DK142460B - Fremgangsmåde til fremstilling af deacetylcephalosporin C. - Google Patents

Description

(¾ \Ra/ (11) FREMLÆGS ELSESSKRIFT 142^60 DANMARK lm C|S 0 12 p 35/06 »(21) Antegning nr. 2046/75 (22) Indleveret den 15· 9pF· 1975 (24) Lebedag 15· apr. 1975 (44) Antegningen fremlagt og Q.

fremlaggelsesekriftet offentliggjort den 5 · nOV. 1 9°0

Dl REKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) Prioritet begæret fra den

15. apr. 1972, 5807V72, JP

(71) TAKEDA CHEMICAL INDUSTRIES LTD., 27, Doshomachi 2-chome, Higashi-ku,

Usaka, JP.

(72) Opfinder: Toshihiko Kanzaki, 5-20, aza-Uchihata, Obayashi, Takarazuka,

Hyogo, JP: Yukio FujTsawa, 1-57-4-15, Nakamiyakifcamachi, Hirakata, Osaka, JP: Hideo Shirafujl, 52-4, Kiriudani, Hironocho, Uji, Kyoto, JP: Ki= yoshi Nara, 55-12, Katsurainuicho, Ukyo-ku, Kyoto, JP: Masahiko jfoneda, 2-15-67 Uozakinakamachi, Higashinada-ku, Kobe, Hyogo, JP.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Dansk Patent Kontor ApS.__ (54) Fremgangsmåde til fremstilling af deacetylcephalosporlr. C.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fermentativ fremstilling af deacetylcephalosporin C (i det følgende undertiden kort kaldt DCPC).

Cephalosporinforbindelser afledt af DCPC, såsom cephalothin og cephaloridin, er højt værdsatte klinisk som antibiotika, der er effektive mod infektioner med gram-positive eller gram-negative bakterier og især mod sygdomme forårsaget af bakterier, som har erhvervet resistens mod forskellige antibiotika. Deacetylcephalosporin C er meget vigtigt som udgangsmateriale til syntese af sådanne cephalosporinforbindelser. Nye cephalosporinderivater, såsom 3-formylcephalosporinderivater, f,eks. 3-formyl-7-phenylacetamido-ceph-2-em-4-carboxylsyre og 3-formyl-7-phenylacetamido-ceph-3-em-4-carboxylsyre afledes også af DCPC. Endvidere er DCPC nyttigt som 2 142460 udgangsmateriale, ved syntese af 3-chloracetoxymethyl-cephalosporin-derivater eller 3-methoxy-methyl-cephalosporin C. Således kan DCPC forventes at blive.udnyttet mere end nogensinde som udgangsmateriale til syntese af forskellige 3-substituerede cephalosporinforbindelser.

Hidtil er DCPC blevet fremstillet ved enzymatisk deacetylering af cephalosporin C ( i det følgende undertiden kort kaldt CPC), som fås ved gæring under anvendelse af f.eks. Cephalosporium acremonium CMI-49137 eller dens mutant 3650 (ATCC-14553). Den enzymatiske deacetylering er blevet udført ved at bringe CPC i kontakt med et enzym produceret af en mikroorganisme hørende f.eks. til slægten Streptomyces eller Bacillus (beskrevet i USA-patent nr. 3.304.236). Disse metoder er ikke fordelagtige industrielt set på grund af nødvendigheden af ' to gæringstrin, nemlig fremstillingen af CPC og deacetyleringen af det således fremstillede CPC.

Det er blevet rapporteret, at en spormængde af DCPC findes i gæringsvæsken, opnået ved fremstilling af CPC ved gæring, men det er blevet opklaret, at DCPC dannes ved ikke-enzymatisk hydrolyse af CPC (Applied Microbiology, 16, 1011-1014 (196$), F.M. Huber et al.).

Til direkte fremstilling af DCPC i store mængder har det således været nødvendigt at nærme sig problemet fra et helt andet udgangspunkt end de kendte metoders.

Yderligere undersøgelser, der ligger til grund for den foreliggende opfindelse, har ført til den nye erkendelse, at visse mikroorganismer, der hører til slægten Cephalosporium,direkte kan producere DCPC i kulturmediet i store mængder.

