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Publication number: DEV0006270MA
Authority: DE

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BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

Tag der Anmeldung: 12. September 1953 Bekanntgemacht am 26, Juli 1956

DEUTSCHES PATENTAMT

Es ist bekannt, daß bei der mikroskopischen Abbildung jede Inhomogenität in der Objektebene, hervorgerufen durch von der Umgebung abweichende Absorption, abweichenden Brechungsindex oder abweichende Dicke, in j eder der Aperturblendenebene konjugierten Ebene eine Beugungsfigur der Aperturblende erzeugt. Bei hinreichend kleinem Objekt ist diese weit auseinandergezogen, während die von hinreichend großem Gesichtsfeld erzeugte Beugungsfigur sich auf das geometrische Bild der Aperturblende zusammenzieht. Letzteres entspricht also dem direkten, vom Objekt nicht beeinflußten Licht.

Mit dem in der deutschen Patentschrift 636 168 angegebenen Phasenkontrastverfahren wurde von Zernike durch Anwendung der Abbeschen Lehre von der Bildentstehung im Mikroskop auf nicht absorbierende, also im normalen Hellfeldbild unsichtbare Objekte gezeigt, daß man diese durch geeignete Phasenänderung und Schwächung des direkten Lichtes allein oder des vom Objekt abgebeugten Lichtes allein im Bilde sichtbar machen kann.

Beim Köhlerschen Beleuchtungsprinzip dient die Aperturblende in der vorderen Kondensorbrennebene als Ersatzlichtquelle. Zur Durchführung des Verfahrens wird im geometrischen Bild der Aperturblende ein Phasenplättchen passender Absorption und Phasendrehung angebracht. Als günstigste Blendenform hat sich der Kreisring erwiesen:

Dies läßt sich theoretisch und experimentell bestätigen. Das strenge Zernikeverfahren liefert ein

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objekttreues Phasenkontrastbild; für die Beobachtung im durchfallenden Licht ist das ein solches, bei dem ein Objekt mit überall gleichem, aber höherem Brechungsindex oder überall gleicher, aber größerer Dicke als die Umgebung gleichmäßig dunkel auf hellem Grund ererscheint (positiver Kontrast).

Da aber der Phasenring eine endliche Ausdehnung haben muß, wird stets auch ein Teil des durch das Objekt abgebeugten Lichtes vom Phasenring beeinflußt. Das Zernikeverfahren ist also nicht in aller Strenge durchführbar. Hierdurch kommen Strukturen in das Bild, die im Objekt nicht vorhanden sind. Das Phasenkontrastbild ist also objektunähnlich, was sich in Form einer dunklen Berandung innerhalb des Objektes und einem hellen Hof um das Objekt äußert. Der dunkle Rand und helle Hof breiten sich mit schmaler werdendem Ring und kleinerem Objekt mehr und mehr aus, das Bild wird also immer objektähnlicher. Nach einer der Erfindung zugrunde liegenden Überlegung wurde als Maß der Objektähnlichkeit der wellenoptisch mit Hilfe der Kirchhöffschen Beu-

TC

gungsformelberechnete Parameterwert Γ = —ζ- ■ BAR

erkannt. In ihm sind

= Wellenzahl pro 2 π cm,

f = Brennweite des Objektivs,
2,B = Durchmesser des Phasenobjekts und
AR = Breite des Phasenringes.

Diese Verhältnisse sind in der Abb. 1 in Kurvenform nochmals dargestellt, und es bedeutet zusätzlich φ = die durch das Objekt hervorgerufene Phasenänderung im Bogenmaß, .
2 B" = Durchmesser des von einem kreis

förmigen Objekt erzeugten Bildes, - p'" = Abstand irgendeines Bildpunktes von der optischen Achse und
Ip" = Intensität im Punkt p".

