DK141706B - Fremgangsmåde til fremstilling af mikroorganismecellemasse. - Google Patents

Description

(11) FREMLÆ66ELSESSKRIFT 141706 DANMARK lnt C| S e 12 " 1/30 §(21) Antegning nr. 1077/76 (22) Inrffevarat den 12. mar. 1976 (23) Lebedag 12. mar. 1976 (44) Ansøgningen fremtogt og fremlaggelsesshrfftet offentliggjort den 27 · maj 1 98Ο DIREKTORATET FOR _^ PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) Prioritet beg«« ft· den

14. mar. 1975· 107^5/75, GB

(Ti) SHELL INTERNATIONALE RESEARCH MAATSCHAPPIJ B.V., Carel van Bylandtlaan 50, Haag, NL.

(72) Opfinder: David Ernest Forester Harrison, 1 Hunters Way, Shelcb® wich Lees, Favereham, Kent, GB: Harmannus Johannes Doddema, Bie Nook, Eastling, Faversham, Kent, GB.

(74) Fuldmagtig under sagene behandling:

Plougmann & Vingtoft Patentbureau..

(64) Fremgangsmåde til fremstilling af mlkroorganismecellemasse.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af mikroorganismecellemasse, hvor en mikroorganisme af slægten Methylococcus dyrkes under aerobe betingelser i et flydende vækstmedium indeholdende assimilerbare nitrogenkilder og essentielle mineralsalte i nærværelse af methangas, og mikroorganismerne udvindes fra det flydende vækstmedium. Der kendes mange mikroorganismer, der som carbon- og/eller energikilde kan udnytte carbonhydrider eller visse oxygenerede derivater deraf eller andre derivater deraf. Den tørrede biomasse, som fås ved dyrkning af sådan mikroorganismer, og som oftest betegnes enkeltcelleprotein (SCP), er rig på protein. I denne sammenhæng er især mikroorganismer, som er i stand til at udnytte gas-formige organiske forbindelser indeholdende åt eller flere carbonato-mer i molekylet, f.eks. methan, interessante. Dansk patentansøgning nr. 2020/74 beskriver dyrkningen af en art af Methylococcus under udnyttelse af methangas.

2 U17Q6

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes en forbedret fremgangsmåde af den ovenfor beskrevne art. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at der anvendes den hidtil ukendte mikroorganisme Methylococcus 999 med NCIB-accessionsnummer 11083. Denne mikroorganisme giver både som ren kultur og som blandingskultur gode udbytter i sammenligning med den kendte teknik.

Dyrkningen ifølge opfindelsen foretages fortrinsvis i nærværelse af a) én eller flere methanoludnyttende mikroorganismer, som er i stand til at metabolisere methanolet, som dannes af den voksende methan-udnyttende mikroorganisme, og b) én eller flere ikke-methylotrofe mikroorganismer, som er i stand til at metabolisere organiske forbindelser, som dannes af de methan- og/eller methanoludnyttende mikroorganismer.

Ifølge en foretrukken udførelsesform kan der i det flydende vækstmedium også være den methanudnyttende bakterie Methylomonas SM3 (NCIB-accessionsnummer 11084), som er beskrevet i hollandsk patentansøgning nr. 74 16644, til stede.

Egnede methanoludnyttende mikroorganismer, som kan anvendes ved den ovennævnte foretrukne udførelsesform for fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse omfatter stammer af Hyphomicrobium (f.eks. NCIB nr. 11040), Pseudomonas extorquens og Pseudomonas methylotropha (f.eks. NCIB nr. 10.508 - 10.515 og 10.592 -10.596) og især obligate methanoludnyttende mikroorganismer såsom stammen betegnet OML (NCIB nr. 11112), som er beskrevet i hollandsk patentansøgning nr. 74 16644 og dansk patentansøgning nr. 6745/74.

Eksempler på egnede ikke-methylotrope mikroorganismer, der kan anvendes til fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, omfatter stammer af Pseudomonas (f.eks. NCIB nr. 11019 og 11022), Acinetobacter (f.eks. NCIB nr. 11020), Curtobacterium (f.eks. NCIB nr. 11021), Nocardiaceae, Mycobacteriaceae og Achromobacteriaceae og især Mycobacterium (NCIB nr. 11061) og tre Pseudomonas-stammer (NCIB nr. 11062, 11063 og 11065), som er beskrevet i hollandsk patentansøgning nr. 74 16644 og dansk patentansøgning nr. 6745/74.

