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Verfahren zur Herstellung eines Heilmittels gegen nicht infektiöse
Leber-, Gallen- und Darmerkrankungen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
eines Heilmittels gegen nicht infektiöse Leber-, Gallen- und Darmerkrankungen unter
Verwendung einer Varietät des Bacillus subtilis. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß Bacillus subtilis var. indolasus in Kohlehydrate undloder andere Verbindungen
als Kohlenstoffquelle enthaltenden schwach alkalischen Nährmedien, die jedoch eiweißfrei
sind und höchstens O, I °/o Aminosäuren enthalten, gegebenenfalls bis zum vollständigen
Verbrauch der Kohlenstoffquellen unter üblichen Bedingungen gezüchtet wird.
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Für die Herstellung des Heilmittels werden das Nährmedium und die
darin enthaltenen Bazillen nach beendeter Züchtung vorzugsweise entwässert, wobei
gegebenenfalls vor oder nach der Trocknung indifferente Stoffe wie Kohlehydrate
u. dgl. hinzugefügt werden. Dabei ist es möglich, daß die Bazillen vor oder nach
der Trocknung durch Hitzesterilisation abgetötet werden. Bei einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform der Erfindung werden das Kulturfiltrat und die Bazillen in üblicher
Weise voneinander getrennt, die Bazillen gegebenenfalls abgetötet und die bazillenfreie
Kulturlösung sowie die Bazillen getrennt getrocknet. Die Züchtung wird vorzugsweise
bis zum völligen Verbrauch der Kohlehydrate bzw. der anderen als Kohlenstoffe dienenden
Stoffe fortgesetzt. Der verwendete Stamm Bacillus subtilis var. indolasus wird durch
die folgende Beschreibung und Identifizierung gemäß dem Schlüssel von Bergeys »
Manuel of Determinative Bacteriology«, VI. Ausgabe, unter Einschluß einiger dort
nicht vorgesehener Teste charakterisiert. Bacillus subtilis var. indolasus gehört
zu Familie XIII Bacillaosae Fischer; genus Bacillus; species Bacillus subtilis var.
indolasus.
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Häufig bemerkt man das Auftreten zweier verschiedener Formen, einer
Rauh- und einer Glattform.
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Bei der Isolierung und Züchtung einer dieser Formen
bildet
sich fast stets auch wieder die andere Form. -Beide Formen, einzeln wie auch in
Mischung miteinander, können zur Erzeugung des Heilmittels verwendet werden.
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Zur näheren Charakterisierung von Bacillus subtilis var. indolasus
dient die Tabelle 1. Der Stamm ist bei der Association pharmaceutique belge, Service
de Controle des Medicaments, Brüssel, I3 Rue Archimede, sowie beim Hygienischen
Institut der Universität Wien hinterlegt.
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Es wurden schon verschiedene Varianten von Bac. subt. früher zur
Erzeugung von Heilmitteln wie Bacitracin und Subtilin insbesondere gegen infektiöse
Darmerkrankungen verwendet. Die so hergestellten Heilmittel haben antibiotische
Wirkung und sind infolgedessen nicht hitzebeständig. Es ist auch bereits bekannt,
Bac.-subt.-Arten in einem eiweißfreien Medium zu züchten, erfindungsgemäß ist jedoch
die Eiweißfreiheit des Nährbodens unbedingte Voraussetzung für die Bildung von therapeutisch
verwendbaren, nichttoxischen Produkten. Andere Bac.-subt.-Varianten bilden auch
auf eiweißfreien Nährböden häufig toxische Produkte, was bei Bac. subt. var. ind.
nie beobachtet werden konnte.
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Die erfindungsgemäß verwendete Variante unterscheidet sich auch in
chemischer Hinsicht von den bisher bekannten Varianten darin, daß sie im besonderen
Maße befähigt ist, Indol abzubauen. Während andere bekannte Stoffwechselprodulfte
des Bac. subt., z. B. Bacitracin, Subtilin u. dgl., ihrer Zusammensetzung nach Polypeptide
sind, können solche in dem erfindungsgemäß hergestellten Präparat nicht nachgewiesen
werden. Das Kulturmedium enthält zwar nach der Züchtung naturgemäß noch stickstoffhaltige
Verbindungen; der reine Wirkstoff, dessen chemische Konstitution noch nicht aufgeklärt
werden konnte, ist jedoch stickstofffrei.
