DK141999B - Fremgangsmåde til fremstilling af antibiotisk stof betegnet 30.504 RP, dets metalsalte og dets salte med nitrogenholdige baser. - Google Patents

Description

(11) FREMLÆG6 ELSESSKRIFT 141999 (¾) DANMARK (51) lnt 0, 3 c 12 p ^,06 L-TMIM ΐνίΛΛΓΤίν C gy g jj/qq «(21) Ansøgning nr, 5Ο65/77 (22) Indleveret den 15·· nov · 1977 (23) Løbedag 28. feb. 1975 (44) Ansøgningen fremlagt og fremlæggelsesskriftet offentliggjort den 4» SUg· 1980 DIREKTORATET FOR ^ PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET ^ Prioritet begæret fra den

1. mar. 1974, 7407066, FR

(71) RHONE-POULENC INDUSTRIES, 22, Avenue Montaigne, 75560 Paris Cedex 08, FR.

(72) Opfinder: Jean Florent, 6, rue Raffaelli, Paris 16erne, FR: Jean Runel, 6, rue de Toul,"Paris 12eme, FR: Denise Mancy, 7 bis avenue Stinvil= le, Charenton (Val-de-Marne), FR.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Ingeniørfirmaet Budde, Schou&Co.__ (64) Fremgangsmåde til fremstilling af antibiotisk stof betegnet 50.5°4 RP, dets metalsalte og dets salte med nitrogenholdige baser.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt, antibiotisk stof, der i det følgende betegnes ved nummeret 30.504 RP, dets metalsalte eller dets salte med nitrogenholdige baser.

30.504 RP er af ganske særlig interesse som følge af dets virkning mod coccidier, der manifesterer sig ved siden af dets antibakterielle virkning og dets virkning mod malaria.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at en stamme af Streptomyces gallinarius DS 25.881 (NRRL 5.785) dyrkes aerobt på et sædvanligt egnet medium og under betingelser, der er sædvanlige for denne kulturtype, hvorefter 30.504 RP, der er dannet under dyrkningen, fraskilles, eventuelt i form af et salt, og renses.

141999 2 30.504 RP er karakteristisk ved, at det har følgende fysiske og kemiske egenskaber: udseende: hvidt, mikrokrystallinsk pulver, opløselighed; 30.504 RP er letopløseligt i chlorerede opløsningsmidler, såsom methylenchlorid og chloroform, i alkoholer såsom methanol og i dimethylformamid, og det er relativt opløseligt i acetone og etliylacetat, tungtopløseligt i hexan og praktisk talt uopløseligt i vand (betegnelserne er ifølge Pharraacopée Francaise IX udgave, 2. del, side 13, (1972), procentjsk sammensætning: 30.504 RP indeholder carbon, hydrogen og oxygen. Dets procentiske sammensætning er ca.: C 69,4%, H 9,0%, O 21,0%, neutraliseringsækvivalent: 30,504 RP er et stof med sure egenskaber, hvis neutraliseringsækvivalent (bestemt i dimethylformamidopløsning ved titrering med tetrabutylammoniumhydroxid) er 830, smeltepunkt: (bestemt på en Kofler-bænk): nær 200°, drejningsevne: (bestemt på en 1%'s opløsning i methanol) den specifikke drejningsevne af 30.504 RP er ca.: [α]2°=-790 [α]206=-188° [α]^5 = -378° ultraviolet spektrum: 30.504 RP har ingen . karakteristisk absorption i det ultraviolette område, infrarødt spektrum: (bestemt ved hjælp af kaliumbromidtabletter)

Dette spektrum er vist på tegningen, hvor der udad abscissen dels er angivet bølgelængden i μ (øvre skala) og dels bølgetallet i cm ^ (nedre skala) og udad ordinaten den optiske tæthed.

I den følgende tabel I er dette produkts vigtigste absorptionsbånd i det indfrarøde område angivet i bølgetal (cm ^).

3 141999

Tabel I.

3440 P 1325 m 915 m 3030 ép 1315 ép. 880 f 2960 F 1295 ép. 865 tf 2938 F 1272 m 845 tf 2880 F 1225 f 825 f 2855 ép. 1200 tf 792 m 2540 tf 1172 m 775 f 2060 tf 1140 m 735 f 1945 tf 1115 ép. 700 f 1900 tf 1100 ép. 675 ép.

1785 ép. 1085 F 655 f 1705 F 1070 ép. 630 ép.

1632 m 1045 ép. 615 m 1622 ép. 1038 F 565 ép.

1535 tf 1012 m 525 m 1458 F 980 F 495 m 1405 ép. 958 F 465 tf 1380 F 935 m F = kraftig m = middel f = svag tf = meget svag ép. = skulder

Chromatografisk vandring: 30.504 RP kan karakteriseres ved opstigende tyndtlagschro-matografi på silicagel under anvendelse af to systemer af opløsningsmiddelblandinger : ethylacetat/cyclohexan/vand/butanol (i volumenforholdet 50/50/25/5):

Rf = 0,45, methylenchlorid/methanol (i volumenforholdet 94/6): Rf = 0,55. Bacteriostatisk virkning in vitro: 30.504 RP har en bakteriostatisk virkning, der især udøves på visse grampositive bakterier.

Den bakteriostatiske virkning af 30.504 RP over for et vist antal organismer er bestemt ved en af de fortyndingsmetoder, der sædvanligvis anvendes til dette formål. For hver organisme bestemmes den mindste koncentration af det aktive stof, der under definerede betingelser forhindrer organismens synlige udvikling i et egnet næ 4 141999 ringsmedium. Resultaterne af de forskellige bestemmelser er sammenfattet i den følgende tabel II, hvor de minimale, bakteriostatiske 3 koncentrationer er angivet i mikrogram stof pr. cm af næringsmediet:

Tabel II

Minimale bakteriosta-

Undersøgte bakterieorganismer tiske koncentrationer _(i pg/cm3)_

Staphylococcus aureus, stamme 209 P - ATCC 6538 P 0,2

Staphylococcus aureus, stamme Smith 0,5

Sarcina lutea - ATCC 9341 0,9

Streptococcus faecalis - ATCC 8043 0,1

Streptococcus pyogenes hemolyticus, stamme Dig (Insitut Pasteur) 0,2

Diplococcus pneumoniae, stamme Til (Institut Pasteur) 0,05

Neisseria catarrhalis (A 152, Institut Pasteur) 6

Bacillus subtilis - ATCC 6633 0,2

Bacillus cereus - ATCC 6630 0,1

Mycobacterium species - ATCC 607 6

Escherichia coli - ATCC 9637 >150

Shigella dysenteriae, Shiga L (Institut Pasteur) >150

Salmonella paratyphi A (stamme Lacasse, Institut

Pasteur) >150

Salmonella schottmuelleri (paratyphi B) - (stamme Fougenc, Institut Pasteur) >150

Proteus vulgaris >150

Pseudomonas aeruginosa >150

Giftighed:

For kyllinger er DL^g 85 mg/kg ved en enkelt, peroral indgivelse.