141706 3

Blandingskulturer, der kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, kan fås på følgende måder: a) Blandingskulturer indeholdende den methanudnyttende mikroorganisme sammen med én eller flere methanoludnyttende mikroorganismer og én eller flere ikke-methylotrofe mikroorganismer kan isoleres fra naturlige kilder. En særlig anvendelig blandingskultur, der kan anvendes til fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse (som i det følgende betegnes T4), indeholder Methylococcus 999 (NCIB nr. 11083), OML (NCIB nr. 11112), Mycobacterium (NCIB nr, 11061) og tre Pseudomonas-stammer (NCIB nr. 11062, 11063 og 11065).

b) Der kan også fås egnede blandingskulturer ved at kombinere Methylococcus NCIB nr. 11083 med én eller flere stammer af methanoludnyttende mikroorganismer og én eller flere stammer af ikke-methylotrofe mikroorganismer.

Stammen Methylococcus 999 (NCIB nr. 11083) er en hidtil ukendt mikroorganisme, der også vokser godt som en ren kultur i et flydende medium.

Denne hidtil ukendte stamme, Methylococcus 999, vokser også godt på methan i nærværelse af én eller flere ikke-methylotrofe mikroorganismer uden tilsætning af methanoludnyttende mikroorganismer.

Blandingskulturen T4, som er særlig foretrukken ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, blev isoleret fra en mudderprøve, som er taget fra en tropisk andefarm, 2 g mudderprøve anbringes i en 250 ml's rystekolbe indeholdende 25 ml 1-NSM-medium (beskrives nedenfor), og der tilføres to gange daglig en gasblanding bestående af 40 rumfan§sprocent methan, 50 rumfangsprocent ilt og 10 rumfangsprocent CC^. Kolben inkuberes i 1 uge ved 40°C i et roterende rysteapparatur med en orbital radius på 2,5 cm ved 200 omdrejninger pr. minut. Kulturen, i hvilken der er kommet uklarhed, dyrkes under anvendelse af 2 ml inokulum i tilsvarende rystekolber under aseptiske betingelser. Dette gentages flere gange, og når der er opnået god vækst, anvendes rystekolbekulturen til inokulering af en kontinuerlig kultur under de i eksesgpel 1 beskrevne betingel 141706 4 ser. Efter mere end 1000 timers kontinuerlig dyrkning er der udviklet en stabil blandingsbakteriekultur, i hvilken den overvejende organisme er en coccoid methanudnyttende bakterie. Karakteristika af blandingskulturen, som betegnes T4, er detaljeret beskrevet nedenfor.

Isoleringen af en ren kultur af den methanudnyttende mikroorganisme fra blandingen T4 viser sig at være umulig under anvendelse af konventionel agarpladeteknik, idet der på disse plader på denne måde kun dannes blandede kolonier. Da det viste sig, at væksten af den methanudnyttende organisme ved anvendelse af denne teknik er afhængig af tilstedeværelsen af heterotrofe (ikke methylotrofe) bakterier i blandingen, anvendes følgende tilpassede fremgangsmåde: 1 ml af blandingskulturen T4 (ca. 2 g/literj blandes med 40 ml af en steril smeltet opløsning (55°C) af 1% Bacto-Difco-agar i 2-ASM-medium (beskrives nedenfor), blandingen hældes i sterile Petri-skåle og lades henstå.

Oven på dette anbringes et andet lag agar, og oven på det andet lag anbringes et sterilt Millipore-membranfilter.

Der laves stregkulturer af prøver af blandingskulturen T4 på membranen. Efter 4 døgns inkubering ved 40°C observeres der kolonier.

Det viser sig, at disse er rene kolonier af den coccoide methanudnyttende bakterie Methylococcus 999 (NCIB nr. 11083).

Denne isolerede organisme vil ikke som en ren kultur vokse på agarplader, medmindre der anvendes et meget tungt inokulum, eller medmindre der anvendes den ovenfor beskrevne overlagsteknik. Bakterien vokser imidlertid godt som en ren kultur i flydende kultur. Kulturen T4 indeholder som nævnt den methanudnyttende stamme Methylococcus 999 (NCIB nr. 11083); den indeholder også én methanoludnytter (NCIB nr. 11112) og fire heterotrofe (NCIB nr. 11061, 11062, 11063 og 11065).

