DK141982B - Antimikrobielt konserveringsmiddel, især til brug i kosmetiske cremer. - Google Patents

Description

(11) FREMLÆGGELSESSKRIFT 141982

I esc· I

\Ra/ DANMARK (61) lntcl·3 Α 01 μ ^3/32 // c 07 d 319/06 §(21) Ansøgning nr. 801/74 (22) Indleveret den 15· f©b. 1974 (23) Løbedag 15· feb. 1974 (44) Ansøgningen fremlagt og . _ fremlæggelsesskriftet offentliggjort den ^ · SUS · 19©0

DIREKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) Prioritet begæret fra den

16. feb. 1973, 333418, US 26. jul. 1973, 382992, US

(71) ELI LILLY AND COMPANY, 3Ο7 East McCarty Street, Indianapolis, Indiana, US. ~ (72) Opfinders Lewis Christopher Lappas, 5331 Hawthorne Drive, Indianapolis, Indiana, US: Clarence August~Hirsch, 6737 Dover Road, Indianapolis, Ine diana, US.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Ingeniørfirmaet Hofman-Bang & Boutard.___ (64) Antimikrobielt konserveringsmiddel, Issar til brug 1 kosmetiske cremer.

Den foreliggende opfindelse angår et antimikrobielt konserveringsmiddel, især til brug i kosmetiske cremer. Konserveringsmidlet er ejendommeligt ved, at det som aktiv bestanddel indeholder en 5-brom-5-nitro-2-alkylsubstitueret -1,3-dioxan med den i krav 1 angivne almene formel, såsom 5-brom-2-methyl-5-nitro-l,3-dioxan, med virkning over for både bakterier og svampe.

Der kendes en lang række antimikrobielle midler. Et stort antal antibiotika og syntetiske og organiske kemikalier anvendes som bakteriostater, bakterioxider, fungistater, fungicider etc. Mange af disse effektive antimikrobielle midler har en vigtig rolle ved kontrol af mikroorganismer, der inficerer mennesket. Nogle har et bredt aktivitetsspektrum, medens andre anvendes indenfor et relativt snævert område. Nogle få er endog begrænset til en enkelt anvendelse.

2 141982

Antimikrobielle konserveringsmidler kendes som vigtige ingredienser ved kosmetiske cremer, der anvendes som basis for make up til ansigtet. Disse cremer består generelt af en olie-i-vand emulsion. Ingredienserne giver et gunstigt substrat for mikroorganismer, såsom bakterier og svampe. Da endvidere både olie og vand er til stede, kræver valget af et passende konserveringsmiddel, at man har opmærksomheden henvendt på behovet for antimikrobiel virkning i begge systemer. Da det er sandsynligt, at et effektivt antimi-krobielt middel virker bedst, når det er opløseligt i substratet, der skal beskyttes, er det vigtigt, at det konserverende middel til en sådan kosmetisk creme har en effektiv opløselighed i både olie og vand.

Et konserveringsmiddel, der har været anvendt i kosmetiske cremer med nogen succes, er 2-brom-2-nitropropan-l,3-diol. Imidlertid har denne forbindelse den ulempe, at den er kemisk ustabil overfor alkali.

En fornylig introduceret forbindelse, der kan anvendes til konservering af kosmetiske cremer, er den fra tysk offentliggørelsesskrift nr. 1.920.298 kendte 5-brom-5-nitro-l,3-dioxan. Denne forbindelse er kemisk stabil over for alkali. Selv om 5-brom-5-nitro- 1,3-dioxan imidlertid har et relativt bredt virkningsspektrum, er der vigtige mikroorganismer, over for hvilke denne forbindelse er inaktiv eller kun udviser ringe aktivitet i relativt høje koncentrationer. Derfor er efterforskningen efter en alkalistabil forbindelse, som både er opløselig i olie og vand, og som har et endnu bredere virkningsspektrum over for mikroorganismer ved lav koncentration, fortsat.

Det er derfor et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en alkalistabil forbindelse, der har en passende olie- og vandopløselighed, og som er effektiv i realtivt små koncentrationer over for en lang række bakterier og svampe.

Fra Roczniki Chemii 46, 1559 - 1565 (1972) kendes 2-methyl- og 2-isopropylderivaterne af den ovennævnte 5-brom-5-nitro-l,3-dioxan.

Det har nu overraskende vist sig, at disse og andre 2-alkylsub-stituerede 5-nitro-5-brom-l,3-dioxaner er virksomme i lave kon- 141982 3 centrationer over for et bredt spektrum af bakterier og svampe.

Sådanne forbindelser her en glimrende kemisk stabilitet ved pH

5-9 og en opløselighed i både vand og olie (mineralolie) på op til 1,1-1,55X5. Kosmetiske cremer kan effektivt konserveres ved at inkorporere så lidt som 0,01% af disse forbindelser.

