DK143803B - 6-aminopenicillansyrederivat til anvendelse som mellemprodukt ved fremstilling af phthalidester af 6-(d(-)alfa-aminophenylacetamido) penicillansyre eller syreadditionssalte deraf - Google Patents

Description

(19) DANMARK (®)

|p (12} FREMUEGGELSESSKRIFT od 143803 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 128l/78 (51) Intel.3 C 07 D 499/42 (22) Indleveringsdag 21. mar. 1978 (24) Løbedag 8. jun. 1972 (41) Aim. tilgængelig 21. mar. 1978 (44) Fremlagt 12. okt. 1981 (86) International ansøgning nr. - (86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag - (62) Stamansøgning nr. 2865/72

(30) Prioritet 9· jun. 1971, 19604/71* GB

(71) Ansøger BEECHAM GROUP LIMITED, Brentford, GB.

(72) Opfinder Harry Ferres, GB: John Peter ^Clayton, GB.

(74) Fuldmægtig Plougmann & Vingtoft Patent bur eau.

(54) 6-Aminopenicillansyrederivat til anvendelse som mellemprodukt ved fremstilling af phthalidester af 6-(D(-)alfa-aminophenylacetamldo)pe= nicillansyre eller syreadditionssal= te deraf.

Den foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt 6-aminopenicillan-syrederivat· til anvendelse som mellemprodukt ved fremstilling af phthalidester af 6-[D(-)α-aminophenylacetamido]penicillansyre eller syreadditionssalte deraf.

ffl r/3 6-[D(-)α-aminophenylacetamido]penicillansyre er et almindeligt an- ^ vendt bredspektret antibiotikum. Imidlertid absorberes den ufuld- y~) stændigt i blodet, når den administreres oralt. Nogle praktiserende .d" læger tror, at dette er en ulempe, og derfor er der gjort forsøg på at finde derivater af 6-[D(“)α-aminophenylacetamido]penicillansyre, ^ som vil medføre højere blodkoncentrationer af den omhandlede peni cillin efter oral indgivelse, end der kunne opnås med selve den omhandlede penicillin.

2 143803

Det har vist sig, at den hidtil ukendte phthalidester af 6-[D(-)a--aminophenylacetamido]penicillansyre giver en høj seriamkoncentration af det pågældende penicillin, når den indgives oralt.

Phthalidester af 6-[D(-)a-aminophenylacetamido]penicillansyre har formlen I

/f~\ <D>

// ')-CH-CO-NH-CH - CH C

W \ CEL·

J T

NH χ 2 CO - N-CH-CO-O-CH^

CO

II

o

Et foretrukket syreadditionssalt af forbindelsen med formlen I er hydrochloridet, men der kan også anvendes salte med andre uorganiske eller organiske syrer (især de syrer, som kan anvendes til dannelse af salte med 6-[D(-)α-aminophenylacetamido]penicillansyren). Endvidere kan forbindelsen med formlen I danne salte med andre peni-cillansyrer, f.eks. 3-(2'-chlor-6'-fluorphenyl)-5-methyl-4-isoxazo-lylpenicillin.

Phthalidester af 6-[D(-)α-aminophenylacetamido]penicillansyre eller syreadditionssalte deraf kan fremstilles ved, at

6-aminopenicillansyrephthalidester eller et silylderivat deraf omsættes med et reaktivt N-acyleringsderivat af den (D)'-isomere af en forbindelse med den almene formel II

v r— CH—COOH II

\=y i

X

hvor X betegner en aminogruppe, en beskyttet aminogruppe eller en gruppe, som kan omdannes til en aminogruppe, silylgruppen, når den 3 143803 er til stede, fjernes ved hydrolyse eller alkoholyse, og gruppen X, såfremt den ikke er en aminogruppe, omdannes til en aminogruppe under neutrale eller sure betingelser· I overensstemmelse hermed er 6-aminopenicillansyrederivatet ifølge opfindelsen 6-aminopenicillansyrephthalidester.