Den methanoludnyttende og de fire heterotrofe organismer er beskrevet i hollandsk patentansøgning nr. 74 16644 og dansk patentansøgning nr. 6745/74.

141706 5

Den methanudnyttende organisme viser sig på grundlag af følgende identifikation at være en hidtil ubeskrevet art af en Methylococcuss

Membrantype: "Il-stacked-membran" (beskrevet af Whittenbury et al,, Journal og General Microbiology (1970), (SI, 205) celleform: cocci cellediameter: ca. 0,9 nm vækst ved 37°C: + vækst ved 42°C: + vækst ved 55°C: + vækst på methanol: + forøgelse af vækst med: gærekstrakt: -malat: -acetat: -succinat: -bevægelighed: -dannelse af kapsel: + kolonifarve: hvid/brun vandopløseligt pigment: - gram-farve: gram-variablej gram-farven varierer afhængigt af cellernes vækstbetingelser. Celler, som er høstet fra en kontinuerlig kultur, der vokser på et nitratmedium, er grampositive, men celler, der er udvundet fra en kultur, som vokser på ammoniak, er gramnegative, catalase: + oxidase: -glucosesyre: - OF (Hugh Leifson): ingen reaktion oxidation af alkaner: + følsomhed over for antibiotika (+ betegner følsomhed, og - betegner ingen følsomhed):

Chloramphenicol 10^,ug: -Erythromycin lO^ug: -Sulfafurasol lOO^ug: +

Novobiocin 5^,ug: -Oleandomycin 5^ug: -Penicillin G 1,5 enheder: +

Streptomycin lO^ug: + 141706 6

Tetracyclin lO^ug: +

Cephaloridin 5^ug: -Kanamycin 5^,ug: +

Ampicillin 2^ug: +.

Fra disse karakteristika fremgår det, at organismen er en stamme af Methylococcus. Den er imidlertid forskellig fra en hvilken som helst tidligere beskrevet stamme af Methylococcus ved, at den vil vokse ved 55°C, og at den ikke danner kolonier på mineralsalteagarplader, medmindre der anvendes den ovenfor beskrevne teknik.

Det flydende vækstmedium, som anvendes ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, indeholder en nitrogenholdig forbindelse, som kan være ammoniak, urinstof, et ammoniumsalt såsom et sulfat, chlorid eller nitrat, f.eks, et alkalimetalnitrat. Forbindelsen er hensigtsmæssigt til stede i en koncentration på 3 - 50 g/liter.

Andre bestanddele, som kan være til stede i mediet, er phosphor, svovl, magnesium og jern. Phosphorkilden er fortrinsvis ét eller flere phosphater, f.eks. K2HP04, KH2P04, Na2HPC>4 eller (NH4)2HP04, eller phosphorsyre, som fortrinsvis er til stede i en koncentration på 3 - 20 g/liter. Svovlkilden kan være svovlsyre eller et sulfat såsom (NH4)2S04, som hensigtsmæssigt er til stede i en koncentration på 0,5 - 5,0 g/liter. De to metaller foreligger i form af et eller andet salt deraf, f.eks. MgS04,7H20 i en koncentration på 0,2 - 2,0 g/liter og FeCl3.6H20 i en koncentration på 0,01 - 0,1 g/liter.

Mediet kan også indeholde spormængder af andre grundstoffer i form af egnede salte, f.eks. calcium, magnesium, zink, cobalt, molybden og bor. Eksempler på egnede medier omfatter: 1-NSM med følgende sammensætning: g/liter_ KH2P04 1,6

Na2HP04 1,16

NaN03 1,18

MgS04.7H20 0,08

FeS04.7H20 0,014

Ca(N03)2.4H20 0,025

CuS04.5H20 4 x 10-3

ZnS04.7H20 3,4 x 10_4

MnS04.4H20 3 x 10"4

Na2Mo04.2H20 2,4 x 10-4 7 1A1706 2- ASM, som har den samme sammensætning som 1-NSM, idet det dog indeholder 1,18 g (NH^)2^0^ pr. liter i stedet for NaNO^· 3- USM, som har samme sammensætning som 1-NSM, idet det dog indeholder 2,0 g urinstof pr. liter i stedet for NaNO^.

