DER0014621MA - - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

Tag der Anmeldung: 15. Juli 1954 Bekanntgemacht am 21. Juni 1956

DEUTSCHES PATENTAMT

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung von Aldosteron, einer biologisch hochwirksamen, chemisch einheitlichen neuen Verbindung, aus Nebennieren. ' . ■

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen nach bekannten Methoden mit Lipoidlösungsmitteln aus Nebennieren hergestellten Extrakt durch Verteilung zwischen einem wäßrigen und einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel und bzw. oder durch Chromatographie auftrennt, gegebenenfalls in Kombination mit einer Reinigung nach demVerf ahren von Girard(Girard,A., und Sandulescu, G., HeIv. chim. Acta, Bd. 19, 1936, S. 1095 bis 1107; USA.-Patentschrift 2 045 132) unter Gewinnung des ketonischen Anteils, und aus den erhaltenen, insbesondere im Mineralstoffwechsel hochwirksamen Fraktionen das Aldosteron durch Kristallisation abtrennt.

Die verfahrensgemäß z. B. aus Aceton—Wasser gewonnene Verbindung ist kristallin. Die lufttrockenen Kristalle enthalten Kristallwasser, denn bei längerem Trocknen im Hochvakuum bei etwa 50⁰ wird 1 Mol Wasser abgegeben. Der Schmelzpunkt liegt vor und nach dem Trocknen je nach Kristallgröße und Erhitzungsgeschwindigkeit zwischen etwa 104 und 112⁰. Die geschmolzene Masse kristallisiert bei weiterem Erwärmen wieder vollständig, worauf bei etwa 153 bis 158⁰ definitives Schmelzen eintritt. Die letzten Spuren

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schmelzen oft erst einige Grade höher. Es kann auch eine höher schmelzende Form gewonnen werden, z. B. durch Kristallisation aus anderen Lösungsmitteln, beispielsweise Aceton—Äther; sie schmilzt nach dem

5 Opakwerden bei etwa 165 bis 169°. Die spezifische Drehung des Hydrats beträgt [ct]|^J = +145° ± 2° (c = 0,9896 in Aceton), diejenige der getrockneten Substanz \_d\" = +152° ±2° (c = 1,0264 in Aceton). Auf Grund der Mikroanalyse kommt dem getrockneten Präparat die Bruttoformel C₂₁H₂₈O₆ zu, wobei, wie immer bei so hochmolekularen Verbindungen, die Wasserstoffzahl mit einer gewissen Unsicherheit behaftet ist (Jz 2). Im Ultraviolettabsorptionsspektrum ist sowohl beim Hydrat wie bei der getrockneten Verbindung die- für a, ^-ungesättigte Ketone typische starke Bande sichtbar. Sie hegt bei 240 ± 0,25 ταμ und weist eine Extinktion auf, deren log ε = 4,2O beträgt. Eine zweite, deutliche Bande befindet sich bei 308 ± 2 ταμ; log ε = 1,92. Diese Werte wurden mit Konzentrationen von 9,70. io~⁴, io~⁵ undio"⁶MoI je Liter in Äthanol bestimmt.

Im Infrarotabsorptionsspektrum (aufgenommen auf einem sogenannten Per kin- Elmer -double -beam -Instrument, Modell 21, in Chloroformlösung, Schichtdicke 0,2 mm, mit Chloroform gleicher Schichtdicke kompensiert) sind charakteristische Banden unter anderem bei i,79 μ (Hydroxylgruppe), bei 5,85 μ

CH₉OH

CHO CO

Ο='

Der neue Wirkstoff bzw. sein Hydrat wird als Aldosteron bezeichnet.

Das Verfahrensprodukt ist biologisch hochwirksam. Besonders ausgeprägt ist seine Wirkung auf den Mineralstoffwechsel. Im Test an der nebennierenlosen Ratte nach Kagawa sowie in demjenigen nach Simpson und Tait und im Erhaltungstest am nebennierenlosen Hunde besitzt es eine mindestens 25- bis ioomal höhere Wirkung als das Desoxycorticosteron (bzw. dessen Acetat), das die im Mineralstoffwechsel wirksamste bekannte Verbindung darstellt (vgl. hierzu

C. M. Kagawa, E.C.Shipley und R.K.Meyer, Proc.Soc.Exp.Biol.Med., Bd. 80, 1952, S. 281; S. A. Simpsonundl. F. Tait, Endocrinology, Bd.50, 1952, S. 150; C. A. Harr op, 1.1. Pfiffner, A. Weinstein und W. W. Swingle, Proc. Soc. Exp. Biol.