Virkning mod coccidier:

Virkningen mod coccidier er bestemt på kyllinger, der især er blevet inficeret med Eimeria tenella og Eimeria acervulina.

Virkningen'af 30.504 RP, der er inkorporeret i kyllingernes føde, mod coccidier viser sig ved ugiftige koncentrationer på 0,005-0,04 vægtprocent af produktet i foderblandingen.

5 141999

Virkning mod malaria; 30.504 RP har desuden en virkning mod malaria ved eksperimentelt fremkaldte plasmodiuminfektioner hos mus og kyllinger.

Organismen, der producerer det antibiotiske stof 30.504 RP, er en stamme af Streptomyces, der er isoleret fra en jordprøve, der er taget i Indien, og denne organisme betegnes ved nummeret DS 25.881. En prøve af denne organisme er deponeret i Northern Regional Research Laboratory of the U.S., Department of Agriculture in Peoria, 111.

(USA), hvor den er indregistreret under betegnelsen NRRL 5785.

Denne organisme, der har egenskaber, der ikke gør det muligt at identificere den med en allerede beskrevet art, må betragtes som en hidtil ukendt art og har fået betegnelsen Streptomyces gallinarius, DS 25.881.

Denne stamme er blevet isoleret under anvendelse af den sædvanlige metode, der består i at suspendere en lille mængde jord i destilleret, sterilt vand, at fortynde suspensionen til forskellige koncentrationer, og at udsprede et lille volumen af hver fortynding på overfladen i petriskåle, der indeholder en næringsagar. Efter inkubering i nogle døgn ved 26°C, hvorved mikroorganismerne udvikles, fjernes de kolonier, der ønskes isoleret med henblik på en fortsat undersøgelse, og de udsåes på næringsagar for at opnå større kulturer.

Streptomyces gallinarius, DS 25.881 danner cylindriske til ovale sporer, der måler 1,0-1,2 μ/0,8-1,0 μ. Dens sporoforer er anbragt i klaser, og de sporedannende filamenter, der er bløde og bugtede, oprulles ofte i enderne og antager enten en let ombøjet form eller danner en spiralformig vinding, undertiden flere. På grund af sporedannelsesmåden hører denne stamme til gruppen Retinaculum-Apertum ifølge Pridham's klassifikation.

Streptomyces gallinarius DS 25.881 udvikles godt ved 26°C og ved 37°C, men ikke ved 50°C. Den har et sporedannende luftmycelium med grå farve. Det vegetative myceliums farve går i almindelighed, afhængigt af kulturmediet, fra gul eller gråliggul til brungul eller gulbrun. Bortset fra en særlig produktion af opløseligt, brunligt rosaviolet pigment på en agar ifølge Hickey og Tresner giver organismen på alle kulturmedier, hvor den er blevet iagttaget, en produktion af opløseligt pigment, der i almindelighed har en ringe intensitet, og som går fra brunliggult eller brunliggråt til gulbrunt.

I kulturer af organismen, der er inkuberet ved 26°C, har den følgende, biokemiske egenskaber: 6 U1999 produktion, af melanin: negativ produktion af hydrogensulfid: negativ tyrosinase: negativ gelatinesmeltning: positiv udnyttelse af cellulose: positiv dannelse af nitriter ud fra nitrater: kraftigt positiv, både i nitratholdig næringsbouillon og i syntetiske medier hydrolyse af stivelse: positiv kultur på skummetmælk: peptonisering uden koagule ring surhedsgraden stiger ganske let.

Kulturegenskåberne af Streptomyces gallinarius DS 25.881 er sammenfattet i den følgende tabel III. Det er egenskaberne af kulturer, der har nået et godt udviklingsstadie, dvs. 2-3 uger ved 26°C, hvor der ikke er angivet andet. Disse egenskaber er iagttaget på næringsagar og bouillonen der sædvanligvis anvendes til bestemmelse af morphologiske egenskaber af Streptomyces-stammer, idet der ved kulturer på agarmedier anvendes skråagar. Et vist antal af de anvendte kulturmedier er fremstillet ifølge de opskrifter, der er angivet i The Actinomycetes, S.A. Waksman, s. 193-197, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., USA, 1950, og i dette tilfælde er de angivet ved bogstavet W fulgt af det nummer, de har i dette værk. Referencerne eller sammensætningerne af de andre medier er følgende: - Ref. A - "Hickey and Tresner's Agar" - T.G. Pridham et al. - Antibiotics Annual, 1956-1957, s. 950 - Ref. B - "Bennett's Agar" - S.A. Waksman - The Actinomycetes, bind 2, s. 331 - nr. 30 - The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961 - Ref. C - Opskrift W-23, tilsat 2% agar - Ref. D - "Yeast Extract Agar". T.G. Pridham et al. - Antibiotics Annual, 1956-1957, s. 950 - Ref. E - "Tomato Paste Oatmeal Agar" - T.G. Pridham et al. - Antibiotics Annual, 1956-1957, s. 950 - Ref. F - "Melanin formation medium" - S.A. Waksman - The Actinomycetes, bind 2, s. 333, nr. 42 - The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961 - Ref. G - W.E. Grundy et al. - Antibiotics and Chem. 2, 401, 1952 - Ref. H - "Inorganic Salts - Starch Agar" - T.G. Pridham et al.-Antibiotics Annual 1956-1957, s. 951 - Ref. I - svarer til opskrift W-l, hvor 3% saccharose er erstattet 7 141999 med 1,5% glucose - Ref. J - svarer til opskrift W-l, hvor 3% saccharose er erstattet med 1,5% glycerol - Ref. K - svarer til opskrift W-18, hvor 3% saccharose er erstattet med 1,5% glucose - Ref. L - svarer til opskrift W-18, hvor saccharose er udeladt og erstattet med små filtrerpapirbånd, der delvis er nedsænket i væsken -Ref. M - "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" -Society of American Bacteriologists - Geneva, N.Y. H^q - 18 - Ref. N - "Plain gelatin" - fremstillet som angivet i "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" - Society of American Bacteriologists - Geneva, N.Y. 11^-18 - Ref. P - Skummetmælkepulver (handelsvare) - rekonstitueret - Ref. Q - Medium, der er angivet til undersøgelse af produktion af H2S af H.D. Tresner og F. Danga - Journal of Bacteriology, 76, 239-244, 1958.