De aktive forbindelser i konserveringsmidlet ifølge opfindelsen har den i krav l’s kendetegnende del al mene formel. Forbindelserne kan fremstilles ved at anvende 2-brom-2-nitropropan-l,3-diol som udgangsmateriale. Forbindelsen 2-brom-2-nitropropan-l,3-diol er kommercielt tilgængelig under varemærket MBronopoln og kan fremstilles på forskellige måder. En effektiv metode omfatter anvendelsen af nitromethan som reaktant og en omsætning med formaldehyd til dannelse af 2-nitropropan-l,3-diol, der omdannes til natriumsalt og bromeres til opnåelse af 2-brom-2-nitropropan-l,3-diol. Fremstilling 1 nedenfor eksemplificerer fremstillingen af 2-brom- 2-nitropropan-l,3-diol ud fra nitromethan.

Fremstilling 1 20 g (0,5 mol) natriumhydroxid opløstes i 400 ml vand, og opløsningen afkøledes til 10°C. Til 74 ml 35% formaldehyd (1,0 mol) sattes 76 ml af den tidligere fremstillede natriumhydroxidopløsning. Til den kombinerede formaldehyd-natriumhydroxidopløsning sattes dråbevis 27 ml (0,5 mol) nitromethan, medens temperaturen i reaktionsblandingen holdtes på 25-30° C ved at dyppe reaktionsbeholderen ned i et is-vandbad. Reaktionen mellem nitromethan og formaldehyd katalyseredes ved hjælp af natriumhydroxid, og der dannedes 2-nitropropan-l,3-diol, men denne isoleredes ikke. Diolen omdannedes til natriumsaltet ved at tilsætte resten af den tidligere fremstillede natriumhydroxidopløsning til reaktionsbeholderen ved en temperatur på 20°C, og blandingen omrørtes ved stuetemperatur og atmosfæretryk i en halv time.

300 ml ethylacetat afkøledes til -5°C under anvendelse af et is-acetonebad. Til den kolde ethylacetat sattes 25,5 ml (0,5 mol) brom i en langsom stadig strøm, hvorved temperaturen holdtes på 5°C eller derunder. Den tidligere fremstillede natrim-2-nitropropan-l, 3-diol-reaktionsblanding sattes langsomt til ethylacetat- 4 141982 brom-blandingen, idet temperaturen holdtes på 5-10°C. Reaktionsblandingen omrørtes i 5 minutter ved stuetemperatur og atmosfæretryk, hvorefter pH indstilledes til 2,0 med 6N saltsyre. 200 g natriumchlorid sattes til reaktionsblandingen, hvorved 2-brom-2-nitropropan-1,3-diolen overførtes til ethylacetatfasen.

Denne frasepareredes og tørredes over magnesiumsulfat og filtreredes. Ethylacetat fjernedes fra filtratet under vacuum, og den fremkomne faste masse vaskedes med methylcyclohexan og inddampedes atter til tørhed. 30,1 g (83,1% udbytte) 2-brom-2-nitropropan- 1,3-diol opsamledes. Denne havde et smeltepunkt på 108-114°C.

De aktive forbindelser kan fremstilles ved at omsætte et passende aldehyd med 2-brom-2-nitropropan-l,3-diol i et surt medium. Fremstillingen af 5-brom-2-methyl-5-nitro-l,3-dioxan er eksemplificeret i eksempel 1.

EKSEMPEL 1 40 g (0,2 mol) 2-brom-2-nitropropan-l,3-diol suspenderedes i 200 ml benzen, og der tilsattes 0,3 g p-toluensulfonsyre.Blandingen afkøledes i et is-vandbad, og en tilbagesvaler sattes på reaktionsbeholderen. Ca. 13,5 g (0,3 mol) acetaldehyd tilsattes langsomt igennem tilbage svaleren, og reaktionsblandingen omrørtes i 30 minutter. En Dean-Stark vandlås blev påsat, og blandingen opvarmedes langsomt og kogtes under tilbagesvaling, indtil der ikke længere udvikledes vand. (Ca. 4 ml vand fremkom i løbet af 1,5 time). Opløsningen filtreredes og inddampedes på en rotationsinddamper ved 45°C. Der opnåedes en mørk olieremanens, der vacuum-destilleredes ved 0,25 mm. Herved opnåedes 36,5 g (75% udbytte) 5-brom-2-methyl-5-nitro-l,3-dioxan, der havde et kogepunktsinterval ved 0,25 mmHg på 72-74°C. NMR- og IR-spektrene stemte overens med strukturen, og grundstofanalysen havde følgende procentvise s ammensætning:

Carbon : beregnet 26,57, fundet 26,85;

Hydrogen: beregnet 3,57, fundet 3,85;

Nitrogen: beregnet 6,20, fundet 6,04;

Brom : beregnet 35,35, fundet 35,21.

Forbindelsen 5-brom-2-methyl-5-nitro-l,3-dioxan er en vandklar, farveløs væske ved stuetemperatur, og den størkner først ved -10°C.

5 141982

Den er kemisk stabil ved pH 5,0-9,0 og har en lugt, der minder om brom.