Nach der Darstellung entspricht das objekttreue Bild dem /"-Wert Null. Für verschiedene /"-Werte wurde die Intensitätsverteilung in der Darstellung beispielsweise für den Achromaten 6 mit f = 2,35 cm und für grünes Licht der Wellenlänge λ = 5,46 · io~⁵cm berechnet und Übereinstimmung mit der Helligkeitsverteilung im Bilde einiger künstlicher, der Rechnung angepaßter Phasenobjekte erzielt. Bei photographischen Aufnahmen wurden sowohl Ringbreite als auch Objektgröße variiert und so der allmähliche Übergang zum objekttreuen Phasenkontrastbild dargestellt. Man kommt so zu dem Schluß, daß die bisher übliche, normale Phasenkontrast einrichtung nur sehr kleine Objekte objekttreu wiedergibt, während größere entsprechend dem dunklen Rand und hellen Hof Strukturen zeigen, die im Objekt nicht vorhanden sind. Mit zunehmender Objektännlichkeit der Phasenobjekte werden die absorbierenden Objekte in Übereinstimmung mit der Theorie-immer objektunähnlicher, um schließlich fast. vollständig z"ü verschwinden. Die phasenkontrastmikroskopische Untersuchung natürlicher Objekte, deren Struktur nicht genau bekannt ist, kann deshalb zu Trugschlüssen Anlaß geben.

In einigen bisher bekanntgewordenen Arbeiten über das Phasenkontrastverfahren sind Vorschläge zur kontinuierlichen Veränderung des Kontrastes durch Variation der Phasendrehung und Durchlässigkeit des Phasenringes gemacht worden. Auf diese Weise kann man den Phasenring dem Objekt anpassen und so für die gegebene Ringbreite optimalen Kontrast erzielen. An dem Grad der Objekttreue wird hierdurch jedoch nichts geändert.

Auf Grund der der Erfindung zugrunde hegenden Überlegung erscheint es noch wichtiger, den Kontrast durch Veränderung der Ringbreite zu variieren, denn nur so kann mit Sicherheit die wahre Struktur irgendeines phasendrehende und absorbierende Objekte enthaltenden natürlichen Präparates ermittelt werden.

Die kontinuierliche Änderung der Breite des Phasenringes ist dabei nicht unbedingt notwendig. Verwendet man neben dem bisher üblichen noch einen leicht auswechselbaren sehr schmalen Phasenring, so sind nacheinander die drei wichtigsten Fälle zu beobachten. Im Hellfeld werden die absorbierenden Objekte objekttreu abgebildet. Im an sich bekannten normalen Phasenkontrastbild sind die absorbierenden und phasendrehenden Objekte gleichzeitig, doch je nach Größe mehr oder weniger objektunähnlich sichtbar, während der sehr schmale Phasenring eine nahezu objekttreue Abbildung der Phasenobjekte liefert. Mit Hilfe dieser drei Bilder kann man also verhältnismäßig sichere Aussägen über die wahre Struktur eines beliebigen Präparates machen.

Die Erfindung bezieht sich demnach auf eine Einrichtung zur mikroskopischen Abbildung nicht selbstleuchtender Objekte, deren Einzelheiten keine oder _r zu geringe Helligkeitsunterschiede hervorrufen, durch Phäsenkontrast mit in irgendeinem Bilde der Aperturblende angeordneten Phasenringen und einer den Phasenringen entsprechend ausgebildeten Aperturblende, deren Bild sich mit den Phasenringen deckt, und sie besteht darin, daß wenigstens zwei Phasenringe unterschiedlicher Breite sowie Mittel zum schnellen, nacheinander erfolgenden Einstellen auf die verschiedenen Phasenringe vorgesehen sind.

Wie sich das erwähnte Auswechseln der Phasenringe ohne Unterbrechung der mikrokospischen Beobachtung in einfacher Weise durchführen läßt, soll im folgenden beschrieben werden, doch ist hierzu noch eine Vorbemerkung notwendig.

Durch Aufspaltung des Phasenringes in zwei konzentrische Ringe z. B. wird der Grad der Objektähnlichkeit erhöht. Hierbei sollen die beiden Ringe einen solchen Abstand haben, daß die zu einem Ring gehörende Beugungsfigur vom zweiten nicht wesentlich beeinflußt wird. Wird hier für verschiedene Objektgrößen 2 B entsprechend dem schon erwähnten Parameterwert Γ und verschiedenen Ringabständen A R

der Parameterwert Γ = ^r BAR eingeführt, so er-

f

2 üZ

gibt sich aus einer Ableitung, daß mit if-= -.