Med., Bd. 29, 1932, S. 449).

Für das vorliegende Verfahren als Ausgangsstoff geeignete Rohextrakte lassen sich nach bekannten Methoden, insbesondere in Anlehnung an die Vorschriften von Cartland und Kuizenga oder von Swingle und Pfiffner gewinnen. Dabei hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Vorschrift von Cartland und Kuizenga nur bis zur Extraktion mit Äthylenchlorid zu verfolgen. — Die verfahrens-(mittelstark), 5,98/i (stärk) und 6,16 μ■ (mittelstark) im Doppelbindungsbereich und bei 7,85 μ, 9,38 μ, 9,62 μ, 9,95 μ, ΐο,ΐ8 μ und 10,41 μ im Fingerprintbereich sichtbar.

Zur Kennzeichnung des neuen Wirkstoffes, kann ferner die Wanderungsgeschwindigkeit im Papierchromatogramm in den Ausführungsformen nach Zaffaroni, Burton und Keutmann (Science, Bd. in, 1950, S. 6) oder nach Bush (Biochem. Journ. Bd. 50, 1952, S. 370) dienen, die im ersten Fall nur wenig größer ist als diejenige von Cortison und im zweiten Fall zwischen derjenigen von Cortison und Hydrocortison liegt oder mit letzterer weitgehend übereinstimmt. Der Nachweis der Substanz auf den Papierchromatogrammen gelingt durch ihr Reduktionsvermögen gegenüber Silberdiammin- oder Triphenyltetrazoliumhalogenidlösung, durch ihre Ultraviolettabsorption, durch die gelbe Fluoreszenz nach Einwirkung von wäßrig-methanolischer Alkalilauge und durch das Ausbleiben von Farbreaktionen mit Phosphorsäure und mit Antimontrichloridlösung. Die Kombination dieser Eigenschaften ist unbedingt kennzeichnend für die Verbindung.

An diesem neuen Wirkstoff durchgeführte Abbauversuche ergeben für diesen die folgenden, miteinander offenbar im Gleichgewicht stehenden Formeln, wobei bei den meisten Umsetzungen die Halbacetalform reagiert: go

OH CHoOH

gemäße Auftrennung der Extrakte erfolgt z. B. durch Verteilung zwischen einem wäßrigen Alkohol, wie 3oprozentigem Methanol, oder Wasser und einem geeigneten, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, insbesondere einem Kohlenwasserstoff, wie Petroläther oder Benzol, oder einem halogenierten Kohlenwasserstoff, wie Chloroform, bzw. deren Gemischen. Diese Reinigung kann in den für diesen Zweck bestimmten Apparaten, z. B. denjenigen von Craig oder von Podbjelniak durchgeführt werden (vgl. hierzu G. F. Cartland und M. H. Kuizenga, Journ. Biol. Chem., Bd. 116, 1936, S. 57; Swingle, W. W., und Pf iff η er, I. I, Amer. Journ. Physiol, Bd. 96, 1931, S. 153, 164; Graig, L. C, Journ. Biol. ,Chem., Bd. 155, 1944,S₁ 519; Graig, L. C, undPost, O., Anal. Chem., Bd. 21, 1949, S. 500; Graig, C. L., und Graig, D., »Extraction and Distributionen in Weissberger, »Technique of Organic Chemistry, Interscience, N. Y., 1950, Vol. Ill, S. 171 bis 311; Ullmanns Enzyklopädie der technischen Chemie, ■ III. Auflage, ι. Band, S. 425).

An Stelle einer solchen Verteilung oder zusammen mit ihr eignet sich auch die Chromatographie hervorragend zur Reinigung, und zwar die Adsorptions- und die Verteilungschromatographie. Diese beiden Prin-

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zipien lassen sich nicht völlig voneinander unterscheiden, indem bekanntlich auch bei der Verteilungschromatographie adsorptive Eigenschaften der Trägersubstanz eine Rolle spielen. Als Träger verwendet S man beispielsweise Kieselsäure (bekannt unter der Handelsbezeichnung » Silicagel«), Magnesiumsilikat, Kieselgur, Cellulose bzw. deren Gemische und als Lösungsmittel z. B. Petroläther, Benzol, Aceton, Chloroform oder deren Gemische. In Verbindung mit

ίο einem oder beiden vorstehend genannten Anreicherungsverfahren läßt sich auch eine schonende Reinigung nach G ir ar d durchführen, also mit Reagenzien die, wie Trimethylammonium- oder Pyridiniumessigsäurehydräzid, wasserlösliche Ketonderivate ergeben, unter anschließender Abtrennung und gelinder Spaltung der letzteren und Gewinnung des ketonischen Anteils. Zur schonenden Durchführung der Trennung nach Girard arbeitet man in Abwesenheit von Säuren, wie Eisessig. Als Lösungsmittel für diese Reaktion eignen sich Alkohole, z. B. Methanol.

