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Publication number: DEV0006270MA
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BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLANDFEDERAL REPUBLIC OF GERMANY

Tag der Anmeldung: 12. September 1953 Bekanntgemacht am 26, Juli 1956Date of registration: September 12, 1953 Advertised on July 26, 1956

DEUTSCHES PATENTAMTGERMAN PATENT OFFICE

Es ist bekannt, daß bei der mikroskopischen Abbildung jede Inhomogenität in der Objektebene, hervorgerufen durch von der Umgebung abweichende Absorption, abweichenden Brechungsindex oder abweichende Dicke, in j eder der Aperturblendenebene konjugierten Ebene eine Beugungsfigur der Aperturblende erzeugt. Bei hinreichend kleinem Objekt ist diese weit auseinandergezogen, während die von hinreichend großem Gesichtsfeld erzeugte Beugungsfigur sich auf das geometrische Bild der Aperturblende zusammenzieht. Letzteres entspricht also dem direkten, vom Objekt nicht beeinflußten Licht.It is known that any inhomogeneity in the object plane is caused in microscopic imaging due to absorption deviating from the surroundings, deviating refractive index or deviating Thick, in each plane conjugated to the aperture diaphragm plane, a diffraction figure of the aperture diaphragm generated. If the object is sufficiently small, it is drawn far apart, while that of sufficiently Large field of view generated diffraction figure contracts on the geometric image of the aperture diaphragm. The latter corresponds to the direct light that is not influenced by the object.

Mit dem in der deutschen Patentschrift 636 168 angegebenen Phasenkontrastverfahren wurde von Zernike durch Anwendung der Abbeschen Lehre von der Bildentstehung im Mikroskop auf nicht absorbierende, also im normalen Hellfeldbild unsichtbare Objekte gezeigt, daß man diese durch geeignete Phasenänderung und Schwächung des direkten Lichtes allein oder des vom Objekt abgebeugten Lichtes allein im Bilde sichtbar machen kann.With the one specified in German patent specification 636 168 Phase contrast method was developed by Zernike by applying the Abbe doctrine of the image formation in the microscope on non-absorbing, objects that are invisible in the normal brightfield image are shown that they can be removed by suitable Phase change and weakening of the direct light alone or of the light diffracted from the object alone can make visible in the picture.

Beim Köhlerschen Beleuchtungsprinzip dient die Aperturblende in der vorderen Kondensorbrennebene als Ersatzlichtquelle. Zur Durchführung des Verfahrens wird im geometrischen Bild der Aperturblende ein Phasenplättchen passender Absorption und Phasendrehung angebracht. Als günstigste Blendenform hat sich der Kreisring erwiesen:With Koehler's lighting principle, the aperture diaphragm is used in the front focal plane of the condenser as a substitute light source. To carry out the method, the aperture diaphragm is shown in the geometric image a phase plate of suitable absorption and phase rotation attached. As the cheapest form of aperture the circular ring has turned out:

Dies läßt sich theoretisch und experimentell bestätigen. Das strenge Zernikeverfahren liefert einThis can be confirmed theoretically and experimentally. The strict Zernike procedure delivers

609 576/231609 576/231

V 6270IX/42 hV 6270IX / 42 h

objekttreues Phasenkontrastbild; für die Beobachtung im durchfallenden Licht ist das ein solches, bei dem ein Objekt mit überall gleichem, aber höherem Brechungsindex oder überall gleicher, aber größerer Dicke als die Umgebung gleichmäßig dunkel auf hellem Grund ererscheint (positiver Kontrast).phase contrast image true to object; for observation in transmitted light this is one in which a Object with everywhere the same but higher refractive index or everywhere the same but greater thickness than that Surroundings appear evenly dark on a light background (positive contrast).

