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Publication number: DEM0026609MA
Authority: DE

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BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

Tag der Anmeldung: 28. März 1955 Bekanntgemacht am 5. Januar 1956

DEUTSCHES PATENTAMT

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Antibioticum, das als »Streptogramin« bezeichnet werden soll, sowie auf dessen Herstellung.

Bakterielles Spektrum

Es wurde festgestellt, daß die neue antibiotische Substanz gegenüber einer großen Anzahl verschiedener Bakterientypen wirksam ist. Unter den Bakterien, deren Wachstum in Gegenwart des neuen Antibioticums aufhört, wären zu erwähnen der Haemophilus pertussis, Bacillus subtilis, Streptococcus pyogenes und insbesondere der Staphylococcus aureus, der gegenüber Penicillin und sonstigen verfügbaren Drogen resistent geworden ist. Dieser letztgenannte Mikroorganismus hat in letzter Zeit beim Menschen eine große Anzahl ernster und oft tödlicher Infektionen verursacht. Es ist bemerkenswert, daß ein Stamm von Staphylococcus aureus, der durch laufende Übertragung gegenüber mehr als dem Hundertfachen der ursprünglichen hemmenden Dosis von Penicillin. resistent gemacht worden war, dennoch gegenüber dem neuen Antibioticum Streptogramin volle Empfindlichkeit zeigt.

Eine ausführliche Liste der Mikroorganismen, die auf das neue Antibioticum ansprechen, findet sich in der nachstehenden Tabelle I.

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Tabelle I

Bakteriostatische Wirkung in vitro
in Mikrogramm je cm³ Kulturmedium

Staph. aureus '. 0,03 bis 0,08

Strep, pyogenes 0,02 bis 0,03

Strep, agalactiae 0,04

Strep, faecalis 0,94 bis 1,12

D. Pneumoniae 0,16 bis 0,31

C. diphtheriae 0,005 bis 0,02

S. typhosa 1,25 bis über 10

S. paratyphi mehr als 10

S. Schot tmuelleri mehr als 10

Slug, sonnei 7,5 bis 10

E. coli 30

P. mullocida 1,8 bis 3,8

„₀ K. pneumoniae mehr als 10

Ps. aeruginosa mehr als 30

Br. abortus 15

H. pertussis 0,06

P. vulgaris mehr als 30.

Physikalische und chemische Eigenschaften

Die neue Substanz ist eine neutrale Verbindung. Gereinigte Konzentrate des Antibioticums sind in Wasser schwer löslich (ungefähr 0,1 mg je cm³). Die Substanz ist leicht in Methanol, Äthanol, Aceton und Äthylacetat löslich, in Ligroin unlöslich. Versuche, ein Präparat des Streptogramins in Kristallform zu erhallen, sind bisher fehlgeschlagen. Verschiedene mit dein Antibioticum gesättigte Lösungsmittel setzten beim Abkühlen winzige feste Kügelchen ab. Hier und cla ballten sich derartige Kügelchen zusammen, um Pseudo-Kristalle (Nadeln) zu bilden, welche indessen zwischen den gekreuzten Nikols kein Erlöschen des polarisierten Lichtstrahls zeigten. Das stärkste Präparat, welches erhalten werden konnte, enthält die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Schwefel (letzlerer als Spuren einer Verunreinigung). Die chemische Analyse dieses Präparats ergab im Mittel 62,25°/o Kohlenstoff, 6,62»/„Wasserstoff, 8,42% Stickstoff und Spuren von Schwefel. Hieraus errechnet sich eine Bruttoformel etwa gleich C_2nH₃₃N₃O₇.

Das Strcptogramin besitzt ein deutliches Infrarot-Absorptionsspcktrum, wie aus der Zeichnung hervorgehl. Es wurde erhalten mit einem Perkin-Elmer selbsttätig registrierenden Infrarot-Spektrophotometer mit NaCl-Prisma. Das Spektrum wurde selbsttätig von 2 bis zu 15 // aufgezeichnet. Das Muster wurde mit SchweHil (Mineralöl) getränkt und ohne die Ver-Wendung eines Distanzstückes gleichmäßig zwischen zwei Salzplatten ausgebreitet. Als Bezugsmuster wurde Mineralöl allein verwendet. Die Spitzenwerte in den Musterspektren bei 3,4 bis 6,8 und 7,2 /< sind teilweise auf das Mineralöl zurückzuführen. Es wurden die folgenden unterscheidbaren Banden festgestellt: 3,°5. 3,-13, 3,5-1, 5,80, 6,02, 6,17, 6,23, 6,35, 6,46, 6,58, 6,94, 7,03, 7,32, 7,46, 7,64, 7,72, 7,96, 8,09, 8,20, 8,44, 8,61, 8,94, 9,45, 9,65, 9,78, 10,15, 10,26, 10,6o, 10,80, 10,98, 11,29, ¹¹O⁰. 11.78, 12,28, 12,68, 13,00, 13.23, 13.40 und 14,35.

