DK141475B - Fremgangsmåde til fremstilling af et dyrefoderadditiv indeholdende et antibiotikum AV290-syntankompleks. - Google Patents

Description

UU7B

i

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et tørt dyrefoderadditiv indeholdende faststoffer fra dyrkningsmedier og et antibiotikum AV290--syntankompleks. "Syntan" er et syntetisk garvemiddél, jfr. nedenfor.

5 Antibiotikum AV290 dannes ved fermentativ biosynte se ved dyrkning under regulerede betingelser af Strepto-myces canidus NRRL 3218 og mutanter deraf. Fremstillingen og egenskaberne ved antibiotikum AV290 er beskrevet i USA patentskrift nr. 3.338.786. Der har været store vanskelig-10 heder i forbindelse med udvindingen af antibiotiket på økonomisk måde. Ifølge nævnte patentskrift anvendes adsorption på trækul efterfulgt af eluering og søjlechroma-tografi. En sådan fremgangsmåde er ikke voldsomt kostbar, når der kræves rent antibiotikum til medicinsk anvendelse.

15 Når antibiotiket imidlertid skal anvendes i dyrefoderadditiver, får omkostningsfaktoren meget stor betydning, og der er derfor et behov for en billig metode til udvinding af antibiotiket til dette formål.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendomme-20 lig ved, at a) et totalt dyrkningsmedium indeholdende antibiotikum AV290 syrnes til en pH-værdi på 1,4-5,0, b) en syntan sættes til det syrnede dyrkningsmedium i en mængde, der er tilstrækkelig til at danne et 25 kompleks med antibiotiket AV290, c) faststofferne fra dyrkningsmediet fjernes sammen med det fældede antibiotikum AV290-syntankompleks, og d) blandingen af faststoffer fra dyrkningsmediet og antibiotikum AV290-syntankompleks tørres.

30 Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse bevirker praktisk taget fuldstændig fjernelse af antibiotikumaktiviteten fra dyrkningsmediet eller -væsken. Endvidere kan de således fremstillede antibiotikum-syntankom-plekser anvendes uden isolering af bestanddelene i dyrefo-35 deradditiver, hvilket er en vigtig økonomisk fordel.

De syntetiske garvemidler, som anvendes ved den her omhandlede fremgangsmåde, er kondensationsprodukter 2 141475 af naphthalensulfonsyrer eller forskellige sulfonerede phenoler med formaldehyd. Næsten alle disse materialer fås i form af polymere, f.eks. polymere med 2,3,4,5 og 6 monomerenheder. Størsteparten af disse syntetiske garve-5 midler er ikke rene isolerede kemiske forbindelser, men derimod ofte blandinger. De er sædvanligvis amorfe vandopløselige materialer, som kan fås enten i koncentreret vandig opløsning eller i pulverform, og farven varierer fra farveløs til mørkebrun. For nemheds skyld betegnes 10 disse sulfonerede syntetiske garvemidler under ét som "syntaner", og dette udtryk anvendes i det følgende.

Ved den her omhandlede fremgangsmåde foretrækkes naphthalensyntaner, som fremstilles ved kondensering af naphthalen-1- eller -2-sulfonsyre med formaldehyd. Den 15 faktiske struktur er ikke blevet fastlagt, højst sandsynligt er produktet en blanding, men produktet (ud fra naphthalen-2-sulfonsyre) kan repræsenteres ved formlen s°3h

20 wn <! /—l ,S0,H

kJJ- ch2\xch2 —uu -I n n er 0-3 eller 4 25

Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan der også anvendes aromatiske hydroxysyntaner.

