DEW0009541MA - - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

Tag der Anmeldung: 23. September 1952 Bekanntgemacht am 16. Februar 1956

DEUTSCHES PATENTAMT

Unter HG-freien Insulinpräparaten sind im folgenden solche zu verstehen, welche nach intravenöser oder intramuskulärer Injektion keine initiale Blützuckersteigerung hervorrufen, sondern ledig-Hch Bluitzuckersenkung bewirken. Bei den im Handel befindlichen Insulinpräparaten tritt im Anschluß an die Injektion eine kurzdauernde, bisweilen sehr erhebliche Blützuckersteigerung auf (S bis 15 Minuten), ehe die erstrebte Senkung des Blutzuckers einsetzt.

Kristallisierte Zinkinsuline mit einem Zinkgehalt unter 0,5°/» sind bereits beschrieben; z.B. ist bekannt, Insulin unter Zusatz von Zitrationen bei gleichzeitiger Zugabe von Zink auszukristallisieren, wobei ein kristallisiertes Zinkinsulin mit einem Zinkgehalt von 0,38°/» Zink erhalten wird. Bei diesem Verfahren wird die Zitronensäure nicht zur Entfernung des Zinks zugegeben, sondern die Auskristallisation des mit Zink beladenen Insulins soll, indem noch Zink zugesetzt wird, unterstützt werden. Von einer Herabsetzung des Zinkgehaltes kann bei diesem Verfahren nicht die Rede sein.

Im Gegensatz zu diesen bekannten Verfahren beruht das nachstehend beschriebene Verfahren auf der neuen Erkenntnis, daß durch Herabsetzen des Zinkgehalteß der durch die übliche Fabrikation erhaltenen zinkreichen Insuline mit etwa 1 % und mehr Zink die unerwünschte initiale Blutzuckersteigerung verschwindet. Weiter hat das neue Verfahren den Vorteil, daß zur Herabsetzung des Zink-

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gehaltes kristallisierter Insudinpräparate die Kristalle als solche nicht umkristallisiert zu; werden brauchen und daher die bei den bisherigen Verfahren unvermeidlichen Verluste an wertvollem Präparat nunmehr vermieden werden. Hierdurch werden die Ausbeuten gegenüber den bekannten Verfahren um beispielsweise io bis 20%> erhöht.

Bisher war es unbekannt, daß die anfängliche bluitzuckersteigernde Wirkung mit dem Zinkgehalt zusammenhing, und aus diesem Grund war kein Präparat auf dem Markt, welches die anfängliche blutzuickersteigernde Wirkung nicht besaß.

Es wurde nämlich gefunden, daß in reinen amorphen uind kristallinischen Insulinpräparaten 'ein bestimmter Anteil des vom Insulin komplex gebundenen Zinks als hyperglykämisierender Faktor wirksam ist. Wenn man z. B. Insulinpräparate mit ι bis 2% Zink, welche den hyp'erglykämisierenden Anfangseffekt aufweisen, im Zinkgehalt auf 0,5% oder darunter senkt, dann zeigen sie die anfängliche Blutzuckersteigerung nicht mehr. Werden umgekehrt Insulinpräparate mit 0,5 %> und darunter, welche den HG-Effekt vermissen lassen, im Zinkgehalt erhöht, z.B. auf 1 bis 2%, so rufen sie nach der Injektion initiale BLutzuckersteigerung hervor. Auf Grund dieser Befunde wurde ein Verfahren entwickelt, mit dem es gelingt, HG-wirksame Insulinpräparate durch Behandlung mit passenden Zink-. komplexbildnern in solche umzuwandeln, welche den HG-Effekt nicht mehr zeigen. Geeignete Komplexbildner sind Oxy-Monocarbonsäuren (z. B. Milchsäure, a-Oxybuttersäure), Oxy-di- und Oxypolycarbonsäuiren (z. B. Apfelsäure, Zitronensäure), organische Phosphorsäuren (z. B. Glycerin-phosphorsäure) und Aminosäuren (z. B. Glykokoll, Alanin, Asparaginsäure). Kristallisiert man HG-wirksame Insulinpräparate aus stark verdünnten Lösungen dieser Substanzen um, so verschwindet die HG-Wirkung.

Der besondere Wert des neuen Verfahrens liegt jedoch darin, daß man damit kristallinisches Insulin unter Erhaltung seiner Kristallstruktur vom hyperglykämischen Faktor befreien kann, indem man die Insulinkristalle unter passenden Bedingungen in Lösungen der genannten Komplexbildner suspendiert. Dadurch läßt sich die Befreiung vom HG-Faktor unter sehr geringen InsuJinverlusten und in sehr kurzer Zeit ausführen; eine Veränderung der Kristallstruktur des Insulins ist nicht feststellbar.

