem Wasser, gemischt. Diese Mischung
muß mindestens so viel an Cyanid-Ionen enthalten, als die Zellulose zu adsorbieren
vermag.
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Anschließend werden unter kräftigem Schütteln oder Rühren z. B. 20
ccm kohlensäurefreies Wasser zugegeben. Es wird so lange geschüttelt oder gerührt,
bis das Material völlig homogen ist. Nach mehrstündigem Stehen ist der Zellulosebrei
gebrauchsfertig.
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Die adsorptive Sättigung der Zellulose mit Cyanidionen ist neben
der Einhaltung eines neutralen pH-Wertes dazu notwendig, um alle Vitamin-Bt2-Faktoren
stets in der gleichen Komplexform zu erhalten, damit definierte und reproduzierbare
R-Werte erzielt werden.
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Bei Verwendung von Zelluloseflocken wird entsprechend mehr an wassergesättigtem
n-Butanol verwendet, da sonst die Masse zu dick wird.
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Die zu füllende Säule, die üblicherweise unten mit einem Hahn verschlossen
ist, wird mit der Entwicklerlösung zum Teil gefüllt. Anschließend wird in die Säule
der n-Butanol-Zellulosebrei durch einen Trichter unter gleichzeitigem Öffnen des
Ablaßhahnes eingebracht. Während des Absetzens der Zelluloseflocken wird die Säule
immer wieder um ihre vertikale Achse gedreht, damit die Füllung gleichmäßig erfolgt.
Der Zellulosebrei wird so lange nachgegossen, bis die abgesetzteFüllmasse ungefähr
die doppelte Höhe der gewünschten Säule, also z. B.
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I4 cm, besitzt, und der Flüssigkeitsspiegel 2 bis 3 cm iiber der Zellulosemasse
liegt. Es wird nun in die Kolonne ein passendes Filterscheibchen eingesetzt (ohne
das Luftbläschen unter das Scheibchens gelangen) und mit Hilfe eines passenden Stampfers
die Zellulosesäule auf t/2 bis 2/3 der ursprünglichen Höhe zusammengedrückt. Sobald
der Entwickler so weit abgetropft ist, daß der Flüssigkeitsspiegel fast verschwunden
ist, wird der Hahn geschlossen und das zu chromatographierende Material, gelöst
in wassergesättigtem n-Butanol oder aufgetragen auf ein trockenes Material, wie
z. B. Kieselgur, durch einen Trichter in das Rohr eingefüllt. Falls das Material
als Trockenprodukt aufgetragen wurde, wird es mit etwas wassergesättigtem n-Butanol
angefeuchtet und nach Auflegen eines zweiten Filterpapierscheibchens mit Hilfe eines
Stampfers leicht zusammengedrückt. Nach dem Öffnen des Hahnes werden nun durch Zugabe
sehr geringer Mengen an Entwickler die Vitamin-B12-Faktoren in die eigentliche Säule
gespült, wonach die Entwicklung beginnen kann.
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Verlauf der Chromatographie. Es wurde durch zahlreiche Versuche,
vor allem mit reinenVitaminen der Bi2-Gruppe, ermittelt, daß die Reihenfolge der
Vitamin-B12-Faktoren bei der Entwicklung in der Zellulosesäule die gleiche ist wie
im Papierchromatogramm bzw. auf der Aluminiumoxydsäule. Bei der Chromatographie
eines Gemisches der Faktoren I und II läuft der Faktor I voran (vgl. Abb. I), bei
einem Gemisch der Faktoren III und V der Faktor III (vgl. Abb. 2). Bei zahlreichen
Chromatogrammen der Faktoren I, II, III und V wurden bestimmte, für jeden Faktor
charakteristischeR-Werte beobachtet: Vitamin-B12-Faktor R-Wert I 0,40 - 0,59 II
0,21 - 0,29 III 0,08-0,123 V 0,04 - 0,059 Die Schwankungen der R-Werte sind auf
die unterschiedliche Herstellungsweise der Säule zurückzuführen, da es nicht möglich
ist, diesen Prozeß absolut gleichartig vorzunehmen. Während die relativen R-Werte
vom Wassergehalt der Säule weitgehend unabhängig sind, hängen die absoluten R-Werte
von der Menge des eingerührten Wassers sehr stark ab. Es empfiehlt sich daher, stets
die gleiche Menge Wasser in den Zellulosebrei einzurühren, und zwar jene Menge an
Wasser, bei der die optimale Trennschärfe der Vitamin-B12-Faktoren erzielbar ist.