Bemerkenswert ist, daß das stärkste bisher erhaltene Präparat ein Absorptionsspektrum zeigt, welches identisch ist mit demjenigen eines Konzentrats, welches um io°/„ in der Potenz differiert, woraus hervorgeht, daß die unwirksamen Verunreinigungen eine nahe verwandte Struktur besitzen. Damit bekommt man eine mögliche Erklärung für die Schwierigkeit, das Antibioticum in Kristallform zu erhalten.. Ein anderer Grund, eine nahe strukturelle Verwandtschaft zwischen dem Antibioticum und der darin enthaltenen unwirksamen Verunreinigung zu vermuten, ist die Schwierigkeit, die beiden Stoffe durch Verteilung eines Lösungsmittels im Gegenstrom voneinander zu trennen. Auch zeigt die Phasenregel-Löslichkeitsanalyse solcher Gemische die Gegenwart nur einer Komponenten, was also zeigt, daß die beiden Stoffe isomorph sind. Der Schmelzpunkt der Streptogramin-Präparate (ungefähr 155⁰ C) ist innerhalb gewisser Grenzen unabhängig von der Potenz, ebenso auch die spezifische Drehung (Mi⁵ = — (134°). /

Eine negative Ninhydrin-Reaktion (a-Aminostickstoff) erhält man sowohl vor als auch nach der Hydrolyse. Die Gegenwart von Ringstickstoff wird nachgewiesen durch einen positiven Farbtest mit Dimethylaminobenzaldehyd in Phosphorsäure.

Eine positive Farbreaktion, erhalten beim Kuppeln mit Diazosulfanilsäure, und ein positiver Farbtest mit Eisen-(III)-Chlorid zeigen die Gegenwart einer oder mehrerer Phenol-Gruppen an.

Kennzeichen des Mikroorganismus

Der Organismus, welcher die erfindungsgemäße neue chemische Substanz erzeugt, wurde aus einem Bodenmuster des Staates Texas isoliert. Dieser im Boden natürlich vorkommende Organismus und spontane Mutationen desselben gehören zu der allgemein als Treptomyces bezeichneten Art. Er ist typisch aerob, bei begrenztem Wachstum im untergetauchten Zustande. Es bildet sich ein echtes Mycel. Bei Ver-Wendung von mit dem Organismus geimpften Natriumcaseinatagar trat nach einer angemessenen Inkubationszeit an der Oberfläche Wachstum und reichliche Sporenbildung auf. Die mikroskopische Untersuchung enthüllte verzweigte vegetative Mycelien von etwa ι Mikron Durchmesser. Es bildeten sich Lufthyphen bzw. Zellfäden von 1 bis 1,3 Mikron Durchmesser, welche kugelförmige Konidien in Ketten, die in dicht aneinanderliegende Windungen ausliefen, trugen. Diese Konidien maßen etwa 1,2 Mikron im Durchmesser. ' '

"Lakusmolke trug ein ausgezeichnetes Wachstum in der Form eines dunkelbraunen bis schwarzen Ringes an der Oberfläche des Mediums. Es erfolgte Peptonisierung bei einer bestimmten alkalischen Reaktion (Pn = 6,4, wechselnd auf 8,2).

In Nitratbouillon erfolgte ein mäßiges bis ausgezeichnetes Wachstum bei Oberflächenkolonien mit weißen Sporen und etwas weißem Niederschlag am Boden des Röhrchens. Das Nitrat wurde in 14 Tagen bei 37⁰ C langsam zu Nitrit reduziert.

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' In Tryptonbouillon erfolgte mäßiges Wachstum in

der Form eines weißen bis grauen Teilhäutchens. Es bildete sichern gelbes lösliches Pigment. Der Indol-Test war negativ. ■

In künstlicher Nährbouillon (Szapek) bildete sich ein vollständiges Häutchen winziger Kolonien, die

' reichlich mit weißen bis grauen Lufthyphen bedeckt

. ■ waren. Die Flüssigkeit wurde rötlichbraun gefärbt.

Gelatineschnitzel wurden in 7 Tagen bei 37⁰ C verflüssigt, obwohl das Wachstum in der Form einiger weniger brauner Oberflächenkolonien und spärlichen

, Bodensatzes gering war.