Denne fremgangsmåde er ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at man dyrker en mikroorganisme, der hører til arten Cephalosporium acremonium, og som er i stand til at producere et stof, som viser meget svag aktivitet mod Alcaligenes faecalis ATCC-8750, men hvis UV-absorption ved 260 πΐμ. forsvinder ved behandling med cephalospo-rinase, i et dyrkningsmedium, indtil deacetylcephalosporin C er akkumuleret i væsentlig grad, og isolerer deacetylcephalosporin C

3 162460 fra kulturvæsken.

De til fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendelige mikroorganismer af arten Cephalosporium acremonium kan isoleres fra naturlige kilder og* kan fås fra typekultursamlingerne.

For at bedømme, hvorvidt en mikroorganisme er i stand til at producere DCPC, kan man f.eks. anvende følgende procedure.

Det er kendt, at Alcaligenes faecalis ATCC-8750 kun er meget lidt følsom overfor DCPC, men yderst følsom overfor CPC. På den anden side dekomponeres både CPC og DCPC let af cephalosporinase, og man kan let konstatere, hvorvidt de er dekomponeret eller ej ud fra en konstatering af, om deres ultraviolette absorptioner ved 260 mu er forsvundet eller ej. Derfor kan den ønskede stamme, som er i stand til at producere DCPC, fås ved at udvælge enhver mikroorganisme af arten Cephalosporium acremonium, der er i stand til at producere et stof, som viser meget svag aktivitet mod Alcaligenes faecalis ATCC-8750» men hvis UV-absorption ved 260 ιημ forsvinder ved behandling med cephalosporinase. Endvidere kan DCPC-producerende stammer identificeres ved at undersøge elektrofogrammeme af deres kulturvsesker.

Hvis en sådan kulturprøve underkastes elektroforese på f.eks.

Toyo nr. 51A-filtrerpapir (Toyo Kagaku Sangyo, Co.Ltd.) i en phosphatpuffer (pH-værdi 6,5; 1/15^) ved en spændingsgradient på 45 V/cm i 1 1/2 time, kan DCPC påvises ved ultraviolet absorption.

CPC og DCPC giver adskilte pletter under uluraviolette stråler.

Følgelig kan man identificere den selektive dannelse af DCPC i kulturvæsken fra en DCPC-producerende stamme.

Som eksempler på mikroorganismer, der kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan nævnes Cephalosporium acremonium C-128, hvis mikroskopiske karakteristika anføres i det følgende, Cephalosporium acremonium nr. 152 og Cephalosporium acremonium C-28. De producerer i det væsentlige ingen CPC eller kun en lille mængde CPC, der kan fjernes fra slutproduktet, d.v.s. DCPC, uden nogen speciel proces for fraskillelse af CPC fra DCPC. Cephalosporium acremonium C-28 er deponeret ved Institute for Fermentation, Osaka, Japan, under nummeret IFO-9537» og ved Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, 4 U2460

Chiba, Japan, under deponeringsnummeret Perm-P nr. 1430. Cephalo-sporium acremonium C-28 og Cephalosporium acremonium nr. 132 er deponeret Ted American Type Culture Collection, Maryland, TT.S.A., under deponeringsnummeret ATCC-20370 henholdsvis ATCC-20371.

De mikrobiologiske karakteristika for Cephalosporium acremonium C-28 er anført nedenfor: 1. Karakteristika på agarmedier: (1) Maltekstraktagar:

Ringe vækst, overfladen uregelmæssigt rynket, farveløs til lysebrun. Koloniens bagside er farveløs til lysebrun.Sparsomt luftmycelium.

Ingen produktion af opløseligt pigment.

(2) Kartoffel-glucoseagar;

Ringe vækst, afgrænset og hævet, farveløs til lysebrun. Bagsiden er farveløs til lysebrun. Sparsomt luftmycelium. Intet opløseligt pigment .

(3) Havremel-agar:

Moderat vækst, diffus, farveløs. Bagsiden er farveløs. Sparsomt luftmycelium. Intet opløseligt pigment produceret.

(4) Glucose-bouillon-agar:

Moderat vækst, diffus, farveløs til lysebrun. Bagsiden er farveløs til lysebrun, Sparsomt luftmycelium. Intet opløseligt pigment.

