DK141835B - Fremgangsmaade til fremstilling af et praeparat til anvendelse ved behandling af interferonfoelsomme infektionssygdomme - Google Patents

Description

(¾

Vgay (11) FREHLÆ66 ELSESSKRIFT 1835 DANMARK ,ntc'3 * ·’ k„379/085 (21) Ansøgning nr. 3477/75 (22) Indleveret den 51 · jul. 1975 (23) Ubedag 31. jul. 1975 (44) Ansøgningen fremlagt og .fremleeggelsesskriftet offentliggjort den 50· JUH. 1 98Ο

DIREKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) Prioritet begwret fra den

1. aug. 1974, 2437166, DE

(71) HELMUT STICKL, Starens«eg 6, D-8033 Rrailling b. Muenchen, DE.

(72) Opfinder: Sanne.

(74) Fukimeegtig under sagens behandHng:

Kontor for Industriel Eneret v. Svend Schørming.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af et præparat til anvendelse ved be= handling af interferonfølsorame infektionssygdomme.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et præparat til human- og veterinærmedicinsk anvendelse ved behandling af interferonfølsorame infektionssygdomme.

I infektionsmedicinen forekommer der nu om stunder i stigende grad sygdomme, hvis fremkaldere findes overalt, persisterer hos klinisk sunde individer og ved forsøg ikke gør sunde individer syge. Det drejer sig herved i det væsentlige om blandingsinfektioner, kroniske og persisterende infektioner, visse lokalinfektionssygdomme og infektiøse tumorer.

2 141835

En specifik profylakse eller terapi mod disse sygdomme er vanskelig og ofte umulig. En ny, meget virksom bekæmpelsesmetode er interferonisering.

Ved interferonisering forstår man medikamentel frembringelse af en hurtig infektionsbeskyttelse ved hjælp af interferon. Derved må man skelne mellem 1) passiv interferonisering (indgift af eksogent interferon) og 2) aktiv interferonisering (medikamentel induktion af aktiv dannelse af endogent interferon).

Det er bekendt at man medikamentelt kan inducere interferondannelse hos mennesker og hos pattedyr. Til induktionen kan m^n anvende kemiske eller såkaldte biologiske induktorer.

De for tiden bedst kendte biologiske interferon-induktorer er bakterielle endotoksiner samt visse virusstammer som fx svækket virus af den infektiøse bovine rhinotrakeitis og den infektiø-se pustuløse vulvovaginitis. Det drejer sig om et dyrisk herpesvirus som er homologt for pattedyr og har et bredt værtsspektrum. Trods svækkelsen er det farligt fordi det som regel er latent sygdomsfremkaldende og dyret vedvarende kimbærende, og .de behandlede dyr bliver varige udskillere af viruset. Efter tilførslen kan dette virus formere sig i den dyriske vært.

Som virale interferon-induktorer har der hidtil stedse været anvendt virusstammer der har kunnet formere sig i pattedyrs celler af bestemte arter, og hvis uskadelighed enten er sikret i kraft af naturlig avirulens, i kraft af kunstig svækkelse eller ved passende inaktivering.

Det har hidtil ikke været kendt at man hos mennesker og pattedyr kan inducere interferon ved hjælp af animalske vira, som ikke kan formere sig i menneskets eller andre pattedyrs organisme (heterologe vira).

Det har nu vist sig at talrige infektioner hos mennesker og dyr, fx generaliseret herpes, herpes zoster, infektioner med influenza-vira, vaccinia-virus, papowa-vira og Condyloma acuminatum-virus med held kan behandles med et præparat der indeholder en 3 141835 særlig stamme af et ved talrige cellekulturpassager svækket hønsekoppevirus. Dette hønsekoppevirus er hverken patogent for dyr eller for mennesker.

På basis af denne iagttagelse er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendommelig ved det i krav l*s kendetegnende del angivne. Det afgørende trask ved tilvejebringelse af det virksomme princip i præparatet er at hønsekoppeviruset attenueres ved 420-800 cellekulturpassager med eller uden klonisering.