Esteren med formlen I kan således fremstilles ved omsætning af

6-aminopenicillansyrephthalidester eller et silylderivat deraf med et reaktivt N-acyleringsderivat af den (D)-isomere af en forbindelse med den almene formel II

O CH-COOH II

X

hvor X betegner en aminogruppe, en beskyttet aminogruppe eller en gruppe, som kan omdannes til en aminogruppe, fjernelse af silyl-gruppen, når den er til stede, ved hydrolyse eller alkoholyse, og, såfremt X ikke er en aminogruppe, omdannelse af gruppen X til en aminogruppe under neutrale eller sure betingelser.

Med betegnelsen "silylderivat" af phthalidester af 6-aminopenicil-lansyre menes her produkter, som er fremstillet ved omsætning mellem 6-aminopenicillanphthalidester og et silyleringsmiddel såsom en halogentrialkylsilan, en dihalogendialkylsilan, en halogentrialkyl-silan, en dihalogendialkoxysilan eller en tilsvarende aryl- eller arylalkylsilan og forbindelser såsom hexamethyldisilazaner. Sædvanligvis foretrækkes halogentrialkylsilaner, især trimethylchlorsilan.

De silylerede derivater af 6-aminopenicillansyrephthalidester er yderst følsomme over for fugtighed og hydroxylforbindelser, og efter omsætning med det reaktive derivat af forbindelsen med den almene formel II kan det acylerede mellemprodukts silylgruppe fjernes ved hydrolyse eller alkoholyse.

Eksempler på beskyttede aminogrupper omfatter den protoniserede aminogruppe (X = NH3), som efter acylering kan omdannes til en fri aminogruppe ved simpel neutralisation, benzyloxycarbonylaminogruppen (X = NH-CC^CE^Ph (Ph betegner i hele den foreliggende beskrivelse CgH5)) eller substituerede benzyloxycarbonylaminogrupper, som senere omdannes til Nl·^ ved katalytisk hydrogenering, og adskillige grupper, som efter acylering omdannes til aminogruppen ved mild sur hydrolyse. (Alkalisk hydrolyse er sædvanligvis ikke anvendelig, idet der sker hydrolyse af phthalidgruppen under alkaliske betingelser.) 4 143803

Eksempler på grupper X, som senere kan omdannes til NH2 ved mild sur hydrolyse, omfatter enamingrupper med den almene formel XII

R1 ! yc 2 / \ R -C N-

3 I I

E—% / 1 2 hvor R betegner lavere alkyl, R betegner enten et hydrogenatom 1 3

eller sammen med R en carbocyclisk ring, og R betegner lavere alkyl, aryl eller lavere alkoxy, og den punkterede linje betegner en hydrogenbinding, eller tautomere former deraf og a-hydroxyary-lidengrupper med den almene formel IV

CH.

/ \ /—C N- z li : iv

V_c H

\/ hvor Z betegner resten af en substitueret eller usubstitueret benzen- eller naphthaienring, og den punkterede linje betegner en hydrogenbinding, eller tautomere former deraf.

Et eksempel på en gruppe X, som kan omdannes til NH2 efter acylering af phthalidester af 6-aminopenicillansyre med det reaktive derivat med den almene formel II, er azidogruppen. I dette tilfælde kan den endelige omdannelse til NH2 enten udføres ved katalytisk hydrogenering eller ved elektrolytisk reduktion.

Der anvendes et reaktivt N-acyleringsderivat med den almene formel II ved den ovenfor angivne fremgangsmåde. Valget af det reaktive derivat afhænger selvfølgelig af den kemiske egenskab af a-substi-tuenten X. Således er det ofte bekvemt, når X er en syrestabil gruppe såsom en protoniseret aminogruppe NH^j eller azidogruppen, 5 143803 at omdanne syren med den almene formel II til et syrehalogenid, f.eks. ved behandling med thionylchlorid eller phosphorpentachlorid til dannelse af syrechloridet.

Sådanne reagenser vil imidlertid undgås, når X er en syrelabil gruppe med den almene formel III eller IV. X sådanne tilfælde er det ofte bekvemt at anvende blandede anhydrider. Til dette formål er alkoxymyresyreanhydrider, som passende fremstilles ved behandling af et alkalimetal- eller tertiært aminsalt af syren med den almene formel II med et passende alkylchloroformiat i vandfrit medium eller under stuetemperatur, særligt passende blandede anhydrider.