Der findes to generelle metoder til fremstilling af disse syntaner: (1) Sulfonering af en aromatisk hydroxyforbin-30 delse efterfulgt af kondensation med formaldehyd, og (2) kondensation af en aromatisk hydroxyforbindelse med formaldehyd efterfulgt af sulfonering til dannelse af et vandopløseligt produkt. Den generelle forbindelsestype fremstillet ud fra phenol kan repræsenteres ved formlen 35 3 UU76

OH OH OH

5 ' ' T

R R R R = H eller SO,H

L J 3 n er 0-3 eller 4

Foruden phenol kan der som udgangsmaterialer anvendes cresoler, naphtholer, bis-phenoler og lignende 10 samt naturligvis blandinger af dannede produkter afhængigt af kondensations- og sulfoneringsbetingelserne. En anden type aromatiske hydroxysyntaner, der kan anvendes ved den her omhandlede fremgangsmåde, har sulfonsyregruppen knyttet til methylengruppen. Disse syntaner fremstilles ved 15 at omsætte en phenol (phenol, cresoler, naphtholer, bis-phenoler, etc.) med formaldehyd og natriumbisulfit eller svovldioxid.

Med hensyn til de ovenfor nævnte syntaner kan henvises til den banebrydende artikel af Stiasny med tit-20 len "Syntans, New Artificial Tanning Materials", i J. Soc.

Chem. Ind., 1913, side 775,samt til artiklen af Turley i J. Am. Leather Chem. Assoc. 40, 58 (1945). Endvidere er fremgangsmåder til fremstilling af syntaner beskrevet i f.eks. tysk patentskrift nr. 262.558, 266.139, 280.233, 25 291.457, 409.984, 433.292, 493.795, 537.451 og 539.474.

Andre egnede syntaner, der kan anvendes ved den foreliggende opfindelse, er anført nedenfor:

Varemærke Producent % Bioaktivitet "Suprak 57" American Cyanamid Co. 41 30 "Tru-tan R T N" A.J. & J.O. Pilar Co. 48 "Tru-tan RT" A.J. & J.O. Pilar Co. 28 "Tru-tan PA 65" A.J. & J.O. Pilar Co. 50 "Orotan TV" Rohm & Haas Co. 21 "Orotan WM" Rohm & Haas Co. 33 35 "Leukanol" Rohm & Haas Co. 68 "Sulframin 1298" WITCO Chemical Co. <46% 4 141475

Produkterne af antibiotiket og syntanerne er blevet betegnet som reversible antibiotikum-syntankomplekser.

Deres nøjagtige kemiske natur er ikke blevet fastlagt, men der indgår ikke covalent binding, og produktet er ikke en 5 fysisk blanding. De kemiske bindinger er reversible, da antibiotikum AV290 kan udvindes fra komplekserne ved adsorption på en søjle af tværbunden carboxymethyldextrangel efterfulgt af eluering med vandig syre.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen indstilles 10 pH-værdien af det totale dyrkningsmedium på en værdi i intervallet 1,4-5,0 med fortyndet vandig syre. Egnede syrer til dette formål er fortyndet saltsyre, fortyndet svovlsyre, fortyndet trifluoreddikesyre og lignende, selv om endog iseddike kan anvendes. Derefter tilsættes langsomt en vandig 15 opløsning af en syntan eller blandinger af syntaner under omrøring ved omgivelsernes temperatur. Antibiotiket og syntanerne danner et kompleks, der er vanduopløseligt og derfor udfældes. Det udfældede syntankompleks sammen med de faste stoffer fra dyrkningsmediet fjernes derpå ved filtre-20 ring eller centrifugering og tørres. De således fremkomne produkter kan tørres ved (1) opslæmning af de fugtige faste stoffer i polære, med vand blandbare ikke-opløsningsmidler, såsom acetone, efterfulgt af filtrering, skylning og lufttørring, eller ved (2) genopslæmning af de fugtige faste 25 stoffer i vand og frysetørring eller spraytørring.

Når de her omhandlede produkter således omhyggeligt tørres under temperaturbetingelser, der ikke nedbryder antibiotikum AV290, fås de sædvanligvis i form af grå til brune pulvere eller faste stoffer. I tør form er dis-30 se produkter yderst stabile og kan opbevares uden kendeligt tab af antibiotisk aktivitet i længere tidsrum. Denne lange opbevaringstid er naturligvis en vigtig praktisk fordel.

