DK143759B - Fremgangsmaade til fremstilling af amyloser med lav gennemsnitlig molekylvaegt bestemt ved en endegruppefremgangsmaade - Google Patents

Description

(19) DANMARK

|j| (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT <n> 143759 B

DIREKTORATET FOR

PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 1779/69 (51) Intel* C 08 B 37/00 (22) Indleveringsdag 31 · 19&9 (24) Løbedag 51 · tl'iar. 1 969 (41) Aim. tilgængelig 2. Okt. 1969 (44) Fremlagt 5· okt. 1S81 (86) International ansøgning nr.

(86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag - (62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 1. apr. 1968, 21565/68, JP

(71) Ansøger HAYASHIBARA COMPANY, Okayama, JP.

(72) Opfinder Kaname Sugimoto, JP: Mamcru Hirao, JP: Mikihiko Yo= shida, JP: Makoto Shioeaka, JP: Yasuyuki Yokobayashi, JP.

(74) Fuldmægtig Johs. Preisz' Efterf. Patent bureau.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af amyloser med lav gennemsnitlig molekylvægt bestemt ved en ende= grupp efr emgangs måde.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af amyloser med lav gennemsnitlig molekylvægt bestemt ved en endegruppefremgangsmåde, ved hvilken en ved hjælp af en a-amylase for-flydet eller ved termisk behandling forklistret stivelsesopslæmning behandles med et enzym.

® Som bekendt er stivelse en blanding af ligekædede molekyler, som T) ^ udelukkende består af a-l,4-bundet dextrose, og som kaldes amylose, > og en stor andel af forgrenede molekyler, som kaldes amylopectin, rj -j. og som 1 det væsentlige indeholder a-1,4-bindinger og a-1,6-forgre- ningsbindinger. Begge disse bestanddele er højmolekylære stoffer, * □ 143759 2 idet førstnævnte angives at have en gennemsnitlig polymerisationsgrad efter antal (bestemt ved en endegruppefremgangsmåde) på over 1000 og sidstnævnte en endog højere gennemsnitlig polymerisationsgrad efter antal på over 2000. Amylose har tilbøjelighed til at retrogradere og udfælde, medens amylopectin har høj viskositet i vandig opløsning og er tilbøjelig til at kvælde. Eftersom stivelse er en blanding af molekyler med en så forskellig struktur og så forskellige molekylvægte, opfører den sig på mange forskellige måder og ikke efter noget bestemt mønster. Dette har i praksis begrænset anvendeligheden af forskellige stivelsesarter til klæbning, limning eller appretering. Hvis imidlertid stivelse kunne nedbrydes på hensigtsmæssig måde, især ved afskæring af forgreningerne i tilknytningspunkterne, således at den uregelmæssigt forgrenede struktur kunne gøres ensartet, ville stivelsen kunne omdannes til ligekædet amylose med bestemt antalsmiddelmolekylvægt, som da ville kunne anvendes til betydelig flere formål ligesom polymere af ethylen, pro-pylen og andre jordolieprodukter dannet ved krakning. På denne baggrund er der specifikt søgt at finde enzymer, som selektivt kan nedbryde a-1,6-bindingerne, forgreningsbindingerne i amylopectin.

Som resultat af disse bestræbelser har det vist sig, at foruden sådanne velkendte enzymer som isoamylaser fremstillet ud fra gær, R-enzymer af vegetabilsk oprindelse og enzymer fremstillet ud fra bakterier (pullulanaser) af arten Aerobacter, kan en række for nylig opdagede enzymer, f.eks. sådanne, som dannes af bakterierne af arten Pseudomonas ved dyrkning ved en pH-værdi i området 6 - 8 og en temperatur i området 20 - 30°C i et dyrkningsmedium, som ud over en nitrogenkilde og en carbonkilde indeholder en mineralkilde, som beskrevet i britisk patentskrift nr. 1.233.744, og de enzymer, som dannes af arterne Aglobacterium, Azotobacter, Lactobacillus, Leuco-nostoc, Microbacterium, Nocardia, Pediococcus, Saricina, Serratia, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Micrococcus eller Erwina, alle nedbryde α-1,6-glucosidbindingerne i stivelsesarter.