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Weiter wurde schon Heuinfus, der Bac.-subt.-Stämme enthielt, peroral
zur Behandlung bestimmter Magen- und Darmerkrankungen verwendet. Die in dem Heuinfus
enthaltenen Bakterien unterscheiden sich von dem erfindungsgemäß verwendeten Stamm
wesentlich. Die Bakterien im Heuinfus wachsen bei einem PH von 5>5, also im sauren
Gebiet. Sie sind gramnegativ bis gramlabil und haben die Form von Kurz- und Langstäbchen,
häufig auch Fadenform.
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Der erfindungsgemäß verwendete Stamm Bac. subt. var. ind. dagegen
wächst bei einem PH von 7 bis 8, also schwach alkalisch, ist grampositiv bis gramlabil
und kommt in einer Rauh- und einer Glattform vor.
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Dementsprechend unterscheiden sich auch die Stoffwechselprodukte
in ihren Eigenschaften und ihrer Wirksamkeit. Der Heuinfus hat gegenüber Colibakterien
bakteriostatische Wirksamkeit und ist gegen Hitze empfindlich.
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Im Gegensatz zu den oben angeführten Produkten, die aus den bisher
verwendeten Bac.-subt.-Varianten erhalten wurden, hat der vorliegende Wirkstoff
keinerlei antibakterielle Wirkung gegen pathogene Mikroorganismen, wie die Tabelle
2 beweist. Er ist hitzebeständig und büßt auch durch länger dauerndes Erhitzen auf
Ioo bis 1200 C nichts von seiner Wirksamkeit ein. -Die erfindungsgemäß hergestellten
Präparate können daher auf übliche Weise sterilisiert werden. Schon daraus ist zu
ersehen, daß die in der Kulturlösung vorhandenen Enzyme (hauptsächlich vertreten
sind tryptische Enzyme) nicht für die Heilwirkung verantwortlich sein können. Hingegen
wurde festgestellt, daß die bei skorbutkranken Meerschweinchen erhöhte Ausscheidung
von I7-Ketosteroiden durch das erfindungsgemäß hergestellte Präparat gesenkt werden
konnte; diese Beobachtung, die noch bei keinem anderen Stoffwechselprodukt der bekannten
Bac.-subt.-Varianten gemacht werden konnte, läßt theoretisch drei Möglichkeiten
der Wirkungsweise offen: direkte Einwirkung auf die Leber, direkter Eingriff auf
die Nebennierenrinde oder eine Bremsung der ACTH-Ausschüttung.
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Auch der erfindungsgemäß verwendete Stamm Bac. subt. ind. ist in
der Literatur schon zur Erzeugung einer aktiven Substanz als Heilmittel gegen Colitiden,
Cholecystopathien, Hepatopathien erwähnt, jedoch ist nichts über die Morphologie
und das spezielle Züchtungsverfahren angegeben.
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Abgesehen von dem Merkmal, daß die schwach alkalischen Nährmedien
eiweißfrei sind und höchstens 0, I °/0 Aminosäuren enthalten, wird die Züchtung
gemäß der Erfindung im wesentlichen in der gleichen Weise wie bei Bac. subt. var.
ind. durchgeführt. Die günstigsten Ergebnisse erhält man bei Züchtung unter aeroben
Bedingungen in einer Submerskultur bei einer Temperatur von 30 bis 400 C. Unter
diesen Bedingungen beträgt die Züchtungsdauer weniger als 3 Tage; abweichende Bedingungen
zeitigen schlechtere Ergebnisse und bewirken eine Verlängerung der Züchtungsdauer.
Der p-Weft soll während der Züchtung 7 bis 8 betragen; ein Zusatz von puffernd wirkenden
Verbindungen hat sich als vorteilhaft erwiesen, da der Bac. subt. var. ind. während
der Züchtung auch Säuren produziert.
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Die Nährlösung enthält als Stickstoffquelle vornehmlich anorganische
Ammoniumsalze und muß frei sein von Eiweißverbindungen, da sich sonst toxische Nebenprodukte
bilden, die die therapeutische Wirkung des Produktes wesentlich herabsetzen. Ein
Zusatz von Aminosäuren bis zu o, I°/o, berechnet auf das Kulturmedium, ist jedoch
möglich und je nach Zusammensetzung der übrigen Nährlösung sogar recht günstig.