Fra Gerbermann et al., Zbl. Vet. Med. B. 20 (1973), 685-695, er det kendt at immunisere endageskyllinger ved oral eller parenteral indgift af et svækket hønsekoppevirus (HP-1) fra 194.-403. cellekulturpassage på hønsefosterfibroblaster.

Virkningen er således immuniserende, og det kendte svækkede hønsekoppevirus er ikke interferoninducerende og stimulerer således ikke organismens eget beredskab mod infektioner. Det gør det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede præparat, netop ved at stimulere organismens interferonproduktion, mens det ikke længer virker immuniserende, først og fremmest på grund af det større antal cellekulturpassager.

Fra Munz et al., Zbl. Vet. Med. B, 21 (1974), 442-454, er det kendt at immunisere kanariefugle ved ikke-parenteral indgift af et ved cellekulturpassager svækket kanariekoppé-virus (KP 1 Att.); antallet af cellekulturpassager varierer med indgiftmetoden og er så højt som mindst 540 ved intramus-kulær indgift. Sammenligning med antallet af cellekulturpassager ved den foreliggende fremgangsmåde er i øvrigt intetsigende, da det drejer sig om et andet virus. Der foreligger intet 4 om at det omhandlede svækkede kanariekqppevirus inducerer interferondannelse; det immuniserer, hvad det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede præparat som nævnt ikke gør. Det kan i øvrigt nævnes at det nævnte svækkede kanariekoppevirus kan formere sig på kanin- og hamsternyreceller, hvorimod det svækkede virus, hvoraf et interferonstimulerende præparat fremstilles i henhold til den foreliggende fremgangsmåde er tilpasset selektivt til formering på fuglefibroblastceller.

Det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede præparat har ikke blot virkning mod sådanne infektioner hos mennesker og dyr som de foran nævnte, herpes, herpes zoster, 14T835 4 influenza, vaccinia, papowavirus og Condyloma acuminatum, men også anvendelsesmuligheder i veterinærmedicinen mod infek-tiøst betinget dødelighed hos nyfødte dyr, infektionssygdomme ved begyndelsen af opfedning af kalve og smågrise, infektiøse faktorsygdomme og blandingsinfektioner, kroniske sygdomme, virale tumorer, lokale virussygdomme i urogenitalkanalen, i åndedrætsvejene og fordøjelseskanalen og i huden.

De foran nævnte virkninger må først og fremmest føres tilbage til en aktiv interferonisering. Derudover kan der konstateres en generel forhøjelse af infektionsforsvaret, der beror på andre faktorer såsom stigning i fagocytose-raten.

Hønsekoppe—viruset er et kvadervirus på 190 til 260 my .

Det er komplekst opbygget af et ydre hylster, to laterallegemer, et overfladeprotein og et inderlegeme der indeholder dob-belts trenget desoxyribonukleinsyre. De store kvadervira af koppevirusgruppen hører til de differentierende vira, der med hensyn til størrelse og struktur står på grænsen til bakterierne. Det drejer sig dog stadig om et typisk virus, som udelukkende formerer sig i homologe levende celler. Særligt egnede næringsmedier er ifølge opfindelsen fibroblastceller vundet fra fuglefostre eller fra chorioallantoismembranen (CAM) fra embryoneredehønseæg; heri formerer viruset sig effektivt. X praksis kan fibroblastrene udvindes af embryonerede hønseæg ved trypsinisering og udstryges i et celleantal på 500.000 til 800.000 pr. ml på en glasflade. Dyrkningsmediet består af 80% Earles opløsning, 10% oksefosterserum og 10% laktalbumin. Efter 24 timers inkubering af cellerne med dette medium har der som regel dannet sig en tæt, flerlaget cellemasse. Derefter fjernes vækstmediet og erstattes med filtreret okse-amniumvæske. Viruset indpodes i cellekulturkoIben og der sker yderligere inkubering i 3 til 4 døgn. Alt efter udviklingen af den cytopatiske effekt sker virushøsten mellem 3. og 5. dag.