Der kendes imidlertid kun lidt om mekanismen af og betingelserne for deres aktiviteter, og disse enzymer synes at have en vis specificitet. Da pullulanase fra bakterier og Pseudomonas-enzymerne viser særlig stor virkning, er forskellige stivelsesarters nedbrydning blevet undersøgt. Denne undersøgelse har ført til erkendelsen af en helt ny fremgangsmåde til fremstilling af "amyloser med lav 143759 3 gennemsnitlig molekylvægt bestemt ved en endegruppefremgangsmåde og med ensartede kædelængder", som aldrig før er blevet fremstillet.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af amyloser med lav gennemsnitlig molekylvægt bestemt ved en endegruppefremgangsmåde, ved hvilken en ved hjælp af en α-amylase forflydet eller ved termisk behandling forklistret stivelsesopslæmning behandles med et enzym, er ejendommelig ved, at der som enzym anvendes en a-1,6--glucosidase, og at enzymbehandlingen foretages ved temperaturer på 45 - 50°C. Herved nedbrydes og afskæres amylopectinets forgreningsbindinger bestående af a-1,6-bindinger med cc-1,6-glucosidasen til dannelse af en næsten ligekædet struktur.

Opfindelsen vil i det følgende blive beskrevet nærmere under henvisning til tegningen, for fig. 1 og 2 viser kurver for ekstinktionskoefficienten bestemt ved amyloses farvereaktion som mål for forløbet af den her omhandlede reaktion, fig. 3 og 4 viser kurver over produkternes opløselighed, og fig. 5 viser en kurve, der angiver produkternes fugtighedsabsorption. På tegningen betegner W "waxy corn"-stivelse, P betegner kartoffelstivelse, SE betegner Pseudomonas-enzym, AE betegner Aerobacter-enzym, Sol betegner opløselig andel, og pptd betegner udfældet andel.

Af forenklingsgrunde vil fremgangsmåden i det følgende blive beskrevet som anvendt i forbindelse med "waxy corn"-stivelse, en stivelsestype af særlig simpel sammensætning. Da denne stivelsestype består udelukkende af amylopectin, bør dens nedbrydningsprodukt også være af simpel struktur. En 5 - 10 vægtprocents vandig suspension af "waxy corn"-stivelsen opvarmes langsomt under omrøring. Når suspensionen er blevet forklistret, opvarmes den i en trykovn ved et tryk på 1,5 - 2 atmosfærer i 30 minutter til opnåelse af fuldstændig forklistring og dispersion. Det resulterende materiale afkøles, indstilles til pH-værdi 4,5, og der tilsættes a-l,6-gluco-sidase fremstillet ud fra bakterier af arten Pseudomonas i en mængde på 20 - 50 enheder pr. gram af stivelsen. Udtrykket "enhed" bestemmes her på følgende måde (bestemmelse af isoamylaseaktiviteten i analogi med fremgangsmåden ifølge Maruo og Kobayashi (Journal of Agricultural Chemical Society, Japan, 23 (1949), side 115 - 120)): En 143759 4 blanding af 1%'s opløselig glutinøs risstivelsesopløsning, 0,5N eddikesyrepufferopløsning (pH-værdi 4,0) og enzymopløsning inkuberes ved 40°C. Til 1 ml af den inkuberede blanding sættes 1 ml 0,01N iod-kaliumiodidopløsning, og blandingen fortyndes med vand til 25 ml. Efter henstand i 15 minutter måles opløsningens ekstinktionskoefficient ved 610 nm under anvendelse af en centimetercelle, og den mængde enzym, som forårsager en forøgelse af ekstinktionskoefficienten med 0,1 på 1 time fastsættes som 10 enheder.

Med regelmæssige mellemrum udtages der prøver fra blandingen, og reaktionsgraden bestemmes under anvendelse af amylosens farvereaktion. Intensiteten af den blå farve, der fremkommer ved tilsætning af en i forvejen bestemt mængde af en iod-kaliumiodid-opløsning, bedømmes på grundlag af ekstinktionskoefficienten ved 570 nm. Resultatet af en sådan prøve er vist ved de i fig. 1 afbildede kurver.