Andre reaktive N-acyleringsderivater af syrer med den almene formel II omfatter det reaktive mellemprodukt dannet ved reaktion in situ med et carbodiimid eller en carbonyldiimidazol.

6-Aminopenicillansyrephthalidester kan fremstilles - omend i lavt udbytte - ved direkte kobling af 6-aminopenicillansyre med 3-brom-phthalid i nærværelse af base. Med denne fremgangsmåde sker nogen epimerisering ved Cg, og fremgangsmåden er derfor ikke helt tilfredsstillende.

Der kan opnås betydeligt bedre udbytte af 6-aminopenicillansyre-phthalidester ved kobling af et N-beskyttet derivat af 6-aminopenicillansyre (f.eks. triphenylmethylderivatet) med 3-bromphthalid og efterfølgende fjernelse af beskyttelsesgruppen (f.eks. ved mild sur hydrolyse, såfremt der anvendes triphenylmethylderivatet).

Alternativt til N-beskyttet 6-aminopenicillansyre kan anvendes 6--acylaminopenicillansyrer. Fremgangsmåder til fjernelse af 6-acyl-sidekæden fra benzylpenicillin og phenoxymethylpenicillin er kendt (f.eks. britisk patentbeskrivelse nr. 1.189.022) og omfatter sædvanligvis behandling af en ester af 6-acylaminopenicillansyre med PClg til dannelse af en iminochloridbinding på 6-amidonitrogenato-met, behandling af iminochloridet med en alkohol til dannelse af en iminoether og efterfølgende hydrolyse af iminobindingen til dannelse af 6-aminopenicillansyreesteren. I det foreliggende tilfælde er det muligt at gå ud fra phthalidester af penicillin G eller penicillin V

c 143803 6 (f.eks. fremstillet ved omsætning af natrium- eller kaliumsaltet af penicillinen med 3-bromphthalid) og spalte acylkæden til fremstilling af phthalidester af 6-aminopenicillansyre.

Forbindelsen med formlen I tåles godt og indgives fortrinsvis oralt, eventuelt i form af et syreadditionssalt. Sædvanligvis indgives den sammen med anvendelige farmaceutisk tolerable bærestoffer. I sådanne præparater kan forbindelsen udgøre mellem 1 og 95 vægtprocent af det totale præparat. Præparatet kan være i form af et pulver til anvendelse i form af en sirup, i form af tabletter, kapsler eller piller eller en hvilken som helst anden sædvanlig form.

Esteren med formlen I eller salte deraf kan passende indgives i enhedsdoser, som har et indhold svarende til 0,025 - 1 g 6-[D(-)a-aminophenylacetamido]penicillansyre, fortrinsvis svarende til 0,1 -0,7 g penicillansyre. Enhedsdoser indeholdende en mængde svarende til 250 - 500 mg af den omhandlede penicillansyre er passende. Den daglige dosis afhænger af patientens tilstand, men sædvanligvis vil 1 - 3 g af esteren, beregnet som den omhandlede penicillansyre, være passende.

6-[D(-)a-AminophenylacetamidoJpenicillansyrephthalidester absorberes godt, når den indgives oralt til mennesker og dyr. Der opnås høje serumværdier af den tilgrundliggende 6-[D(-)a-aminophenylacet-amido]penicillansyre.

Dansk patentansøgning nr. 2757/72 beskriver oxofurylestere af 6-(α-aminophenylacetamido)penicillansyre. Prioritetsældre i forhold til nærværende ansøgning er alene generisk sådanne med en monocyc-lisk mættet ring i esterdelen og specifikt alene forbindelsen 5-oxo--tetrahydro-2-furylesteren af ampicillin. Denne fra ansøgning nr. 2757/72 prioritetsældre forbindelse er i nedenstående tabel betegnet II, medens 6-[D(-)α-aminophenylacetamido]penicillansyrephthalidester er betegnet I.