Da aber der Phasenring eine endliche Ausdehnung haben muß, wird stets auch ein Teil des durch das Objekt abgebeugten Lichtes vom Phasenring beeinflußt. Das Zernikeverfahren ist also nicht in aller Strenge durchführbar. Hierdurch kommen Strukturen in das Bild, die im Objekt nicht vorhanden sind. Das Phasenkontrastbild ist also objektunähnlich, was sich in Form einer dunklen Berandung innerhalb des Objektes und einem hellen Hof um das Objekt äußert. Der dunkle Rand und helle Hof breiten sich mit schmaler werdendem Ring und kleinerem Objekt mehr und mehr aus, das Bild wird also immer objektähnlicher. Nach einer der Erfindung zugrunde liegenden Überlegung wurde als Maß der Objektähnlichkeit der wellenoptisch mit Hilfe der Kirchhöffschen Beu-But since the phase ring must have a finite extension, part of the through the Object diffracted light influenced by the phase ring. So the Zernike method is not all Strictly feasible. This creates structures in the image that are not present in the object. The Phase contrast image is therefore dissimilar to the object, which is in the form of a dark border within the object and a bright halo around the object. The dark edge and light courtyard expand with it the ring and the smaller object become more and more narrow, so the image becomes more and more object-like. According to one of the considerations on which the invention is based, the measure of object similarity the wave optics with the help of the Kirchhöffschen Beu-

TCTC

gungsformelberechnete Parameterwert Γ = —ζ- ■ BAR Formula-calculated parameter value Γ = —ζ- ■ BAR

erkannt. In ihm sindrecognized. Are in him

= Wellenzahl pro 2 π cm, = Wave number per 2 π cm,

f = Brennweite des Objektivs,
2,B = Durchmesser des Phasenobjekts und
AR = Breite des Phasenringes. f = focal length of the lens,
2, B = diameter of the phase object and
AR = width of the phase ring.

Diese Verhältnisse sind in der Abb. 1 in Kurvenform nochmals dargestellt, und es bedeutet zusätzlich φ = die durch das Objekt hervorgerufene Phasenänderung im Bogenmaß, .
2 B" = Durchmesser des von einem kreisThese relationships are shown again in curve form in Fig. 1, and it also means φ = the phase change in radians caused by the object,.
2 B " = diameter of a circle

förmigen Objekt erzeugten Bildes, - p'" = Abstand irgendeines Bildpunktes von der optischen Achse und
Ip" = Intensität im Punkt p". shaped object, - p '" = distance of any pixel from the optical axis and
Ip "= intensity at point p".

Nach der Darstellung entspricht das objekttreue Bild dem /"-Wert Null. Für verschiedene /"-Werte wurde die Intensitätsverteilung in der Darstellung beispielsweise für den Achromaten 6 mit f = 2,35 cm und für grünes Licht der Wellenlänge λ = 5,46 · io~⁵cm berechnet und Übereinstimmung mit der Helligkeitsverteilung im Bilde einiger künstlicher, der Rechnung angepaßter Phasenobjekte erzielt. Bei photographischen Aufnahmen wurden sowohl Ringbreite als auch Objektgröße variiert und so der allmähliche Übergang zum objekttreuen Phasenkontrastbild dargestellt. Man kommt so zu dem Schluß, daß die bisher übliche, normale Phasenkontrast einrichtung nur sehr kleine Objekte objekttreu wiedergibt, während größere entsprechend dem dunklen Rand und hellen Hof Strukturen zeigen, die im Objekt nicht vorhanden sind. Mit zunehmender Objektännlichkeit der Phasenobjekte werden die absorbierenden Objekte in Übereinstimmung mit der Theorie-immer objektunähnlicher, um schließlich fast. vollständig z"ü verschwinden. Die phasenkontrastmikroskopische Untersuchung natürlicher Objekte, deren Struktur nicht genau bekannt ist, kann deshalb zu Trugschlüssen Anlaß geben.According to the representation, the image true to the object corresponds to the / "value zero. For different /" values, the intensity distribution in the representation was, for example, for the achromatic 6 with f = 2.35 cm and for green light with the wavelength λ = 5.46 · io ~ ⁵ cm and correspondence with the brightness distribution in the image of some artificial phase objects adapted to the calculation is achieved. In photographic recordings, both the ring width and the object size were varied and the gradual transition to the phase contrast image true to the object was shown. One comes to the conclusion that the previously common, normal phase contrast device reproduces only very small objects faithfully to the object, while larger ones show structures corresponding to the dark edge and light halo that are not present in the object. With increasing object similarity of the phase objects, the absorbing objects become more and more object-dissimilar to finally almost in accordance with the theory. The phase-contrast microscopic examination of natural objects, the structure of which is not precisely known, can therefore give rise to false conclusions.