Aus den Fraktionen, die auf Grund der beschriebenen papierchromatographischen Analyse oder biologischen Untersuchung die neue Verbindung enthalten, läßt sich diese durch Kristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, z. B. Aceton — Äther, gewinnen, vorteilhaft in Gegenwart von wenig Wasser, oder aus wäßrigem Aceton. Bei Gegenwart von Wasser wird das Hydrat des Wirkstoffes erhalten.

Frühere Untersuchungen von Nebennierenrinderohextrakten nach ähnlichen Arbeitsmethoden, wie sie in der vorliegenden Anmeldung beschrieben sind (vgl. z. B. HeIv. chim. Acta, Bd. 19, 1936, S. 1107; deutsche Patentschriften 656 785 und 892 228) führten lediglich zu den bereits bekannten Hormonen oder zu gereinigten Extrakten mit hoher Wirkung im Mineralstoffwechsel. Die Abtrennung des Aldosterons, des reinen und kristallisierten Nebennierenhormons, wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung erstmals beschrieben. Seine hohe Aktivität erschließt ein ausgedehntes Gebiet praktischer Anwendungsmöglichkeiten.

Die nachstehendenBeispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.

. .

Beispiel 1

500 kg frische oder tiefgekühlte Rindernebennieren werden nach einem der bekannten Verfahren, vorzugsweise nach Cartland und Kuizenga (Journ.

Biol. Chem., Bd. 116, 1936, S. 57), extrahiert. Je nach der Qualität der Drüsen erhält man so 100 bis 500 g Rohextrakt, der sodann durch Verteilung zwischen wäßrigem Alkohol, z. B. 3o°/₀igem Methanol, und Petroläther gründlich entfettet wird. Die wäßrige Schicht extrahiert man nach Entfernen des Alkohols (alle Verfahrensmaßnahmen erfolgen bei einer. Temperatur von weniger als 50⁰) 4mal mit dem gleichen Volumen Äther—Chloroform (2:1 oder 3:1; die Lösungsmittel müssen vorher gründlich gereinigt werden). Die vereinigten Äther-Chloroform-Lösurigen werden als solche oder nach Waschen mit verdünnter Salzsäure und Hydrogencarbonatlösung und Trocknen über Natriumsulfat im Vakuum eingedampft. Man erhält auf diese- Art 23 bis 30 g gereinigten Extrakt als Ausgangsstoff für das vorliegende Verfahren.

Der genannte Extrakt wird auf einer großen Säule einer Verteilungschromatographie unterworfen, wobei als stationäre Phase die 100- bis 2oofache Menge Kieselgur—Wasser im Gewichtsverhältnis 1: 1 und als mobile Phase Petroläther, Benzol und Chloroform dienen. Die Laufgeschwindigkeit der Eluate soll etwa 90 bis 100 cm³ je Stunde betragen, das Volumen jeder Fraktion 1000 bis 1200 cm³. Die durch Eindampfen im Vakuum gewonnenen Rückstände der einzelnen Fraktionen, aus denen zum Teil einige der bekannten Corticosteroide bereits kristallisiert anfallen, werden papierchromatographisch analysiert. Die neue Verbindung läßt sich dabei z. B. mit Hilfe der i?jF-Werte (relative papierchromatographische Wanderungsgeschwindigkeiten; vgl. z. B. Journ. biol. Chem., Bd. 177, S. in), der Ultraviolettabsorption und des Reduktionsvermögens gegen Silberdiamminlösung in solchen Fraktionen lokalisieren, welche durch Elution mit Benzol—Petroläther 7:3 bis 9:1 erhalten werden. Die betreffenden Fraktionen (300 bis 400 mg) werden hierauf vereinigt und an einer zweiten Säule aus gereinigtem Cellulosepulver durch Verteilung zwischen 6o%igem wäßrigem Methanol und Petroläther—Toluol (1: 2 bis ι: 3) aufgetrennt. Das Gewichtsverhältnis von Substanz zu Cellulose beträgt dabei etwa 1: 100 und dasjenige von stationärer Phase zu Cellulose 1: 2. Zum Durchlauf einer einzelnen Fraktion (40 cm³) benötigt man etwa 5 Stunden. Die durch Eindampfen erhaltenen Fraktionen werden wiederum papierchromatographisch analysiert. Aus den ausgewählten und vereinigten Fraktionen läßt sich die neue Substanz nun mit Aceton—Äther, vorteilhaft in Gegenwart von wenig Wasser, kristallisieren. Durch Umkristallisieren gewinnt man farblose Kristalle des Aldosterons in Form des Hydrates vom doppelten Schmelzpunkt 104 bis 112 und 153 bis 158°, die sich als einheitlich erweisen, eine hohe biologische Wirksamkeit auf den Mineralstoffwechsel und die übrigen in der Einleitung genannten Eigenschaften besitzen. Die Elementaranalyse des im Hochvakuum bei 50⁰ getrockneten Präparates lieferte die folgenden Werte: Kohlenstoff 69,68%, Wasserstoff 8,39%; berechnet für C₂₁H₂₈O₅: Kohlenstoff 69,97%, Wasserstoff 7,83%. Die übrigen Eigenschaften der getrockneten Verbindung weichen nicht wesentlich von denjenigen des Hydrats ab.