^ö ° 5,46 · 10—⁵cm

für Γ > 5 der Ringabstand obige Bedingung erfüllt. Bringt man nun innerhalb des normalen Phasenringes in entsprechendem Abstand einen zweiten, sehr schmalen Phasenring und in der zugehörigen ,^:

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Aperturblende einen zweiten entsprechenden Ring an, so liefern beide. Ringe zusammen das dem normalen Phasenring entsprechende Phasenkontrastbild, da die Störung durch den schmalen Ring vernachlässigbar S klein ist. Zieht man jetzt die Kondensoririsblende so weit zu, daß der normale äußere Ring der Aperturblende ganz verdeckt ist, so sieht man für Γ > 5 das dem schmalen Ring entsprechende Phasenkontrastbild, ■' da in diesem Fall entsprechend dem passend

ίο gewählten Abstand die Beugungsfigur von dem normalen Ring nur sehr wenig beeinflußt wird.

Zur Verdeutlichung des Erfindungsgedankens sind die Verhältnisse nochmals in der Abb. 2 schematisch

: dargestellt. Es bedeuten: ι die Kondensoririsblende, 2 die Aperturblende, 3 den Kondensor, 4 das Objektiv, 5 die Objektebene und 6 die in der hinteren Brennebene liegende Phasenringblende. Weiterhin stellt 7 den an sich bekannten Phasenring normaler Breite ■. und 8 nach der Erfindung einen zweiten, wesentlich schmaleren Phasenring dar.

Entsprechend sind auf der Äperturblendenseite 9 der dem normalen Phasenring entsprechende und 10 der dem schmalen Phasenring entsprechende Aperturblendenring. Nach einer Weiterbildung der Erfindung ist außer den beiden den Phasenringen entsprechenden Aperturblendenringen ein dritter, breiter, aber in der Objektivbrennebene keinem Phasenring entsprechender Apertürblendenring vorgesehen. Dies wird in der Abb. 3 verdeutlicht, in welcher zu den schon erwähnten Phasenringen 7 und 8 und den Aperturblendenringen 9 und 10 noch ein weiterer, aber breiter Aperturblendenring 11 hinzukommt. Dadurch ist es möglich, mit der Irisblende nacheinander die Aperturblendenringe 11 und 9 abzudecken. Dies entspricht einer nacheinander durchgeführten Beobachtung im Hellfeld des normalen Phasenkontrastbildes und schließlich einer dem schmalen Phasenring 9 entsprechenden nahezu, objekttreuen Abbildung der Phasenobjekte.

Dieser zusätzliche Aperturblendenring bringt in Verbindung mit der erwähnten Irisblende auch für die bisher verwendete Phasenkontrasteinrichtung mit einem Phasenring wesentliche Vorteile. Man kann, ohne die mikroskopische Beobachtung unterbrechen zu müssen, durch Betätigen der Irisblende allmählich von der Hellfeld- zur Phasenkontrastbeobachtung übergehen. Das ist wesentlich, wenn das Präparat außer Phasenobjekten auch Amplitudenobjekte ent-

■ hält.

Eine andere Möglichkeit zum Auswechseln der Phasenringe läßt sich mit Hilfe einer Zwischenabbildung schaffen.

Das vom Kondensor + Objektiv erzeugte Bild der Aperturblende liegt stets entweder kurz hinter dem Objektiv oder, besonders bei den stärkeren Systemen, im Objektiv selbst, so daß diese Ebene zum Auswechseln der Phasenringe nicht zugänglich ist. Um diesen Schwierigkeiten zu entgehen, ist schon eine Zwischenabbildung der hinteren Brennebene in eine günstigere Stelle vorgeschlagen worden.

Man verwendet dann ein Objektiv ohne Phasenplättchen und bringt letzteres an den Ort der Zwischenabbildung, wo es leicht gegen ein anderes ausgetauscht werden kann. Nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung sind für verschiedene Objektive verschiedene konzentrische Phasenringe auf einer Revolverscheibe angebracht und eine zweite in der Aperturblendenebene angeordnete Revolverscheibe mit den Phasenringen entsprechenden Aperturblenden vorgesehen. Dieses Ausführungsbeispiel wird nach der schematischen Darstellung in Abb. 4 näher erläutert. Es bedeutet 12 die hintere Brennebene, 13 das Zwischenabbildungssystem und 14 bzw. 15 die in der Phasenringebene bzw. in der Aperturblendenebene angeordneten Revolverscheiben.