Der eksisterer følgende forskelle mellem det oprindelige hønsekoppevirus som det forekommer i naturen, og det ved multiple cellekulturpassager svækkede hønsekoppevirus, dvs et sådant der har mistet sin virulens: 141835 5 :/

Ingen sygdomsfremkaldende egenskaber for fjerkræ og andre fugle, specielt ikke for daggamle kyllinger (oralt, intramuskulært), ingen bestemt organotropi ved bestemt massivpodning i modtagelige organismer. Kraftig og hurtig formering i cellekulturer, lytiske plaquer, kraftig interferonproduktion i fugle- og pattedyrorganismer, stigning af fagocy-tose-rater og forøgelse af mængden af komplement. Dette virus er ikke længer immunogent for den naturlige vært; det inducerer imidlertid stadig interferon. Grovmorfologisk er det ikke muligt ved elektronmikroskopiske undersøgelser at fastslå nogen forskelle mellem det svækkede og det oprindelige avipox-virus.

Serologisk og immunbiologisk har de i cellekulturer svækkede virus ikke forandret sig.

Med den radiale immunodiffusionsmetode ifølge Mancini (Mancini et al., "A single-radial -diffusion method for the immunological quantitation of proteins", Prot. Biol.-Fluids 11th Colloq., Bruges, s. 370 ff, ed. Peeters; W. Becker, "Bestimmung von Antiseratitern rait Hilfe der einfachen Immundiffusion", Immunochemistry 6, 539, 1969) har de svækkede vira 3 præcipitationsbånd færre end de oprindelige. Det drejer sig herved om et bånd fra lipoproteidfraktionen og sandsynligvis om 2 ikke nærmere definerede bånd fra virusets proteidfraktion. Koppeviruserne sedimenterer i saltmedium allerede ved 13.000 til 14.ΟΟΟ g i løbet af 20 min. I sakkarose-gradienter ved 35%s sakkarose-pufferopløsning sker der en koncentrering ved skillelaget. Denne metode benyttes til rensning af viruserne.

. Ved den orale optagelse af det svækkede hønsekoppevirus behøves der ikke nogen meget kraftig rensning for fremmedprote-iner, blot det sikres at der ikke er nogen patogene fremmed-vira til stede i præparatet.

Det svækkede hønsekoppevirus er forholdsvis miljøresistent.

Det er holdbart i vand ved en pH-værdi på 7,2 til 7,8. I frysetørret tilstand er det næsten ubegrænset holdbart. En yderligere forbedring af holdbarheden kan derudover opnås ved tilsætning af albuminpepton eller dekstran. Desinfektion og inaktivering af viruset kan ske ved hjælp af lipofile opløsningsmidler samt detergenter (acetone, kloroform, alkohol, benzen; men ikke æter).

6 141835

Udgangspunktet for omdannelsen til det nye virus er hønsekoppevirus. Det nye virus kan i praksis hensigtsmæssigt opnås på følgende måde:

Et hønsekoppevirus anbringes på cellekulturer af hønsefibroblastceller. De tætvoksede cellemasser inficeres med disse vira og ødelægges i løbet af 3 til 5 dage. Når cellelinierne er ødelagte til over 50% og de resterende celler lader den af viruset fremkaldte cytopatogene effekt erkende, høstes mediet med de tilbageværende celler.En yderligere oplukning af cellerne sker ved frysning og optøning og påfølgende behandling med ultralyd. Høsten af disse celler sker efter 72 eller 96 timer, dvs. efter tilfredsstillende dannelse af primærudbyttet og indtruffet generalisering over hele membranen.

Fra virushøsten bortkastes de grove, efter ultralydbehandling tiloversblevne cellebestanddele efter sedimentering ved forholdsvis svag centrifugeringssedimentering ved 120 -600 g; den ovenstående væske anvendes til udvinding af viruset. Udvindingen af viruset kan ske ved centrifugering med høj hastighed (30.000 g) i løbet af 30 min i kulden ved udfældning eller ved.frysetørring. I sidstnævnte tilfælde er alle salte og æggehvidestofbestanddele endnu tilbage i cellemediet.