In einigen bisher bekanntgewordenen Arbeiten über das Phasenkontrastverfahren sind Vorschläge zur kontinuierlichen Veränderung des Kontrastes durch Variation der Phasendrehung und Durchlässigkeit des Phasenringes gemacht worden. Auf diese Weise kann man den Phasenring dem Objekt anpassen und so für die gegebene Ringbreite optimalen Kontrast erzielen. An dem Grad der Objekttreue wird hierdurch jedoch nichts geändert.In some previously known work on the phase contrast method are proposals for continuous Change in contrast by varying the phase rotation and transparency of the Phase ring has been made. In this way you can adapt the phase ring to the object and so for achieve optimal contrast for the given ring width. However, this affects the degree of object fidelity nothing changed.

Auf Grund der der Erfindung zugrunde hegenden Überlegung erscheint es noch wichtiger, den Kontrast durch Veränderung der Ringbreite zu variieren, denn nur so kann mit Sicherheit die wahre Struktur irgendeines phasendrehende und absorbierende Objekte enthaltenden natürlichen Präparates ermittelt werden.On the basis of the considerations on which the invention is based, the contrast appears to be even more important to vary by changing the ring width, because only in this way can the true structure of any phase-rotating and absorbing objects containing natural preparation can be determined.

Die kontinuierliche Änderung der Breite des Phasenringes ist dabei nicht unbedingt notwendig. Verwendet man neben dem bisher üblichen noch einen leicht auswechselbaren sehr schmalen Phasenring, so sind nacheinander die drei wichtigsten Fälle zu beobachten. Im Hellfeld werden die absorbierenden Objekte objekttreu abgebildet. Im an sich bekannten normalen Phasenkontrastbild sind die absorbierenden und phasendrehenden Objekte gleichzeitig, doch je nach Größe mehr oder weniger objektunähnlich sichtbar, während der sehr schmale Phasenring eine nahezu objekttreue Abbildung der Phasenobjekte liefert. Mit Hilfe dieser drei Bilder kann man also verhältnismäßig sichere Aussägen über die wahre Struktur eines beliebigen Präparates machen.The continuous change in the width of the phase ring is not absolutely necessary. Used in addition to the previously usual one an easily replaceable, very narrow phase ring, see above the three most important cases can be observed one after the other. The absorbing objects are in the bright field depicted true to object. In the normal phase contrast image, which is known per se, the absorbing and phase-rotating objects at the same time, but depending on the size more or less unlike the object visible, while the very narrow phase ring provides an image of the phase objects that is almost true to the object. With With the help of these three images, one can see with relative certainty about the true structure of a make any preparation.

Die Erfindung bezieht sich demnach auf eine Einrichtung zur mikroskopischen Abbildung nicht selbstleuchtender Objekte, deren Einzelheiten keine oder _r zu geringe Helligkeitsunterschiede hervorrufen, durch Phäsenkontrast mit in irgendeinem Bilde der Aperturblende angeordneten Phasenringen und einer den Phasenringen entsprechend ausgebildeten Aperturblende, deren Bild sich mit den Phasenringen deckt, und sie besteht darin, daß wenigstens zwei Phasenringe unterschiedlicher Breite sowie Mittel zum schnellen, nacheinander erfolgenden Einstellen auf die verschiedenen Phasenringe vorgesehen sind.The invention thus relates to a device for microscopic imaging is not self-luminous objects, the details of which, whose image coincides _r cause insufficient brightness differences no or by Phäsenkontrast with correspondingly formed in any image of the aperture stop arranged phase rings and the phase rings aperture stop with the phase rings , and it consists in that at least two phase rings of different widths and means for rapid, successive adjustment to the different phase rings are provided.

Wie sich das erwähnte Auswechseln der Phasenringe ohne Unterbrechung der mikrokospischen Beobachtung in einfacher Weise durchführen läßt, soll im folgenden beschrieben werden, doch ist hierzu noch eine Vorbemerkung notwendig.How the aforementioned replacement of the phase rings can be achieved without interrupting the microscopic observation can be carried out in a simple manner, will be described in the following, but there is still more to this a preliminary remark is necessary.