EKSEMPEL 2

Forbindelsen 5-brom-2-ethyl-5-nitro-l,3-dioxan fremstilledes ved at følge fremgangsmåden beskrevet i eksempel 1, idet der anvendtes pro-pionaldehyd i stedet for acetaldehyd. NMR-spektret stemte overens med strukturen, og en grundstofanalyse gav følgende procentvise sammensætning:

Carbon: beregnet 30,02; fundet 30,24

Hydrogen: beregnet 4,20; ftindet 4,24

Nitrogen: beregnet 5,83; fundet 5,92

Brom: beregnet 33,29; fundet 32,99

Det hvide krystallinske stof havde et smeltepunkt på 58 - 59°C, Forbindelsen er kemisk stabil ved pH 5 - 9 og har samme lugt, der minder om brom, som methylderivatet.

EKSEMPEL 3

Forbindelsen 5-brom-5-nitro-2-n-propyl-l,3-dioxan fremstilledes ved at følge metoden beskrevet i eksempel 1, idet der anvendtes n-butyr-aldehyd i stedet for acetaldehyd. NMR- og IR-spektrene stemte overens med strukturen, og en grundstofanalyse viste følgende procentvise sammensætning:

Carbon: beregnet 33,09; fundet 33,32;

Hydrogen: beregnet 4,76; fundet 4,63;

Nitrogen: beregnet 5,51; fundet 5,66;

Brom: beregnet 31,45; fundet 31,64;

Forbindelsen var en farveløs olie, der, når den destillerede ved 0,005 mmHg havde et kogepunkt på 73 - 75°C. Olien størknede til en voksagtig fast masse ved henstand ved stuetemperatur. Der var en bromagtig lugt til stede.

EKSEMPEL 4

Forbindelsen 5-brom-2-isopropyl-5-nitro-l,3-dioxan fremstilledes 6 1A1982 ved at anvende metoden beskrevet i eksempel 1, idet isobutyraldehyd anvendtes i stedet for acetaldehyd. MR- og IR-spektrene stemte overens med strukturen, og en grundstofanalyse gav følgende procentvise sammensætning:

Carbon: beregnet 33,09; fundet 33,33

Hydrogen: beregnet 4,76; fundet 4,83 Nitrogen: beregnet 5,51; fundet 5,33 Brom: beregnet 31,45; fundet 31,24

Forbindelsen var en farveløs krystallinsk masse, der efter omkrystallisation fra 1:1 isopropanol:vand havde et smeltepunkt på 42 - 44°C. Der var en bromagtig lugt til stede.

De aktive forbindelser i konserveringsmidlet ifølge opfindelsen eksemplificeret i eksemplerne 1, 2, 3 og 4 kan eksistere som cis-og trans-isomere. Metoden beskrevet i eksempel 1 giver et forhold mellem de isomere på 9:1. Det er hensigten at omfatte begge geometriske isomere som kemiske enheder såvel som den isomere blanding. Antimikrobielle forsøg med isomere blandinger af 5-brom-2-methyl- 5-nitro-l, 3-dioxan, én med et højt indhold af cis-formen, og en anden med et højt indhold af trans-formen, viser lige stor aktivitet, hvilket angiver, at der ikke er nogen signifikant forskel mellem de to geometriske isomere. Som en konsekvens heraf er de i det følgende beskrevne forsøg udført lander anvendelse af den isomere blanding (ca. 9:1) fremstillet som beskrevet i eksempel 1.

En af de aktive forbindelser i konserveringsmidlet ifølge opfindelsen, nemlig 5-brom-2-methyl-5-nitro-l,3-dioxan, er særdeles effektiv in vitro overfor en lang række mikrobielle organismer, både bakterier og svampe. Endvidere er den antimikrobielle virkning af denne forbindelse indtil 20 gange den virkning, som kendes fra andre forbindelser såsom 5-brom-5-nitro-l,3-dioxan. F.eks. har denne aktive forbindelse en minimal hæmningskoncentration på 5yug/ml overfor Corynebacterium aenes og Staphylococcus aureus sammenlignet med en minimal hæmningskoncentration på 100^ug/ml for forbindelsen 5-brom-5-nitro-l,3-dioxan over for de samme mikroorganismer i et konventionelt fortyndingsforsøg. Ved dette forsøg var koncentrationen af den podede væske 10^“ organismer/ml.

In vitro aktiviteten af de aktive forbindelser, 5-brom-2- 7 141982 methyl-5-nitro-l,3-dioxan (forbindelse A), 5-brom-5-nitro-l,3-dioxan (forbindelse B) og 2-brom-2-nitro-propan-l,3-diol (forbindelse C), bestemtes ved at udstrege seks organismer på agarplader indeholdende de aktive antimikrobielle midler A, B og C.

Den minimale hæmningskoncentration for forbindelsen A var fra l/5 til 1/30 af den minimale hæmningskoncentration observeret for forbindelsen B, og fra 1/20 til 1/67 af den minimale hæmningskoncentration fundet for forbindelsen C. Forsøgene udførtes samtidigt, og der var 10^ mikroorganismer/ml. De anvendte mikroorganismer samt forsøgsresultaterne er vist i tabel I nedenfor.