Efter udvinding af sedimentet optages det avipoxvirus-holdige sediment i en tiendedel af udgangsopløsningen i pufret kogsaltopløsning; der tilsættes pepton eller 4%s oksealbumin til stabilisering. Derefter frysetørring. Det tørre pulver, der enten som opløsningsformidler og konserveringsmiddel foruden viruset også indeholder pepton, dekstran eller albumin, bestemmes med hensyn til virusindholdet og anvendes til presning af tabletter.

Svækkelsen ved dyrkning af viruset i et antal cellekulturpassager kan generelt gennemføres på følgende måde:

Med indbyrdes mellemrum på 4 til 6 døgn overføres fra den ene kolbe til den næste kolbe l/20 til 1/40 af det virus-holdige medium, idet der i den kolbe, hvortil overførselen sker, er sket vækst af en hønsefibroblast-cellekultur. Efter 7 141835 hver tredie cellekulturpassage foretages identitetsundersøgelse af virus serologisk og biologisk (identity-test). Ligeledes sker der en yderligere identitetspåvisning på grundlag af forhåndenværende markører (plaque-størrelse, elektronoptisk kontrol af kvadervira m.m.). Hvis identitetspåvisningen er lykkedes så sker der en yderligere opformering af det afpodede virus i den næste, med celler tilvoksede kolbe. Allerede efter 190 passager kan der iagttages en tydelig nedgang i virusets virulens og patogenitet ved infektion af Cortison-kyllinger eller ved podning af daggamle kyllinger (intravenøst). Fra den 420. passage er dette virus hverken patogent for mennesker eller for fugle og kan anvendes til oparbejdning til det omhandlede præparat. Anvendelse cif viruset kan fx ske efter yderligere 30 cellekulturpassager og evt. klonisering over 3 plaque-slutfortyndingspassager. Mellen den 420. og den 800. cellekulturpassage er viruset stabilt og har identiske egenskaber og kan derfor i dette område og derudover anvendes til fremstilling af præparatet (Consistency-test).

En yderligere metode til virusdyrkningen til at holde svækkede stammer konstant frembyder sig ved overførelse til embryoneret hønseæg: Luftkammeret oppustes og æghuden (chorioal-lantois-menbranen) på hønseæggets side sænkes. På dette stedindpodes 0,2 ml af det virusholdige materiale. Efter 4 dage opsamles æghuden, den vaskes i antibiotikumholdig kogsaltopløsning og nedfryses i dybfryser ved en temperatur mellem -40 og -80°C. Viruset holder sig stabilt i denne æghudkultur.

Derved bliver det muligt at gribe tilbage til "frisk" materiale fra tidligere cellekulturpassager på tidspunktet for produktionen. Til fremstilling af det omhandlede præparat anvendes der ikke antibiotika på noget trin af produktionen. Der anvendes hertil kun æg fra leukosefri og sundhedsmægsigt overvågede hønsebestande.

Præparatet kan anvendes lokalt, systemisk, oralt, nasalt, intrakutant og intramuskulært. Den subkutane og intra-muskulære anvendelse er mindre effektiv; der sker dog også herved en påviselig interferonisering.

Ved nogle konkrete fremstillinger i henhold til opfindelsen var den virksomme andel af såvel faste som flydende 14Y835 8 præparater det svækkede hønsekoppevirus fra 432. til 800. passage. Den 429. cellekulturpassage blev renset ved 3 ganges klonisering (432. passage); det var udsædsviruset for produktionen og udgangsviruset for alle senere virus-cellepassa-ger. Dette udgangsvirus blev deponeret under deponeringsbetegnelsen "Mayr-S tickl-Avipox-Interferon-Inducer" hos Landes-impfanstalt Nordrhein-Westfalen, Abteilung Viruszuchtung und -prufung, og kan rekvireres i denne form til identifikation ved sammenligning. Denne stamme: er frigivet til udlevering til offentligheden. Stabiliteten og identiteten af viruset i de yderligere passager er påvist. Vira efter et stort antal cellekulturpassager er som regel miljølabile, men specielt denne svækkede virusstamme har i betydelig grad bibeholdt sin miljøstabilitet.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal i det følgende belyses nærmere ved nogle udf ørelseseksempler.