Geeignete Nährlösungen bzw. Nährböden enthalten beispielsweise Traubenzucker, Fruchtzucker,
Maltose, Rohrzucker, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Kaliumphosphat, Natriumphosphat,
Magnesiumsulfat, Alanin, Asparagin, Calciumchlorid, Zitronensäure, Glycerin, Dextrin,
Mannit, Sorbit, Vitamine, Hormone, Purine u. dgl.
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Die Züchtung erfolgt vorteilhafterweise bis zum Verbrauch sämtlicher
Nährstoffe. Eine sofortige Aufarbeitung ist nicht erforderlich, da sich die therapeutische
Wirkung des Kulturmediums bei längerem Stehen nicht verringert.
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Die bei der Züchtung anfallenden festen oder flüssigen Kulturen von
Bac. subt. var. ind. können, wie bereits erwähnt, unmittelbar als Heilmittel verwendet
werden, insbesondere nachdem ihnen zur Haltbarmachung ein Konservierungsmittel,
insbesondere ein Gemisch verschiedener p- Oxybenzoe-
säureester,
hinzugefügt worden ist. Besser ist es jedoch, insbesondere aus Gründen der Haltbarkeit,
das Produkt zu entwässern, beispielsweise durch Zerstäubungstrocknung, auf einem
Walzentrockner oder Eindampfen zu konzentrieren, wobei der Lösung zwecks besserer
Verteilung auch indifferente wasserlösliche oder wasserunlösliche Stoffe, insbesondere
Kohlehydrate, vor oder nach der Trocknung hinzugefügt werden können. Es ist also
nicht erforderlich, die Bakterien im Heilmittel abzutöten oder zu entfernen. Jedoch
ist eine Abtötung durch physikalische oder chemische Mittel durchaus möglich, ohne
daß z. B. durch eine Hitzesterilisation eine Wirkungsabnahme stattfindet. Weiterhin
können die in der Kulturlösung vorhandenen Bakterien abgetrennt und sowohl diese
abgetrennten Bakterien, gegebenenfalls nach einer vorherigen Abtötung, wie auch
die Kulturlösung in flüssiger oder entwässerter Form als Therapeutikum angewendet
werden. Eine Reinigung des Trockenrückstandes der Kulturlösung ist im Prinzip möglich,
ein besonderer Vorteil hat sich hierbei jedoch nicht ergeben.
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Bezogen auf die therapeutisch notwendige Dosis ist die Toxizität
des erfindungsgemäß hergestellten Heilmittels außerordentlich gering. Ein durch
Eindampfen einer Iotägigen Kulturlösung erhaltener sterilisierter Trockenrückstand
besaß eine Dosis letalis 50 nach K ärb er bei intravenöser Injektion von I75 bis
200 mg!kg Maus (Ioomg enthielten 13,3 Milliarden Keime). Die zur Heilung von Leber-,
Gallen- und Darmkrankheiten notwendige Dosis beträgt pro Tag etwa 25 mg für einen
Erwachsenen von etwa 60 kg. Da das Heilmittel auch bei oraler Applikation voll wirksam
ist, haben andere Applikationsformen keine wesentliche Bedeutung.
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Der therapeutische Wert der Heilmittel aus Bac. subt. var. ind. ergibt
sich daraus, daß mit ihnen bei chronischer Cholangitis, chronischer Cholecystitis,
Folgezuständen nach Hepatitis epidemica acuta, Folgezuständen nach vorausgegangener
Cholecystektomie, chronischen Hepatitiden, Praecirrhosen und Cirrhosen mit und ohne
Ascites, chronischer Gastro-Enteritis, Colitis ulcerosa gravis bisher sehr gute
Erfolge erzielt wurden.
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Beispiel I Eine sterilisierte Lösung von 5 g primärem Kaliumphosphat,
o,6g Kochsalz, 0,1 mg Zinksulfat, o, 8 g Ammonchlorid und 3,2 g Glukose in 1 1 Wasser,
die durch Zugabe von Natriumhydroxydlösung auf einen p-Wert von 7,2 eingestellt
war, wurde mit Bac. subt. var. md. beimpft. Die Lösung wurde 7 Tage bei einer Temperatur
von 350 C bebrütet. Durch Rühren mit Hilfe eines gut wirksamen Schnellrührers wurde
die gebildete Oberflächenhaut feinst in der Lösung verteilt (eine derartige Verteilung
ist auch in einer Schüttelapparatur unter Zugabe von Glaskugeln oder mit Hilfe von
Ultraschall möglich). Sodann wurden unter Erwärmen in der Lösung 2 g eines Gemisches
gleicher Teile p-Oxybenzoesäuremethyl-und-propylester gelöst. Die so entstandene
Lösung kann unmittelbar als Heilmittel verwendet werden. Sie enthält in der gesamten
Flüssigkeitsmenge annähernd I Billion Keime.