8 141982

CQ

S

h ^ m o Η Φ - -

•Η &0 H O O

&0H in O

d il H

φ Λ

ft CQ

C

CQ CO 3 •d co in o H O -

Ti H CM in o

dP CM O

CO Η H

O CO A

CO

•H

P H

OH O O O

H O «· « *

d O CM O O

φ H CM

,3

CQ

m

rH

^s

tiD CQ

3 3 o \ o

d O

p d o cq m o o h o od > ·η o Φ cm m o P H Ph H m d co >> d

H d P CO

P> ft H W) d

d Φ P

Η H O CO

φ d d p P o

<0 d P

EH H CQ CQ

> &o d d o

H *H O CQ

Φ d OH o o o •H s OH - - -

p ffi O CO H O O

Op P O H CM

d ft ω

PH ω CO

H CO d H

SS -p

•Η H CO

P d B Si C s

CQ

cO CO d cq o o o o o S d - - - oh h m o

Ti W) CM CM

d d Φ d CQ Φ ft CO

emu Φ

CQ

H

Φ I I

X} d H “ s

P

d

O I I

ft 9 141982

Den antimikrobielle aktivitet af 5-brom-2-methyl-9-nitro-l,3-dioxan (forbindelse A), 5-brom-5-nitro-l,3-dioxan (forbindelse B) og 5-brom-2-ethyl-5-nitro-l,3-dioxan (forbindelse D) bestemtes samtidigt over for Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus og Escherichia coli ved et konventionelt fortyndingsforsøg,og over for Aspergillus flavus, Aspergillus niger og Candida albicans, idet der anvendtes agarplader. Koncentrationerne af mikroorganismer i fortyndingsforsøgene var 104 organismer pr. ml, og koncentrationen ud-streget på agarpladerne var 10^ mikroorganismer pr. ml agar. Tallene i tabel II viser de laveste koncentrationer i ^ug/ml aktiv forbindelse i væsken eller på agaren, hvor der ikke fremkom nogen vækst. Dette anvendtes som den minimale hæmningskoncentratipn for den aktive forbindelse over for hver mikroorganisme.

10 141982 01 ρ

Hin m HØ h &: m o oj

b£ ·Η CM in H

£ s Φ

P

M

c m[

P

H cQ Η P

•h > in in fat cd - £H cm cm in

φ<Η Η H CM

P CQ <

O H £ S

-P CQ

h fan cd £ m i> -s P cd “ ^ η o in O cm

5 £ dri cm m H

η o £ P

•h cd H

bo -P O cd £ Cd

h £ CQ

£ -P P

H X £ o

H £ Φ O

H O O

1-3 > £ OM

Η o o P m in CQ Η Λ Η Φ <ς οι oi >£ cm cm tn Η h fao P P H h cm P £ P cd oh cd

£ £ -P

X S CQ

6 ϋ cd •H »ri

-PH P

£ Cd OH

<5 S η H m m H £ O *> d ø o cm m cm

Η p H CM H

S O

01 H

M

cd cd £ oi o o S £ m oh cm in in

P fat - r-id £ M3 CM CM

Φ £ HH

m φ CL, cd

i < i pq i P

£ £ £ Η Φ Η Φ Η Φ

P 01 PM PM

£ Η £ Η £ H

O Φ O Φ O Φ

(x, Ό fe H fx, H

n 141982 I et tredje forsøg bestemtes den antimikrobielle aktivitet af forbindelsen A, forbindelsen B og 5-brom-5-nitro-2-n-propyl- 1,3-dioxan (forbindelse E) samtidigt over for de samme seks mikroorganismer som vist i tabel I. Forbindelsen A var klart bedre end forbindelsen B over for fire af de seks mikroorganismer, og forbindelsen E viste en klar virkning som antimikrobielt middel. Forsøgene var in vitro bestemmelser under anvendelse af agarplader indeholdende den aktive forbindelse i en koncentration på 10, 25 og 50 /ug pr. ml agar. Organismerne anvendtes i en koncentration på 10b organismer pr. ml, og de syv udstregedes på den faste agar. Pladerne inkuberedes i 24 timer, og nærværelse eller fravær af vækst noteredes. Den minimale hæmningskoncentration bestemtes som den laveste koncentration af aktiv forbindelse i agaren, hvor der ikke fremkom nogen vækst. Tabel III nedenfor viser resultatet af dette forsøg.