Det er en fordel ved den foreliggende opfindelse, 35 at syntanmængden, som tilsættes for at fælde komplekserne med antibiotiket, ikke er kritisk, og at der ikke skal følges eksakte støkiometriske forhold. Almindeligvis vil den 141475 5 anvendte mængde syntan være noget mere end den minimumsmængde, der kræves til dannelse af komplekset med anti-biotiket. Overskud af syntan vil blot forblive i opløsning ved filtrering. Den krævede syntanmængde er imidler-5 tid direkte proportional med koncentrationen af antibio-tiket i dyrkningsmediet eller -væsken og varierer med naturen af den anvendte syntan. Den specifikke bioaktivitet for det udfældede kompleks varierer ligeledes med naturen af den anvendte syntan. Det er således faktisk sand-10 synligt, at komplekserne indeholder varierende relative mængder antibiotikum, og naturligvis er det ret sandsynligt, at der er tale om blandinger af komplekser, da de anvendte syntaner ikke er rene enkelte kemiske forbindelser.

15 Den mindste syntanmængde, der kræves til dannelse af komplekset med antibiotiket i et vilkårligt enkelt dyrkningsmedium,kan let bestemmes på følgende måde. Der udtages en prøve (hensigtsmæssigt 50-100 ml) af hele dyrkningsmediet, som klares ved fjernelse af myceliet og an-20 dre uopløselige stoffer ved filtrering, fortrinsvis under anvendelse af et filterhjælpemiddel. Derpå syrnes filtratet til en pH-værdi på 1,8-2,0 med fortyndede vandige mineralsyrer såsom fortyndet saltsyre, fortyndet svovlsyre, fortyndet phosphorsyre eller lignende. Denne opløsning ti-25 treres derpå med den specielle vandige syntanopløsning, som skal anvendes, indtil der ikke længere udfældes stof eller dannes uklarhed. Mængden af syntanopløsning til dyrkningsmediet beregnes derpå ud fra titeren for den udtagne prøve, idet der tilvejebringes et lille overskud.

30 I de senere år har anvendelsen af antibiotika i dyrefoder til forøgelse af vækstkarakteristika og foderudnyttelsen fået stor økonomisk betydning. De tørrede faststoffer fra dyrkningsmediet indeholdende syntankomplekser-ne, enten alene eller i kombination med egnede bærestoffer, 35 bevirker en forøgelse af væksthastigheden ved tilsætning til dyrefoder. Endvidere forøges foderudnyttelsen. De har den fordel, at væksthastigheden hos ikke-drøvtyggere såsom 6 141475 fjerkræ og svin, specielt smågrise, som på et tidligt tidspunkt er taget fra soen, forøges i betydelig grad, og at foderomdannelseshastigheden forøges væsentligt.

Det her omhandlede foderadditiv gives i en 5 mængde, der er tilstrækkelig til at tilvejebringe omtrentlig følgende dosisniveauer i mg pr. individ pr. dag:

Store drøvtyggere 350

Små drøvtyggere 200 10 Ikke-drøvtyggere 100

Fjerkræ 2

Antallet af mg af antibiotikum AV290 pr. vægtenhed i vilkårligt foderadditiv ifølge opfindelsen kan let bestemmes ved den i USA patentskrift nr. 3.338.786 be-15 skrevne biologiske prøve. Ud fra de således opnåede data kan man let beregne den mængde fodersupplement, som skal anvendes pr. ton foder.

Der kan anvendes mange forskellige bærestoffer ved fremstillingen af foderadditivet indeholdende de tør-20 rede faststoffer fra dyrkningsmediet indeholdende syntan-komplekserne. Egnede bærestoffer til anvendelse i foderadditiverne er f.eks. sojabønnemel, lucernemel, bomuldsfrøoliemel, linoliemel, majsmel, rørsukkermelasse, urinstof, benmel og majskolbemel. Bærestoffet fremmer en ens-25 artet fordeling af komplekserne i det færdige foder, hvortil additivet er blandet. Det har således en vigtig funktion ved at sikre rigtig fordeling af komplekserne i foderet.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen forklares nærme-30 re i det følgende, hvor eksempel 1-2 illustrerer fremstillingen af syntaner.