2. Mikroskopiske karakteristika:

Lufthyfer 1,5-3)0 u brede, forgrenede og glasklare. Konidiebærere rejser sig fra lufthyfer eller vegetative hyfer i en ret vinkel, 30-70 u lange og 1,5-2,0 u brede; en masse af konidier, 8-14 u i diameter, dannes ved spidsen. Konidierne er elliptiske, meget spidset til i hver ende, encellede, glasklare ,2-3 u x 8-13 u.

5 1 -42 A 6 O

På maltekstrakt-agar, kartoffel-glucose-agar og havremel-agar iagttages kun reduceret konidiedannelse. På glucose-bouillon-agar udvikles konidier i overflod.

I det følgende anføres mikroskopiske karakteristika for Oephalo-sporium acremonium C-128:

Sterile hyfer er krybende. Konidiebærere rejser sig som korte opretstående, ikke-tværdelte, forgrenede lufthyfer, som ikke er opsvulmede i spidsen. Konidierne bæres enkeltvis i spidsen af konidiebserer-ne og skubbes til side af de senere dannede konidier. Disse er sædvanligvis ægformede, glasklare eller svagt farvede.

Kolonierne er kugleformede, tætte, fnuggede, i begyndelsen hvide, senere meget svagt rosafarvede. De vegetative hyfer er glasklare, tværdelte i ringe grad og forgrenede. Konidiebeereme rejser sig som sidegrene på lufthyfer, er opretstående enkle og ikke-tvær-delte, 40-60 x 3 μ· Konidierne forekommer i stort tal, er elliptiske eller aflange, lige eller buede, næsten glasklare, 4 x 1-1,5 μ.

De mikrobiologiske karakteristika af Cephalosporium acremonium nr. 132, frembragt ved mutation af Cephalosporium acremonium ATCC-14553, er de samme som for Cephalosporium acremonium ATCC-14553.

Dyrkningen af mikroorganismerne kan udføres enten på et fast eller flydende medium, og det anbefales at anvende et flydende medium til industrielle formål. Når der anvendes et flydende medium, kan dyrkningen udføres under aerobe betingelser med rystning eller omrøring.

Dyrkningsmediet, der skal anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, indeholder assimilerbare carbonkilder, fordøjelige nitrogenkilder, uorganiske salte og stimulerende faktorer.

Carbonkilderne kan være de konventionelle, f.eks. glucose, saccharose, stivelse, opløselig stivelse, melasse, n-paraffiner, eddikesyre, ethanol, glycerol og sorbitol.

6 U2660

Nitrogenkilderne kan f.eks. være naturlige produkter eller materialer tilberedt af dem (f.eks. pepton, kødekstrakt, casein, majsstøbevand, affedtet sojabønnepulver, tørgær, gærekstrakt, sojabønnemel, bomuldsfrømel, risklid, hvedeklid), ammoniumsalte af organiske syrer (f.eks. ammoniumsuccinat, ammoniumtartrat, ammoniumacetat), uorganiske nitrogenforbindelser (f.eks. ammoniumchlorid, ammoniumsulfat, ammoniumphosphat) og organiske nitrogenforbindelser (f.eks. urinstof).

De uorganiske salte kan f.eks. være metalsalte, ssåsom sulfat, nitrat, chlorid, carbonat og phosphat af kalium, magnesium eller calcium.

De stimulerende faktorer kan f.eks. være methionin, cystein, cystin, thiosulfat, methyloleat og svinefedtolie. Blandt disse faktorer er methionin fremragende til at forøge produktionen af DCPC.

Mængden af methionin i dyrkningsmediet ligger fortrinsvis fra 0,05 til 3,0 vægt/volumenprocent, mere foretrukket fra 0,1 til 2,0 vægt/ volumenprocent. Både D- og L-formerne af methionin er virksomme ved produktionen af DCPC.

Dyrkningsbetingelserne, f.eks. dyrkningstemperaturen, mediets pH-værdi og dyrkningstiden, vælges på passende måde, således at den anvendte mikroorganisme kan akkumulere en maksimal mængde DCPC. F.eks. udføres dyrkningen med fordel ved en temperatur på fra 15 til 45°C, fortrinsvis fra lB til 3$°C, ved en pH-værdi på fra 2 til 10, fortrinsvis fra 4 til 9, og i fra 10 til 360 timer, fortrinsvis fra 96 til 240 timer.