12 141982 ra 3 Η Η ίπ •H 0 O O m bi bt H in w f-t ·Η ^ ød

P

CQ

<: m ns „ dø o in o •pc H ni in d -H yr λ ΰρ

ø Η Ο CO

cO

•Η λ ο ·η·η ο ο ιη

Ρ Η Η Η CM

Η 0 Ο ν ν ο S ί ο Ρ \ ϋ -ρ bO 0

•ri 3 W

ί> Ρ β μ •Η Ο Ρ •ri Ο ω -ρ ο Ρ cO om •HP ο Ρ Η -Ρ Ο 0 ο ιη ΙΛ

H .yp HP Η CM CM

Η PØ ^ Ρ V

Η ·Η Ο ίΟ > ΰ Ρ ΡΙ Ο 0 Η Η i! -Ρ PQ 0 Μ C0

<! ·Η bO

ΕΗ Ρ S

Ο ·Η Μ Ρ d Ρ X & Ο •Η « ϋ 0

S ,d OH

•Η OH Ο Ο Ο

-Ρ Η Ο 0 Η Η ΙΑ pø -Ρ Ο s/ ν A

< a ρ 0 •Η 0 0 d ρη •Η -Ρ

S CQ

0 0 0 d ø ο ο s d ο lp ο Ο Η Η CM ΙΑ Ο b[ ν a Ρ Ρ 0 ρ 0 0 (Ρ 0 C CQ Η 0 0 0 0 0 0 Η Η Η 0 0 0 d η χ} d d d •Μ Ή ·γ-1 rQ rQ γΟ Ρ Ρ Ρ ο ο ο [Ρ fe pt4 13 141982 I et fjerde forsøg bestemtes den antimikrobielle virkning af 5-brom-2-isopropyl-5-nitro-l,3-d.ioxan (forbindelse F) over for de samme seks organismer som vist i tabel I plus Aspergillus flavus.

Den minimale hæmningskoncentration bestemtes ved at udstrege de syv mikroorganismer på agarplader indeholdende forbindelsen F i forskellige koncentrationer. Den laveste koncentration af forbindelsen, hvor der ikke fremkom nogen vækst på agaren efter inkubation, blev bestemt som den minimale hæmningskoncentration. De anvendte mikroorganismer samt forsøgsresultaterne er vist i tabel IV nedenfor.

3% 14 141982 ra •H |> h£ ø

Pi H O

(B'H LTV

P

03

C

ra 3 H Ph H 0) H hi

ht H O

Ph P A

0 P m <; ra ø P p ø h o o

PH A

PP 0 H olø ø

H

P

O H •H i—1

P O O

H 0 O A

OS P

P \ o -p ho ra Ή ^ P3 > ^ P p" 2 h o 3

•pH O

bO -P O

P 3 O

•HP ora p -P 0 3 P P HØ

pø > P A

•HO P 3 Al

> !> P PS

H O 0

HP -P

p ø ra cq pq h ho

m P P

<| o η ra

Eh p p 3 ra PS oh

•h æ OH

S P o ø

•H O O

-PH o 0 A

pø -PØ Al

< B PH

•H 0

P P

H -P

S w ra

ø ø P m o o S P

OH O

P h£ A

3 3 ø P ra ø Ph 0

Ph ø ra

H

ø

P

P

♦ri

P

P

o

Ph 15 141982

De aktive forbindelser i konserveringsmidlet ifølge opfindelsen viser også eksceptionel god antifungal virkning. Denne virkning bestemtes over for 16 almindelige svampe, og over for 14 af de 16 organismer havde 5-brom-2-methyl-5-nitro-l,3-dioxan en lavere mi-ninal hæmningskoncentration end den, der observeredes, når 5-brom-5-nitro-l,3-dioxan anvendtes i et sideløbende forsøg. Forsøgene udførtes ved at sætte den aktive forbindelse til smeltet agar i koncentrationer på 200, 100, 50, 25 og 10 ^ug/ml, størkne agaren og udstrege organismerne derpå. Resultatet af forsøgene er vist i tabel V.

* 16 141982 i m «t Η ο g g -μ cd •Η bt d cd ιΤ\ ·Η οοοοοοοοοοοοο ο ο i ooomooooooooooqq

g g Η CM 'CM Ir-tHHHHHCMHCMincMCM

c! o cd ' I A. Λ. ire 1 I I I I 1 A I A I A Ay O g K o CMOOOOOO O in •HPO m Lninmininin m c\l P I ·Η cd ιητ) g -p d

g S

CD \ O O bt)

g S

μ O ·Ν •Η μ

> CQ

bt P

S3 g I cd * Ή 'i—I tT\ *ill g i cd

bt) g H

•5 i S* g -μ g > g maS o o o o o o o qo ^ μ s i o ίηοοοοιηιηιηοιηοιηο oo J > μ a Ή HHHHCMCMCMinCMHCMH Η Η pq Η μ g i in o ooooomooq q q cd g μ to cm in ininHHHCMHinH H in EH Μ I · g inn μ η o •nag μ> \μ g rød -¾ g^g μ

O

•H

CD CQ ra

CQ g CD CD

g Φ H -μ CD ω P CQ cd >: cd μ o ω a μ μ

μ g o μ 3 μ P

CQ CQ O !>: ·Η g W O

g μ Hl o CQ g CQ μ g μ ra a a ϊ> g S S g -η d ? cdgggcDgaaogcdoggcd b£ωμcDggggί!coHcdμøμα)