Eksempel 1

Fremstilling af en sulfoneret phenol-formaldehydkondensat-_syntan_ 35 En blanding af 2 mol phenolsulfonsyre og 1 mol form aldehyd, i 37,5% vandig opløsning, opvarmes i en tætlukket flaske på et dampbad i 1 time. Der fås en mørkfarvet opløs- 141475 7 ning, hvori der efter afkøling natten over afsættes en lille mængde af et amorft hvidt faststof. Dette opløses let ved tilsætning af en lille mængde koldt vand. Efter delvis neutralisation kan opløsningen anvendes til garv-5 ning.

Syntaner af denne generelle type forhandles af firmaet A.J. and J.O. Pilar Co. under varemærket "Trutan S-55" og "Trutan R108", jf. Encyclopedia of Chemical Technology, Krik-Othmer, Interscience Publishers (195,4) , bind 10 13, side 594.

Eksempel 2

Fremstilling af en sulfoneret naphthalen-formaldehydkonden-_satsyntan__ 20 g naphthalen sulfoneres med 10 ml 93%'s salt-15 syre i 2 timer, idet temperaturen holdes ved ca. 105°C.

Blandingen afkøles derpå til ca. 35°C, og der indrøres 5 ml 37,5%'s vandig forraaldehydopløsning. Produktet opløses derpå i vand til en koncentration på ca. 35%, og aciditeten formindskes til ca. 1/10 N ved tilsætning af alkali.

20 Syntaner af denne generelle type forhandles af firmaet A.J. og P.O. Pilar Co. under varemærket "Trutan OA" og af firmaet Rohm & Haas Co. under varemærket "Tamol N" ®, jf. Encyclopedia of Chemical Technology, Kirk-Othmer, Inter-science Publishers (1954), bind 13, side 594.

25 Eksempel 3

Fremstilling af antibiotikum AV290-"Trutan RT Regular"-_kompleks_ 14 liter AV290 dyrkningsvæske indeholdende 722 mcg AV290 antibiotikum pr. ml indstilles på pH-værdien 1,8 30 med svovlsyre, hvorpå der filtreres under anvendelse af diatoméjord. En 100 ml portion af lige store dele "Trutan RT Regular" (et phenol-formaldehyd-bisulfitkondensat fra A.J. og J.O. Pilar Co.) og vand sættes til 10 liter af filtratet under omrøring. Fældningen får lov til at bundfælde, 35 og den ovenstående væske dekanteres. Bundfaldet isoleres ved centrifugering, vaskes to gange med 250 ml vand, suspenderes i ca. 1 liter vand og frysetørres. Der fås 30,5 g 8 141475 tørret produkt, som ved afprøvning udviser en antibiotisk aktivitet på 28,3%.

Eksempel 4

Fremstilling af antibiotikum AV290-"Trutan RT Regular" kom-5 _pleks ud fra totalt dyrkningsmedium_ 3. liter AV290 dyrkningsmedium indeholdende 2000 mcg antibiotikum 290 pr. ml indstilles på pH-værdien 1,9 med svovlsyre. Til det omrørte syrnede dyrkningsmedium sættes 15 ml "Trutan RT Regular". Blandingen centrifugeres, og de 10 faste stoffer vaskes to gange med 350 ml vand ved opslæmning, centrifugering og dekantering. Den antibiotiske aktivitet, der forbliver i den ovenstående dyrkningsvæske, fældes med yderligere 20,8 ml "Trutan RT Regular". De vaskede faste stoffer fra sidste trin sættes til de vaskede 15 faste stoffer fra begyndelsestrinet, suspenderes i 1000 ml vand og frysetørres. Der fås 77 g tørret produkt, som ved biologisk afprøvning udviser en antibiotisk aktivitet på 6,3%.

