DK141917B - Analyseapparat til samtidig bestemmelse af opløste bestanddeles koncentration i flere adskilte væskeprøver. - Google Patents

Description

(11) FREMLÆGGELSESSKRIFT 1^+1917 (ί&) \Ra/ ΠΔΝΜΔΡΚ' (Bi) int.Cl.3 G 01 N 21/27 6 01 N 21/64 «(21) Ansøgning nr. 4-588/75 (22) Indleveret den 21. auS· 1^75 (23) Løbedag 21. aug. 1975 (44) Ansøgningen fremlagt og ill O80

fremlæggelsesskriftet offentliggjort den 1 4. JU-L · J

DIREKTORATET FOR

PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET (3°) P"0"®1 begået fra den

22. aug. 1972, 282814, US

(71) UNITED STATES ENERGY RESEARCH AND DEVELOPMENT ADMINISTRATION, Was=

Eington, D.C. 20545, US.

(72) Opfinder: Thomas Oliver Tiffany, 125 West Lincoln Road, Oak Ridge,

Tennessee, US: James CliTford Mallen, 154 Cumberland View Drive, Oak Ridge, Tennessee, US: Louis Howard Thacker, 5727 Frostwood Road, Knox= ville, Tennessee, US.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Kontor for Industriel Eneret v. Svend Schønning.

(54) Analyseapparat til samtidig bestemmelse af opløste bestanddeles kon= centration i flere adskilte væskeprøver.

Den foreliggende opfindelse angår et analyseapparat til samtidig bestemmelse af opløste bestanddeles koncentration i flere adskilte væskeprøver, omfattende et rotoraggregat som afgrænser flere analysekyvetter, en fluorescens-exciterende lyskilde indrettet til at udsende en mod kyvetterne skråt orienteret lysstråle, en fotometrisk lyskilde placeret på rotoraggregatets modsatte side og indrettet til at udsende en lysstråle gennem kyvetterne, og organer til detektering af henholdsvis fluorescens udsendt fra kyvetterne og lys transmitteret gennem kyvetterne.

2 141917

Fra DK fremlæggelsesskrift nr. 134.795, og US patentskrift nr. 3.514.613 kendes en fotometrisk analysator omfattende et rotoraggregat med et antal kyvetter anbragt ved periferien af rotoren, en lyskilde samt en detektoranordning 5 til måling af det gennem kyvetterne under rotationen transmitterede lys.

Fra DK patentskrift nr. 104.264 kendes endvidere et analyseapparat omfattende et drejebord med et antal analyseceller anbragt på omkredsen af drejebordet og en drivmekanis-10 me til trinvis fremføring af cellerne til en detektor. Dette apparat kan anvendes såvel til fluorescensmåling som til lystransmissionsmåling.

I et instrument som skal anvendes både som absorptionsfotometer og fluorometer er det enkleste arrangement således 15 at en lyskilde placeres på den ene side af en prøveindeholdende kyvette og en fotodetektor på den anden side. Lys med speciel bølgelængde sendes gennem kyvetten og den udgående stråle detekteres. Ved måling af den af væsken emitterede fluorescens anvendes passende filter til at bortfiltrere det ex-20 citerende lys. Lignende arrangementer anvendes i stor udstrækning i hurtige analyseapparater, f.eks. sådanne som er beskrevet i US patentskrifterne 3.547.547 og 3.555.284. I praksis er det imidlertid ikke let med et sådant arrangement at gennemføre fluorometriske målinger på grund af vanskeligheder med 25 at opnå signaler, som afviger signifikant fra dem, der forårsages af baggrundsstøjen. Det forstyrrende excitationslys kan også elimineres ved vinkelafbøjet excitations-emissionsdetek-tering hvor den exciterende lysstråle er orienteret med 90° i forhold til den fotodetektor som måler den emitterede fluor-30 escens.