Når enzymet anvendes i en mængde på 50 - 100 mikrogram pr. gram stivelse, forløber nedbrydningen næsten til grænsen i løbet af 50 - 20 timer. Når der anvendes et Aerobacter-enzym, indstilles pH-værdien til 6. Resultaterne af et sådant forsøg fremgår af de i fig. 2 viste kurver. Når der anvendes et Pseudomonas-enzym, danner den ved reaktionens fremskriden fremkomne amylose med ligekædede molekyler miceller på grund af tilbøjeligheden til at danne krystalliter og fælder ud. Når reaktionen er tilendebragt, kan den derfor let skilles fra vandet ved centrifugering. Udbyttet kan ligge fra 80 til 90-vægtprocent, beregnet på udgangsmaterialet. Når produktet er vasket flere gange, hver gang med en ringe mængde vand, og derpå tørret, vil det have form af et hvidt pulver. Når gennemsnitspolymerisationsgraden efter antal bestemmes på de reducerende endegrupper ved periodsyre-oxidations-metoden, viser den udfældede andel en gennemsnitlig polymerisationsgrad efter antal på 23 - 24. Dette svarer godt til de anerkendte værdier på 20 - 30 for amylopectinets forgreningskæder, medens grundstammekæden antages at have en polymerisationsgrad på ca. 50 - 80. Ved forsøget bestemmes for en sikkerheds skyld tilstedeværelsen eller fraværelsen af forgreninger i strukturen ved nedbrydningsmetoden i henhold til Smith. Der fandtes ca. 2 forgreninger pr. amylosemolekyle, og selv om det kunne tyde på, at nogle meget korte grene ikke var blevet fjernet, har produktet forholdsvis lav opløselighed i vand, danner miceller og udfælder. Røntgenstrålediffraktionsundersøgelser viser tydeligt kry- 5 143759 stalliserbarhed, hvilket viser, at produktet er en næsten lige-kædet amylose med forholdsvis korte kasder.

Den andel, som er opløst i reaktionsopløsningen, giver ved koncentrering et hvidt krystallignende pulver i et udbytte på højst 20 vægtprocent, beregnet på udgangsmaterialet. Denne andels gennemsnitspolymerisationsgrad efter antal og antal af forgreninger er henholdsvis 17 og 1 - 2, og denne andel har således lidt lavere antalsmiddelmolekylvægt end den ovenfor beskrevne udfældede del og øjensynligt færre forgreninger end den udfældede del. Røntgenstrålediffraktion viser partiel krystallinitet, og dette produkt er derfor en opløselig amylose.

Som ovenfor beskrevet gør fremgangsmåden ifølge opfindelsen det muligt at fremstille hidtil ukendte næsten ligekædede amyloser med en gennemsnitlig polymerisationsgrad efter antal på 20 - 30. De konventionelle fremgangsmåder til nedbrydning af stivelse med en syre eller a-amylase medfører en tilfældig nedbrydning, og produkterne er derfor blandinger af molekyler med mange forskellige størrelser fra polymerisationsgrad 1 til gennemsnitlige polymerisationsgrader efter antal på flere gange 10 eller endog gennemsnitlige polymerisationsgrader efter antal på flere gange 100, og med hensyn til molekylstruktur er de således fremstillede produkter blandinger af ligekædede og forgrenede molekyler. De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede produkter indeholder ensartede molekyler med sædvanligvis ensartede kædelængder og næsten ligekædet molekylstruktur, men en vis mindre grad af forgrening kan forekomme, så at den afgørende forskel mellem de kendte produkter og de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede produkter ligger i molekylernes gennemsnitlige længde og deres forgreningsgrad. Produkterne kan bringes på en krystallignende form, er passende opløselige i vand, er langt mindre viskose end stivelse og endog mindre viskose end almindelige stivelsessirupper med gennemsnitlige polymerisationsgrader på omkring 2. De har ikke stivelsessiruppers sødhed, og de er kun i ringe grad reducerende. Der er ikke tidligere fremstillet sådanne dextriner med ringe variationer i sammensætningen, af hvilken grund det antages, at den foreliggende opfindelse vil blive af stor vigtighed for stivelsesindustrien. De ovennævnte fy- 6 1437B9 siske egenskaber ved de her omhandlede amyloser kan udnyttes ved fremstillingen af vandopløselige film, membraner, fibre og skumstoffer. Hvis deres kemiske struktur udnyttes, vil det være muligt at fremstille sirupper udelukkende af amylose ved nedbrydning med et enzym eller en syre. Endvidere letter fraværelsen af a-1,6--bindinger nedbrydningen forårsaget af gluc-amylase eller β-amylase, hvorved det bliver muligt at forøge disses nedbrydningshastigheder overordentlig meget.