Eine Versuchsreihe, bei der je 5 g Zellulosepulver und 50 ccm n-Butanol, gesättigt
mit Wasser, unter Zugabe verschiedener zusätzlicher Mengen Wasser geschüttelt worden
waren, ergab, daß die optimale Menge an Wasser zwischen 1 und 3 ccm liegt. Ohne
zusätzliches Wasser durchgeführte Versuche ergaben diffuse Zonen. Bei mehr als 3
ccm Wasser bildet das Zellulosepulver schwer zu beseitigende Zusammenballungen,
wodurch die Zonen gleichfalls unscharf werden. Die absoluten R-Werte vermindern
sich mit steigendem Wasserzusatz.
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DieVorteile der geschilderten erfindungsgemäßen chromatographischen
Methode sind vor allem folgende: I. Eine einfache Herstellbarkeit der Chromatographiersäule,
2. Eine kurze Entwicklungsdauer. Die Faktoren I und II können in 5 bis 6 Stunden
entwickelt und eluiert werden. Die Faktoren III bis V benötigen I2 bis I8 Stunden.
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3. Eine ungewöhnlich hohe Trennschärfe. Bei sorgfältiger Durchführung
und bei nicht zu starker Verunreinigung mit Salzen bzw. mit organischen Fremdstoffen
kann in einem Chromatogramm eine praktisch quantitative Trennung der Komponenten
I, II, III und V erzielt werden (vgl. Abb. 3) 4. Die Billigkeit und die leichteRegenerierbarkeit
des Entwicklers. Nach Extraktion der Vitamine der Bt2-Gruppe aus dem Eluat mit Wasser
ist der Butylalkohol nach einer einfachen Destillation wieder gebrauchsfähig.
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5. Ein geringer Bedarf an Entwickler. Zur Durchführung der Chromatographie
werden äußerst geringe Mengen an wassergesättigtem n-Butanol benötigt, was auch
aus den Abb. I bis 3 zu ersehen ist.
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Die Abszisse zeigt das Volumen an benötigtem Entwickler, die Ordinate
die Menge an eluiertem Vitamin-B12-Faktor; der letztgenannte Wert ist für die Faktoren
II und III mit Hilfe folgender Formel zu errechnen: Vitamin-B12-Faktor ~ optische
Dichte bei 36I m, in Gamma/ccm = oho207 Die Trennung der verschiedenen Vitamin-B,2-Arten
aus Faulschlamm mit Hilfe der adsorptionschromatographischen Methode ist nur in
bestimmter Ausführungsform durchführbar, nämlich besonders unter Verwendung von
Aluminiumoxyd in Gegenwart von Cyanidionen im pH-Bereich 6 bis 8, vor allem unter
Benutzung von Mischungen von Aceton mit Wasser, indem man die Konzentration an Wasser
im Verlauf der Entwicklung des Chromatogramms allmählich steigert. Trotz der Brauchbarkeit
dieser Methode hat sie aber im Vergleich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren folgende
Nachteile: I. Eine verhältnismäßig umständliche Herstellbarkeit der Adsorptionskolonne,
2. Eine lange Entwicklungsdauer. Ein Chromatogramm dauert oft mehrere Tage.
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3. Eine verhältnismäßig geringe Trennschärfe.
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In einem Chromatogramm kann nur der Faktor I
praktisch
quantitativ abgetrennt werden. Andere Faktoren müssen rechromatographiert werden.
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4. Hohe Verluste an Entwickler (z. B. Aceton) durch Verdunstung.
Schwierigere Regenerierbarkeit des Entwicklers (z. B. Entwässerung von Aceton) .
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5. Der Verbrauch an Entwickler beträgt das Vielfache des Volumens
an wassergesättigtem n-Butanol im erfindungsgemäßen Verfahren.
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Es muß ausdrücklich betont werden, daß bei dem geschilderten Verfahren,
dessen Nachteile gegenüber dem erfindungsgemäßen Verfahren auseinandergesetzt wurden,
ein Adsorptionsmittel wie besonders Aluminiumoxyd verwendet wird, daß es sich also
dabei um eine adsorptionschromatographische Methode handelt, bei der die Vitamine
der B12-Gruppe an der Säule adsorbiert und durch den Entwickler eluiert werden.