Durch Aufspaltung des Phasenringes in zwei konzentrische Ringe z. B. wird der Grad der Objektähnlichkeit erhöht. Hierbei sollen die beiden Ringe einen solchen Abstand haben, daß die zu einem Ring gehörende Beugungsfigur vom zweiten nicht wesentlich beeinflußt wird. Wird hier für verschiedene Objektgrößen 2 B entsprechend dem schon erwähnten Parameterwert Γ und verschiedenen Ringabständen A R By splitting the phase ring into two concentric rings z. B. the degree of object similarity is increased. Here, the two rings should have such a distance that the diffraction figure belonging to one ring is not significantly influenced by the second. Is here for different object sizes 2 B according to the already mentioned parameter value Γ and different ring distances AR

der Parameterwert Γ = ^r BAR eingeführt, so er-the parameter value Γ = ^ r BAR introduced, so

ff

2 üZ 2 üZ

gibt sich aus einer Ableitung, daß mit if-= -. it follows from a derivation that with if- = -.

^ö ° 5,46 · 10—⁵cm ^ö ° 5.46 · 10 ^-5 cm

für Γ > 5 der Ringabstand obige Bedingung erfüllt. Bringt man nun innerhalb des normalen Phasenringes in entsprechendem Abstand einen zweiten, sehr schmalen Phasenring und in der zugehörigen ,^: for Γ> 5 the ring spacing fulfills the above condition. If you now bring a second, very narrow phase ring within the normal phase ring at a corresponding distance and in the associated one ^:

5T6/2315T6 / 231

V 6270IX/42 hV 6270IX / 42 h

Aperturblende einen zweiten entsprechenden Ring an, so liefern beide. Ringe zusammen das dem normalen Phasenring entsprechende Phasenkontrastbild, da die Störung durch den schmalen Ring vernachlässigbar S klein ist. Zieht man jetzt die Kondensoririsblende so weit zu, daß der normale äußere Ring der Aperturblende ganz verdeckt ist, so sieht man für Γ > 5 das dem schmalen Ring entsprechende Phasenkontrastbild, ■' da in diesem Fall entsprechend dem passendAperture diaphragm to a second corresponding ring, so both deliver. Rings together the phase contrast image corresponding to the normal phase ring, since the interference caused by the narrow ring is negligibly small. If one now pulls the condenser iris diaphragm so far that the normal outer ring of the aperture diaphragm is completely covered, one sees the phase contrast image corresponding to the narrow ring for Γ> 5, since in this case it is appropriate

ίο gewählten Abstand die Beugungsfigur von dem normalen Ring nur sehr wenig beeinflußt wird.ίο chosen distance the diffraction figure from the normal one Ring is affected very little.

Zur Verdeutlichung des Erfindungsgedankens sind die Verhältnisse nochmals in der Abb. 2 schematischTo illustrate the concept of the invention, the relationships are again shown schematically in Fig. 2

: dargestellt. Es bedeuten: ι die Kondensoririsblende, 2 die Aperturblende, 3 den Kondensor, 4 das Objektiv, 5 die Objektebene und 6 die in der hinteren Brennebene liegende Phasenringblende. Weiterhin stellt 7 den an sich bekannten Phasenring normaler Breite ■. und 8 nach der Erfindung einen zweiten, wesentlich schmaleren Phasenring dar.: shown. The following mean: ι the condenser iris diaphragm, 2 the aperture diaphragm, 3 the condenser, 4 the objective, 5 the object plane and 6 the one in the rear focal plane lying phase ring diaphragm. Furthermore, 7 represents the phase ring of normal width, known per se ■. and FIG. 8, according to the invention, represents a second, substantially narrower phase ring.