Opfindelsen er hidtil overvejende blevet beskrevet i forbindelse med enzymet hidrørende fra bakterier af arten Pseudomonas. I tilfælde af enzymet fra Aerobacter-bakterier er den enzymatiske aktivitet øjensynlig noget afvigende. Produktet viser forholdsvis høj opløselighed og er vanskeligt at fraktionere som krystallignende bundfald. Det er nødvendigt at udfælde med butanol eller koncentrere hele massen til opnåelse af fraktionering. Videre detaljer herom vil blive givet i de efterfølgende eksempler.

Hvad angår andre amylopectinholdige stivelsesarter end "waxy corn"--stivelse, f.eks. kartoffelstivelse, er der i amyloseindholdet øjensynligt en meget bred fordeling af amylosemolekylernes polymerisationsgrader, og disse molekylers gennemsnitlige polymerisationsgrader er derfor højere.

Det materiale, der fås ved forklistring af en stivelsesopslæmning, har normalt høj viskositet og er vanskeligt at behandle i processen før tilsætningen af α—1,6-glucosidase. Det foretrækkes derfor ifølge opfindelsen at nedsætte viskositeten i den forklistrede stivelsesopslæmning ved forflydning til en DE-værdi på ca. 1 før behandlingen med en α-l,6-glucosidase. På denne måde opnås det bedste amy-loseudbytte.

Endvidere skal det nævnes, at reaktionsopløsningens koncentration sædvanligvis ligger fra 5-10 vægtprocent. Med en koncentration på 20 vægtprocent er der tegn på, at reaktionshastigheden nedsættes. Dette tilskrives det forhold, at stivelsesopslæmningens dispersion foretages ved 100 - 130°C. Ved opvarmning under omrøring ved en temperatur på under dextroses sønderdelingstemperatur i området fra 150°C ned til 100°C er det muligt at opnå en mere end 25%'s forkli- 7 143759 stret opløsning. Denne opløsning er yderst viskos og har tilbøjelighed til retrogradering ved temperaturfald og vil derfor være vanskelig at omsætte med a-1,6-glucosidase. På den anden side mister enzymet aktivitet ved høj temperatur, hvor retrogradering ikke forekommer. Hvis den forklistrede eller forflydede stivelse afkøles til temperaturer, hvor enzymet er aktivt, på tilstrækkelig kort tid, løses problemet med retrogradering, og der fås tilfredsstillende amyloseudbytte. En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen går derfor ud på, at den forklistrede eller forflydede stivelsesopslæmning afkøles hurtigt og derefter tilsættes en a-1,6-glucosidase.

En særlig fordelagtig metode til at opnå hurtig afkøling af stivelse sops læmningen er at sprøjte den ind i en vakuumkøler, og denne metode er derfor den foretrukne. Samtidig sprøjtes en i forvejen bestemt mængde af enzymet ind i køleren og blandes grundigt med den indsprøjtede opløsning, således at temperaturen nedsættes hurtigt, og således at nedbrydningen fremmes til formindskelse af viskositeten. Alternativt kan man hælde enzymet i en stor mængde af opløsningen på et ret fremskredet nedbrydningsstadium og fortynde opløsningen under omrøring til formindskelse af viskositeten og til fremme af reaktionen. På begge disse måder kan reaktionsopløsningens koncentration forøges.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen og de fremstillede produkters egenskaber belyses nærmere ved de følgende eksempler:

Eksempel 1.

Nedbrydning af forskellige stivelsesarter med a-1,6-glucosidaser.

"Waxy corn"-stivelse, glutinøs risstivelse og kartoffelstivelse renses og suspenderes i vand, således at der fås 5-10 vægtprocents vandige suspensioner. Suspensionerne indstilles på pH-værdi 4,0 - 5,0, når der anvendes et enzym produceret af bakterier af arten Pseudomonas (som beskrevet i britisk patentskrift nr.

1.233.744, som angivet ovenfor), eller på pH-værdi 5,8 - 6,0, når der anvendes et enzym produceret af bakterier af arten Aerobacter (ved dyrkning af en isoamylase-producerende bakterie i et kultur 143759 8 medium indeholdende flydendegjort stivelse som carbonkilde og et ammoniumsalt som nitrogenkilde i dyrkningsmediet efterfulgt af opsamling af isoamylasen fra kulturmediet, som beskrevet i britisk patentskrift nr. 1.233.743). Suspensionerne opvarmes under omrøring til forklistring af stivelsen.