i 8 141999 rt *· -η tn u -π d Ο) 04 54 -P Ή Μ W Ό 0) i-4'd · oil (u\(d<u<UH<i)d(i)

oh i—I >0 3 ίΤίβΗΛίτΙ M

<D -H ‘ Λ C O 0) S t> 0)

J-j tyi +) «-CN Q) Q) CD H

(DO) μ « 4S04JJ1 -um c j) jin cd'H'dca) 0(D 44 54 I _54(dOOdO)gd .,-1 ,£* moo3. (DUrl 0) 54 0) +itn ·η & - 54 0) Xi - li Od (C-r4 M tn r4 Ο Ο 54 QI+J'd'H^

> g 54 Ό »1M o Ufl ® EIH4J

54 <d a) c j) Hri o ft® ai-nii) n) n 0) ,¾ Xl -Η H d) I 5401+>+)·Θ.βΜ(0 mod h ®rico o d C^rQ d *ri Ό XI -Η 44 >i> J, Ο XI W ΟΡΕοΒΌδΛΟΑΜί ( " , 4J +) I d ’j β ijl <D H d mi H +) Η I 9 54 φ £ i—f+i&iO O' O' XI Λ II ftS 33 S3 ft 43 «ft 43

ft! Is B* gg 65 HO

o ft ffl M ra Ο) X 01 r4 HWi-l

(DO1 +1 I 43 I

τσ CD -P CD Ai 4J S»A! +* tic 3 3 3S*> -S' 3®> 3 u -p m **§ .3 ♦‘«g v 5 Λ ,,3 3 +J.P 44 od X +4 - 44 · Q 44

H S 44 ϋ (S 3 «id 54 Ό 0>·Ρ44 S'"0 3 S'o'^X

f-4 > 44 >,Ό-·Η 54 O' d ZlS1? 3_li3 3j2 3·Η+ι3 Η I (d c (D H tJi(D «H-H-r! Η-Ρ^Η·Η5-Τ ΰ , m *"5 +11)4 43 54 0) 0) 44 44 flHH ; 3 2,3333.14 2,3 1-4 W Sm Ο O rn h d ·Η old 54 44 -r4 O' !> ·ι4 o(d Ό 44 Η old O' P> 3 dodS,| >.So £ &S3 £13 £ ft§3 & &11 Λ -

51 I

H 1 3 0 3 ,_! H

a) -H d --4 Η Η M

O tn O' > 3 d 3 >1 o' d 2? S' £

Skas+Jd S' g j (U X! CO 54 3 2 3 -ph >ιΛ ,, 3 £ 3 > 1-4 W 1-4 44 d X! g 4 ® d r4 3 ? rt, 2

44 CD 0) i4 d $4CU H

(d—'54^44 O' X! ^ XJ

44 · d ι4 Ή (US-PtDd j · “ 3 tn · η ο* d 44 2 2 51 s

<u>didS4<u · ® J

> ~ 44 m λ h > >m > m g1 O' O' S' -H -r4 -H 3 Η Η · H rj 44 a) a) <y > d Ό Ό i Ό -o 54 0 a)o ocuooo >3 tji U E4 O' C3 E-ι O' &4 O' g §fl) <D 0) Q) Ό 44 CD Ό O'

•H O' O' O' O' 0) 44 O' 0) O

Ά rl O' Η H H S d H g I

ω so ^ & —- ©—· s n--' s η m

g 1)4 PC 04 -P P3 04dU04g4JQ04gO)44 H

p -r4 i>i <U -r4 44 Ή Ο ·ι4 d Cfl ·Η d g 0) o Q) d · 0)· CD · X 44 · X 0) 44 -P · 44 P 44 tQ 04 54 d *44 PP04pT30)04 PrdPd4404 1-4 tdoo)0) (ddfl) ίο®® (ΰ·Η5ι® id-ri>Sid® d O'-Η 54 P4 ΟΌ)« 0'S« 0154¾¾ 01540054¾

Sad C 2 E-ι — 4IB- CM— c CO O'— c CO C 44 44 — g 141999 ·► g s

•ri I O

C S +> to (O O ret t n

ri «uh m C

Q) M ftJ fd

U> I S +> o H

O C G *h tn O) Ή 'θ. C tn

}-) tr> td Ή m ή O

φ (i Ό (0 u G C S <U tn o tu ow -u to td Ηΐ -H 0) -W >

.jj [fl +> r-l · HtO

(0 Ή Λ ή Ή > g Μ 3-ΡΉ C Λ +> μ 5 <U Ό Λ <ϋ <ϋ G <d <υ +; χι ο tnxi +ι η η to Ο td G <U G 0) Ο td X! ·Η ,¾ fe G ίΰ +ι tog Ο Λ to +1-Ρ +ι +ι tnn tn tn td 3 <tl •ri > tn > +i

r-i +i to tn to G

O) ΰ ·Ή 3

0) Q) +1 H +1 +> G -G +> +J

©. g <1> G tU (Di tu tu <u

h & tn G +· b>H +J +i +J

Dj-G tU G C tud C c! S3

0 Dj S Λ η Etn Η Η H

J»-** +1 (0 tn i to 0) O I tu · +> τ) tu +> i S g g +i G °id g *d tn Ό O · O O Cn

O ΛΡβ 1-1 -ri .14 —. fe Dj -H

Ή +) ·Η 0) Η > <U G 10 H

— (O^rlSo · G · X! G O · ,:¾.i

,14 <U <U G S +Jo(d+i ^ O ft +) -Η +1 -U

h fy +> u td 3 tntJ <U m to tn CnO tu H > +1 >μΠ3 ·η ·η η -η G 'Ί ΤΙ Η i (tf g <υ r-i r-l+lAj+l-'rlHm +1 +> +J ^

OtU-ridJ+l OS 0) <U titD-ri h tHgi+ioa -g tn > +1 tn G -h g -P +J -H tn > tu 3 O 3 ft>i > ΦΌ G -G Φ >0 C c £,2¾ XI Χ| '-Ή 10 g MEGHr-igffiM H H ffiSd td 61 g § bi H tu .