Tabellen indeholder resultater af bestemmelsen af blodniveauet af ampicillin i mus efter oral administration af henholdsvis forbindelsen I (fremstillet ud fra mellemproduktet ifølge opfindelsen) og forbindelsen II (prioritetsældre) i en dosis svarende til 50 mg/kg ampicillin son fri syre.

143803 7

Tabel

Forbindelse nr. Test nr. Koncentration (mg/ml) antal minutter efter dosering 30 60 120 240 I 1 2,15 4,2 0,55 0,28 1.8 3,25 0,88 0,30 3.0 1,9 1,05 0,41 2,15 - 0,96 0,31 2,25 - 1,15 0,20 2 4,2 5,4 1,9 1,7 2.0 2,3 0,45 0,05 2.9 0,86 0,32 0,08 2,7 0,72 0,64 0,04 1,6 1,6 1,5 1,3 gennemsnit 2,48 2,53 0,94 0,47 II 1 1,35 0,97 0,19 0,15 2.9 0,80 0,33 1,15 1.05 0,98 0,32 0,30 3.0 0,87 0,46 0,22 1.0 0,88 0,33 2 1,65 0,68 1,9 0,09 1,65 1,6 0,2 0,44 1.6 0,5 0,22 0,14 1,3 0,41 0,71 0,12 1.7 0,52 0,11 0,78 gennemsnit 1,72 0,82 0,48 0,27 " M~' ‘ ' ' I-·»··-.............., , II ..............

0 143803

O

Det fremgår af resultaterne, at koncentrationen af ampicillin i blodet er væsentligt større efter administration af forbindelsen I end efter administration af den prioritetsældre forbindelse.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler:

Eksempel 1.

Phthalidet af 6-aminopenicillanat.

Metode 1.

En blanding af 10,8 g 6-aminopenicillansyre (0,05M) og 6,9 ml tri-ethylamin (0,05M) omrøres i 20 ml tørt acetone i 0,5 time ved stuetemperatur. Blandingen afkøles til 0°C, og der tilsættes i én portion en opløsning af 10,65 g 3-bromphthaiid (0,05M) i 20 ml tørt acetone, og den resulterende gule blanding omrøres ved stuetemperatur i 5 timer. Reaktionsblandingen fortyndes med 150 ml tørt di-ethylether og filtreres. Det klare gule filtrat vaskes med 100 ml IN natriumbicarbonatopløsning og med 100 ml mættet saltopløsning. Til det klare gule filtrat sættes 9,5 g af en opløsning af p-toluensulfonsyre-monohydrat (1 ækvivalent) i 150 ml tørt acetone, hvorefter phthalidet af epi-6-aminopenicillanatet i form af p-to-luensulfonatsaltet udkrystalliserer straks fra opløsningen.

6-a-trans-isomer: NMR [(CD^^SO]: L δ = 7,84 (4H.s. aromatisk phthalid) , δ = 7,58 (IH.s. CO-O-CH), δ = 7,30 (4H.q. aromatisk sulfonat), δ = 5,35 (lH.d. C-5-proton, J = 2Hz), S = 4,89 (IH.s. C-3-proton), δ = 4,70 (lH.d.

C-6-proton, J = 2Hz), δ = 2,30 (3H.s. CH3) og δ = 1,48 (6H.d. gem--di-CH3) . IR (KBr) stærke bånd ved 1780 cm \ 1210 cm \ 1170 cm 1010 cm 970 cm 682 cm ^ og 574 cm~^.

Ud fra moderluden fås noget yderligere olie, ud fra hvilken fås en ringe mængde (ca. 5%) af en nogenlunde ren prøve af den naturlige cis-isomere af phthalid af 6-aminopenicillanat i form af p-toluen-sulfonatsaltet deraf ved gentagne fraktionerede krystallisationer af den 6-a-trans-isomere af en opløsningsmiddelblanding af acetone/ ether (3:1).

9 U3803 6-|3-cis-isomer: NMR [(CD^)2S°]:δ = 7,84 (4H.s. aromatisk phthalid), 6 = 7,58 (IH. s. CO-O-CH), 6= 7,30 (4H.q. aromatisk sulfat), 6 = 5,50 (lH.d.