Entsprechend sind auf der Äperturblendenseite 9 der dem normalen Phasenring entsprechende und 10 der dem schmalen Phasenring entsprechende Aperturblendenring. Nach einer Weiterbildung der Erfindung ist außer den beiden den Phasenringen entsprechenden Aperturblendenringen ein dritter, breiter, aber in der Objektivbrennebene keinem Phasenring entsprechender Apertürblendenring vorgesehen. Dies wird in der Abb. 3 verdeutlicht, in welcher zu den schon erwähnten Phasenringen 7 und 8 und den Aperturblendenringen 9 und 10 noch ein weiterer, aber breiter Aperturblendenring 11 hinzukommt. Dadurch ist es möglich, mit der Irisblende nacheinander die Aperturblendenringe 11 und 9 abzudecken. Dies entspricht einer nacheinander durchgeführten Beobachtung im Hellfeld des normalen Phasenkontrastbildes und schließlich einer dem schmalen Phasenring 9 entsprechenden nahezu, objekttreuen Abbildung der Phasenobjekte.Correspondingly, on the aperture side 9, the corresponding to the normal phase ring and 10 the aperture ring corresponding to the narrow phase ring. According to a further development of the invention In addition to the two aperture diaphragm rings corresponding to the phase rings, there is a third, wider, but in the Lens focal plane no aperture ring corresponding to a phase ring provided. This is done in the Fig. 3 shows in which to the already mentioned phase rings 7 and 8 and the aperture diaphragm rings 9 and 10 a further, but wide aperture diaphragm ring 11 is added. This is how it is possible to cover the aperture diaphragm rings 11 and 9 one after the other with the iris diaphragm. This matches with an observation carried out one after the other in the brightfield of the normal phase contrast image and finally, an almost true-to-object image of the corresponding to the narrow phase ring 9 Phase objects.

Dieser zusätzliche Aperturblendenring bringt in Verbindung mit der erwähnten Irisblende auch für die bisher verwendete Phasenkontrasteinrichtung mit einem Phasenring wesentliche Vorteile. Man kann, ohne die mikroskopische Beobachtung unterbrechen zu müssen, durch Betätigen der Irisblende allmählich von der Hellfeld- zur Phasenkontrastbeobachtung übergehen. Das ist wesentlich, wenn das Präparat außer Phasenobjekten auch Amplitudenobjekte ent-This additional aperture ring brings in connection with the mentioned iris diaphragm also for the Phase contrast device with a phase ring previously used has significant advantages. One can, without having to interrupt the microscopic observation, gradually by operating the iris diaphragm move from brightfield to phase contrast observation. This is essential when taking the drug apart from phase objects also amplitude objects

■ hält.■ lasts.

Eine andere Möglichkeit zum Auswechseln der Phasenringe läßt sich mit Hilfe einer Zwischenabbildung schaffen.Another possibility for changing the phase rings can be found with the help of an intermediate image create.

Das vom Kondensor + Objektiv erzeugte Bild der Aperturblende liegt stets entweder kurz hinter dem Objektiv oder, besonders bei den stärkeren Systemen, im Objektiv selbst, so daß diese Ebene zum Auswechseln der Phasenringe nicht zugänglich ist. Um diesen Schwierigkeiten zu entgehen, ist schon eine Zwischenabbildung der hinteren Brennebene in eine günstigere Stelle vorgeschlagen worden.The image of the aperture diaphragm generated by the condenser + objective is always either just behind the Lens or, especially with the more powerful systems, in the lens itself, so that this level can be exchanged the phase rings are not accessible. To avoid these difficulties is one Intermediate imaging of the rear focal plane in a more convenient location has been suggested.

Man verwendet dann ein Objektiv ohne Phasenplättchen und bringt letzteres an den Ort der Zwischenabbildung, wo es leicht gegen ein anderes ausgetauscht werden kann. Nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung sind für verschiedene Objektive verschiedene konzentrische Phasenringe auf einer Revolverscheibe angebracht und eine zweite in der Aperturblendenebene angeordnete Revolverscheibe mit den Phasenringen entsprechenden Aperturblenden vorgesehen. Dieses Ausführungsbeispiel wird nach der schematischen Darstellung in Abb. 4 näher erläutert. Es bedeutet 12 die hintere Brennebene, 13 das Zwischenabbildungssystem und 14 bzw. 15 die in der Phasenringebene bzw. in der Aperturblendenebene angeordneten Revolverscheiben.An objective without a phase plate is then used and the latter is brought to the location of the intermediate image, where it can easily be exchanged for another. According to a further embodiment of the Invention are different concentric phase rings on a turret disk for different objectives attached and a second arranged in the aperture diaphragm plane with the turret disk Phase rings provided corresponding aperture diaphragms. This embodiment is after Schematic representation in Fig. 4 explained in more detail. It means 12 the back focal plane, 13 that Intermediate imaging system 14 and 15, which are arranged in the phase ring plane or in the aperture diaphragm plane Turret discs.