H >0 1 rj φ "ri β β

S to F* P

>, tyi +) -P G h +> g G td G G Λ Λ '“j (U Λ G G 3 +JH G G 4J -JJ tn > h to +1 XI X! tn tntu ΗφβΗ Η H <0 td to +j tu G G G >+i >>i id g t n tn tn to h to m +i · G S.

(U2+i· · · · tn · +> · bl. HE S S S tn SH s (U i> G · * * · Η · S3 * >η·λ; > > > > η > tn > to tn G tn •G H +1 +1 +> rH rH td (O ·«

M 0) G +1 G <U +· <U G

•h U S tu tutu tn tu tn tu > td g ti td tnO G tn G ti

ti G <U O O <UQ rj Jlyl O

G) tn E-t tn S SS K S G S

g i fe i

G G +J Q) · (U g I

•ri r, id tnft; g t+i tn G i to »O totn OtttUH-H G <0

φ I Ild tJ G|«HO<®.>iOrT.i-I II

g OJlStO φΰ+ΐβίΰ^-ΐΗΛίΗ U S <UG M tOG^b> g-riKnJ -HtO ld G r^to-ri G OO G ^ to ,14¾ Φ G GO+J· X) G OJ O tn ^ 4J O +> G -G tn G O (U to -G G -G td 4-t , I G 1 t O td ft cn

h G Di td ft I G ft GhH G d (d Ό Η o td t n I G ft id I

G Htutnft!!s tn^fy-GtutdtnfttUidOc; > id E5 h id t n |s fe OfeidS'-' <; u tT+dri <ϋΐ g g- o i w t3 Dj id ^ 10 141999 ·· I 1 to 1 1 0) 5-1 I h "C OOH ø m ' m id - c ή <u >

mi b. a)°0)rGM0)-Pa)r-i'G

S n -H ^OM-Pd-nCMC ω

n cn .H+J'<N<HOfi-P^ltS-H

0)0 iWrn M ‘O ao) tnja nd ft * · *H

2 (Ko®®HHtOS3E tn t n <D (d

O 0) o.X MI O (d Λ O M CM

η x α)„ο)θοα,·Η ø +> ·η ø <u +) tn M ID (|Ή Bl *ÉD ΜΉ CnO rlHflH tn · (d-Hd) 1>iS Μ μη ®Ή0®Η®ΑΙΜ > g Λ · tn £ ® τ1 _ d ’Ί

μ S® OøGOMaidtDO) C > G O -P

ø χ X W s-HH ® Oti ® ® ® 0) Μ -M

raoto flLriSrioiiBs+i'a -PO røcn

,Q -H >1 +) >1 > "ti * 0)HmCC0)-rJ>iO

ΟΛ Βί5υοβΗ·ΗίΛο®®β·μ an

I M -P

P i C 1 , |. ® j?

tn H 3 ^ rj P

h-p Ene .O * <U|d4J(Dtn4J

0) C 3 r* tn tn S m +ι h -P -P -P -p in -h -p -P ·η

•ft g &1Λ Οι-P tn G tu H <D <D H

rH tn Id tn Id «id i?d α,-H > -H > M >MG0)3G0)3 OPjWHjjWG’ mil HrllT H i ttl +J Φ . .

I® ri 1 I ti t n Cn X >i 0) d -P <uo ϊ ®

M 'dtu -P i5 MT; -P

O ord g Ό \otd 31-1¾.¾ · tn «Η Λ 3 G -P Μ ^ ·Η g £ £ ^

— i»·pø Ό t n -p -P K ndH

a ΜΗ ·Η 0 g \ tJ! ^ y · h k4øøcg>x5r}j-io·1 ^ ®2 +| η « -P o td 3 il Si ή tn\ ^ Λ Ό o Η κ +) >i>d -H ¢0¾ Q Ί-Ι +> £ tn rH ,, 1 Id β 0 ri -H g g rH old ® m i—I 4JM^M® H mOMJJ^ r-H 0 -H <D 0)

0) m g m o o o(dH-tj-ri tn«d <u =<d cn > -P -P

Λ 3 O 3 Or >i Μ -H g, > 0) M ^ ,¾ ® 3 £ £ 0 |J| ring u -P φ « t n t n ,9 C5S3H h gi S *

3 III

hø Cn tn tn i—i 'ΰ ’Ί 'Ί !lj

0 -H C H rH rH

n w d β ofo oio >. cn u g ft ft g M Id Xt M Cn Cn Q) Λ η Λ -P rH 3 ft ft > H 10 +> t n -M tn tn H 0 C H tn ® ® 4j 0 3 0) >1 > > idr-vMOi'd h tn tn

-P · 3 -M

ø2+)· tn ·+)·+) · -P

g> -H g tn SHgHSH

0)>3· (d *3 «g, * g, >'-'X >m > tn > tn > tn tn

Cn C Cn

H -H +) -P

rH rH Id td X 0 Ό M -P M 0) 0) H'dSoa) tu 0) dl tn *> id g tj> ό tnO c c *d M tn o <u Q χ) d D t n E-i S SSOiIPh ml ·η Ml M 0) -H 1^ ?øHg c d Id- Id m Φ Cm x ft id |MX Cn id η X tn o ø Ητΐ i d ø μήλ- ød