C-5-proton, J = 4Hz), δ = 5,14 (lH.d. C-6-proton, J = 4Hz), δ = 4,68 (lH.s. C-3-proton) , δ= 2,27d (3H.s. CH·,) og δ = 1,53 (6H.d. gem-di- 3 -1 -1 -1 methyler). IR (KBr) stærke bånd ved 1780 cm , 1210 cm , 1170 cm , 1010 cm *", 970 cm 682 cm ^ og 574 cm Metode 2.

En opløsning af 9,8 g 6-tritylaminopenicillansyre (0,02M) i 100 ml tørt acetone afkøles til 0°C, der tilsættes 2,9 mg triethylamin (0,02M) efterfulgt af 4,1 g 3-bromphthalid (0,02M) i 20 ml tørt acetone, og reaktionsblandingen holdes ved 0°C under omrøring i 2 timer og derefter ved stuetemperatur i 1 time. Det udfældede tri-ethylammoniumbromid fjernes ved filtrering, det inddampede filtrat opløses i 150 ml ethylacetat, og efter vask med 2 x 150 ml koldt 2%'s vandig natriumbicarbonatopløsning og 2 x 100 ml isvand tørres ethylacetatfasen over vandfrit magnesiumsulfat, hvorved phthalidet af 6-tritylaminopenicillanat fås i form af et hvidt amorft fast stof ved fjernelse af opløsningsmidlet i vakuum.

NMR [ (CD^)2S°]! ^ = 7,4 (20 H. bred singlet med mindre skuldre ved δ = 7,80 (aromatiske protoner og CO-O-CH-), S = 4,41 (2H.m. β-lactamprotoner), δ = 4,15 (IH bred singlet C-3-proton) og δ = 1,38 (6H.d. gem-dimethyler).

IR (KBr) stærke bånd ved 1745 cm 980 cm-'1', 750 cm ^ og 708 cm 5,9 g phthalid af 6-tritylaminopenicillanat (0,01M) i 200 ml acetone indeholdende 0,2% vand behandles med 1,9 g p-toluensulfonsyre--monohydrat (0,01M). Efter 2 timers henstand ved stuetemperatur tilsættes 0,25 ml vand, og ved langsom tilsætning af 250 ml petro-leumsether (kogeinterval 40 - 60°C) fås bundfald af phthalid af 6--aminopenicillanat-p-toluensulfonat. Ved filtrering og efterfølgende vask med petroleumsether fås det rå p-toluensulfonatsalt.

Prøven omkrystalliseres af acetone/diethylether (85%'s genvinding).

NMR [(CD-j^SO]: 6 = 7,84 (4H.s. aromatisk phthalid), δ = 7,58 (IH. s. -CO-O-CH-), δ = 7,30 (44,9 q. aromatisk sulfonat), δ = 5,50 (lH.d. β-lactamer, J = 4Hz), δ = 5,14 (lH.d. β-lactam, J = 4Hz), 143803 ίο 6 = 4,68 (IH.s. C-3-proton), δ = 2,27 (3H.s. CH3) og δ = 1,53 (6H.d. gem-dimethyler).

Analyse:

Beregnet for C23H24N2S2O8: C 53,08 H 4,61 N 5,39 S 12,31 Fundet: C 52,32 H 4,60 N 4,94 S 12,27.

Metode 3.

Benzylpenicillinphthalidester.

20,0 g af kaliumsaltet af benzylpenicillin (10,054 mol) opløses i 50 ml tørt dimethylformamid og afkøles til 0°C. Til denne opløsning sættes under omrøring 11,5 g 3-bromphthalid (0,054 mol) i 20 ml tørt dimethylformamid i én portion. Reaktionsblandingens temperatur lades stige til stuetemperatur, og blandingen omrøres i yderligere 2 timer. Blandingen hældes i 600 ml iskoldt vand og omrøres kraftigt. Det hvide faste bundfald, som udskiller, opsamles og vaskes grundigt med vand. Efter tørring omkrystalliseres stoffet af varmt isopropanol, hvorved fås 10,5 g hvidt krystallinsk produkt (41,9%) med smeltepunkt 167 - 169°C. IR-Spektret (nujol) indeholder bl.a. stærke bånd ved 1770 cm \ 1678 cm *", 1524 cm ^ og 970 cm NMR [(CD^)2SQ/D2O] indeholder toppe ved: δ = 7,88 (4H.m. aromatisk phthalid), δ = 7,61 (IH.s. CO-O-CH-), δ = 7,28 (5H.s. aromater), δ = 5,55 (2H.m. 0-lactamer), δ = 4,55 (lH.s. C^-proton), δ = 3,56 (2H.s. PhC^CO) og δ = 1,53 (6H.d. gem-dimethyler) . Renheden bestemt med hydroxylamin er 109,2%.