Toksicitetsundersøgelse: 20 Produktet underkastes afprøvning for toksicitet på følgende måde: Produktet indgives til hunmus (Carworth Farms CF-1) med en vægt på 18-20 g. Produktet indgives oralt i 0,2%'s agar i en dosismængde på 1024 mg pr. kg legemsvægt. Alle musene overlevede en 14 dages forsøgsperiode.

25 Eksempel 5

Fremstilling af antibiotikum AV290-"Trutan RT Regular" _kompleks ud fra totalt dyrkningsmedium_ 37,5 liter dyrkningsvæske indeholdende 3660 mcg antibiotikum AV290 pr. ml indstilles på pH-værdien 2 med 30 svovlsyre. Til det syrnede dyrkningsmedium sættes under omrøring 1312,5 ml "Trutan RT Regular", som er blevet fortyndet med 1312,5 ml vand. Blandingen opbevares ved 4°C natten over, hvorpå den filtreres under anvendelse af 800 g diatoméjord. Efter vaskning af filterkagen med 35 15 liter vand tørres den fugtige filtermasse i vakuum ved ca. 40°C. Der fås 1439 g tørret produkt, som udviser en antibiotisk aktivitet på 9 %.

UU75 9

Eksempel 6

Fremstilling af antibiotikum AV290-"Trutan RT Regular" _kompleks ud fra totalt dyrkningsmedium_ 1500 ml dyrkningsmedium indeholdende 1940 mcg anti-5 biotikum AV290 pr. ml indstilles på pH-værdien 2 med svovlsyre, til det syrnede dyrkningsmedium sættes under omrøring 52,5 liter "Trutan RT Regular", som er fortyndet med 52,5 liter vand. Blandingen filtreres under anvendelse af 45 kg diatoméjord som filtreringshjælpemiddel, 10 og filterkagen vaskes på filterpressen med vand. Den fugtige filterkage tørres i vakuum ved ca. 55°C. Der fås 93 kg tørret produkt, der udviser en antibiotisk aktivitet på 3,15%.

Eksempel 7 15 Vækstfremmende virkning af antibiotikum AV290-"Trutan RT Regular" kompleks i blanding med faststoffer fra totalt _dyrkningsmedium_

Dyrkningen af foderadditivet fremstillet ifølge eksempel 4 bestemmes på følgende måde: Der indkøbes 20 daggamle kyllinger i det angivne antal. Kyllingerne anbringes i en opvarmet kyllingemoder og holdes i et kyl-lingerum ved en temperatur på ca. 24°C. Alle grupper kyllinger vejes ved forsøgets start og ved dets afslutning efter 28 dage. Kyllingerne har fri adgang til foder 25 og vand. Ved alle forsøgene anvendes følgende grundfoder.

Grundfoder

Bestanddel g/kg

Formalet gul majs 514 30 Sojabønneoliemel (44#) 500

Majsglutenmel 50

Sildemel (60#) 50

Fedt 40 Tørret lucernemel (17#) 20 35 Formalet kalk 5

Dicalciumphosphat 12

Natriumchlorid 5 ir

Spormineraler 1

Vitaminforblanding** 5 UU75 ίο χ Spormineraler - mangen 6%, iod 0,12%, jern 2,0%, kobber 0,2%, Cobalt 0,02%, zink 2,0% og calcium 25,5% xx Vitaminforblanding - pr. kg foder, indeholder 5 125 mg butyleret hydroxytoluen, 500 mg DL-methio- nin, 3300 I.E. vitamin A, 1100 I.E. vitamin D^, 2,2 I.E. vitamin E, 11 mcg vitamin B^/ 4,4 mg riboflavin, 27,5 mg niacin, 8,8 mg pantothen-syre, 500 mg cholinchlorid, 1,43 mg folsyre og 10 1,1 mg menadionnatriumbisulfit til 5 g formalet gul majs.

Forsøgsresultaterne er anført i den følgende tabel I.