5-C med følgende sammensætning: KH2P04 1,6

Na2HP04 1,16

NaN03 3,18

MgS04.7H20 0,107

FeS04.7H20 0,009

Ca(N03)2.4H20 0,06

CuS04.5H20 3 x 1θ”4

ZnS04.7H20 3,6 x 1θ“4

MnSO,.H-0 5 x 1θ“4 42 -4

Na2Mo04.2H20 3,1 x 10

CoCl2.6H20 1,5 x 10~4

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan udføres chargevis, halvkontinuerligt eller fortrinsvis ved kontinuerlig flow-dyrkning. Til opnåelse af vækst inokuleres mikroorganismerne i et flydende vækstmedium, som er i berøring med en gasblanding indeholdende methan og oxygen, Methan kan tilsættes i form af naturgas. Til kontinuerlig flow-dyrkning kan mikroorganismerne dyrkes i en hvilken som helst egnet fermentationsbeholder, der er udstyret på egnet måde, f.eks. en med prelplader forsynet fermentor, i hvilken der omrøres, eller en med spreder forsynet tårn-fermentor, der er forsynet med enten indre afkøling eller en ydre recirkulationskøleslange. Det friske medium pumpes kontinuerligt ind i kulturen med en hastighed, som svarer til 0,02 - 1,00 rumfang af kulturen pr. time, og kulturen fjernes med en sådan hastighed, at kulturens rumfang holdes konstant. En gasblanding indeholdende methan og oxygen og eventuelt carbondioxid eller andre gasser bringes i berøring med mediet, fortrinsvis ved kontinuerligt at boble denne gennem en spreder i bunden af beholderen. Kulturens oxygenkilde kan være luft, oxygen eller oxygenberiget luft. Forbrugt gas fjernes fra beholderens top. Forbrugt gas kan recirkuleres enten gennem en ydre "sløjfe" eller internt ved hjælp af en "gasinducer 141706 8 impeller”. Gassens strømning og recirkulation skal udføres således, at der opnås maksimal vækst af organismen og maksimal udnyttelse af methan.

Kulturens temperatur holdes sædvanligvis mellem 30 og 60°C, fortrinsvis mellem 38 og 50°C. Kulturens pH-værdi holdes på mellem 6,0 og 8,0, fortrinsvis mellem 6,0 og 7,0, ved passende tilsætning af et alkali, f.eks. NaOH, KOH eller NH^OH, og/eller en syre, f.eks. I^SO^ eller EL^PO^.

Mikroorganismecelleme kan høstes fra vækstmediet under anvendelse af en hvilken som helst sædvanlig anvendt standardfremgangsmåde, f.eks. flokkulation, sedimentation og/eller udfældning, efterfulgt af centrifugering og/eller filtrering. Biomassen tørres derefter, f.eks. ved fryse- eller spraytørring.

Nærværende patent omfatter ikke fremgangsmådens anvendelse ved tilvirkning af næringsmidler.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved de følgende eksempler:

Eksempel 1.

Kontinuerlige kulturer af både blandingskulturen T4 og en ren kultur af Methylococcus 999 dyrkes under aseptiske betingelser i en fermentor med et arbejdsrumfang på 2,5 liter (Biotec-Fermenter, LKB Co., Ltd.), i hvilken der omrøres. Methan/luftblandinger (rumfangsforhold 2:1) bobles gennem væsken i fermentorerne med en hastighed på 900 - 1200 ml/minut. Kulturens temperatur holdes på 42°C, og pH-værdien holdes på 6,8 ved automatisk tilsætning af en blanding af 0,5N natriumhydroxidopløsning og 0,5N kaliumhydroxidopløsning. Kultu- 9 141706 ren omrøres ved en hastighed på 1200 omdrejninger pr, minut. Der føres kontinuerligt frisk medium til kulturen ved hjælp af en perΙέ taltisk pumpe, og kulturen pumpes ud med den samme hastighed til opretholdelse af et konstant rumfang i beholderen. Mediets sammensætning er følgende:

Bestanddel Koncentration (millimol) (nh4)2so4 11,0 h3po4 10,0

MgS04 0,4

CaCl2 0,1

FeSO. 33 x 1θ“3 4 -3

ZnSO, 1,0 x 10 J

4 -3

MnS04 1,0 x 10 H3B03 1,0 x 1Q~3

CuS04 0,5 x 10“3

Na2Mo04 0,2 x 10~3

CoCl2 0,2 x 10"3

Kl 0,5 x 10“3 h2so4 1,0 x 1θ“3,

Fermentorerne fyldes først med 2 liter medium, der omrøres og gennemluftes, og der tilføres methan og luft som beskrevet ovenfor. Hver fermentor inokuleres med 100 ml fuldt udvokset ryste-kolbekultur, den ene med blandingen T4 og den anden med ren kultur Methylococcus 999, Mediet føres til fermentorerne med en fortyh-dingshastighed, som begynder på 0,10 time \ og som trinvis forøges til omtrentligt 0,02 - 0,03 time-^, indtil kulturen begynder at blive vasket ud af beholderen. Der holdes ligevægte ved hver fortyndingshastighed i mindst 48 timer. Resultaterne er angivet i tabel I.

Tabel I

Kultur Opnået maksimal Tørvægtkoncentra- Udbyttekoeffi- fortyndingshas- tion g x liter-1) cient (g tør- tighed (time-1) vægt/g anvendt _______ch4) T4 0,34 2,42 0,71

Methylococcus 999 0,31 2,14 0,66 141706 ίο

Eksempel 2.

Chargevise kulturer af organismen Methylococcus 999 alene og af denne organisme i blanding med en ureasepositiv bacillus, som ikke er i stand til at vokse på methan, men som er i stand til at vokse på stoffer, som er dannet af organismen Methylococcus 999, dyrkes ved 42°C i et simpelt saltmedium, som findes i sterile glasbeholdere med en kapacitet på.500 ml, gennem hvilke der kontinuerligt bobles methan, luft og CO^ med hastigheder på henholdsvis 25, 100 og 10 ml pr. minut gennem et sintersolglasfilter.

Kolberne inokuleres med 1,5 ml frisk inokulum. Mediet i beholderne er 300 ml 3-USM. Væksten vurderes ved måling af den optiske tæthed (OD) ved 625 nm. Resultaterne fremgår af tabel II.

Den ureasepositive bacillus karakteriseres på følgende måde:

Gram-farve +, stavformet, ikke-bevægelig, vækst i luft +, catalase +, oxidase -, glucosesyre (gas) +, OF (Hugh & Leifson) +, urease +, ingen denitrificering.

Tabel II

Vækst på Methylococcus 999 og blandingskultur (OD ved 625 nm)__ (gennemsnit af tre dyrkninger)

Kultur \t timer . 24 96 120

Methylococcus 999 alene 0,005 0,005 0,029 0,054

Methylococcus 999 bian- 0,005 0,229 . 0,490 0,550 det med ureasepositiv bacillus

Det fremgår af disse resultater, at organismen Methylococcus 999 kun vokser godt på urinstof, hvis der også er- en ureasepositiv organisme til stede.

Eksempel 3,

Blandingskulturen T4 dyrkes med forskellige nitrogenkilder under forskellige betingelser.

Kulturerne dyrkes i 2,5 liters beholdere, i hvilke der omrøres, 141706 11 på analog måde som beskrevet 1 eksempel 1. Selv om der til disse eksperimenter ikke blev opretholdt fuldstændig aseptiske betingelser, ændrede kulturens mikrobiologiske karakteristika sig ikke.

Dyrkningsbetingelserne var: temperatur 42°C, pH-værdi 7,0, fortyndingshastighed 0,18 time""1, omrøringshastighed 1000 omdrejninger pr. minut, og total gasstrømningshastighed 600 ml/minut. Udbyttekoefficienterne blev beregnet på grundlag af analyse af gasstrømmen ind i og ud fra fermentoren ved hjælp af gaschromatografi og fra omhyggelige bestemmelser af gasstrømningshastigheder vinder anvendelse af et boble-flow-meter, Organismens tørvægtkoncentration, der var mellem 4 og 5 g/liter, blev bestemt ved måling af differencen i car-bonkoncentrationen mellem en kulturprøve og kultursupernatanten efter centrifugering af en prøve ved 6000 G i 15 minutter. Carbonind-holdet af ovntørrede celler viste sig at være konstant ved 48 C.