Fraskillelsen af DCPC fra dyrkningsmediet udføres bekvemt ved hjælp af i og for sig kendte midler, f.eks. ved filtrering af kulturvæsken, vask af cellerne med vand og derpå isolering af DCPC fra blandingen af filtratet og vaskevæsken. For at isolere det således akkumulerede DCPC fra den DCPC-holdige væske kan anvendes enhver af de i og for sig kendte metoder, f.eks. kromatografi på harpikser eller aktiveret kul eller gelfiltrering. F.eks. sættes penicillinase til filtratet for at dekomponere cephalosporin N. Filtratet påføres en søjle af en svagt basisk ionbytterharpiks, på hvilken DCPC adsorberes. Det absorberede DCPC elueres med en passende væske, såsom en airnnoniumacetat- 7 142460 pufferopløsning, og de DCPC-holdige fraktioner opsamles. DCPC-frak-tionerne koncentreres under reduceret tryk og påføres en søjle af aktiveret kul for at adsorbere DCPC. Efter vask med vand elueres DCPC med en passende væske, såsom en blanding af lige volumendele acetone og vand. De DCPC-holdige fraktioner opsamles og koncentreres under reduceret tryk, hvorpå tilsættes overskud af acetone. Denne procedure giver et råpulver af DCPC.

Om ønsket eller nødvendigt kan nogle af trinene i denne procedure gentages. Endelig sættes NaOH-opløsning til fraktionen for at neutralisere, og der tilsættes ethanol, hvorved natriumsaltet af DCPC kan fraskilles som krystaller.

Til yderligere forklaring af fremgangsmåden ifølge opfindelsen bringes de følgende eksempler, hvori "delfe)" er regnet på vægtbasis, med mindre andet er angivet, og forholdet mellem "delfe)" og "volumendel fe)" er som forholdet mellem "gram" og "milliliter". Udtrykkene "ug", "r.p.m.", "M" og "$" betyder henholdsvis mikrogram, omdrejninger pr. minut, molær koncentration og procent.Procenter er på vægt pr. volumenbasis, med mindre andet er angivet.

Eksempel 1.

I en fermenter med en kapacitet på 2000 volumendele hældes 500 volumendele af et podnings-kulturmedium, indeholdende 3,0$ saccharose, 1,5$ kødekstrakt, 0,5$ majsstøbevand og 0,15$ CaC0^,og efter sterilisering podes med Cephalosporium acremonium C-28 (ATCC-20370). Det podede medium dyrkes under rystning ved 28°C i 72 timer.

I en gæringstank med en kapacitet på 50000 volumendele hældes 30000 volumendele af et gæringsmedium,indeholdende 3,0$ saccharose, 3,2$ råt sojabønnemel, 0,5$ DL-methionin og 0,15$ CaCO^. Mediet steriliseres så og afkøles. Gæringsmediet podes aseptisk med ovennævnte podningskultur og dyrkes ved 28°C under omrøring og beluftning fl00$ vægt/ volumen beluftning pr. minut; 200 r.p.m.). Efter 132 timers dyrkning filtreres gæringsvæsken. Der fås således 26000 volumendele filtrat. Filtratet undersøges for CPC og DCPC efter følgende princip og procedure.

8 142460 Når CPC og DCPC underkastes elektroforese under de tidligere beskrevne betingelser, vandrer* de henholdsvis ca. 15 cm og 17 cm mod anoden. Efter elektroforesen skæres CPC- og DCPC-zonerne ud af filtrerpapiret, og zonerne ekstraheres hver for sig med vand. Ekstrakterne undersøges så for absorption ved 260 mu. Af de således opnåede absorptioner ses det, at filtratet indeholder 1.900 ug/ml DCPC og ikke en gang spor af CPC.