Et andet problem der er forbundet med bestemmelsen af koncentrationen af et materiale i en væske ved fluorescensmålinger optræder når prøven er karakteriseret ved en relativ høj absorbans. Den del af prøven som befinder sig mellem ky-35 vettevinduet og en trinvis voksende rumfangsdel af prøven svadeker den exciterende lysstråle og formindsker således den emitterede fluorescens. Den emitterede stråling svaakkes på i hovedsagen samme måde, men i mindre udstrækning end den som er forbundet med den exciterende stråle. Dette problem kaldes "indre 3 U1917 filtereffekt".

Det ville således være ønskeligt at tilvejebringe en optisk konfiguration for fluorescensmålinger, hvor de exci-terende og emitterede lysstrålers banelængder er korte. I 5 en sådan konfiguration ville fejl på grund af den indre filtereffekt formindskes til et minimum og fluorometrets effektive område for koncentrationsmålingen udvides.

Potometriske målinger kræver på den anden side en optisk konfiguration hvor en relativt lang banelængde (ca.

10 1 cm) må tilvejebringes for den indfaldende lysstråle inden et effektivt område af koncentrationen af et materiale i en væske kan måles. De krav, der stilles til kyvettens banelængde i forbindelse med fotometriske målinger, strider således mod dem, der stilles til banelængden ved fluorometriske må-15 linger. Opfindelsens formål er derfor at tilvejebringe et dynamisk, hurtigt analyseapparat af flerstationstypen med en kyvettekonstruktion som kan anvendes til både fotometriske og fluorometriske målinger.

Det ovennævnte formål er ifølge opfindelsen virkelig-20 gjort i et analyseapparat som er ejendommeligt ved de i krav 1 angivne kendetegn.

Analysekyvetterne er placeret i en cirkulær række inden i en centrifugerotor således at de danner et roterbart kyvettesystem. Hver kyvette er forsynet med en flad del med 25 et gennemsigtigt vindue på kun den ene side til udførelse af fluorometriske målinger, og en del med større dybde og gennemsigtige vinduer på begge sider til gennemførelse af fotometriske målinger. En fluorescens-exciterende lyskilde er indrettet til at udsende en skråt orienteret lysstråle mod 30 den flade kyvettedel. En fotometrisk lyskilde er placeret på rotorens modsatte side og indrettet til at udsende en lysstråle mod kyvetterne i en position hvor deres dybde er større.

Til tilvejebringelse af 141917 4 henholdsvis fluorometriske og fotometriske målinger af ky-vetteindholdet er en fotodetektor anbragt til ved en tilpasning af apparatet at modtage enten den emitterede fluorescens eller den fra den fotometriske lyskilde transmitterede lys-5 stråle. Disse målinger kan imidlertid også udføres samtidigt, hvis apparatet er udstyret med to fotodetektorer.

Det væsentlige træk ved den foreliggende opfindelse ligger i løsningen af den konflikt, der fremkommer ved kravet om prøvens tykkelse ved henholdsvis fluorometrisk og fo-10 tometrisk måling. Som tidligere nævnt kræves der ved fluorometrisk måling tynde eller snævre (0,1 til 0,2 cm) analyseky-vetter for at reducere den indre filtervirkning mest muligt, hvorimod der til fotometrisk måling kræves forholdsvis tykke (1 cm) kyvetter før man kan måle over et effektivt koncen-15 trationsinterval.

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes en ky-vetteudformning hvor disse indbyrdes modsatte, men vigtige krav opfyldes for både fotometrisk og fluorometrisk måling udført i en enkelt målebeholder eller kyvette indenfor et ef-20 fektivt koncentrationsområde.

Analyseapparatet ifølge opfindelsen forklares nærmere i det følgende ved hjælp af en beskrivelse af de foretrukne udførelsesformer og under henvisning til tegningen, hvor fig. 1 er et perspektivbilIde, hvor en del er skåret 25 bort, som viser et analyseapparat ifølge opfindelsen, fig. 2 er et plant billede af en del af den i apparatet ifølge fig. 1 anvendte rotor som viser formen af de deri anvendte kyvetter, fig. 3 er et tværsnit af rotordelen ifølge fig. 2 som 30 viser lysstrålernes retning ved gennemførelsen af fluorometriske og fotometriske målinger af kyvetteindholdet, fig. 4 er et plant billede af en alternativ kyvette-konstruktion ved hvilken der anvendes indlæg til at danne flade dele i kyvetterne, 35 fig. 5 er et tværsnit af rotordelen ifølge fig. 4, fig. 6 er et diagram der viser de relative intensiteter som funktion af fluoresceinkoncentrationen for kyvetter med banelængder på 0,2 cm og større end 0,2 cm, og fig. 7 er ét diagram der viser den relative inten- 5 141917 sitet og absorption som funktion af fluoresceinkoncentratio-nen for et fluorometer af tidligere kendt type sammenlignet med et fluorometer ifølge opfindelsen.