Das Wachstum auf Kartoffelpfröpfchen war ausgezeichnet. Die Oberfläche des Pfropf chens bedeckte sich mit winzigen aufrecht stehenden Kolonien, die , ihrerseits mit pulverförmigen, weißen Lufthyphen, die später grau wurden, überzogen waren. Die Kartoffelpfröpfchen wurden schwarz.

■ Das Wachstum auf Stärke-Agar war reichlich in der Form leicht aufrecht stehender, lederfarbener bzw. lohfarbener Kolonien mit unregelmäßigen Kanten und rauher Oberfläche sowie mit Riefen von der Kante zur Mitte. Die Oberflächen waren mit grauen Lufthyphen mit weißem Rande bedeckt. Die Rückseite der Kolonie war braun bis zu schwarz. Die Stärke wurde hydrolysiert. ' . _.

Das Wachstum auf Bennetts Agar war ausgezeichnet. Die -Kolonien waren den auf Stärke-Agar gezüchteten ähnlich. Ein lösliches Pigment war nicht vorhanden. . "

' - Das Wachstum auf Nähragar (Fleischpepton) war iriaßig. Die Kolonien waren den auf Stärke-Agar gezüchteten ähnlich.

Das Wachstum auf Glukose-Pepton-Agar war mäßig und gab Anlaß zu lohfarbenen Kolonien mit unregelmäßigen Kanten, die sich in den Agar hineingruben; sie waren mit weißen Lufthyphen bedeckt. Die Rückseite der Kolonien war braun bis zu schwarz. Es wurde ein gewisses Aufspalten der bei 37 ° gewachsenen Kolonien beobachtet. Ein lösliches Pigment war nicht vorhanden.

Das Wachstum in, Glukose-Asparagin-Agar war gering unter Auftreten ,spinnwebenähnlicher isabellfarbener Kolonien mit unregelmäßigen Kanten und spärlichen weißen Lufthyphen bei 30⁰ C.

Bei künstlichem Agar (Szapek) erhielt man ein mäßiges Wachstum isabellfarbener spinnwebenähn-, richer Kolonien, ähnlich denjenigen auf Glukose-■ Asparagin. Es konnte weder eine Bildung von Sporen noch eine solche von löslichem Pigment beobachtet werden. -. . ■ .

Natriumcaseinat-Agar trug ein ausgezeichnetes Wachstum mit geruchlosen Kolonien von unregel-. mäßigen Kanten bzw. Rändern, die sich bei 30⁰ mit j5 grauen Luftmycelien bedeckten. Bei 37⁰ bildeten sich gefiederte Kolonien mit flacher Oberfläche, mit Sporen in der Mitte und sporenlosem Rande. Die Rückseite der Kolonie zeigte ein braunes Zentrum mit farblosem Rande. Ein lösliches Pigment wurde nicht gebildet.. . ■ .

Auf Tyrosin-Agar' war das Wachstum gering in der Form winziger, hütchenförmiger, brauner Kolonien mit nicht wahrzunehmenden Lufthyphen. Die Rückseite der Kolonien war hellbraun. Ein lösliches Pigment wurde nicht gebildet. ,

Das Wachstum auf Calciummalat-Agar war mäßig ' unter Bildung gefiederter Kolonien unter der Oberfläche mit einem hütchenförmigen Mittelpunkt über dem Agar, bedeckt mit gelblichweißen Lufthyphen; Ein lösliches Pigment wurde nicht gebildet. Im allgemeinen waren Wachstum und Sporenbildung bei 37° besser als bei 30⁰, aber einige wenige Grade mehr oder weniger ergaben auch, noch zufriedenstellende Resultate.

Von obigen Kennzeichen darf man annehmen, daß sie den Organismus und seine Formen von irgendwelchen Arten wie sie in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 6. Auflage, S. 929 bis 967, be- .,·. schrieben sind, unterscheiden. , . :.

Demzufolge wurde der Name Streptomyces graminofaciens gewählt, um dem neuen, vorstehend beschriebenen Organismus zu bezeichnen.