g OCn&tUm-H-H'dK· øtn -HIO&-HI3H

M M d- g” C -Η ,^πΐ^.ρχιΰ'-'.ΡΧΗ 3 (DM ø id d) M · ø i o tu tu tn øøen·

i* OldMM>tn-PPHtH > 4J -t -y ω 4J 04 IH

rH >1 (¾ id is.j μη 0) ir| id i fiiddin end® 3 HmCntn+jOcdOPi >iN®p

X O id id < a 3 m tn"" 03+1^ cn u g M tn O

u 141999 Μ II II ·· ·· O) MM Μ Μ in

<D φ 0) Φ O

p p P PH

HH Η H β

PM Μ Μ H

p . p . P · -P · H

Η > ·Η > ·γΙ !> Η !> Φ

Cn i β η β Η β η β-Ηϋ

o β +) -P -P P

0) HH Ή ri HH Η Η H

Htyi td tn to tn β tn ixitnro φ φ O O O . $5 C β Dj β Dj ββι β ft® od) O O O O tn •H ,54 Η Η Ρ HP Η -P Η Ρ H · 4-j tn 0) P cn P tn P tn P tn Φ > td ·Η Λ Λ·Η A! H A! Η -¾ *Ί Ρ > g cd β-Ρ β Ρ β Ρ β ρ ρ ρ ^ Ιΐί Α«Η dw Ό η ΑΉ >ιΗ β\ μ w o® ο d ο in ο <d β tn

tno MM MM MM MMndO

p H (MA! IMA! (MA! Dj A! D Dj

O P

4J β

Cn β ’r-\ J-l

Η Ρ Ρ P

φ β H . ,

~ tn φ Ρ β Ρ Ρ -P P

p ^StJi&itUtU Φ Φ

β H&cd&i-P-P Ρ P

tn c^h η ββ β β

p Q D W Η Η Η Η H

M

H tn Ρ P

— tu o tu i ω Ό <U r—I · ΟΆ p ^

Η °β g Ό Η Μ Φ -M 5* S

Η ϋ3β BO S> g *

H p Η Φ ft 'S Ti ft <9 S

Β ΜΗ β« · tn · β O

H ,¾ Φ ID fi β Ρ Ρ , ,ίϊΗ^ϊί O) fflp O Λ P OH CnP p'β φ β Η n S Ρ Η Η Η β , tn Η Η β Γ β Ε φ Η Η φ ΗΜ Ρ Ρ -ΗΡΑ! Ρ β E-t Ρ Η Ρ Η Φ It! TS Ό Φ · Φ ® SULT? 3

IHglHOO ΉίΙ HOP Ρ Ρ °β tn > ftP

3 Ο β &> > Ρ > Ο φ β β ΜΦ'ββ J^Hing Μ « SC S Η Η Η t5 S β Dj Η % tn

Η φ Η I I I

Η Ti I Η tn Ον tn Φ Η β β β 3) β Ο 03 β β β β β >ι & Μ Μ Ρ ΙΗ , Ρ , £ Μ β Ρ Ρ Μ Μ β ΦΡ 'β - β _*· β ρ Η Ρ Η ti ρ τ} Ρ ΌΡ Ρ > Η tn tn Η HH Η Η Η Η Η φ β β Ρ >β >β >β Ρ φ > Ρ Ρ A! Η Α! ΡΑ! β ^ Μ tn Η Cn tn Ο1 tn .μ . β β Ηφ Η tn Η Οι Η tn φ g Ρ · tn Η Τ3 Η Η ΗΗ ΗΗ tn · η S tn ·β β »β Ρ »β Ρ ·>β Ρ Φ > β · η μη Μ tn Μ tn Μ tn >'-Ρ>Η C3P Ο β Ο β ΰΦ tn tn β Η Ρ Ρ Η Ό β β ,4 β Ρ Μ Μ ΡΦ Ρφ ΡΦ Η Μ Φ Φ Φ Φ Ο Φ Ο Φ tn > Cn Cm3 β! Cn β Cn β εη β 1¾ 0)0 Ο ΦΗ Φ Η ΦΉ D> SS S S Μ S Μ gu ε η ι ρ 3 Μ Ο Η ι I — Φ -Η βΗ^Η— βοο ιη ι · τ3 Λ Οι Φ iHcnp PH Ρ Ο Ρ β Η Φ ιηβϋο «βπ β β υ ι tn β υ ~ tn β η φ ε η 1 >iCD tnOI Η I οοέ Η I ΟίΜ HI ΟΗί Μ Ρ Ρ Η ,Η Ρ !S Ρ Ρ Η β w Ρ Ρ Η Η Ρ Ρ Η φ β φ φ Cn · rnl'-' φ Φ Η Φ Φ ΦΗ 0> φ Φ Η Ο Ρ ρ Ο, ΙΗ ζ. Ρ Ρ ftH φ Ρ ΟιΗ Η Ρ Dj Η φ Η β β T3 Φ ·Η cd β ί β ββ Μ β β β Τ3 Φ β « ββ Μ β >ιΝ φβ ρΜΟ >ιΝ Ο Φ Ο >ιΝ Ο φβ >ι Ν Ο Φ Ο Μ cnug— U pH W U Ρ g Μ WUPg'-f W Ο Ρ β Π 12 141999

.. . I

Μ ti , <D O Ή

+> ,14 β Η I

P »· H g +> μ > β Ό +) ·· o β +ι . ·η Q) η ω m m

cni -rl> +) τ) β cm CMP

0 β C-H H β <P «. · B +3 O

u <U -P m νοτ> P»p

Utn ιρ ·Η O (31+1(1)((-1¾

3¾ rd CO Λ β 0) β β β (Ρ (P

c O -H Hl P 0(fl Ό (tf •ri X O O1 <D · O ^- +> +3 03 -H +j C · 03 O'-Η H -rj 0) CO-H +> 0> -H+) Ή fit) -p > Η · j> g ρ 24 H β β StI pm ϋ·Η

ρ § ΰ) 3 4J +i P OPffiftP-PiPO

d) ,¾ >Q Ό «Ρ i-HOT +> ΰ) > Ό (tf 0) fi

ω O (0 O (tf 4) Ό aH I ® O birQ P

,Q .p 24 PP SO (D3B ‘ POJStf

Ofl in fii x w g a O' ft10 a C (tf +* +1 tyl •h ti rp +1 O'

d) β H

03 Q) -P +3 +3 Η I +3 ·& g d) d) t n C o)

H & +> +1 [tf S -P

a -π c c > p β 0 a η η ω λ η

K»~S

+> β Η 03 6i r* +1 Q) O , f

Ρ Ό 0) H

o OH) +1 Ό -HP · P

m Λΰ)β E( o (JO

« jj ή o) a Ό a 0) Ρ Η β ~ * 03 Η 03 η ^imicg -p, >, Η fij +1 Ο β 3 ΟΉ Λ ·Η Η > +3 >,O ·Η Η 01 ) m g HIH +> Hd) HO) +1 -Ρ η +3Ή 5 Ρ 0) 0) Ότι Ητ) 0) d) <1) (Ρ S Ή Ο Ο +3 Η d) «Κ! 0) -Ρ -Ρ λ β ο β a >ι β >+> ρ +» β 6 (Β Η'-Η 03 g Η Μ 03 Ο 03 Η Η ΕΗ •Η d) η τ) 0) Η θ' Η Ο 03 β I β θ' ·Ρ +3 Η 01 -Ρ g Ρ β Ρ β β Οι β 0) Λ β Οι Η β +) Η β Ρ , Η Ρ > Η 03 β Λ -Ρ β Λ Η 0) β Ρ Η 03 β Η +ι 0) Λ β >) Ρ β β — Ρ θ' θ' Η Λ θ' +1 · β ·Η +> Q)g+1 Η · · β +30» ·