μgcdcQ(DωggpJog>μμgH

Βρμροωοο μ Η H g g Φ cd gcDO!>i μppao,-,gdμa> μ μ g bd cq μ cq cq gH g a fcd _ _ o 0) Η i > il bil PI _ g g „ mmaaog'XMo cq cd o o g gggg^^oo-HacdcdH-p-pg cd Hi-^Hga._<_gp,riggrjr“g s HHHooaaa-p-Hgogfl'go CQ μμΗΡΡΡΡΡΟβπίθΟΡΡΡ μ bt bt μ cq cd μ μ μ μ o η o μ o o cq g ggooμggg<Dμcdμoμμg cd <D(DμgocdcdcdHβ)Γ^μ,ϋoϋ> bt ppgoocQtQcQHcΰHggμμ-μ g cq cq ω μ cd g g g o μ g cd μ g g μ O CCCL.SMføfefeOOfcXffiEHEHfg 17 141982

Den antifungale virkning af forbindelserne A og B bestemtes for 7 svampe og en gærsvamp i et andet forsøg. Vandige koncentrationer på 0,1, 0,05 og 0,025 vægtprocent af hver forbindelse A og B podedes med ca. 10^ organismer pr. ml. Levedygtige organismer optaltes efter 24 timer, som vist i tabel VI. Forbindelsen A observeredes at være signifikant bedre end forbindelsen B over for gær, Saccharamyces pastorianus,ved en koncentration på 0,025 procent. Endvidere havde forbindelsen A en forbedret virkning over for Trichophyton menta-grophytes i forhold til forbindelsen B.

18 141982 i

S

o u u φ p SI m

•H LA IA OOOO OOOO

-p CM OOOHOOO O

p O H CM H CMHVØH

af · V v v X ν' CM S ° ^ co tn

P -JR X

v-· o O P

Citl o o i lt\|

IS P m O OOOOOOOO

ΙΛ J O OOOOOOO

CO H Ol Hi—IHHHHHH

T-J £_, | VVv/VVVvV

ω -P o t> ri ri

(D P

o Sri hi oooooooo poih oooooooo p fcd IT\ ol hhhhhhhh o af vvvS'/vvv/

ri P

p ri

H .X

!> ri I

•h m i m oooooooo ri O CM oooooooo

P ri ep ri O HHHHHHHH

<D cd p - V vvvvvv-v

bO P H O

ri p ^ ri η ω ^ i ri ^-nn x p i H h ξ—j > p cd o >, m| oooooooo > P H p ol oooooooo

i-} PPrin HHCMHHHHH

W h ri cd Φ cd Ol vv v v ^ v

CQ cd ω ri S X

C bO S P I O

EH ri « ri CM H

ri P Φ I xi p ri o s i •Η S riOfAHl oooooooo

P b£ O ri ·> H OOOOOOOO

ri ri fed p h ol hhhhhhhh <iO VN/v'vVVv/v φ φ Φ bo ri ri H ra

ρ Φ °cd I Η Η P

p s S Η ® φ cd IfllOCO MflvtlOID

bo ra pridio oooooooo

£>ιΡ H ri P ri H HHHHHHHH

Φ Φ ^ ri Ρ Ρ XXXXXXXX

!> bO · ri X ri

φ Ρ Ρ Φ P O ri -itAGOCMISHCMCM

p O PH S Ρ Φ ra Φ ra p g £

cd P

ra ·η o ri P ri P S S o S bl cd ri ri P ri cd Φ

p ri φ ra ra p H

•Hcdracdcdoricd Bpppjrap®> ri o ί>ι ri o S o p ri ba ra φ h

φ ri &a ri S

ra s S o p o ri riririi^ospri

Φ Η P ri S ri > O

S HH O O ra ρ p P

ra p Η p ri η S P ω p bt p ra cd P o o o ri rioop>ppri

Cd ®PriOri©0|>i b£ prioopafpp

ri mrapedopriP

o cpsramoBPi 19 1A19 82 I tabel VI betragtes et antal organismer på mindre end 100 som værende indikativt for en fuldstændig udryddelse, 2-methylderivatet af 5-brom-5-nitro-l,3-dioxan er en særlig fore-trukken forbindelse som aktiv bestanddel i konserveringsmidlet ifølge opfindelsen.

Der udførtes forsøg til vurdering af hudirritationen og hudfølsom-hedsegenskabeme hos forbindelsen 5-brom-5-nitro-l, 3-dioxan og den foretrukne aktive forbindelse 5-brom-2-methyl-5-nitro-l,3-dioxan. Der anvendtes følgende fremgangsmåde:

Der anvendtes 200 personer til hver undersøgelse. Der benyttedes en gentagen irritationsteknik ved skønhedspletforsøget. En forskellig gruppe personer anvendtes til hver vurdering.

Teknikken benyttet ved pletforsøget kræver, at der påsættes en serie på 9 pletter af hver aktiv forbindelse på hver person. Serien fulgtes 2 uger efter med en enkelt plet af hver aktiv forbindelse for at afprøve hudens følsomhed.