Beispiel 2

500 kg Rindernebennieren werden, wie im Beispiel 1 angegeben, extrahiert. Das . entfettete Ausgangsmaterial (24 g) wird zuerst durch Adsorptionschromatographie an der iofachen Menge Kieselsäure (bekannt unter dem Handelsnamen »Silicagel«) mit Methylenchlorid, Chloroform, Aceton und Methanol gereinigt. Die papierchromatographisch kontrollierten Fraktionen, welche neben anderen Verbindungen den gesuchten Wirkstoff enthalten (9,7 g), werden vereinigt und auf einer Säule unter Verwendung der 2ofachen Menge Cellulosepulver zwischen Propylenglykol einerseits und Cyclohexan, Toluol sowie Methylenchlorid anderseits verteilt. Diejenigen Frak-

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tionen, welche viel Propylenglykol enthalten, werden davon nach Versetzen mit Äther-Chloroform-Lösung (3 : 1) durch Ausschütteln mit Wasser befreit.
Die entsprechend der papierchromatographischen Analyse geeigneten Fraktionen (2,9 g) werden vereinigt und einer weiteren Verteilungschromatographie an der 4ofachen Menge Cellulose zwischen Propylenglykol und Benzol unterzogen. Die wirkstofflialtigen Fraktionen (etwa 600 mg) reinigt man schließlich noch durch Verteilung gemäß Beispiel 1. Nun läßt sich die neue. Verbindung ohne weiteres, wie im Beispiel 1 beschrieben, kristallisieren.

An Stelle einer Verteilungschromatographie im Rohr läßt sich auch eine solche an Papierbögen unter Verwendung der Systeme Propylenglykol—Toluol oder wäßriges Methanol—Petroläther—Toluol bzw. Benzol oder Essigester durchführen.

Beispiel 3

Ein aus 500 kg Nebennieren hergestellter, wie im Beispiel 1 angegeben, gereinigter Extrakt (25 g) wird mit Girard - Reagenz (vgl. A. Girard und C. Sandulesco, HeIv. chim. Acta, Bd. 19,1936, S. 1095 bis 1107) in methanolischer Lösung stehengelassen. Dann wird Wasser zugegeben, mit Chloroform—Äther (1:3) extrahiert, der wäßrige Anteil mit verdünnter Salzsäure auf etwa p_H = 1 gebracht und nach ¹J₁ Stunde der freigesetzte ketonische Anteil mit Chloroform— Äther (1:3) ausgezogen. Die regenerierte Keton-, fraktion (4,8 g) unterwirft man den im Beispiel 1 beschriebenen zwei Verteilungschromatographien.

Eine vorteilhafte Ausführungsform besteht darin,' daß man die Abtrennung der ketonischen Bestandteile nach Girard erst nach' der ersten Verteilungs-

35. Chromatographie mit den hierbei ausgewählten Fraktionen vornimmt und erst dann die so erhaltene Ketonfraktion (80 mg) der zweiten Verteilungschromatographie auf einer Cellulosesäule oder an Papierblättern unterwirft.