Eksempel 1

Ved dekantering fraskilles den fracentrifugerede ovenstående væske i cellekulturen fra et sediment indeholdende hønsekoppevirus som angivet foran, efter 438. cellekulturpassage. Sedimentet opsamles og frysetørres under tilsætning og pepton og skummetmælk. Skummetmælken tjener herved samtidig som pressemateriale til fremstilling af tabletter, der yderligere kan styrkes ved tilsætning af syntetiske polysakkarider, mikrokrystallinsk cellulose, mælkesukker, silikater, talkum, gær eller urinstof. Tilsætning af urinstof giver tabletter med større hårdhed og tillader bedre persorption af viruset. En betingelse for holdbarhed af viruset er en pH-værdi før frysetørring på 7,4· Da skummetmælk har sur pH-værdi er en omhyggelig indstilling af pH-værdien nødvendig.

Som stabilisator har en apatogen gærart, Saccharomyces boulardii, vist sig velegnet. Adsorptionen af avipox-viruset til denne gærart forøger præparatets virksomhed og dets holdbarhed. De på denne måde vundne tabletter indeholder ingen stærkt findelt kiselsyre eller silikater, da viruset skal frigives så godt som muligt i mundslimhinden.

9 141835

En tablet har fx følgende kvantitative sammensætning.

12 mg virus med 2 x 10^ VE (virusenheder) og pepton 68 mg Saccferonyces-Polysaccharider 8 mg salte fra næringsmediet 100 mg talkum ca. 400 mg skumme tmælkepulver ca. 588 mg = store, flade tabletter, forholdsvis bløde og hydro-skopiske

Eksempel 2

Til fremstilling af et flydende præparat, fx i form af et sprøjtepræparat til nasal indgift, opbevares samme virus som i eksempel 1 og efter samme antal cellekulturpassager, i en mængde på 2 til 6 x 10 virusenheder/ml i Ringer-opløsning med 2% glycerol (pH-værdi 7,2) og opbevares i kulden. Den flydende opløsning indeholder til kontrol af pH-værdien en farveindikator, fx fenolrødt. Man anvender Ringer-opløsning så at den af osmotiske gradienter betingede brændende fornemmelse i næseslimhinderne undgås? glyceroltilsætningen tjener til stabilisering af præparatet samt bedre vedhæftningsmulig-hed for det virksomme stof.

De pressede tabletter opbevares efter frysetørring og tørring i en inertgas ved +4°C. Det i Ringer-glycerolopløsning tilstedeværende virus kan ligeledes opbevares ved +4°C; før anvendelsen gennemblandes denne opløsning påny omhyggeligt. Umiddelbart før anvendelsen sker der indfyldning i små plastsprøj teflasker. Der er intet til hinder for yderligere tilsætning af andre terapeutiske stoffer såsom egnede æteriske olier eller antibiotika. Ved industriel fremstilling kan der anvendes tilsætning af glycerin i en mængde på 2 til 20¾ til konservering samt en blanding af neomycin og bacitracin som eksempel på egnet antibiotikumtilsætning, eller andre konserverende og anti-bakterieit virksomme stoffer. Herved muliggøres samtidig hæmning af banale smitstoffer, dvs sådanne smitstoffer som går til an- 10 141835 greb ved, beskadigelse af slimhinderne, eller som formerer sig efter en virusbetinget sygdom og deraf følgende svækkelse hos mennesket, idet de iøvrigt er til stede i daglige omgivelser og ved svækkelsen bliver i stand til at invadere patienten og derved på sin side atter kan føre til sygdomsfænomener (virus— på huden, bakterie-synergisme). Eksempler herpå er streptokokker/ Bacterium coli, de allestedsnærværende stafylokokker, Pseudomonas pyocyanea og Klebsiella-arter.