Es liegt auch im Sinne der Erfindung, daß die beiden Revolverscheiben nicht mit konzentrischen Phasenringpaaren bzw. Aperturblendenringpaaren, sondern mit für verschiedene Objektive verschiedenen, abereinzelnen Phasenringen bzw. Aperturblendenringen unterschiedlichen Breiten versehen sind, doch so, daß jedem Objektiv zwei oder mehr Phasenringe unterschiedlicher Breite zugehören, so daß unter Verzicht ^: der Irisblende allein durch Bedienung der Revolverscheiben der durch unterschiedliche Ringbreiten der Phasen- bzw. Aperturblendenringe hervorgerufene Phasenkontrast erzielt wird. Es läßt· sich zeigen, daß die Einrichtung nach der Erfindung auch für ρ ·< 5 brauchbar ist. In den FormelnIt is also within the meaning of the invention that the two turret disks are not provided with concentric phase ring pairs or aperture diaphragm ring pairs, but with different but individual phase rings or aperture diaphragm rings of different widths for different objectives, but in such a way that two or more phase rings of different widths belong to each objective , so that by doing without ^: the iris diaphragm alone by operating the turret disks the phase contrast caused by the different ring widths of the phase or aperture diaphragm rings is achieved. It can be shown that the device according to the invention can also be used for ρ · <5. In the formulas

F = - B~ÄR und Γ = — ΒΔ R f f F = - B ~ ÄR and Γ = - ΒΔ R ff

ist für jedes Objektiv f konstant. K, Δ R sowie Δ R kann man nur in verhältnismäßig engen Grenzen verändern. Es war in dem erwähnten Beispielis constant for each objective f. K, Δ R and Δ R can only be changed within relatively narrow limits. It was in the example mentioned

2JI2JI

5 A5 A

io"~⁵cmio "~ ⁵ cm

= 1,14 · io⁵ cm"¹; f = 2,35 cm= 1.14 x ^{10 5} cm "¹; f = 2.35 cm

Claims

PATENT CLAIMS:

and for the normal phase ring Δ R = 0.06 cm.

Δ R can hardly be made larger than 0.1 cm. Substituting these values into F and Γ gives

Γ = 5 · ίο ³ B; / "normal = 3 x 10 ^s B

For objects with Γ <5, Γ becomes normal <3. However, this means that the effect of the narrow ring can be dispensed with for very small objects, as can be seen from the representation of the calculated intensity distribution (Fig. 1) and the photographs , even the normal phase ring delivers a true-to-object image.

The device described here specifically for observation in transmitted light can be can of course also be used for observation in reflected light.

i. Device for microscopic imaging of non-self-luminous objects and their details No or too little difference in brightness caused by phase contrast in the Transmitted light or incident light with phase rings and arranged in some image of the aperture diaphragm one of the phase rings accordingly formed, arranged in the focal plane of the condenser Aperture diaphragm whose image coincides with the phase rings, characterized in that little

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at least two phase rings of different widths as well as means for rapid, one after the other Adjustment to the various phase rings are provided.

2. Device according to claim 1, characterized in that that two or more concentric phase rings of different widths are provided are and with the help of an iris diaphragm located in the vicinity of the aperture diaphragm optionally one of the two aperture diaphragm rings can be hidden.

3. Device according to claim 2, characterized in that, in addition to the two, the phase rings corresponding aperture diaphragm rings a third, wider, but none in the objective plane Phase ring corresponding aperture diaphragm ring is provided and that the aperture diaphragm rings with the iris diaphragm can be covered one after the other.

4. Device according to claim 1, characterized by the use of one in the phase ring plane arranged turret disc with different concentric for different objectives Phase rings and a second turret disk arranged in the aperture diaphragm plane the aperture diaphragms corresponding to the phase rings, so that with the help of one in the vicinity of the aperture diaphragm located iris diaphragm optionally one of the two aperture diaphragm rings can be hidden.

5. Device according to claim 1, characterized by such in the phase ring plane or in the Aperture diaphragm ring plane. arranged turret disks with different for different objectives, but individual phase rings or aperture diaphragm rings that each objective has two or more Phase rings of different widths are included, so that only by operating the turret discs due to the different ring widths of the phases or Aperture diaphragm rings caused phase contrast is achievable.

Considered publications:
German Patent No. 811 736;
British Patent Nos. 669 479, 631 251.

1 sheet of drawings

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