Wachstum bzw. Züchtung des Mikroorganismus

Das Antibioticum wird erzeugt durch die üblichen Fermentierungsverfahren einschließlich Rühren und Belüftung zwecks Durchführung einer aeroben Kultur. Es kann dazu eines der üblichen Fermentierungsmedien verwendet werden; dieses muß die üblichen Bestandteile, wie z.B. ein Kohlehydrat, eine Quelle für Stickstoff; Mineralsalze, wie z. B. Phosphate, sowie Spurenelemente einschließen. Beispielsweise wird Streptogramin in dem folgenden Kulturmedium erzeugt:

Cerelose (geringe Verunreinigungen enthaltende Glukose, erzeugt von der Fa. Com Products, USA.): 0,8 °/₀; N-Z-Amin B (Trypton) (enzymatischer Auszug , von Kasein, erzeugt von der Fa. Bordon Co., USA.): 0,28%; Sojapepton (Papainausziig von Sojabohnenmehl, erzeugt von der Fa. Sheffield Co. USA.): 0,05 %; Basaminbact (Hefeextrakti erzeugt von der Brauerei Anheuser Busch Company, USA.): 0,1 %; Glutaminsäure: 0,1%; NaCl: 0,083%; K₂HPO₄: 0,24%; ■ KH₂PO₄: 0,2%; MnCl₂: 0,0002%. Die Cerelose kann durch andere Kohlehydrate, wie z. B. Dextrin oder Stärke, ersetzt werden.

Zu Beginn des Fermentierungswachstums des S. graminofaciens soll das Kulturmedium auf einen p_H-Wert von 6,7 bis 7 eingestellt werden.

Die Erzeugung sowie die Gewinnung von Strepto- ■■ gramin gehen weiterhin aus den nachfolgenden Beispielen typischer Verfahren hervor.

Beispiel 1

Es wird ein steriles Kulturmedium der folgenden

Gewichtszusammensetzung hergestellt:

Cerelose (geringe Verunreinigungen enthaltende Glukose, erzeugt von der Fa. Com . Products, USA.) . .·. ....'......'. o,8%;

N-Z-Amin B (Trypton) (enzymatischer ₍ -

Auszug von Kasein, erzeugt von der . Fa. Bordon Co., USA.) ... 0,28%

K₂HPO₄ ' : 0,24% ,

KH₂PO₄ 0,2%

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Basaniinbact (Hefeextrakt, erzeugt von der Brauerei Anhcnscr Busch Company, USA.) 0,2%

Mononatriumglutamat o,i %

NaCl 0,083%

Sojapepton (Papainauszug von Sojabohnenmolil, erzeugt von der Fa. Sheffield Co., USA.) 0,05%

Mn CL 0,0002 %

p„ = 6,7 bis 6,8

Eine öse voll sterilen Bodens, der vorher mit S. graminofaciens geimpft worden war, wird einem das Kulturmedium enthaltenden Kolben von 250 cm³ hinzugesetzt. Unter Schütteln des Kolbens läßt man das Wachstum 4 Tage lang bei 25⁰ C vor sich gehen. Aus dem Kolben werden 10 cm³ entnommen und einem 2-1-KoII)CiI des Mediums hinzugesetzt. Das Schütteln wird 3 Tage lang bei 25⁰ C fortgesetzt.

ao Das Wachstum wird dann unter Rühren in einer Flasche, die 12 1 des auf einen p_irWert von 6,7 eingestellten Kulturmediums enthält, ausgeführt. Hierzu fügt man 360 cm³ des Inokulats aus dem 2-1-Kolben. Ferner wird ein Scliaumverhütungsmittel hinzugesetzt.

as Das Rühren geschieht durch ein Rührwerk bei 1750 Umdr./Min. Zur Belüftung wird ^J/₄ Volumen steriler Luft je Minute eingeführt. Die Temperatur wurde auf 25⁰ C gehalten, und der Betrieb wurde 24 Stunden lang fortgesetzt.

12 1 dieses Fcrmentierungsproduktes setzte man 600 1 des Kulturmediums mit einem p_n-Wert von 6,7 und ein Schaumverhinderungsmittel hinzu. Das Rühren erfolgte durch ein Rührwerk mit 120 Umdr./ Min. Die Belüftung erfolgte durch Einführen von etwa '/₄ Volumen steriler Luft je Minute. Die Temperatur wurde auf 25⁰ C gehalten, und der Betrieb wurde 48 Stunden lang fortgesetzt.

Das Wachstum wurde dann in größeren Behältern fortgesetzt, indem man 48 1 des Fermentierungsproduktes zu 2400 1 des Kulturmediums hinzusetzte. Die Wachstumsbedingungen wurden wie bei der 600 1-Charge aufrechterhalten. Nach 24 Stunden hatte das Fermentierungsmedium 91,2 Einheiten je cm³, nach 48 Stunden einen Gehalt von 177 Einheiten je cm³.

Das sind also 17,7 /<g je cm³, auf die Potenz des reinsten Präparats von Streptogramin, das isoliert werden konnte, bezogen.