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Statt die Lösung mit den Benzoesäureestern zu versetzen, kann sie
auch durch Erhitzen sterilisiert werden. Weiterhin kann die Lösung durch Sprüh-oder
Walzentrocknung oder durch Eindampfen bei Normaldruck oder im Vakuum zur Trockne
gedampft werden. Der erhaltene Rückstand kann durch Verreiben mit Milchzucker, Traubenzucker,
Rohrzucker od. dgl. auf eine bestimmte Gewichtsmenge eingestellt werden.
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Beispiel 2 Eine sterilisierte und auf einen pH-Wert von 6,6 mit Hilfe
von Natronlauge eingestellte Lösung von o, 8 g Ammoniumsulfat, o, 6 g Kochsalz,
o, 8 g Natriumcitrat, o,55g Zitronensäure, o,gg prim. Natriumphosphat und 4 g Fruktose
in 1 1 Wasser wird mit Bac. subt. var. ind. beimpft und 6l/2 Tage bei einer Temperatur
von 36 bis 37° C bebrütet. Die entstandene Kultur kann entsprechend Beispiel I weiterverarbeitet
werden.
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Beispiel 3 Eine sterilisierte und auf einen pr-Wert von 7,0 eingestellte
Lösung von I,35 g prim. Kaliumphosphat, 5.65g sek. Natriumphosphat, 0,06 g Magnesiumchlorid,
0,0005 g Calciumchloridhydrat, 0,45 g Kochsalz, o,g g Alanin und 4 g Saccharose
in I 1 Wasser wird mit Bac. subt. var. ind. geimpft. Nach einer Bebrütungszeit von
5 Tagen, Homogenisierung der ausgebildeten Oberflächenhaut und einer Sterilisierung
durch Erhitzen auf I200 C wird die entstandene Kulturlösung im Vakuum zur Trockne
gedampft und der Trockenrückstand mit 22,5 g Milchzucker verrieben.
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Die entstandene Verreibung kann unmittelbar verwendet werden.
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Beispiel 4 Eine sterilisierte und auf einen p-Wert von 7,5 eingestellte
Lösung von 0, OOI g p-Aminobenzoesäure, 0,05 g Adenin, 0,05 g Cytidin, 0,05 g Mangansulfat,
o, 85 g Asparagin, 0,5 g Kaliumchlorid, 1,35 g prim.
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Kaliumphosphat, 5,65 g sek. Natriumphosphat und 4 g Maltose wird mit
Bac. subt. var. ind. geimpft und 4'/2 Tage bei einer Temperatur von 37,5 bis 38°
C bebrütet. Die entstandene Kulturlösung wird durch ein Bakterienfilter filtriert,
das Filtrat zur Trockne gedampft und mit Milchzucker verrieben.
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Die abgetrennten Bakterien werden ebenfalls getrocknet und mit Milchzucker
verrieben. Beide Milchzuckerverreibungen können therapeutisch verwendet werden.
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Beispiel 5 In einer entsprechend Beispiel 3 hergestellten Nährlösung
werden 30 g Agar gelöst. Der sterilisierte Kulturboden wird mit Bac. subt. var.
ind. geimpft und in schalen 7½ Tage bei einer Temperatur von 38°C bebrtet. Die entstandene
Oberflächenhaut wird von den Agar-Platten entfernt, getrocknet, die Bakterien durch
Erhitzen abgetötet und sodann mit Rohrzucker verrieben.