Dagegen beschreibt das erfindungsgemäße Verfahren eine verteilungschromatographische
Methode, bei der keine Adsorption der Vitamin-B12-Faktoren an das Säulenmaterial
stattfindet, sondern vielmehr eine Verteilung der Vitamine der Bl2-Gruppe zwischen
dem in der Zellulosefaser festgehaltenen Wasser und dem vorbeifließenden Eluens.
Die Vitamine der Bl2-Gruppe werden an Zellulose nicht adsorbiert.
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Verteilungschromatographische Methoden zur Trennung der Vitamine
der Bl2-Gruppe in Chromatographiersäulen wurden bisher nur vereinzelt verwendet.
So reinigten E. Lester Smith et al. (Proc.
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Biochem. Soc. vom 29. 5. I948; Feder.. Proc. 9, Nr. I [I950]) den
Antiperniziosafaktor mit Hilfe von Silikagelkolonnen, wobei sie als Entwickler zu
zwei Drittel mit Wasser gesättigtes n-Butanol -allein oder mit Phenolzusatz - benutzten.
Sie erhielten auch bei Verwendung von n-Propanol bzw.
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Isopropanol, enthaltend IO bis 20 O/o Wasser, zufriedenstellende Chromatogramme.
Die gleichen Autoren verwendeten auch Stärke an Stelle von Silikagel. Sie beobachteten
auf Stärkekolonnen R-Werte von 0,5 bzw. I,2 für die Vitamine B12b bzw. Bl2. K. H.
Fantes et al. (Proc. Roy. Soc.
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B I36, 592, [I950]) benutzten zur Entwicklung der Silikagel -Verteilungschromatogramme
n-Butanol, enthaltend II bis I2 O/o Wasser. Diese Verfasser beschrieben auch Versuche
mit Silikagelkolonnen unter Verwendung von Mischungen aus n-Butanol und Phenol bzw.
Kresol an Stelle von reinem n-Butanol.
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Sie fanden, daß diese Mischungen keine nennenswerten Vorteile gegenüber
n-Butanol haben, bis auf eine etwas raschere Elution. Bei Verwendung von Mischungen
aus n-Propanol bzw. Isopropanol und IO bis 25 0/o Wasser als Entwickler wurden Verteilungschromatogramme
erhalten, die den mit n-Butanol-Wasser erzielbaren sehr ähnlich waren.
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U. J. Louis Lewis et al. (J. Biol. Chem. I94, 539, cm9521) chromatographierten
das aus Fäzes gewonnene Vitamin-Bl2-aktive Material mit Hilfe von Silikagelsäulen
unter Benutzung von wassergesättigtem Butanol als Entwickler Die Vitamin-Bl2-Faktoren,
die am oberen Ende der Kolonne festgehalten waren (die also nicht entwickelt wurden),
entfernten die Verfasser samt dem Silikagel und eluierten daraus das aktive Material
mit 650/oigen Athanol. J. E. Ford und J. W. G. Porter (Biochem. J. 51, Proc. V [1952])
chromatographierten die aus Kalbsfäzes gewonnenen Vitamine der Bl2-Gruppe an feuchtem
Silikagel unter Benutzung von wassergesättigtem sec.-Butanol, enthaltend eine Spur
an Cyanid. Sie trennten mit Hilfe dieser Methode das Gemisch von Vitamin-B12-Faktoren
in zwei Fraktionen, von denen die eine Vitamin B12 und den Faktor B enthielt, die
andere den Faktor A, allerdings nicht in völlig reinem Zustand.
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Die verteilungschromatographischen Versuche mit Stärkesäulen ergaben,
daß sich dieses Material zur Trennung von Gemischen von Vitamin-B12-Faktoren aus
Faulschlamm nicht eignet. Es wurden mehrere Stärkesorten unter Verwendung verschiedener
Entwickler untersucht, wobei stets sehr diffuse Chromatogramme ohne Zonenbildung
erhalten wurden.