Til opnåelse af fuldstændig forklistring opvarmes hver forklistret opløsning yderligere ved et tryk på 1,5 - 2,0 kg/cm i 20 - 30 minutter, hvorpå den hurtigt afkøles til 45°C. Enzymet tilsættes i en mængde på 20 - 100 enheder pr. gram af stivelsen, og blandingen omsættes under omrøring ved 45°C. Efter ca. 16 timers forløb sker reaktionen hurtigt. Reaktionens forløb bestemmes ved blåfarvning af opløsningen ved tilsætning af en iod-kaliumiodid-opløsning, som deltager i en reaktion, der er karakteristisk for den bestemte amylose, som dannes.

I løbet af ca. 1 time efter reaktionen er viskositeten bemærkelsesværdigt formindsket. Når der anvendes Pseudomonas-enzymet, udfældes amylosen, efterhånden som reaktionen skrider frem.

Reaktionshastigheden bestemmes ved, at man tilsætter 9 ml 0,1N saltsyre pr. ml af reaktionsopløsningen, hvorved reaktionen afsluttes, og undersøger opløsningen ved anthron-metoden. Ved anthron--metoden blandes prøven med anthron (9,10-dihydro-9-oxoanthracen) indeholdende koncentreret svovlsyre ved en temperatur i området 10 - 15°C, og efter omrystning opvarmes prøverne i 16 minutter i kogende vand og afkøles derpå; den optiske densitet bestemmes indenfor 1 time ved 625 nm imod destilleret vand. Beregninger ud fra den optiske densitet er ligefrem proportionale med carbonhydrat-koncentrationen (se "Methods in Carbohydrate Chemistry", Vol. 1, 389 - 394 (1962)). Der udtages en mængde af opløsningen svarende til 10 mg sukker, og under tilsætning af 2 ml af en eddikesyrepuf-feropløsning ved pH-værdi 4,0 og 0,5 ml af en 0,3%'s vandig opløsning af iod og kaliumiodid forøges den samlede mængde til 100 ml.

Efter 30 minutters forløb måles ekstinktionskoefficienten med lys med bølgelængde 570 nm.

Når det ved iodfarveprøven er konstateret, at reaktionen er løbet til ende, koncentreres opløsningen ved kogning, og produktet tør- 9 143759 res og pulveriseres. Når der anvendes Pseudomonas-enzymet, udfælder den dannede amylose. Derfor koncentreres opløsningen til et faststofindhold på ca. 20%, hvorpå den afkøles, og bundfaldet får lov at afsættes natten over, hvorpå det fraskilles ved centrifugering. Derpå opløses det til en 20 vægtprocents opløsning og genudfældes, og bundfaldet fraskilles og tørres ved 40 - 50°C.

De to opløsninger blandes, og blandingen koncentreres i vakuum, hvorpå den tørres og pulveriseres.

Den ovennævnte udfældnings- og isoleringsbehandling udføres lettest, når der anvendes Pseudomonas-enzym ved anvendelse af "waxy corn"-stivelse eller glutinøs risstivelse som stivelsesmateriale.

Eksempel 2.

Når 30 vægtprocents "waxy corn"-stivelsessuspension kontinuerligt føres til en kolonne med flerbladet omrører og opvarmes med damp til 160 - 165°C, fås en transparent og tyktflydende forklistret opløsning med en nedbrydningsgrad udtrykt i dextroseækvivalenter på mindre end 1 g dextrose pr. 100 g af opløsningens indhold af tørstof. Denne opløsning sprøjtes i en vakuumkøler. Desuden indsprøjtes en i forvejen bestemt mængde af en Pseudomonas- eller Aerobacter-enzymopløsning. Begge opløsninger i forstøvningståge-form tilblandes fuldstændigt og øjeblikkeligt, hvorpå blandingen straks under omrøring hældes ud i en stor mængde af reaktionsopløsningen i en reaktionsbeholder. Den gennemsnitlige opholdstid i reaktionsbeholderen er ca. 1 time.