01 ·Η Η g go 03 β S

(!) > β β · · Ρ >ι·Η · >^Χ ο > > Λ HP > 0) Οι β •Η Ό +3 -Ρ Η β β β X Ρ Ρ Ρ •Η 0> 0) Ο > Ό Ό Ό Ό τ) Ό 0.00 Ο Ο d g ο ω ο a

S G'r-f (U

β ·Η Η g β X d) _ •Η τ) β ·Η I Η θ' Οι

τ) ΗΟ·+> ο(0 Η ro HO

d) ο λ (ρ β ^ ad) g — & — s +i + β (ρ ρ σ ρ 4J οι Ρ5 d) ω ριρρ— d) ·η ΰ) β β β" οι- · β ο ο) η g · ββ· +ι ρ·ρ aoiw+i+3>cm1(p pm Οίρ η +) Ρ β β Μ 11 Η ΡΉ I 3d) β Ο) β 0) β pieo φηβ θ' ρ β Pi ¢¢1 aOH Pi'-'-' w^m'- w- rtltiQ'- 13 141999

Streptomyces gallinarius DS 25.881 har et sæt egenskaber, der ikke falder nøjagtigt sammen med egenskaberne af nogle af de allerede beskrevne stammer, og den må derfor betragtes som en ny art.

Ved at betragte de arter, der er beskrevet i "The Actinomycetes" (bind 2, S.A. Waksman, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961) samt i Bergey's "Manual of Determinative Bacteriology" (7. udgave, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1957), er den art, med hvilken den logisk kan sammenlignes Streptomyces hygroscopicus. Ligesom denne udvikler S. gallinarius DS 25.881 således et vegetativt mycelium, der i almindelighed er gult eller gråliggult til brungult eller gulbrunt, og den har i almindelighed et gråt, sporedannende luftmycelium. Den danner ikke opløseligt melaninpigment på organiske medier, producerer ikke HjS og smelter langsomt gelatine, på hvilken, den ikke danner opløseligt pigment. På alle sine kulturmedier, såvel syntetiske som organiske, hvor den ikke danner opløseligt pigment, eller hvor den kun danner opløseligt pigment, der almindeligvis har en ringe intensitet, er den brunliggul eller brunliggrå til gulbrun. Ud over disse egenskaber har Streptomyces gallinarius DS 25.881 den egenskab, at den på en særlig måde kan producere et opløseligt, brunligt rosaviolet pigment på et af de medier, hvor den er blevet dyrket (agar ifølge Hickey og Tresner), hvilket af H.D. Tresner og E.J. Backus (Applied Microbiology 4, 243-250, 1956) er blevet erkendt som en egenskab ved talrige stammer, der tilhører arten Streptomyces hygroscopicus og er blevet iagttaget på forskellige medier afhængigt af stammerne. Imidlertid afviger den fra denne art ved to af de tre væsentlige egenskaber, ved hvilke den defineres. Dels svarer formen af dens sporoforer ikke til sporoforerne af arten Streptomyces hygroscopicus, og dels dannes der ikke skinnende, sorte områder i dens sporedannende luftmycelium i noget tilfælde, hvilket er karakteristisk for arten Streptomyces hygroscopicus.

Streptomyces gallinarius DS 25.881 kan ligeledes sammenlignes med Streptomyces aureofaciens, der heller ikke danner melanin, i almindelighed danner et gult til orangegult eller bananligt vegetativt mycelium, og som har et gråt, sporedannende luftmycelium. Desuden danner Streptomyces aureofaciens ikke opløseligt pigment på adskillige kulturmedier, og, når dette er tilfældet, danner den opløselige pigmenter med en gul til brunlig farve, der i almindelighed er temmelig svag. I visse tilfælde farves det vegetative mycelium af Streptomyces aureofaciens rødbrunt til purpur, men i dette tilfælde drejer det sig som et pigment, der ikke difunderer ud 1 mediet, 14 141999 og som på grund af dette ikke kan svare til det opløselige, brunlige, rosaviolette pigment, der kan produceres af Streptomyces gallinarius DS 25.881.

Desuden smelter S. aureafaciens ikke gelatine, på hvilken den danner et flødefarvet, vegetativt mycelium, og den hverken koagulerer eller peptoniserer skummetmælk, mens S. gallinarius DS 25.881 derimod smelter gelatine, på hvilken den danner et gulbrunt, vegetativt mycelium, og giver en klar og regulær peptonisering af skummetmælk. Det fremgår altså heraf, at S. gallinarius DS 25,881 ligeledes afviger fra denne sidstnævnte art.