Fig. 1 er et perspektivbillede, hvor en del er skåret 5 bort, som viser et ifølge opfindelsen konstrueret analyseapparat i form af et kombineret dynamisk fluoro- og fotometer af flerstationstypen. Et rotoraggregat af pladetypen består af en flange forsynet med stålrotor 1, kvartsvinduer 2,3, en mellem disse indføjet, slidsforsynet kyvettering 4 af poly-10 tetrafluorætylen, støtteringe 5,6 af polytetrafluorætylen, og en med skruer forsynet flangering 7 af stål. Støtteringene 5,6, vinduerne 2,3 og kyvetteringen 4 er presset sammen mellem rotoren 1 og flangeringen 7 til dannelse af flere radialt orienterede kyvetter 8 i den slidsede kyvettering 4. Med af-15 stand fra hinanden spredte huller 9,10 og 11 er indrettet i henholdsvis flangeringen 7 og støtteringene 5 og 6 i aksial indretning med kyvetterne 8 til at muliggøre passage gennem kyvetterne for en lysstråle fra et fotometer eller spektro-fotometerlysrør og et under rotoren placeret spejlaggregat 20 31 til en ovenfor rotoraggregatet placeret fotodetektor 12.

Et lysrør 13 for det fluorescens-exciterende lys holdes fast af et overstykke 14, som er placeret umiddelbart over flangeringen 7 i linie med hullerne 9. Lysrøret 13 er indstillet med en vinkel i forhold til fotodetektoren 12 for at tilveje-25 bringe en fluorescensemission med en anden vinkel til detek-tion. Overstykket 14 holder lysrøret 13 i en position i forhold til et emissionsvindue 15, som fører til fotodektoren 12. En holder 16 for et monokromatisk emissionsfilter er anbragt mellem overstykket 14 og fotodetektoren 12.

30 På fig. 2 og 3 vises kyvetter 8 i en foretrukken ud førelsesform. Som det ses har hver kyvette 8 en første del 17, som strækker sig aksialt gennem kyvetteringen 4, og en flad, trappetrinsformet del 18 langs kyvettens ene side.

En hævert 19 til aftapning af væske strækker sig fra den 35 radialt ydre ende af hver kyvette til kyvetteringen 4's periferi, hvor væsken udtømmes i et stationært opsamlingstrug 20 som vist på fig. 1. Fluorescensmålinger gennemføres i den flade del 18, hvor den del af den exciterende lysstråles bane 21, som går gennem væsken, er begrænset til 0,2 cm eller 40 mindre. Den exciterende lysstråle 21 danner en vinkel α på 6 141917 ca. 30° med vinduet 3 og den flade del 18's overflade 22. Dette muliggør detektion af emissionsstrålen 23 i en anden vinkel end den reflektionsvinkel som normalt hører sammen med stråling som falder ind mod overfladen 22. En lysstråle 24 5 anvendes til fotometriske målinger gennem delen 17 af hver kyvette på den måde som er beskrevet i US patentskrift nr. 3.555.284.

Fig. 4 og 5 viser en alternativ kyvettekonstruktion hvor en opaque skive 25 indføres i spor 26 i siderne af en 10 kyvette for i denne at danne en flad del 27 hvis dybde egner sig til fluorometriske målinger. Fluorcmetriske målinger udføres i den flade del 27 og fotometriske målinger i kyvet-tens resterende del som ikke ændres ved indføringen af skiven 25. Eksisterende fotometriske analyseapparater af den ro-15 terbare kyvettetype kan let modificeres ifølge denne udførelsesform ved at man fræser spor i kyvetternes sider og indfører egnede skiver.