Die in der papiercnromatographischen Analyse als besonders wirkstoffhaltig befundenen Fraktionen kristallisiert man in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise oder, aus Aceton—Wasser um.

Beispiel 4

100 kg Schweinenebennieren werden, wie im Beispiel ι angegeben, extrahiert. Der noch stark fetthaltige Extrakt (151 g) wird dann zwischen natriumchloridhaltigem, 30%igem Methanol und Petroläther verteilt. Die wäßrig-alkoholische Lösung, in der sich die Nebennierenrindenhormone befinden, wird sodann im Vakuum¹ auf 250 cm³ eingeengt und 5mal mit je 11 Äther—Chloroform (3 :1) extrahiert. Nach Trocknen über Natriumsulfat wird das Lösungsmittelgemisch im Vakuum abdestilliert. Man erhält so 38 g eines Extraktes, der an einer Säule mit der ioofachen Menge Kieselgur-—Wasser (1: 1) chromatographiert wird. Als mobile Phase dient wassergesättigter Petroläther, dem im Verlaufe der Chromatographie nach und nach

^ßo steigende Mengen von Benzol zugesetzt werden. Die papierchromatographische Analyse der einzelnen 5oo-cm³-Fraktionen zeigt das Aldosteron in den Eluaten mit 70% Benzol an. Diese Fraktionen werden vereinigt (380 mg) und an einer Säule mit der 20ofachen Menge gereinigten Cellulosepulvers unter Verwendung des Systems Wasser—Methanol—Benzol—Petroläther 5:5:3:7 und 1:1:1:1 chromatographiert, wobei das Gewichtsverhältnis von Cellulose. zu unterer (stationärer) Phasen : 1 beträgt. Aus den nach papierchromatographischer Analyse ausgewählten Fraktionen läßt sich der Wirkstoff aus Aceton—Äther— Wasser kristallisieren. Aus den Mutterlaugen erhält man nach papierchromatographischer Reinigung noch weitere Mengen Kristalle. Durch Umkristallisieren aus Aceton—Äther gewinnt man das Aldosteron in Form von farblosen Kristallen vom F. = 165 bis 169⁰ (nach Opakwerden ab 130⁰).

Beispiel 5

500 kg Rindernebennieren werden, wie im Beispiel 1 angegeben, extrahiert. Das entfettete Ausgangsmaterial (27 g) wird in 50 cm³ Aceton gelöst, mit 25 g Kieselgur—Wasser (1: 1) vermischt und das Aceton im Vakuum vollständig entfernt. Dann wird in Petroläther suspendiert, auf die Säule (Füllung: 1,4 kg Kieselgur, mit 1,4 kg Wasser befeuchtet Und in Petroläther suspendiert) gegeben und nach Absitzen und FestpressenmitpassendenFilterpapierscheibengedeckt. Zum Schluß wird noch eine Schicht (25 g) frisches Kieselgur—Wasser analog aufgetragen und wieder mit einigen Filterpapierscheiben gedeckt. Anschließend wird bei 20⁰ chromatographiert, Laufgeschwindigkeit etwa 100 cm³ je Stunde. Als mobile Phase werden verwendet: Petroläther, Petroläther-Benzol-Gemisch, Benzol-Chloroform-Gemische und Chloroform (alle Lösungsmittel wassergesättigt). In den Eluaten, die mit Benzol—Petroläther vom Mischungsverhältnis 65 : 35 bis 75 : 25 erhalten werden, kann das neue Hormon papierchromatographisch nachgewiesen werden (Propylenglykol-Toluol-System sowie C-System von Bush; vgl. Science, Bd. in, 1950, S. 6, und Biochem. Journ., Bd. 50, 1952, S. 370).