Til 26.000 volumendele af ovennævnte filtrat sættes penieillanase (fremstillet af Schwarz/Hann Biochemicals) for fuldstændigt at dekomponere Cephalosporin U. Umiddelbart derefter påføres filtratet en søjle af AMBERLITE IRA-900, en anionbytter på basis af en phenol-formaldehyd-harpiks og på acetatform, på hvilket DCPC adsorberes. Det adsorberede DCPC elueres med ammoniumacetatpuffer (pH-værdi 5,0; 0,2M),og de DCPC-holdige fraktioner opsamles. Disse fraktioner koncentreres under reduceret tryk til 13.000 volumendele. Koncentratet føres over på en søjle, pakket med l.$00 volumendele kromatografisk kul (opnået ved forkulning og påfølgende dampaktivering af savsmuld, kornstørrelse ca. 40 mesh, overfladeareal 1460 m / g) ved en volumenhastighed på 1,0 pr. time. Efter at søjlen er vasket med vand, elueres det adsorberede DCPC med 9.000 volumendele 50%’s (v/v) vandig acetone. DCPC-fraktionerne forenes og koncentreres under reduceret tryk, hvorpå tilsættes overskud af acetone. Proceduren giver et rå pulver af DCPC. Dette rå pulver opløses i vand, adsorberes på ® DOWEK 1x2, en anionbytter pa basis af en phenol-formaldehyd-harpiks og på acetatform, og elueres med 1.000 volumendele af den samme ammoniumacetatpuffer som ovenfor. Derpå føres eluatet over på en søjle på lignende måde som ved ovennævnte behandling.

DCPC-fraktionerne forenes og koncentreres under reduceret tryk. Efter at koncentratet er neutraliseret med NaOH-opløsning, tilsættes ethanol, så der fås 70$’s (v/v), hvorpå natriumsaltet af DCPC udfældes som krystaller. Krystallerne opsamles ved filtrering og tørres, hvorved fås 13,0 g krystaller af DCPC. Dette krystallinske produkt omkrystalliseres yderligere, og derpå sammenlignes det omkrystalliserede produkt med en DCPC-prøve, der er opnået ved enzymatisk omdannelse af CPC.

Med hensyn til antibakterielt spektrum, papirkromatogram, tyndtlags- 9 142460 kromatogram, ultraviolet spektrum, infrarødt spektrum, kærnemagnetisk resonansspektrum etc. stemmer de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnåede krystaller fuldstændigt overens med den autentiske prøve. Elementæranalysen af produktet ( C 36,9%, H 5,60%, N 9,30%, S 7,00%) er også i god overensstemmelse med de data, der er angivet i Biochem.

J. Si, 591, 1961 (J.D’A. Jeffery et al.).

Eksempel 2.

I en fermenter med en kapacitet på 200 volumendele hældes 30 volumendele af et podnings-kulturmedium indeholdende 3,0% saccharose, 1,5% kødekstrakt, 0,5% majsstøbevand og 0,15% CaCO^og efter sterilisering podes med Cephalosporium acremonium nr. 132 (ATCC-20371), som er afledt af Cephalosporium acremonium ATCC-14553 ved behandling med ultraviolet lys. Det podede medium dyrkes ved 2S°C i 72 timer under omrøring.

I en fermenter med en kapacitet på 200 volumendele hældes 20 volumendele af et gæringsmedium indeholdende 3,0% saccharose, 3,2% rå sojabønnemel, 0,5% DL-methionin og 0,15% CaCO^. Mediet steriliseres så på konventionel måde og køles. Den ovenfor nævnte podningskultur overføres aseptisk til fermenteren, og der udføres dyrkning ved 2$°C i 144 timer. Dyrkningsmediet filtreres.. Filtratet undersøges ved Samme metode som i eksempel 1, hvorved det viser sig at indeholde 1300 ug/ ml DCPC og ikke en gang spor af CPC.

Der udføres dyrkning under brug af Cephalosporium acremonium C-28 (ATCC-20370) og Cephalosporium acremonium nr. 132 (ATCC-20371) på samme måde som i eksempel 2, bortset fra, at mængden af methionin varieres. De opnåede gæringsvæsker filtreres, og filtraterne underkastes en undersøgelse som beskrevet i eksempel 1. Relationen mellem den anvendte mængde methionin og den producerede mængde deacetyl-cephalosporin C er vist i tabel 1.

Som det ses af tabellen, forøger DL-methionin i udpræget grad den producerede mængde DCPC.