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Auch Silikagelkolonnen erlaubten bei Verwendung von mit Wasser völlig
mischbaren Alkoholen mit dem üblichen Gehalt an Wasser und Cyanid keine Trennung
von Gemischen der Vitamin-B12-Faktoren aus Faulschlamm. Nicht viel besser verhielt
sich in diesem Fall wassergesättigtes sec.-Butanol. Eine teilweise Trennung gelang
bei Verwendung von wassergesättigtem n-Butanol, allerdings nur bei Anwendung sehr
großer Volumina an Entwickler und bei mehrtägiger Entwicklungsdauer. Es wurde in
einem Beispiel ein aus Faulschlamm gewonnenes gereinigtes Konzentrat der Vitamine
der Bl2-Gruppe mit Hilfe einer Silikagelsäule unter Verwendung von wassergesättigtem
n-Butanol und Cyanid als Entwickler chromatographiert, im Prinzip nach der Vorschrift
von E. Lester Smith et al. (Biochem. J. 52, 389 [1952]). Wie aus der Abb. 4 zu ersehen
ist, konnten auf diese Weise die Vitamine der Bl2-Gruppe in vier Fraktionen (I bis
4) aufgeteilt werden. Zwecks genauerer Identifizierung dieser Fraktionen wurden
die Eluate fraktionsweise vereint und nach entsprechender Konzentrierung mit Hilfe
des erfindungsgemäßen Verfahrens auf Zellulose-n-Butanol-Wasser-Kolonnen chromatographiert.
Das Ergebnis ist in Tabelle 2 wiedergegeben.
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Aus der Tabelle 2 ist zu ersehen, daß die mit Hilfe der Silikagelsäule
erhaltenen Fraktionen, mit Ausnahme der Fraktion I, mit den Nachbarfraktionen verunreinigt
waren. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens konnten aber die Fraktionen I
bis 4 mit Leichtigkeit gereinigt werden.
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Auch eine Wiederholung der Chromatographie ergab völlig homogene Zonen.
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Das neue erfindungsgemäße Verfahren wird durch folgendes Beispiel
näher erläutert: Beispiel Ein aus Faulschlamm gewonnenes und vorgereinigtes Gemisch
von Vitamin-Bl2-Faktoren, niedergeschlagen auf Kieselgur und getrocknet, wird auf
eine Säule aufgetragen, die nach obiger Beschreibung aus Zellulosepulver, n-Butanol
und Wasser unter Zusatz der üblichen Menge an
Tabelle 2 Verteilungschromatographie
der Fraktionen I bis 4 (aus der Silikagelchromatographie) auf einer Zellulose-n-Butanol-Wasser-Kolonne.
| Fraktion Verteilungschromatogramm in Zellulose-n-Butanol-Wasser |
| der |
| mit Hilfe des R-Wertes |
| Silikagelsäule Zone Farbe ll R-Wert t identifizierter Faktor |
| I stark violett 0,45 1 |
| 2 stark rot o,24 II |
| sehr schwach rot o,og III |
| 3 sehr schwach J rot o,26 II |
| stark rot o,og III |
| 4 stark rot ' 0,08 III |
| stark j violett 0,04 V |
Natriumcyanid hergestellt wurde; Säulendurchmesser 11,5 mm, Höhe 70 mm.
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Nach Entwicklung mitwassergesättigtem n-Butanol, enthaltend die übliche
Menge an Natriumcyanid, werden die einzelnen Vitamin-Bl2-Faktoren in praktisch völlig
getrennter Form im Eluat aufgefangen. Die Faktoren II und III können dann ohne weitere
Reinigung zur Kristallisation gebracht werden (vgl. dazu Abb. 3).
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Abb. 1 zeigt die Verteilungschromatographie eines Gemisches der Vitamin-Bl2-Faktoren
I und II aus Faulschlamm mit Hilfe einer Kolonne aus Zellulosepulver, n-Butanol
und Wasser unter Zusatz von Cyanid. Entwickler: wassergesättigtes und C N'haltiges
n-Butanol, Säulendurchmesser 11.5 mm, Höhe 70 mm; Abb. 2 zeigt die Verteilungschromatographie
eines Gemisches der Vitamin-Bl.,-Faktoren III und V aus Faulschlamm; Versuchsbedingungen
wie Abb. I; Abb. 3 zeigt die Verteilungschromatographie eines Gemisches der Vitamin-Bl2-Faktoren
I, II, III und V aus Faulschlamm; Versuchsbedingungen wie Abb. I; Abb. 4 zeigt die
Verteilungschromatographie eines gereinigten Faulschlammkonzentrats mit Hilfe einer
Kolonne aus Silikagel, n-Butanol und Wasser unter Zusatz von Cyanid. Entwickler:
wassergesättigtes und C N'haltiges n-Butanol.
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Säulendurchmesser 26 mm, Höhe 200 mm.