S. gallinarius DS 25.881's evne til at udnytte forskellige carbonkilder eller nitrogenkilder er blevet bestemt ifølge princippet i metoden ifølge Pridham og Gottlieb (J. of Bact. 56, 1Q7-114, 1948). Udviklingsgraden er blevet iagttaget på det basismedium, der er angivet af forfatterne, idet glucose erstattes med forskellige carbonkilder, og ammoniumsulfat erstattes med forskellige nitrogenkil der. De opnåede resultater er angivet i den følgende tabel: 15 141999

Undersøgte udnvttelse Undersøgte Udnyttelse carbonkilder ^_ nitrogenkilder __ D-Ribose negativ NaNO^ positiv D-Xylose positiv NaN02 positiv L-Arabinose positiv (NH4)2S04 positiv L-Rhamnose positiv (NH4)2HPC>4 positiv D-Glucose positiv urinstof positiv D-Galactose positiv L-asparagin positiv D-Fructose positiv glucosamin positiv D-Mannose positiv glycocol positiv L-Sorbose negativ sarcosin negativ

Lactose positiv DL-alanin positiv

Maltose positiv DL-Valin positiv

Saccharose positiv DL-asparaginsyre positiv

Trehalose positiv L-glutaminsyre positiv

Cellobiose positiv L-Arginin positiv

Raffinose negativ L-Lysin positiv

Dextrin positiv DL-serin positiv

Inulin negativ DL-threonin positiv

Stivelse positiv DL-methionin positiv

Glycogen positiv taurin negativ

Glycerol positiv DL-phenylalanin positiv

Erythritol negativ L-tyrosin positiv

Adonitol negativ DL-prolin positiv

Dulcitol negativ L-hydroxyprolin positiv D-Mannitol positiv L-tryptophan positiv D-Sorbitol negativ betain negativ

Inositol positiv

Salicin positiv 16 141999

Dyrkningen af Streptoxnyces gallinarius DS 25.881 kan gennemføres ved en hvilken som helst aerob dyrkningsmetode på overfladen eiler submerst,. men den sidstnævnte metode foretrækkes af bekvemmelighedsgrunde- Til dette formål anvendes forskellige typer af apparatur, der sædvanligvis anvendes i gæringsindustrien.

Der kan især anvendes følgende arbejdsgang til gennemførelse af operationerne:

Streptomyces gallinarius DS 25.881 (stamkultur) agarkultur i rvstekolbekultur podekultur til gæring i produktionskultur til gæring.

Gæringsmediet Bør i det væsentlige indeholde en assimilerbar carbonkilde og en assimilerbar nitrogenkilde, uorganiske elementer, især chlorider, og; eventuelt vækstfaktorer, idet alle disse stoffer kan tilføres ‘i? form' af veldefinerede produkter eller komplekse blandinger, såsom biologiske produkter af forskellig oprindelse.

Som assimilerbare carbonkilder kan der anvendes kulhydrater, såsom glucose, saøcbarose, maltose, dextriner, stivelse eller andre carbon- og hydrpgenholdige stoffer, såsom sukkeralkoholer (glycerol) eller visse organiske syrer, f.eks. mælkesyre eller citronsyre.

Visse animalske eller vegetabilske olier, såsom spækolie eller sojaolie kan fordelagtigt erstatte disse forskellige carbon- og hydrogenkilder eller anvendes i forbindelse med disse.

Der findes overordentlig mange egnede kilder til assimilerbart nitrogen. De.kan være meget simple kemiske stoffer, såsom uorganiske eller organiske ammoniumsalte, urinstof og visse aminosyrer. Nitrogen kan også tilføres med komplekse stoffer, der først og fremmest 17 141999 indeholder nitrogen i proteinform, f.eks. casein, lactalbumin, gluten og disses hydrolysåter, sojamel, jordnøddemel, fiskemel, kødekstrakt, gærekstrakt, distillers' solubles og majsstøbevand.

Blandt de tilsatte, uorganiske stoffer kan visse have en puffervirkning eller en neutraliserende virkning, såsom alkalimetal- eller jordalkalimetalphosphater eller calcium- eller magnesiumcarbonater. Andre giver den nødvendige, ioniske ligevægt for udviklingen af Streptomyces gallinarius DS 25.881 og for produktionen af 30.504 RP, såsom chlorider og sulfater af alkalimetaller og jordalkalimetaller. Endelig virker visse stoffer mere specielt som aktivatorer for de metaboliske reaktioner i Streptomyces gallinarius DS 25.881, og disse er salte af zink, cobalt, jern, kobber og mangan.

Vækstfaktorerne er stoffer af vitaminnatur, såsom riboflavin, folinsyre og pantothensyre.

Gæringsmediets pH-værdi ved dyrkningens begyndelse bør være mellem 5,8 og 7,8, fortrinsvis mellem 6,2 og 7,4. Den optimale temperatur ved gæringen er mellem 25 og 30°C, men en tilfredsstillende produktion fås ved temperaturer mellem 23 og 33°C. Beluftningen af gæringsmediet kan varieres inden for temmelig vide grænser. Det har dog vist sig, at beluftninger på 0,3-3 liter luft pr. liter medium og minut er særlig godt egnet. Det maksimale udbytte af 30.504 RP fås efter 2-8 døgns dyrkning, idet dette tidsrum i det væsentlige afhænger af det anvendte medium.

Det fremgår af det foregående, at de generelle betingelser for dyrkning af Streptomyces gallinarius DS 25.881 til produktion af 30.504 RP kan varieres inden for et stort område og tilpasses enhver speciel omstændighed.

30.504 RP kan isoleres fra gæringsblandinger på følgende måde:

Blandingen filtreres ved en pH-værdi i det sure område, i almindelighed mellem 3 og 6 og fortrinsvis nær 5, i nærværelse af et filtreringshjælpemiddel.

Mængden af aktivt stof, der tilbageholdes i filterkagen, ekstraheres ved hjælp af et egnet, organisk opløsningsmiddel, f.eks. en lavere alkohol, såsom methanol, eller et chloreret opløsningsmiddel, såsom methylenchlorid. Råproduktet kan isoleres fra de oven for nævnte organiske opløsninger ved krystallisation efter koncentrering af disse opløsninger under formindsket tryk, idet der eventuelt 18 141999 tilsættes et dårligt opløsningsmiddel eller et ikke-opløsningsmiddel og henstilles koldt. . .

30.504 RP kan renses ved sædvanligt anvendte metoder, såsom omkrystallisation, chromatografering på forskellige,adsorberende midler eller modstrømsfordeling.

Opfindelsen illustreres ved det følgende eksempel.

Eksempel.

a) Gæring: I en gæringsbeholder på 170 liter anbringes der:

Pepton: 1200 g Gærekstrakt: 600 g

Glucose-monohydrat: 1200 g

Delvis hydrolyseret stivelse: 2400 g

Ledningsvand op til 110 liter.

3 pH-værdien indstilles til 7,3 ved tilsætning af 50 cm 10 N natriumhydroxidopløsning. Mediet steriliseres ved gennemblæsning med damp med en temperatur på 122°C i 40 minutter. Efter afkøling er mediets volumen 120 liter på grund af kondensationen af damp under sterilisationen, og pH-værdien er 6,90.