Serierne med 9 påsatte pletter udførtes mandag, onsdag og torsdag og der opretholdtes en kontakt med huden i 24 timer, hvorefter pletten fjernedes og stedet på huden inspiceredes for irritation. Torsdagspletterne anbragtes umiddelbart efter fjernelse og vurdering af onsdagens påføringer. Efter at den niende påsatte plet var anbragt, gik der en periode på 2 uger, hvor der ikke påsattes pletter, hvorefter der påsattes en plet for at bestemme følsomhedsreaktioneme. Til denne nye 24 timers plet anvendtes et nyt sted på huden. Dette sted valgtes altid ved siden af et behandlet sted, d.v.s. et sted, hvor der var udført gentagne påsætninger under serien med de 9 påsatte pletter. Den sidst påsatte plet vurderedes 24 og 72 timer efter påsætningen.

Påføringen på huden for hver aktiv forbindelse udførtes under anvendelse af ovale adhæsive pletter (1" x 1 1/4”) med cirkulære gaze-centre. Gazecentrene dækkedes med ca. 0,03 ml af det afprøvede materiale lige før påføringen. Det pointsystem, der anvendtes ved hudirritationsreaktionerne og ved vurdering af følsomheden, var følgende: 20 141982

TABEL VII

Forsøg med gentagen påsætning af irrirationspletter på mennesker

Pointsystem for hudreaktioner Erythema og eschar dannelse

Ingen reaktion O

Meget ringe erythema (næsten ikke synlig) 1

Mildt, veldefineret erythema 2

Moderat til alvorlig erythema 3

Alvorligt erythema (rød som rødbeder) til eschara dannelse (skader i dybden) 4

Total mulig Erythema point 4 Ødem dannelse

Ingen reaktion 0

Meget ringe ødem (lige netop synlig) 1

Lidt ødem (kanten af arealet er veldefineret ved en endelig forhøjning) 2

Moderat ødem (arealet forhøjet ca. 1 mm) 3

Alvorligt ødem (areal forhøjet mere end 1 mm og · strækker sig ud over det areal, der er direkte påvirket) 4

Total mulig ødem point 4

Total mulig primær irritationspoint 8

Fire separate formuleringer af hver forbindelse afprøvedes sammen med to formuleringer af parabener. Disse formuleringer var alle kosmetiske cremer med forskellige koncentrationer af de aktive forbindelser, som vist i tabel VIII.

TABEL VIII

Formulering Aktiv forbindelse Koncentration % Cremetype A 5-brom-5-nitro- 0,05 Nonionisk B 1,3-dioxan 0,1 Nonionisk C 0,05 Anionisk D 0,1 Anionisk E 5-brom-2-methyl-5- 0,01 Nonionisk F nitro-1,3-dioxan 0,1 Nonionisk G 0,01 Anionisk

Tabel VIII (fortsat) 21 141982

Formulering Aktiv forbindelse Koncentrationer % Cremetype H 0,1 Anionisk K Parabener 0,6 Nonionisk L 0,6 Anionisk

Tabel IX nedenfor viser et resumé af de opnåede point i alle forsøgene:

TABEL IX

Sammenligning af 5-brom-5-nitro-l,3-dioxan og 5-brom-2-methyl-1,3-dioxan med hensyn til irritation og følsomhed i et forsøg med mennesker.

5-Brom-5-aitro-l,5-dioxan

Vurdering af irritationen

Totalt antal reaktioner med point på:

Afprøvet Antal positive formulering reaktioner 012345678 A 25 1766 18 3 3 1 1100 B 41 1735 29 12 9 3 3 0 0 2 C 21 1768 18 6 1 0 1 1 0 0 D 56 1693 59 23 6 6 2 4 0 0 K 19 1771 21 5 0 0 0 0 01 0 L 20 1767 21 5 2 1 1000

Vurdering af følsomheden

Totalt antal reaktioner med point på:

Afprøvet Antal positive formulering reaktioner 012345678 A 3 197 00110 11 00 B 11 189 2 2 2 1 11 21 0 11 C 2 198 0 0 1 0 0 11 0 0 D 20 180 1 5 2 5 11 31 11 21 K 2 198 11000000 L 1 199 00010000

Indicerer hudfølsomhed 22 141982 5-Brom-2-methvl-5-nitro-l,3-dioxan

Vurdering af irritaionen

Totalt antal reaktioner med point på:

Afprøvet Antal positive f ormulering reaktioner 0 1 2 3 45 678 E 13 1787 13 0 0 00000 F 26 1774 23 2 1 00000 G 25 1775 22 1 2 00000 H 25 1775 21 2 2 0 0 0 0 0 K 20 1777 19 4 0 0 0 0 0 0 L 24 1776 22 2 0 00000

Vurdering af følsomheden

Totalt antal af reaktioner med point på:

Afprøvet Antal positive formulering reaktioner 0 l 2 3 4 5678 E 0 200 0 0 0 0 0 0 0 0 F 0 200 0 0 0 0 0 0 0 0 G 0 200 0 0 0 0 0 0 0 0 H 2 198 2 0 0 0 0 00 0 K 1 199 10000000 L 2 198 2 0-0 0 000-0

Fra tallene i tabel IX er det klart, at 5-brom-5-nitro-l,3-dioxan har en tydelig følsomhedseffekt, idet 11 ud af 200 personer vurderedes som værende følsomme over for en koncentration på 0,1 procent af forbindelsen ved følsomhedsforsøget, medens ingen af de 200 personer var følsomme med en koncentration på 0,1% af 5-brom-2-methyl-5-nitro-l,3-dioxan. Et pointtal på 5 til 8 dømtes at være indikativt for udvikling af hudfølsomhed over for den afprøvede forbindelse. Endvidere var irritationspointene for forbindelsen 5-brom-5-nitro-l,3-dioxan alvorligere end de, der er anført for 2-methyl-derivatet.