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Beispiel 6 85 g Asparagin, 0,5 g Aneurin, 0,5 g Lactoflavin, o,gg
Diäthyldioxystilbenpropionat, 5 g Ferrosulfat,
Tabelle I
| Acetyl- Eisen- @@ Ver- Pepto- Indol- |
| Hämo- Wachs- methyl- chlorid- |
| Gas Säure flüssi- nisie Nitrit NH3 H2S Indol spal- |
| lyse tum carbi- schwär- tung |
| gung rung nol zung |
| Blutagar und Blut- |
| bouillon + + |
| (Hä- |
| mo- |
| lyse) |
| Gelatine .......... + + |
| Löffler Serum + ++ |
| Serum Agar...... + ++ |
| Milch............. + ++ |
| Nitratbouillon..... + + |
| Pepton-Lösung |
| nach Voges |
| Proskauer....... + + |
| Rindergalle..... - |
| Dextrose........ - + + |
| Fruktose........ - + + |
| Sacharos........ - + + |
| Maltos.......... - + + |
| Mannose......... - + + |
| Xylose.......... - + + |
| Stärke.......... - + + |
| Dexitrin........ - + + |
| Glycerin........ - + + |
| Mannoit......... - + + |
| Sorbit.......... - (+) + |
| Galaktose....... - nach |
| 60 |
| Std. |
| + + |
| Lactose.......... - - + |
| Rhamnose......... - - + |
| Rafinnose........ - - + |
| Dulcit........... - - + |
| Adonit........... - - + |
| 3% NaCl Bouillon + |
| 6% NaCl Bouillon + |
| Kligler Eisen-Agar + |
| Äsculin.......... - + + + |
| Harnstoffagar.... (~) wenig |
| Inulin........... - nach |
| 108 |
| Std. |
| + + |
| Inosit........... - nach |
| 108 |
| Std. |
| + + |
| serum............ + + |
| Leberbouillon.... ++ + |
| 1% Gelatinelösung |
| mit Indolzusatz + |
Die Spaltung der Kohlehydrate (außer Äsculin) wurde in Barsiekow-Nährlösung geprüft.
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Wachstum ++ sehr gut + gut (+) wenig, erst nach einigen Tagen.
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Tabelle 2 Kulturtrockenrückstand (enthaltend I33 Millionen Keime
pro mg) in ccm
| Stamm 500 250 125 62,5 31,25 15,5 Kontrolle |
| Micrococcus pyogenes var. aureus SG 511 + ++ + + + ++ ++ |
| Micrococcus pyogenes var. aureus B ... ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ |
| Micrococcus pyogenes var. aureus H ... + + + + + + + + + +
+ + + + |
| Micrococcus pyogenes var. aureus W + + + + + + + + + + + +
+ + |
| E coli B1........................... ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ |
| E coli H............................ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ |
| E coli W............................ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ |
| E coli 562.......................... ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ |
| Streptococcus Gr. A Nr. 807......... ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ |
| Streptococcus Gr. B Nr. 779 ............... ++ ++ + ++ ++ +
++ |
| Streptoccocus Gr. C Nr. 895......... ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ |
| Streptococcus Gr. D Nr. 816......... ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ |
| Diplococcus pneumoniae Type I Nr H ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ |
| Diplococcus pneumoniae Type I Nr. I23I + + + + + + + + + +
+ + + + |
| Diplococcus pneumoniae |
| Type II Nr. Knoop.................. ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ |
| Diplococcus pneumoniae |
| Type III Nr. Kohler + + + + + + + . . . . . . . . . + + + +
++ ++ ++ |
++ = gutes Wachstum 0,1g Kupfersulfat, 5 g Kochsalz, 55 g Zitronensäure, 430 g sek.
Natriumphosphat und 400 g Fruktose werden in 1001 destilliertem Wasser gelöst. Nach
Zugabe von 5 g eines Schaumverhütungsmittels (Entschäumungsmittel E 100 konz. Bayer)
wird die Lösung durch Erhitzen sterilisiert und nach dem Erkalten mit Bac. subt.
var. ind. geimpft. Die Lösung wird sodann auf einer Temperatur von etwa 36 bis 37°C
gehalten und während 4 Tagen unter Einblasen von steriler Luft in das untere Ende
des Behälters gebrütet. Sodann wird die entstandene Lösung durch Erhitzen sterilisiert
und nach Zugabe einer Mischung von gleichen Teilen Kochsalz und Milchzucker auf
einem Walzentrockner getrocknet.
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PATENTANSPROCHE : I. Verfahren zur Herstellung eines Heilmittels
gegen nicht infektiöse Leber-, Gallen- und Darmerkrankungen unter Verwendung einer
Varietät des Bacillus subtilis, dadurch gekennzeichnet, daß Bacillus subtilis var.
indolasus in Kohlehydrate und/oder andere Verbindungen als Kohlenstoffquelle enthaltenden
schwach alkalischen Nährmedien, die jedoch eiweißfrei sind und höchstens 0,1% Aminosäuren
enthalten, gegebenenfalls bis zum vollständigen Verbrauch der Kohlenstoffquellen
unter üblichen Bedingungen gezüchtet wird.