Diese Fraktionen (324 mg) werden zur weiteren Reinigung einer zweiten Verteilungschromatographie unterworfen. Als Träger dient 60 g gewaschenes Cellulosepulver, das mit 30 cm³ der unteren Phase des folgenden Lösungsmittelsystems vermischt wird: 666 cm³ Toluol, 333 cm³ Petroläther, 400 cm³ Wasser und 600 cm³ Methanol. Als bewegliche Phase wird die obere Schicht anfangs dieses Systems verwendet, später diejenige aus 750 cm³ Toluol, 250 cm³ Petroläther, 400 cm³ Wasser und 600 cm³ Methanol. Das zu trennende Material (324 mg) wird in 2 cm³ schwerer Phase gelöst (eine kleine Menge Material bleibt ungelöst) und mit 4 g Cellulosepulver vermischt auf die Säule aufgetragen. Der kleine ungelöste Rest wird nun noch mit 1 cm³ schwerer Phase und 2 cm³ Cellulosepulver aufgenommen und ebenfalls auf die Säule gegeben. Nach Auflegen einer Filterpapierscheibe werden noch 2 g Cellulosepulver mit 1 cm³ schwerer Phase vermischt aufgegeben, gut gepreßt und mit der leichten Phase chromatographiert. Laufgeschwindigkeit 8 bis 9 cm³ je Stunde, Temperatur 20°. Alle Fraktionen werden im Vakuum bei 35 ° Badtemperatur eingedampft. Für die Fraktionen 34 bis 44 wird das Gemisch mit höherem Toluolzusatz ver-

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wendet und von Fraktion 45 an die leichte. Phase eines Gemisches aus 10 Teilen reinem Benzol, 4 Teilen Wasser und 6 Teilen Methanol. Die Fraktionen, die hauptsächlich das neue Hormon enthalten (etwa 51 mg), geben aus wenig feuchtem Aceton mit Äther nach mehrstündigem Stehen bei 0° spontan Kristalldrusen;. F. = 104 bis 107⁰, dann bei vorsichtigem weiterem Erhitzen langsam erstarrend mit zweitem Schmelzpunkt bei 154 bis 157⁰. Nach dem Papierchromatogramm ist die Verbindung einheitlich. Die Hauptmenge ist farblos. Die vereinigten Mutterlaugen geben, wie vorstehend beschrieben, nochmals eine reichliche Menge Kristalle, die aber leicht gelblich gefärbt ist. Die Reinigung gelingt am besten wie folgt: Die Rohkristalle werden in wenig Aceton, das io°/₀ Wasser enthält, gelöst, mit etwa der 5fachen Menge Äther versetzt und durch eine kleine Schicht gepreßter Watte (etwa 3 mm dick und 5 mm lang) filtriert, die vorher gut mit Aceton—Äther gewaschen worden ist. Dann wird gut mit demselben Lösungsmittel nachgewaschen, das klare farblose Filtrat auf ein kleines Volumen eingeengt und vorsichtig mit Äther verdünnt·. Nach Impfen setzt die Kristallisation sofort ein. Sie wird durch mehrstündiges Stehen bei o° und allmählichen Zusatz von Äther vervollständigt. Dann wird mit wenig Aceton—Äther (etwa 1: 10), reinem Äther und Pentan gewaschen. Ausbeute an Rohkristallen: 22,5 mg. Diese werden nochmals auf die gleiche Weise filtriert und umkristallisiert und liefern 21,8 mg des analysenreinen Wirkstoffes.

Claims (10)

1. Patentansprüche:

   i. Verfahren zur Abtrennung von Aldosteron aus Nebennierenextrakten, dadurch gekennzeichnet, daß man einen nach bekannten Methoden mit Lipoidlösungsmitteln aus Nebennieren hergestellten Extrakt durch Verteilung zwischen einem wäßrigen und einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel und bzw. oder durch Chromatographie auftrennt, gegebenenfalls in Verbindung mit einer Reinigung nach G ir ar d unter Gewinnung des ketonischen Anteils, und aus den erhaltenen, insbesondere im Mineralstoffwechsel hochwirksamen Fraktionen das Aldosteron durch Kristallisation abtrennt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch i-, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verteilung zwischen einem wäßrigen Alkohol und einem geeigneten, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, insbesondere zwischen 30%igem Methanol und Petroläther, vornimmt.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Chromatographie hauptsächlich in Form einer Adsorptionschromatographie vornimmt.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Adsorptionsmittel Kieselsäure (bekannt unter dem Handelsnamen »Silicagel«) oder Silikate verwendet.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Chromatographie hauptsächlich in Form einer Verteilungschromatographie vornimmt.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Trägersubstanz Kieselgur oder Cellulose verwendet.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung mit dem Girard-Reagenz unter schonenden Bedingungen in Abwesenheit einer Säure durchführt.
8. 8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis ,7, dadurch gekennzeichnet, daß man die erhaltenen hochwirksamen Fraktionen aus Aceton—Äther umkristallisiert.
9. 9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umkristallisation in Gegenwart von Wasser durchführt.
10. 10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die erhaltenen hochwirksamen Fraktionen aus wäßrigem Aceton umkristallisiert.