De aktive forbindelser har den vigtige egenskab, at de er opløselige i vand i en udstrækning på op til 1,5% og i mineralolie i en udstrækning på op til 1,1%. Denne værdifulde egenskab gør disse for- 23 141982 bindeiser særdeles nyttige som aktive bestanddele i antimikrobielle midler til konservering af kosmetiske cremer. Effektiv konservering af en kosmetisk creme kan gennemføres ved at inkorporere fra 0,01 til 1,5%t fortrinsvis 0,1 til 1,0% af en sådan forbindelse. Præparationen af en typisk kosmetisk creme under anvendelse af 5-brom-2-methyl-5-nitro-l,3-dioxan i en koncentration på 0,1% som aktiv bestanddel i et konserveringsmiddel er eksemplificeret i eksempel 5.

EKSEMPEL 5 7,5 kg af en ikke-ionisk overfladeaktiv kosmetisk baseret creme fremstilles som følger:

Tilsæt til en første egnet beholder fase I:

Tung mineralolie 1,875 g

Cetylalkohol 300 g

Hvidt voks 450 g

Vandfri lanolin 225 g

Sorbitan monosterat 300 g

Polyoxyethylen (20) sorbitan monosterat 450 g

Opvarm fase I til 80°C under kontinuerlig omrøring og tilsæt til en anden egnet beholder fase II:

Renset vand 3,750 ml

Opvarm fase II til 80°C.

Tilsæt fase I til fase II under kontinuerlig omrøring.

Fjern varmen og lad blandingen afkøle til 45°C under kontinuerlig omrøring.

Sæt til en tredje egnet beholder fase III:

Polyethylenglycol 200 93,7 g 5-brom-2-methyl-5-nitro-l,3 dioxan 7,5 g

Opvarm til 45°C til opløsning af forbindelserne under omrøring. Sæt fase III til reaktionsblandingen mellem fase I og fase II ved 45°C og bland godt under kontinuerlig omrøring.

Fyld op med vand til 7,5 kg, d.v.s. 200 ml vand·

Afkøl til 37°C under kontinuerlig omrøring.

24 141982

De aktive forbindelser i konserveringsmidlet ifølge opfindelsen er effektive antimikrobielle midler til hindring af væksten af mikroorganismer, der er valgt fra gruppen bestående af gram-positive og gram-negative bakterier samt svampe. Væksten af sådanne mikroorganismer kan hindres ved at bringe disse i kontakt med en mængde af en sådan forbindelse, som er effektiv til at hindre denne vækst. Effektive mængder af forbindelserne varierer fra så lidt som 0,01 vægtpct. til 2,0 vægtpct. af denne blanding, hvori forbindelsen er inkorporeret, fortrinsvis 0,1-1,0 vægtpct.

Typiske sammensætninger af sådanne midler, og koncentrationen af den aktive forbindelse deri, er anført i eksemplerne 6-12.

25 141982 EKSEMPLER 6-12

Antimikrobiel opløsning: 95% SD3A Alkohol 50 dele

Ionbyttet vand 49,5 dele 5-Brom-2-methyl-5-nitro-l,3-dioxan 0,5 dele

Antimikrobiel salve:

Polyethylenglycol 300 49,5 dele

Polyethylenglycol 1500 49,5 dele 5-Brom-5-nitro-2-n-propyl-l,3-dioxan 1,0 dele

Antimikrobielt pulver:

Talkum, U.S.P. 99 dele 5-Brom-2-methyl-5-nitro-l,3-dioxan 1 del

Shampoo:

Natriumlaurylsulfat 40 dele

Kokosfedtsyre-diethanolamid 6 dele

Ionbyttet vand 53 dele 5-Brom-2-ethyl-5-nitro-l,3-dioxan 1 del

Antimikrobiel sæbe:

Kokosolie-glycerider, natriumsalt 60 dele

Oksefedt-glycerider, natriumsalt 39 dele 5-Brom-2-methyl-5-nitro-l,3-dioxan 1 del

Antimikrobielt rensemiddel:

Fedtalkoholsulfat (natriumsulfat) 25 dele

Natriumcarbonat 7 dele

Natriumsulfat 15 dele

Trinatriumphosphat 40 dele

Pentanatriumaminotrimethylenphosphat 10 dele

Carboxymethylcellulose 1 del 5-Brom-2-methyl-5-nitro-l,3-dioxan 2 dele