Analyse:

Beregnet for C24H22N2S06: C 61,55 H 4,90 W 5,87 S 6,72 Fundet: C 61,80 H 4,72 H 6,02 S 6,86.

11,6 g benzylpenicillinphthalidester (0,025M) opløses i 250 ml tørt methylendichlorid og afkøles til -25°C. Der tilsættes 5,60 ml N-methylmorpholin (0,025M) efterfulgt af en opløsning af 6,0 g phosphorpentachlorid i 150 ml methylendichlorid i løbet af 5 minutter. Der udvikles en svag gul farve, og efter omrøring i 0,5 time stiger temperaturen til 0°C. Reaktionsblandingen afkøles til -25°C, og der tilsættes 5,60 ml N-methylmorpholin og tørt methanol, hvorved fås en langsom stabil stigning i temperaturen indtil ca. -10°C.

143803 11

Efter omrøring ved en temperatur på fra -5 til 0°C i yderligere 2 timer tilsættes 400 ml vand under kraftig omrøring, medens blandingens pH-værdi justeres fra 1,2 til 6,0 med fortyndet natriumhydroxidopløsning .

Den organiske fase fraskilles, vaskes med vand og med en mættet saltopløsning og filtreres gennem siliconepapir.

Der tilsættes 4,75 g af en opløsning af p-toluensulfonsyre-mono-hydrat (0,025M) i 100 ml acetone under omrøring til den organiske fase, og der tilsættes ether, indtil opløsningen bliver uklar. Ved henstand natten over ved 0°C fås 7,0 g hvide krystaller af 6-amino*-penicillansyrephthalidester-p-toluensulfonat, og der fås yderligere 2,5 g ved koncentrering af filtratet. Det totale udbytte er 9,5 g (73,4%).

NMR [(CD^^SO]: δ = 7,84 (4H.s. aromatisk phthalid) , δ = 7,58 (IH. s. -C0-0-CH-), 6 = 7,30 (4H.s. aromatisk sulfonat), δ = 5,50 (IH. d. (3-lactam, J = 4Hz) , δ = 5,14 (iH.d. Ø-lactam, J = 4Hz) , δ = 4,68 (lH.s. C^-proton), 6 = 2,27 (3H.s. CH3~) og δ = 1,53 (6H.d. gem-di-CH3).

Analyse:

Beregnet for <-23H24I^2^2<^8! C 53,08 H 4,61 N 5,39 S 12,31 Fundet: C 52,50 H 4,62 N 4,98 S 12,34.

Eksempel 2.

Ampicillinphthalidester (I) via kobling af phthalid af 6-aminopeni-cillanat med et blandet anhydrid af enaminbeskyttet a-aminophenyl-eddikesyre.

<D> (D> f ')-CH-COjNa (f )-CH-C0-0-C0-0C2H5

\—/ I I

CH3”9 ? CH-.-C H

I : -> 3 I ! J3 CH 0 \c ' \ ^ r y NCx 6~aminope- I I \ nicillan- OCH·, JL„ \ syrephtha- j utii3 \ lid 143803

-CHCO-NH--j-S

pH-værdi 2,5 | --N-v (I) 4- CH3-/\ ^ ^o-o ii i CH 0 / 1 \ / I >1 I o och3 10.4 g phthalid af 6-aminopenicillanat-p-toluensulfonat suspenderes i 60 ml ethylacetat og omrøres kraftigt sammen med 135 ml IN natriumbicarbonatopløsning i 20 minutter ved stuetemperatur. Den organiske fase fraskilles, vaskes med 100 ml vand indeholdende 5 ml 2%'s natriumbicarbonatopløsning, tørres over vandfrit magnesiumsulfat, filtreres og holdes ved -15°C.