Det anvendte medium indeholdt (g/liter 1) KEUjPO^; 1,60, Na2HP04: 1,16, MyS04.7H20j 0,080, FeSO4.7H20: 0,014, Ca(N03)24H20: 0,025, 2.4 x ΙΟ-3, ZnS04,7H,0: 3,4 x 10_4, MnS0.,4H„0: 3,0 x 10"6, NaMoO..2H-0: -4 7 Z -4 4 4 4 4 2.4 x 10 , CoCl ,6H20: 1,5 x 10 , koncentreret svovlsyre (36 N) tilsættes med 0,33 ml pr, liter. Som nitrogenkilde tilsættes NaN03 (3,18 g/liter), (NH4)2S04 (2,46 g/liter) eller urinstof (1,122 g/liter).

Resultaterne fremgår af tabel III,

Tabel III

Virkning af nitrogenkilde og begrænsende faktorer på kontinuerlige kulturer af blandingen T4.

Nitrogenkilde NaNO^ (NB4)2S04 Urinstof

Luft/methanforhold i den tilførte gas 3:1 6:1 3:1 6:1 3:1 Vækstbegrænsende faktor 02 CH4 02 CH4 02

Udbyttekoefficient (g celler/g CH4) 0,65 0,63 0,69 0,83 0,76 ±0,03 - 0,03 ± 0,04 - 0,02 ±0,05

Eksempel 4.

Kulturen lades vokse i 7 liters fermentorer (Chemap Co., Ltd., Zurich, 12 U1706

Schweiz), i hvilke der omrøres, Temperaturen holdes på 42°C, og pH-værdien på 7,4 ved automatisk tilsætning af en 5N opløsning af en KOH/NaOH-blanding (1:1) eller 5N H2S04 afhængigt af forholdene.

En blanding af oxygen og methan ledes gennem fermentoren med 2 liter/ minut. Der omrøres i fermentoren med en hastighed på 1500 omdrejninger pr. minut. Rumfanget i fermentorbeholderen holdes på 4,4 liter ved hjælp af en overstrømningskanal, gennem hvilken der kontinuerligt pumpes kultur ud. Der føres medium til kulturen i 2 strømme, nemlig 1) en opløsning af NH^SO^ (150 mM), H3PO4 (45 mM), MgS04 (4,5 mM), CaCl2 (1,5 mM), FeS04 (0,6 mM) og 26,4 ml af en opløsning indeholdende (g/liter) ZnSC>4.7H20: 0,18, CuS04.5H20: 0,16, MnS04.4H20: 0,15, CoC13.6H20: 0,18, 0,1 og NaMo04,2H20: 0,3, og 2) deioniseret vand. Disse pumpes kontinuerligt ind i kulturen, således at den totale strømningshastighed altid svarer til en dyrkningsfortyndingshastighed på 0,09 time De relative strømningshastigheder af saltog vandtilførslen varieres. Da gastilledningen var mere end tilstrækkelig, var dyrkningskoncentrationen begrænset af koncentrationen af nitrogenkilde i den totale mængde tilført medium. Der sker således ved forøgelse af tilførselshastigheden for saltopløsningen i forhold til vandtilførslen en forøgelse af organismekoncentrationen i kulturen.

Idet der begyndes med en organismetørvægtkoncentration på 4,2 g/liter, forøges strømningshastigheden af saltopløsningen, indtil der blev opnået en organismetørvægtkoncentration på 23 g/liter, og ligevægten blev opretholdt på dette niveau.

Eksempel 5.

Kulturer af organismen Methylococcus 999 og blandingen T4 dyrkes i kontinuerlige kulturer på analog måde som beskrevet i eksempel 1 på medium 5-C med en fortyndingshastighed på 0,08 time ^. Cellerne høstes fra kulturen, som pumpes ud af fermentationsbeholderen, centrifugeres og frysetørres. Proteinindholdet (beregnet som N x 6,25) af begge var 69¾. Aminosyreanalyser af celler fra de to kulturer er angivet i tabel IV,

Claims (2)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af mikroorganismecellemasse, hvor en mikroorganisme af slægten Methylococcus dyrkes under aerobe betingelser i et flydende vækstmedium indeholdende assimilerbare nitrogenkilder og essentielle mineralsalte i nærværelse af methan-gas, og mikroorganismerne udvindes fra det flydende vækstmedinm, kendetegnet ved, at der anvendes mikroorganismen Methylococcus 999 med NCIB-accessionsnummer 11083.

2· Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mikroorganismen Methylococcus 999