Derefter overføres reaktionsblandingen kontinuerligt til en hovedreaktionsbeholder, og reaktionen udføres i chargedrift i 20 - 40 timer. I løbet af 1 - 2 timer skrider reaktionen frem under formindskelse af viskositeten. Fra da af hersker de samme betingelser som beskrevet i eksempel 1. Da opløsningen er yderst koncentreret, udfælder den.

143759 ίο

Eksempel 3.

Efter rensning af forskellige stivelsesarter indstilles stivelsesopløsninger på koncentrationer på 30 - 35% og pH-værdi 6. Derefter sættes α-amylase (forflydende enzym) til hver opløsning i en mængde på 5 enheder pr. gram af stivelsen. Derpå føres blandingen på samme måde som beskrevet i eksempel 2 ind i et apparat til kontinuerlig forflydning, og temperaturen indstilles på 100°C. Efter en holdetid på 5 - 7 minutter fås en viskos, forflydet stivelsesopløsning med lav nedbrydningsgrad. Det er en transparent, homogent forklistret stivelsesopløsning med en nedbrydningsgrad udtrykt i dextroseækvivalenter (DE-værdi) på 0,5 - 1,svarende til 0,5 - 1 g dextrose pr. 100 g af opløsningens indhold af tørstof. Denne opløsning afkøles hurtigt som beskrevet i eksempel 2 og nedbrydes på samme måde under tilsætning af en a-l,6-glucosidase. Den resulterende opløsnings viskositet er lidt mindre end viskositeten af de opløsninger, der fås ved højere temperaturer på over 150°C, hvilket naturligvis gør behandlingen lettere. Der iagttages imidlertid ingen kendelig forskel i nedbrydningsproduktet.

n 143759

Oversigt over forsøgsresultaterne.

1. Koncentration af den forklistrede opløsning: I eksempel 1 sammenlignes koncentrationerne af størrelsesordenen 5-10 vægtprocent på grundlag af farveudviklingen ved iodreaktionen. Resultaterne viser, at der opnås samme effekt med koncentrationer op til 10 vægtprocent. I eksempel 2 har den anvendte opløsning en koncentration på 30%, og en sammenligning giver resultater svarende til resultaterne i det foregående eksempel.

2. Den mængde enzym, der skal anvendes: Når en reaktion udføres i løbet af 48 timer, er den mindste mængde enzym 20 enheder pr. gram af stivelsen. Når enzymet anvendes i en mængde på 5 - 10 enheder pr. gram af stivelsen, kræves der meget længere reaktionstid, og der sker overhovedet ingen amylolyse.

3. Produktets gennemsnitlige polymerisationsgrad og forgreningsgrad:

Til bestemmelse af den gennemsnitlige polymerisationsgrad efter antal anvendes den metode, som er beskrevet i METHODS IN CARBOHYDRATE CHEMISTRY, bind V, 251 (65), og som er benævnt "Determination of reducing end-groups by periodate oxidation". Bestemmelsen af antallet af forgreninger foretages i henhold til den såkaldte Smith-nedbrvdningsmetode, som er foreslået af T.K. Hamilton og P. Smith i Journal of American Chemical Society, 7(3, 65907 (1956), ibid., 78, 5910 (1956).

Stivel- Koncen- Enzym/an- I væsken/- Gennemsnitlig Gennemsnitsesart tration tal enhe- udfældet polymerisa- ligt antal i vægt- der pr. g tionsgrad forgrenin- procent stivelse efter antal ger W 1 (I) SE/1000 22,95 1,49 P 1 (I) SE/1000 i væsken 21,34 2,71 udfældet med butanol 61,87 0,99 (tabel fortsat) 143759 12 W 5 (I) SE/100 i væsken 22,42 1,39 udfældet 34,72 1,50 W 5 (I) SE/20 i væsken 30,01 2,17 udfældet 30,84 2,33 W 10 SE/50 i væsken 19,0 udfældet 32,2 W 20 (II) SE/50 i væsken 20,1 udfældet 34,0 25 SE/50 i væsken 20 udfældet 36 W = "waxy corn"-stivelse; P = kartoffelstivelse; SE = Pseudomonas-enzym; (I), (II) = behandlet som beskrevet i eksempel 1 henholdsvis eksempel 2.

Nedenstående tabel indeholder oplysninger om de gennemsnitlige polymerisationsgrader efter antal, der opnås ved gentagne omsætninger med samme enzym.