141475 11

-P

Φ .Μ 1—I <_ί Η (Μ Κ3 g \ oo mi β Β φ ω if φ Ό ° η ο β Φ 1¾ -5 Μ Β τ& if φ β ρ 5 i ο ω ® φ 1¾ i Η 8 Ο LO -Ρ α > - ·* fi ε η οο t- ω Ο ·Η Μ

i Β C

£ S

cd ° -Ρ -Ρ m β φ >: 13- CO Ο (Μ -Ρ φ β $ m κλ vom il I φ |> *3 *3 »s + Ο TJH CM CM Η Η β 03 Ο-Η £ί CM fcP 'β > 2 ^ ΜΙ “ φ φ i φ Μ·Η ο Μ > Cd . Β •Ρ Ό Ρ C0CM 03 a ΗΜ Φ 03 CM ^f-Og φ oo i cm m m νο o XI β CM 8 -¾ cd φ i > £ Β Ό O H ® Β ff ·> P £ β t>) Φ w

Μ £ I

cl φ O

•Ρ M 03

rP β CM

i—li—Ι·Ρ CM CM CM CM !>

i>;Cdl—I I—I H rpl I

i -Pi—I

£ > X

φ < il g o a x; a *> ,,

Φ φ II

φ Ό „ Η bC O O Φ Φ C Η Η Ό

p J M

'O B B

0 PS (¾ Sti β TJ > S §

O -P +3 -P

<p -p O O

•p £ = £ = Μ Ό Β β B β O Ό = cd s cd

cd H i H CM I H

pi β P O £ -P O £ φ Φ ΡΦοηΜΡΦοΜ ϋ Ό ΦΡγν]ΦΦΡ(Ν<!> æ ο φ· c > κ φ c >« > feBHrtJ Β Η ,< 12 141475

Eksempel 8

Fremstilling af antibiotikum AV290 kompleks ud fra totalt _dyrkningsmedium_ 5 ml portioner af det totale dyrkningsmedium fra 5 en kultur af AV290 indeholdende 1000 mikrogram antibiotikum AV290 indstilles på pH-værdien 2,0 med svovlsyre. Der tilsættes derpå de i det følgende anførte mængder af hvert enkelt fældningsmiddel, og komplekserne centrifugeres. De ovenstående væsker afprøves ved papirpladeagardiffusionspla-10 demetoden. Agaren er podet med Corynebacterium zerosis NRRL-B-1397.

141475 13 O O o o o . o o o o o

O · · Pc Pi Pi Pc P

O O cd cd cd cd ro tn o o hhhhh r-t *4 -Η Ή jrl jrl

Cd 02 02 Ph CM P-ι fc P-c o cd cd •h cd cd .....

B ffi K ooooo .p 02 . · £ £ -d Ό S ° § § «8 oB c« <$3 c«

2 O

td o E E ··,_··· 0- p Λ Id i-ot-a'-o'-o'-o c, tH o o .....

(5 > pd pd

•H

<D

ω

02 H

id cd sd +? ω o

h »cd P

H -P v— 02

H C E

<12 Φ P

P > -H

cd O Td ^ d Ε» Jt σ\ in co vo co h <o o σ\ cm h ni ·=*- o oo tn o

ø C/2H r—i H HHHHr^K^l^NCvjLO

T3 6C

β

•Η *H

P 5 ω Pc p >.

•h . p > p <a ϋ id < &o æ φ S ja •cd p Pc id ί3

C

02 H W in HCMlA H CM m CM in ΟΙ 1Λ CM in W 1Λ CM in > sd <d oo

Ch I C

CM H

H d Cd

02 H

H · £3 2, 02 Pc 02 . _ &0 5

OidNCd P3 02 02 - d cd Pd 2 s = in •H 02 02 E = oinco E PcP^ > S Eh Eh p in <

02 >»rl 02 E-C 5 Pd Pd Pd CQ CM

&C 02 >j Pc _ cd g <o >> sd s s s s s s •Hcdcuca cd cd cd cd cd cd cd

d Pc Td cd p P P P P P P

d <hOO cd cd P 3 2 ? 2 1— 1 I—I P P Pc Pc Pc Pc Pc Pc Pc g o O Eh E-I E-I jH Jh