Til humanmedicinsk anvendelse skal koncentrationen være sådan at der pr. tablet er mindst 10 cellekulturfor-meringsdygtige enheder til stede. Som regel er 2 til 5 x 10^ VE (plaques forming units/ml virussuspension) pr. tablet tilstrækkeligt. Den samlede dosering ved en behandling, der 8 10 strækker sig over 2 dage, er mindst 10 VE til højst 10 VE. Højestedoser er uden videre mulige. Dosis retter sig efter indikationen. Den er højst ved Herpes genitalis og ved behandling af Condylomata acuminata og kan holdes lav ved behandling af Herpes simplex labialis. Antallet af tabletter sker under henvisning til disse doseringsanvisninger.

Der indgives 10-20 tabletter Λ 0,4 g ifølge eksempel 1, 1 til 3 gange hos patienter med en indbyrdes afstand på 6 til 12 timer. Ved Herpes zoster må dosis forhøjes til det dobbelte, ligeledes ved Herpes genitalis. Præparatet er selv ved en hundrede gange stor dosis atoksisk, avirulent og apatogent. Ved·Herpes zoster kan det være nødvendigt udover en dosisforhøjelse at give blandingen flere gange. Man må herved holde sig for øje at der ved induceret interferon kan indtræde interferon-tolerance.

Udover de med henblik på de videnskabelige undersøgelser gennemførte dyreforsøg frembyder der sig følgende praktiske anvendelsesområder: nyfødte føl kan ved hjælp af præparatet beskyttes effektivt mod hesteinfluenza; nyfødte grise der endnu er ømfindlige for en række virusinfektioner hos mennesker og dyr, kan beskyttes mod virusbetingede staldepidemier. De udmærker sig også ved stærkere vægttilvækst og bedre trivsel end sammenligningsgrupperne. Naturlige forhold forekom hår kyllinger fik det ved fremgangsmåden ifølge opfin- 11 141835 delsen fremstillede viruspræparat i drikkevandet. Forholdet mellem tab og trivsel udviklede sig gunstigere for avleren.,

En særlig fordel ved anvendelse af det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede præparat ved veterinærmedicinsk anvendelse består i at det i modsætning til de hyppigt til dette formål anvendte antibiotika fuldstændigt nedbrydes i den dyriske organisme.

Ved dyreforsøg har det også vist sig at man kunne bekæmpe Columbis SK-infektionen. Endog dødeligheden hos mus efter monocytogen infektion med Listeria gik ned til det halve ved interferonisering og parallel phagocytose-stigning.

En undersøgelse af den interferoninducerende virkning af den nye virusstamme hos hunde gennemførtes som følger:

Gruppe Antal Behandling hunde 1 3 Intraperitoneal injektion med 5 ml hønsekoppe-suspension* 2 3 Nasal indgift af 1 ml hønsekoppe- suspension* i 3 på hinanden følgende dage 3 2 Intraperitoneal injektion med 5 ml fysiologisk kogsaltopløsning y· *7 .

Avipox-suspensionen indeholdt 10 TClD50/ml (Tissue Culture Infective Dose, som bevirker infektion i 50% cif tilfældene).

Før og efter behandlingen blev der fra alle hundene taget en blodprøve til bestemmelse af interferonindholdet i deres serum. Interferonet koncentreredes ikke før bestemmelsen. Interferonindholdet bestemtes efter slutpunktsmetoden, ved hvilken man som virus anvender canine herpes virus og som selve system anvender primære hundenyrecellekulturer.

De opnåede resultater fremgår af nedenstående tabel.