Opløselig del Udfældet del

Koncen- Enzym/an- Gennemsnit- Antal Gennemsnit- Antal tration tal enhe- lig polyme- forgre- lig polyme- forgre- i vægt- der pr. g risations- ninger risations- ninger procent stivelse grad efter grad efter antal antal 1. reaktion 5 SE/50 19,86 3,4 32,53 3,1 2. reaktion 1 SE/50 17,67 2,3 23,43 2,3 3. reaktion 1 SE/50 17,27 2,2 23,19 2,3

Af de ovenstående resultater ses det, at i det tilfælde, hvor et enzym anvendes i stort overskud eller gentagne gange til reaktionen, viser "waxy corn"-stivelse gennemsnitlige polymerisationsgrader efter antal på 17 (i den opløselige del) og 23 (i den udfældede del). Når der anvendes kartoffelstivelse, forøger det oprindelige amyloseind- 143759 13 hold den udfoldede dels gennemsnitlige pQlymerisationsgrad efter antal, men produktet vil praktisk taget ikke have forgreninger.

Også i andre tilfælde er forgreningen yderst lille, idet der øjensynligt kun forbliver én eller to forgreninger tilbage i hver mole-kylkæde.

4. Nogle typiske produktudbytter:

Stivel- Koncen- Enzym/an- Reak- Opløselig Udfældet Samlet ud- sesmate- tration tal enhe- tions- del del bytte, be- riale i vægt- der pr. g tid regnet på procent stivelse stivelses- udgangsmaterialet, i vægtprocent W 5 SE/100 48 9,4 90,6 77,1 (19,6) (27,68) W 10 SE/50 48 19,6 80,4 92,8 (20,1) (34,3) W 10 SE/50 48 21,8 78,2 96,8 (19,9) (34,5) W 10 SE/50 48 14,1 85,9 81,1 (19.8) (32,2) W 5 SE/150 48 31,2 68,8 99,3 (20.8) (25,8)

Tallene i parentes betegner gennemsnitlige polymerisationsgrader.

Af det ovenstående fremgår følgende:

Udfældet X den over- Forgre-stående nings- væske grad

Ved anvendelse af Gennemsnitspo- 20 - 28 20

Pseudomonas-enzym, lymerisations-100 enheder pr. g grad efter an-stivelse tal udbytte 90 10 2-3 (tabel fortsat) 143759 14

Ved anvendelse af Gennemsnitspo- 30-34 20

Pseudomonas-enzym, lymerisations-50 enheder pr. g grad efter an-stivelse tal udbytte 80 20 2-3

Ved anvendelse af Gennemsnitspo-

Pseudomonas-enzym, lymerisations-100 - 1000 enheder grad efter an- pr. g stivelse tal 24-23 20-18 1-0 udbytte 90 10 5. Udbytter og gennemsnitlige polymerisationsgrader efter antal af produkter fremstillet ud fra forskellige stivelsestyper:

Udbytte Gennemsnitlig polymerisationsgrad

Stivelses- Opløselig Med butanol ud- Opløselig Udfældet materiale del i vægt- fældet del i del del procent vægtprocent

Aerobacter-enzym, koncentration af 5 vægtprocent stivelsesudgangsmateriale

Tapioka 70,3 29,7 24,01 88,43

Majs 51,9 48,1 24,12 68,41

Hvede 42,4 57,5 22,60 78,39

Batat 59,6 40,4 25,96 63,79

Sago 60,9 39,1 23,76 59,86

Aerobacter-enzym, koncentration af stivelsesudgangsmateriale: 10 vægtprocent "waxy corn"-stivelse, bereqnet på udgangsopslæmningen

Tapioka 60,8 39,2 24,11 49,58

Majs 52,8 47,2 16,63 58,34

Hvede 49,0 51,0 20,94 82,72

Batat 58,6 41,4 26,34 75,79

Sago 51,1 48,9 17,38 51,93 143759 15

Det vil forstås, at de opløselige dele af nedbrydningsprodukterne af forskellige stivelsesarter er små amylosemolekyler med polymerisationsgrader 17 - 20. De udfældede dele (i 10 vægtprocent butanol) har højere antalsmiddelmolekylvægte, hvilket antageligt skyldes de oprindelige amyloseindhold, omend øjensynligt med nogen uregelmæssighed i antalsmiddelmolekylvægten.