Beispiel 1

10 mg kristallisiertes, HG-wirksames Insulin (Zn-Gehalt 1,4%) werden in einem Gemisch von 2 ecm wäßriger Asparaginsäurelösung (3,35 mg Asparaginsäure/ccm, auf p_H 5,3 eingestellt) und 2 ecm Aceton suspendiert. Die Einstellung auf Ph 5>3 erfolgt zweckmäßig mit Hilfe von stark verdünnter Natronlauge bzw. Salzsäure. 30 Minuten gelinde schütteln, abzentrifugieren, nochmals in frischer Asparaginsäurelösung schütteln, abzentrifugieren, Kristalle mit 1 ecm Aceton waschen, Aceton abzentrifugieren, Kristalle im Vakuumexsikkator trocknen. Auebeute 9,1 mg, Zn-Gehalt jetzt 0,4%, HG-Wirkung nicht mehr nachweisbar.

Beispiel 2

100 mg kristallisiertes, HG-wirksames Insulin (Zn-Gehalt 1%) werden in 5 ecm 0,1 n-wäßrigef Apfelsäuirelösung (mit NaOH auf p_H 5,4 eingestellt) im Zentrifugenglas suspendiert. Nach i2stündigem Stehenlassen abzentrifugieren, zweimaliges Wiederholen der Behandlung mit Apfelsäure. Nach Abzentrifugieren der letzten Apfelsäurefraktion waschen mit 2 ecm Aceton und abzentrifugieren. Trocknen der Kristalle im Vakuumexsikkator. Ausbeute 95 mg. Zn-Gehalt 0,48%. HG-Wirkung i. v. und i. m. nicht mehr nachweisbar.

Das Verfahren beruht däraucf, daß das im handelsüblichen Insulin chemisch gebundene Zink aus 80" der Verbindung entfernt wird. Das Zink ist als fester Scherenkomplex am Insulin gebunden. Bei der beschriebenen Behandlung wer den. die Bindungen des Zinks mit den NH₂-Gruppen aufgespalten, das Zink geht die Salzbildung mit dem Säureüberschuiß ein, und die an das Zink gebundenen sauren Gruppen des Insulins gehen in freie saure Gruppen über. Die Behandlung wird zweckmäßig in solchen Behandlungsflüssigkeiten vorgenommen, die die Insulinkristalle nicht lösen. Beispielsweise in aceton- g₀ haltigen Lösungen von α-Aminosäuren (p_H etwa 5 bis 6) oder in Oxy-mono- oder Polycarbonsäuren, insbesondere a-Oxy-Säuren (p_H etwa 5 bis 6). Wenn man lösende Behandlungsflüssigkeiten verwendet, läßt sich das Zink schneller und vollständiger entfernen, aber die Wiedergewinnung eines kristallisierten Produktes bereitet gewisse Schwierigkeiten, und die Entfernung des Zinks auf einen Gehalt von 0,4 bis 0,5 % ist ausreichend für die Entfernung der störenden HG-Wirkung. Als zinkbindende Behandlungsmittel sind milde wirkende Stoffe zu verwenden, die nicht vom Insulin festgehalten werden und das Insulinmolekül in seiner blutzuckersenkenden Wirkung nicht schädigen. Eine Herabsetzung des Zinkgehaltes auf 0,5 °/o oder weniger erreicht man beispielsweise durch Dialysieren einer Zink-Insulin-Lösung gegen eine saure 0,01 n-Apfelsäurelösung vom p_H 3 bis 4, zweckmäßig unter fortlaufendem Zutropfen frischer Apfelsäurelösung in das Dialysat.

Neben den vorstehend genannten Verbindungen finden sich noch zahlreiche andere, auch aromatische, aliphatisch-aromatische, heterocyclische saure Verbindungen, Pyridincarbonsäusren usw., die Zink zu binden vermögen und daher grundsätzlich für die Durchführung des Verfahrens geeignet sind. · Die vorstehend genannten Verbindungen sind jedoch zellvertraut und nicht toxisch, so daß ihre Anwendung immer unbedenklich ist.

Claims (3)

1. PATENTANSPRÜCHE:

   i. Verfahren zur Herstellung von Insutlinpräparaten mit einem Zinkgehalt von 0,5 °/o und darunter, dadurch gekennzeichnet, daß zinkreicheres Insulin zur Vermeidung der nach parenteraler Injektion eintretenden initialen

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   Blutzuckersteigerung mit zinkbindenden Reagenzien', wie Milchsäure, Apfelsäure, Asparaginsäure, behandelt wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß kristallinische zinkhaltige Insulinpräparate in solche Lösungen zinkbindender Reagenzien eingebracht werden, in denen sie sich nicht lösen, wie wäßrig-acetonische Lösung von Asparaginsäure mit einem p_H-Wert von 5 bis 6, und dabei ohne Verlust ihrer kristallinen Struktur vom hyperglykämischen Faktor befreit werden.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Herabsetzung des Zinkgehaltes durch Dialysieren einer. Zink-Insulin-Lösung gegen eine saure Apfelsäurelösung, beispielsweise mit einem p_H von 3 bis 4, zweckmäßig unter fortlaufendem Zutropfen frischer Apfelsäurelösung in das Dialysat, durchgeführt wird.

   Angezogene Druckschriften:
   Schweizerische Patentschrift Nr. 255 252;
   deutsche Patentschrift Nr. 835 499.

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