Der podes med 200 cm^ af en rystekolbekultur af Streptomyces gallinarius DS 25.881. Kulturen udvikles i løbet af 21 timer under omrøring og beluftning med steril luft. Den er derefter egnet til podning af produktionskulturen.

Produktionskulturen fremstilles i en gæringsbeholder på 800 liter, i hvilken der er anbragt følgende stoffer:

Destillers' solubles: 12,5 kg

Saccharose: 12,5 kg

Natriumchlorid: 2,5 kg

Magnesiumsulfat-heptahydrat: 1,0 kg

En opløsning af 20 g cobalt- chlorid-hexanydrat pr. liter 0,5 liter Ledningsvand op til 460 liter.

141999 19

Mediets pH-værdi indstilles til 7,5 ved tilsætning af 720 cm3 10 N natriumhydroxidopløsning, og det steriliseres derefter ved gennemblæsning med damp med en temperatur på 122°C i 40 minutter.

Efter afkøling er mediets volumen 500 liter på grund af kondensationen af damp under sterilisationen, og mediets pH-værdi er 6,40. Der podes med 50 liter af den ovenfor beskrevne podekultur, der er fremstillet i gæringsbeholderen på 170 liter. Kulturen udvikles i løbet af 116 timer ved 27°C under omrøring med en turbine, der roterer med 205 omdr./min., og beluftning med 20 m steril luft pr. time. Sænkningen af pH-værdien ved dyrkningens begyndelse begrænses til 6,5 ved automatisk tilsætning af 5 N natriumhydroxidopløsning (total anvendt mængde: 0,5 liter).

Efter dyrkningens tilendebringelse er kulturens pH-værdi 7,85, og volumenet er 470 liter.

b) Ekstraktion: 1000 liter af gæringsblandingen, der fremstilles under de ovenfor angivne betingelser, omrøres i 1/2 time efter syrning til en pH--værdi på 5 ved tilsætning af 7 liter 6 N saltsyre.

Efter blanding med 35 kg filtreringshjælpemiddel filtreres gæringsblandingen på en filterpresse. Filterkagen vaskes på filteret med 200 liter vand, hvis pH-værdi er indstillet til 5 ved tilsætning af 6 N saltsyre.

Filtratet og vaskevæsken fjernes.

Filterkagen findeles i 700 liter methanol. Den fremkomne blan- 3 ding indstilles til en pH-værdi på 7 ved tilsætning af 470 cm 6 N natriumhydroxidopløsning og omrøres i 1/2 time.

Blandingen filtreres på en filterpresse, og filterkagen vaskes på filteret med 100 liter methanol.

Filtratet og vaskevæsken forenes og koncentreres under formindsket tryk (5-10 mm Hg), således at der fås 60 liter vandigt koncentrat.

Dette koncentrat indstilles til en pH-værdi på 3 ved tilsætning 3 af 580 cm 6 N saltsyre og omrøres i 10 minutter med 40 liter methy-lenchlorid. De to faser adskilles. Derefter ekstraheres den vandige fase successivt med 30 liter og 20 liter methylenchlorid.

Methylenchloridekstrakterne forenes og omrøres med 9 liter 3 vand, idet der syrnes til en pH-værdi på 3 i den vandige fase (20 cm 6 N saltsyre.). Den organiske fase fraskilles og vaskes igen med 18 liter vand, idet der tilsættes natriumhydroxidopløsning til en pH-værdi på 9,5 i den vandige fase (20 cm 6 N natriumhydroxidopløsning).

20 141999

Methylenchloridfasen koncentreres under formindsket tryk (5-10 mm Hg) indtil et volumen.på ca. 1 liter.

Det således fremstillede methylenchloridkoncentrat udhældes langsomt i 10 liter hexan. Opløsningen filtreres. Der fraskilles herved 7,5 g af et inaktivt, uopløseligt stof. Filtratet koncentreres til et volumen på ca. 1 liter. Koncentratet, til hvilket der er sat 1 liter ethylacetat, omrøres i nærværelse af 1 liter vand. Der indstilles til en pH-værdi på 3 ved tilsætning af 6 N saltsyre.

Den organiske fase fraskilles og koncentreres til et volumen på 1 liter» 30.504 RP udkrystalliserer langsomt ved henstilling af opløsningen ved +4°C. De fremkomne krystaller fraskilles ved filtrering og vaskes med 50 cm^ hexan ved 4°C og tørres derefter ved 35°C under formindsket tryk (5-10 mm Hg). Der fås på denne måde 76 g 30.504 RP som råprodukt på syreform.

c) Rensning: 3 76 g af det ovenfor fremstillede produkt opløses i 1520Jcm acetone. Opløsningen omrøres i 1/2 time i nærværelse af aktivt kul.

3

Suspensionen filtreres, og filterkagen vaskes med 100 cm acetone.

3

Filtratet og vaskevæsken forenes. Derefter tilsættes der 850 cm vaiid under langsom omrøring ved 0°C, og blandingen henstilles ved 4°C.

3

De fremkomne krystaller fraskilles ved filtrering, vaskes med 100 cm af en blanding af acetone og vand i volumenforholdet 1:3 og tørres under formindsket tryk (5-10 mm Hg) ved 35°C. Der fås på denne måde 68,5 g 30.504 RP.

d) Omkrystallisation: 68 g af det således fremstillede produkt opløses i 2,8 liter hexan. Opløsningen omrøres i 7 timer, hvorunder produktet langsomt udkrystalliserer.

Suspensionen henstilles i 15 timer ved +4°C, hvorefter krystal- 3 lerne fraskilles ved filtrering, vaskes med 100 cm hexan og tørres under formindsket tryk (5-10 mm Hg) i 12 timer ved 35°C. Der fås på denne måde en første fraktion på 54 g 30.504 RP på syreform.

Der kan fremstilles en anden fraktion ved koncentrering af moderluden under formindsket tryk (5-10 mm Hg) til et volumen på 0,4 liter og henstilling i 12 timer ved +4°C, De dannede krystaller 3 fraskilles ved filtrering, vaskes med 20 cm hexan og tørres under formindsket tryk (5-10 mm Hg) i 12 timer ved 35°C. Der fås på denne måde en anden fraktion på 10 g 30.504 RP på syreform.