Isolierung des Streptogramins Beispiel 2

Das Mycel wurde durch Filtrieren entfernt und das Filtrat mit ¹^, Volumen Äthylacetat in einem Gegenstrom-Extraktionsgefäß extrahiert. Das das Antibioticum enthaltende Lösungsmittel wurde zuerst mit '/r, Volumen einer Phosphatpufferlösung mit einem Pn-Wert von 9, dann mit einer Acetatpufferlösung — ¹If, Volumen — mit einem p_H-AVert von 3,5 und schließlich mit '/& Volumen Wasser gewaschen. Diese Waschungen, wenn sie auch nicht wesentlich sind, beseitigen doch die Verunreinigungen, welche sonst das Endprodukt verschlechtern würden. Das gewaschene Lösungsmittel wurde durch Destillation im Vakuum auf ein Volumen von etwa 4 1 herabgesetzt und dann mit dem dreifachen Volumen Ligroin be- 65' handelt, wobei der wirksame Stoff ausgefällt wurde, der nach Filtrieren und Trocknen im Vakuum eine Reinheit von etwa 50% besaß und 200 g wog.

Zur weiteren Reinigung wurde eine io%ige Lösung in Methanol des oben beschriebenen Rohprodukts mit dem neunfachen Volumen einer i%igen Phosphatpufferlösung mit einem p_n-Wert von 7 behandelt. Die Lösung wurde bei 5° C 18 bis 24 Stunden lang aufbewahrt und dann filtriert. Das Antibioticum verblieb im Filtrat und wurde auf diese Weise von einer erheblichen Menge der gefärbten unwirksamen Verunreinigungen abgetrennt. Das Filtrat wurde durch Destillation im Vakuum auf ein Volumen von ein Zehntel des vorherigen eingedampft. In diesem Stadium schied sich das Antibioticum aus der Lösung in reiner Form aus, wurde durch Filtrieren aufgesammelt, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei man 90 g reinen Streptogramins erhielt.

Physiologische Eigenschaften

Streptogramin zeigt bei Mäusen eine intraperitoneale Giftigkeit von etwa 450 mg/kg (LD₅₀). Mäuse, die intraperitoneal mit 1000 letaler Mindestdosen pathogener Organismen infiziert worden waren, wurden geschützt durch die Verabfolgung eines geringen Bruchteils der giftigen Dosis von Streptogramin. Das Streptogramin wurde im Verlauf von 4 Tagen verabfolgt, und zwar auf verschiedenen Wegen, wobei die Mindestmenge in Mikrogramm je Dosis bestimmt wurde, die 50% Überlebende ergab. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle dargestellt.

Tabelle II

	Verabfolgung	PD₆₀-DoSiS
Infektiöser Mikroorganismus	intraperitoneal	in Mikrogramm/ Dosis
Staph. aureus	intramuskulär	1,9
desgl.	peroral	3525,0
desgl.	intravenös	1509,0
desgl.	subkutan	492,0
desgl.	intraperitoneal	543,o
Strep, pyogenes	intramuskulär	1,2
desgl.	peroral	111,0
desgl.	intravenös	664,0
desgl.	142,0

Es ist bezeichnend, daß eine einzige Dosis Streptogramin ungefähr ebenso wirksam ist wie sieben Dosen der gleichen Größe und daß die Dosis bzw. die Droge sowohl bei intraperitonealer als auch bei intravenöser, 120 ' intramuskulärer oder peroraler Verabfolgung wirksam wird. Bei Versuchen mit Hautwunden an Kaninchen, die mit dem Staphylococcus aureus infiziert worden waren, ergab die Behandlung mit Streptogramin eine Verkürzung der Heilungsdauer im Vergleich zu ahnliehen unbehandelten Kontrolltieren.

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Die Vcrabfolgung gereinigten Streptograrains auf allen möglichen Wegen (intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan und peronal) wurde in allen Fällen gut vertragendes zeigten sich weder Nekrosen noch Verfärbung noch sonstige Schäden.

Das kräftigste bisher isolierte Präparat zeigte einen Schmelzpunkt von etwa 155⁰ sowie eine spezifische Drehung von [et]"⁰ = — 134° ·

Claims

PATENTANSPRUCH:

Die Verwendung von Streptomyces graminofaciens zur Herstellung und Gewinnung des Antibiotikums Streptogramin durch submerse Züchtung in üblichen Nährflüssigkeiten und Extraktion des Kulturmediums mit Äthylacetat und Fällung mit Ligroin. ,

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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