Når der som vist på fig. 1 kun anvendes en fotodetektor til at detektere både den emitterede fluorescens og den 20 fra den fotometriske lyskilde transmitterede lysstråle, kan de fluorometriske og fotometriske målinger ikke udføres samtidigt. Det i fig. 1 beskrevne system ville imidlertid ikke kræve nogen omplacering af fotodetektoren idet målingerne udføres i den samme radiale position af rotoraggregatet. En an-25 den fotodetektor, som er vinkelforskudt i forhold til den første, ville kunne anvendes og både fluorometriske og fotometriske målinger ville kunne udføres samtidigt. I dette tilfælde skulle det til fluorescens-exciteringen anvendte lysrør 13, overstykket 14 og fotodetektoren 12 bibeholdes som 30 vist på fig. 1 og en anden fotodetektor skulle indrettes ak-sialt med fotometerlysrøret og spejlaggregatet 11 i en position som er vinkelforskudt i forhold til fotodetektoren 12.

Den alternative udførelsesform ifølge fig. 4 og 5 kræver radial forskydning af fotodetektoren 12 til ændring fra fluoro-35 metriske til fotometriske målinger hvis der kun anvendes en fotodetektor.

Fig. 6 er et diagram der viser den relative intensitet som funktion af fluoresceinkoncentrationen bestemt ved dynamiske fluorescensmålinger. De i diagrammet indtegnede resul 7 141917 tater viser virkningen af den exciterende lysstråles banelængde på det målelige område af koncentrationen af et materiale i en væske.

Kyvetterne i et dynamisk fotometer af flerstationstype 5 modificeredes ifølge den i fig. 4 og 5 viste udførelsesform og anvendtes som fluorescenskyvetter under rotation. En kol-limeret lysstråle fra en 470 nm xenonlampe som excitations-kilde med anvendelse af en spaltebredde på 0,5 · 1,0 mm rettedes mod kyvetternes overflade med en indfaldsvinkel på 30°.

10 Fluorescensemissionen fik lov til at passere gennem et 500 - 600 nm filter og detekteredes vinkelret på kyvetternes overflader. Der måltes relative intensiteter for pufrede opløsninger indeholdende fluorescein i koncentrationer på op til 100 jig/ml. Målingerne gennemførtes under identiske be-15 tingelser med undtagelse af at der anvendtes to forskellige banelængder til overfladeexcitering. I det ene tilfælde var banelængden 0,2 cm og i det andet tilfælde ca. 0,5 cm. Fig. 6 viser tydeligt at anvendelsen af den kortere banelængde gav et meget større lineært område til koncentrationsbestemmel-20 se.

I et andet forsøg sammenlignedes et i handelen tilgængeligt spektrofluorometer med en banelængde på 0,5 cm med et dynamisk fotometer af flerstationstype som var modificeret som vist på fig. 4 og 5 til opnåelse af en banelængde 25 på 0,2 cm. De i fig. 7 afbildede resultater viser en sammenligning mellem de relative intensiteter af emissionsværdierne som opnåedes med stigende fluoresceinkoncentration. Det bemærkes at intensiteterne ved anvendelse af instrumentet med en banelængde på 0,5 cm i virkeligheden blev mindre ved 30 en fluoresceinkoncentration på over ca. 80 pg/ml, hvilket indebærer at en analyse af opløsningskoncentrationen uden for denne værdi er meningsløs. Kurven for det modificerede instrument med en banelængde på 0,2 cm viser imidlertid at måling er mulig over et meget udstrakt koncentrationsområde.

35 Elektroniske hjælpekomponenter til udnyttelse af foto detektorens udgangssignal og visning af resultaterne fra de respektive kyvetter under rotation er beskrevet i US patentskriftet nr. 3.514.613. Disse komponénter vil ikke blive beskrevet her da opfindelsen i dette tilfælde angår en forbed-40 ring som er begrænset til kyvetternes mekaniske konstruktion