6. Produkternes opløselighed:

Hver prøveportion opløses i vand ved en i forvejen bestemt temperatur og holdes ved konstant temperatur natten over til opnåelse af udfældning. Mængden af sukkerforbindelse i den ovenstående væske bestemmes ved anthron-metoden som mål for opløseligheden.

Resultaterne af forsøgene er angivet nedenfor. Opløseligheden bestemmes på den opløselige og udfældede del på mange forskellige overjordisk og underjordisk dyrkede stivelsesarter under anvendelse af 150 - 1000 enheder af forskellige enzymer hidrørende fra Pseudomonas og Aerobacter pr. gram af hver stivelsesart. De værdier, som fremgår af fig. 3 og 4, betragtes overvejende som funktioner af de gennemsnitlige polymerisationsgrader efter antal.

7. Specifik drejning:

To gram af hver prøveportion opløses i 100 ml 30 vægtprocents vandig calciumchloridopløsning, og den specifikke drejning bestem mes. Resultaterne fremgår af nedenstående tabel: 22

Stivelses- Enzym/an- Udfældet eller Gennemsnitlig (a)D

art tal enhe- opløst polymerisa- der pr. g tionsgrad ef- stivelse ter antal

Waxy corn SE/50 udfældet del 32 +194,90

Waxy corn SE/50 opløst del 20 +188,90

Waxy corn SE/50 udfældet del 23 +193 00

Re SE/50 udfældet del ' (tabel fortsat) 143759 16

Waxy corn SE/50 opløst del

Re SE/50 opløst del

Waxy corn SE/1000 23,0 +176,0

Kartoffel AE/100 med butanol ud- ... _ fældet del +ibJ,/5

Kartoffel AE/1000 opløst del 21,3 +150,45

Waxy corn SE/150 opløst del 20,8 +163,77

Waxy corn SE/150 udfældet del 25,8 +182,71

Re betegner, at samme enzym er anvendt igen til omsætning af samme prøve.

8. Viskositet:

Under anvendelse af et Brookfield rotationsviskosimeter (Tokyo Keiki Company Ltd., Tokyo, Japan) med 60 omdrejninger pr. minut, med BL-adapter bestemmes produkternes viskositet. Produkterne giver relativt lave viskositetsværdier.

Resultaterne fremgår af nedenstående tabel:

Prøve Gennemsnit- Koncentration 60°C 50°C 40°C

lig polyme- i vægtprocent cP cP cP

risationsgrad efter antal "Waxy corn"-stivelse, behandlet med Pseudomonas- 15 1,37 1,50 1,89 -enzym, 150 enhe- 20,78 10 0,97 1,29 1,40 der pr. g stivel- 5 0,89 0,97 1,14 se, opløselig del "Waxy corn"-stivelse, behandlet 15 6,19 6,32 6,46 med Pseudomonas- 25,79 10 4,32 4,50 4,85 -enzym, 150 enhe- 5 1,23 1,58 2,10 der pr. g stivelse, udfældet del (tabel fortsat) 143759 17

Kartoffelstivelse, behandlet med Aero- 15 2,03 2,25 bacter-enzym, 1000 24,53 10 1,42 1,84 enheder pr. g sti- 5 1,13 1,15 velse, opløselig del "Waxy corn"-sti- velse, behandlet 15 3,01 3,96 med Aerobacter-en- 23,05 10 1,82 2,40 zym, 1000 enheder 5 1,15 1,48 pr. g stivelse, opløselig del

Kartoffelstivelse, behandlet med 15 1,61 2,10

Pseudomonas-enzym, 21,34 10 1,20 1,75 1000 enheder pr. 5 1,00 1,12 g stivelse, med butanol udfældet del, opløselig del

Sirup (43 g dextrose pr. 100 g af sirup- 0,94 pens indhold af tørstof)

Vand 0,90 9. Andre urenhedsindhold: Rå proteiner Askeindhold i vægtprocent i vægtprocent "Waxy corn"-stivelse behandlet med Pseudomonas-enzym, 50 enheder pr. g stivelse, opløselig del 4,04 0,072 "Waxy corn"-stivelse behandlet med Pseudomonas-enzym, 50 enheder pr. g stivelse, udfældet del 0,205 0,052 10. Fugtighedsabsorption:

Ved relativ fugtighed 80% og temperatur 30°C viser den opløselige del og den udfældede del væsentlige forskelle med hensyn til fug-