Es liegt auch im Sinne der Erfindung, daß die beiden Revolverscheiben nicht mit konzentrischen Phasenringpaaren bzw. Aperturblendenringpaaren, sondern mit für verschiedene Objektive verschiedenen, abereinzelnen Phasenringen bzw. Aperturblendenringen unterschiedlichen Breiten versehen sind, doch so, daß jedem Objektiv zwei oder mehr Phasenringe unterschiedlicher Breite zugehören, so daß unter Verzicht ^: der Irisblende allein durch Bedienung der Revolverscheiben der durch unterschiedliche Ringbreiten der Phasen- bzw. Aperturblendenringe hervorgerufene Phasenkontrast erzielt wird. Es läßt· sich zeigen, daß die Einrichtung nach der Erfindung auch für ρ ·< 5 brauchbar ist. In den Formeln

F = - B~ÄR und Γ = — ΒΔ R f f

ist für jedes Objektiv f konstant. K, Δ R sowie Δ R kann man nur in verhältnismäßig engen Grenzen verändern. Es war in dem erwähnten Beispiel

2JI

5 A

io"~⁵cm

= 1,14 · io⁵ cm"¹; f = 2,35 cm

Claims

PATENTANSPRÜCHE:

und für den normalen Phasenring Δ R = o,o6i cm.

Δ R kann man kaum größer als 0,1 cm machen. Einsetzen dieser Werte in F und Γ ergibt

Γ = 5 · ίο³ B; /"normal = 3 · 10^s B

Für Objekte mit Γ < 5 wird Γ normal < 3. Das heißt aber, daß man bei sehr kleinen Objekten auf die Wirkung des schmalen Ringes verzichten kann, da, wie aus der Darstellung der berechneten Intensitätsverteilung (Abb. 1) und photographischen Aufnahmen ersichtlich ist, schon der normale Phasenring ein obj ekttreues Bild liefert.

Die hier speziell für die Beobachtung im durchfallenden Licht beschriebene Einrichtung läßt sich selbstverständlich auch für die Beobachtung im reflektierten Licht verwenden.

i. Einrichtung zur mikroskopischen Abbildung nicht selbstleuchtender Objekte, deren Einzelheiten keine oder zu geringe Helligkeitsunterschiede hervorrufen, durch Phasenkontrast im Durchlicht oder Auflicht mit in irgendeinem Bilde der Aperturblende angeordneten Phasenringen und einer den Phasenringen entsprechend ausgebilde ten, in der Brennebene des Kondensors angeordnsten Aperturblende, deren Bild'sich mit den Phasenringen deckt, dadurch gekennzeichnet, daß wenig-

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stens zwei Phasenringe unterschiedlicher Breite sowie Mittel zum schnellen, nacheinander erfolgenden Einstellen auf die verschiedenen Phasenringe vorgesehen sind.
2. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zwei oder mehr konzentrische Phasenringe unterschiedlicher Breite vorgesehen sind und mit Hilfe einer in der Nähe der Aperturblende befindlichen Irisblende wahlweise einer der beiden Aperturblendenringe ausblendbar ist.
3. Einrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß außer den beiden den Phasenringen entsprechenden Aperturblendenringen ein dritter, breiter, aber in der Objektivebene keinem Phasenring entsprechender Aperturblendenring vorgesehen ist und daß mit der Irisblende die Aperturblendenringe nacheinander abdeckbar sind.
4. Einrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Verwendung einer in der Phasenringebene angeordneten Revolverscheibe mit für verschiedene Objektive verschiedenen konzentrischen Phasenringen und einer zweiten in der Aperturblendenebene angeordneten Revolverscheibe mit den Phasenringen entsprechenden Aperturblenden, so daß mit Hilfe einer in der Nähe der Aperturblende befindlichen Irisblende wahlweise einer der beiden Aperturblendenringe ausblendbar ist.
5. Einrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch derart in der Phasenringebene bzw. in der Aperturblendenringebene. angeordnete Revolverscheiben mit für verschiedene Objektive verschiedenen, aber einzelnen Phasenringen bzw. Aperturblendenringen, daß jedem Objektiv zwei oder mehr Phasenringe unterschiedlicher Breite zugehören, so daß allein durch Bedienung der Revolverscheiben der durch unterschiedliche Ringbreite der Phasenbzw. Aperturblendenringe hervorgerufene Phasenkontrast erzielbar ist.

In Betracht gezogene Druckschriften:
Deutsche Patentschrift Nr. 811 736;
britische Patentschriften Nr. 669 479, 631 251.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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