12 141835

Antal dage efter Interferontiter3* i serum behandlingen Gruppe χ Gruppe 2 Gruppe 3 0 - 2 16 16 3 16 16 6 80 16 7 16 32 - 8 16 32 9 16 140 10 32 250 * Reciprok titer pr. ml.

Disse resultater visér at det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede præparat ved intraperitoneal indgift bevirker en hurtig og kraftig stigning af interferontiteren. mens der efter nasal indgift kan konstateres, en langsommere stigende, men til slut væsentlig højere titer.

.1 det følgende beskrives indgiften af det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede præparat og de herved opnåede resultater med hensyn til herpes-udslet (efflorescenser), da resultatet af behandlingen her kan aflæses visuelt på huden.

13 141835 1. tilfælde

Patient A, mand, 25 år, Herpes genitalis med lokalisation på glans-penis såvel som penisskaft. Exacerbation af symptomerne ca. 8 dage før behandlingsbegyndelse. I gennemsnit 8-ugers manifestation, ufuldstændig heling, permanent irritationssyndrom, eftersmerter efter heling. Ved fornyet exacerbation væsentligt lokalt besvær og opsvulmning af glans.

Der blev 3 gange indgivet 20 thbletter ifølge eksempel 1 og med en tidsafstand på 6 timer i patientens fastende tilstand, nemlig en halv time før spisetid. Tabletterne blev tygget grundigt i munden. Patienten var allerede efter 4 timers forløb fri for besværet. Begyndelse af indtørring af efflorescenserne efter 24 til 48 timer. Endnu en kur med den samme dosis på 3. dag efter behandlingens begyndelse, og påny behandling på 5. dag: fuldstændig forsvinden af symptomerne og heling af slimhinden.

2. tilfælde

Kvindelig patient B, recidiverende Herpes corneae allerede behandlet flere gange ved abration, øjet løber i vand væsentlig smerte i corneae.

Behandling skete med to gange 20 tabletter ifølge eksempel 1, hvorved den 1. indgift skete om middagen, og den 2. indgift kl. 18. Allerede 2 timer efter 2. indgift kunne der erkendes aftagen af symptomerne. Efter 48 timer var efflorescenserne fuldstændig helet; symptomfrihed.

3. tilfælde

Kvindelig patient C, 30 år, recidiverende herpes på overlæben periodevis store besværligheder, kraftige symptomer. Varighed ca. 10-14 dage.

Der skete indgift af to gange 20 tabletter ifølge eksempel 1. Efter 48 timers indtørring af efflorescenserne og 161835 14 smertefrihed. Efter 4 dage heling. Den 4 uger senere forekommende recidivering var væsentligt svagere og behandledes på samme måde. Patienten har nu i 4 måneder været uden tilbagefald og uden symptomer.

4. tilfælde

Kvindelig patient D, 5 år gammel pige, Herpes zoster på højre kind, øjet indbefattet, delvist generaliseret, med enkelte efflorescenser på hænderne (strækkesiden).

1. behandlingsdag, 40 tabletter ifølge eksempel 1, kontrol næste dag. Tilbagegang af hævelsen. Øjet er noget mere frit, dog forekomst af nye Herpes-efflorescenser. Endnu en behandling med 40 tabletter. På 4* dag kan der konstateres indtørring af efflorescenser og kun en moderat tilbageværende rødmen af hudens undergrund.

5. tilfælde 47 år gammel mand, stærk, langtidskontakt med influenzaramt kvindelig patient. Første influenzategn med hæs stemme og ondt i halsen. Indtog 8 tabletter om aftenen og ligelides 8 tabletter om morgenen. Begge gange tabletter ifølge eksempel 1. Velbefindende efter 4 til 6 timer. Ingen yderligere sygdomstegn. Flere influenzaanfald blandt omgivelserne.

6. tilfælde 13 år gammel dreng med virusbetingede vorter på fingrene og på begge håndrygge. Indgift af 2 x 8 tabletter ifølge eksempel 1 med hver 5 x 10^ VE. Efter 2 dage tydelig tilbagegang og efter 13 dage fuldstændig helbredelse.