5.4 g af et blandet anhydrid af natrium-D(-)N-(1-methoxycarbonyl-propen-2-yl)-a-aminophenylacetat i 30 ml ethylacetat fremstilles ved tilsætning af 2 ml ethylchloroformat og 2 dråber pyridin ved -15°C og omrøring af reaktionsblandingen i 10 minutter ved en temperatur mellem -15 og -20°C. Til denne opløsning af et blandet anhydrid sættes ethylacetatopløsningen af phthalidet af 6-aminopeni-cillanat, og blandingen omrøres ved -15°C i 15 minutter og derefter yderligere i 45 minutter uden yderligere afkøling.

Der tilsættes 75 ml vand, efterfulgt af 10 ml 2N saltsyre, og reaktionsblandingen omrøres kraftigt i 25 minutter. Der tilsættes langsomt 250 ml petroleumsether (kogeinterval 60 - 80°C) under omrøring. Den vandige fase fraskilles og mættes med natriumchlorid, og olien, som skiller ud, ekstraheres med 2 x 100 ml ethylacetat og tørres over vandfrit magnesiumsulfat.

Efter filtrering koncentreres opløsningen i vakuum til ca. 1/4 rumfang, der tilsættes langsomt ca. 250 ml tørt ether, og ampicillin-phthalidet, som bundfælder i form af 4,0 g hvidt amorft hydrochlo-ridsalt (40%), opsamles og vaskes grundigt med ether. Hydroxylamin- 13 143803 analyse giver 76,1%, iodometrisk analyse giver 77,5%, og chlor" indholdet er 7,07% (teoretisk 6,85%).

Forsøg.

Hydrolysehastigheden af phthalidester af 6-[D(-)a-aminophenylacet-amido]penicillansyre-hydrochlorid bestemmes ved at sætte esteren i en mængde svarende til 5^ug pr. ml 6-[D(-)α-aminophenylacetamido]-penicillansyre til 0,05M kaliumphosphatpuffer ved en pH-værdi på 7,0, til 901's menneskeblod og til 90%'s dødningehovedabeblod.

Esteren blev også testet for hydrolyse i et tyndtarmhomogenat fra dødningehovedabe i en koncentration svarende til lOO^ug pr. ml 6-[D(-)α-aminophenylacetamido]penicillansyre, og reaktionsblandingen fortyndes til en koncentration svarende til 5,0^,ug pr. ml af den omhandlede penicillansyre før analyse. Vævhomogenatet fremstilles ved homogenisering af vasket dødningehovedabetyndtarm i den 4-dobbelte vægtmængde af 0,05M kaliumphosphatpuffer. Reaktionsblandingen fremstilles ved yderligere fortynding (1:10) af dette præparat.

Alle reaktionsblandingerne inkuberes ved 37°C. Efter inkubering skilles esteren fra reaktionsblandingen ved elektroforese. På stivelses-agar-gel-plader, pufret til en pH-værdi på 5,5, anbringes 5^uliter af en passende fortynding af reaktionsblandingen og 6-[D(-)α-aminophenylacetamido]penicillansyre-standarder, fremstillet i et passende medium. Over pladerne lægges et potential på 15 volt pr. cm i 20 minutter. Ved denne pH-værdi bliver den pågældende penicillansyre tæt ved dets oprindelige sted, og en hvilken som helst tilstedeværende ester bevæger sig mod katoden. Den mængde af den pågældende penicillansyre, som er til stede i reaktionsblandingen, bestemmes ved at overhælde gel-pladerne med en næringsagar (okseblod-grund-agar) podet med Sarcina lutea NCTC 8340 og inkubering i 16 timer ved 30°C. Inhiberingszonerne fra ampicillin i prøverne og standarderne måles, og den mængde af den pågældende penicillansyre, som er dannet ved reaktionen, bestemmes.