DK144083B - Fremgangsmaade til fremstilling af et middel til forhindring af gastro-intestinale forstyrrelser hos svin - Google Patents

Description

(19) DANMARK

|j| (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT ud m083B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 2657/71 (51) IntCI.3 A 61 K 39/02 (22) Indleveringsdag 1 . jun. 1971 // A 23 K 1/18 (24) Løbedag 1. jun. 1971 (41) Aim. tilgængelig 4. dec. 1971 (44) Fremlagt 7· dec. 1981 (86) International ansøgning nr.

(86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 3. jun. 1970 , 26746/70, GB

(71) Ansøger UNILEVER N.V., Rotterdam, NL.

(72) Opfinder jan Roland Hill, GB: Raymond Kenworthy, GB: Philip

Porter, GB.

(74) Fuldmægtig ingeniørfirmaet Budde, Schou & Co.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af et middel til forhindring af gastro-intestinale forstyrrelser hos svin.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et middel til forhindring af gastro-intestinale forstyrrelser hos svin, og denne fremgangsmåde er af den art, hvor man dyrker pathogene svinetarminficerende bakterier, skiller bakte-OQ rierne fra kulturen og dræber de fraskilte bakterier på en sådan 2 måde, at endotoxiner frigøres fra bakteriernes celler.

3 Gastro--intenstinale forstyrrelser hos svin stammer ofte ^ fra tilstedeværelsen i tarmen af én eller flere patogene stammer

«J

[— af bakterien Escherichia coli, især stammer af følgende serotyper: * 3 2 144083

Weybridqe-klassificering International serotype- klassificering_ G7 08 : K87 (B) K88a,b(L)

E65 045 : K

E57 0138 : K81 (B) E4 0139 : K82 (B) E68II 0141 : K85a,b->K85a,c(B) G1253 0147 : K89 (B) K88a,c(L) 'Abbotstown' 0149 ; K91 K88a,e(L) Når svins omgivelser eller kost ændres, f.eks. når de flyttes eller vænnes fra, efterlader ændringen i vilkårene svinets system i en tilstand, der er gunstig for formeringen af de pathogene E. coli-stammer, og de gastro-intestinale forstyrrelser, som kan være resultatet deraf forringer dyrets almene helbredstilstand og vægtforøgelse, ofte med dødelig udgang.

Den foreliggende opfindelse er baseret på den erkendelse, at svinetarmen kan stimuleres til at danne antistoffer mod allerede tilstedeværende pathogene E. coli-stammer ved, at der i tarmen (og altså ikke i blodstrømmen som ved injektion) indføres endotoxinerne af én eller flere af de ovenfor nævnte E. coli-serotyper, praktisk taget fri for levende E. coli-organis-mer.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der er af den allerede angivne art, er i overensstemmelse med det ovenfor anførte ejendommelige ved, at man fremstiller endotoxiner fra én eller flere af de pathogene E. coli-serotyper 08, 045, 0138, 0139, 0141, 0147 og 0149, hvorefter de frigjorte endotoxiner blandes med sædvanlige foderbestanddele, fortrinsvis ved pH 5-6.

Når det materiale, der skal indføres i svinetarmen, specificeres som "endotoxiner", er der ikke hermed ment, at der fra dette materiale skal være udelukket tilstedeværelsen af exotoxi-ner eller af det cellulære materiale, hvori endotoxinerne er indesluttet i den levende bakterie; meningen er blot, at endotoxinerne er af primær betydning for opnåelse af den ønskede immunologiske virkning, medens dette ikke er tilfældet for exotoxinerne og celleresterne. Imidlertid vil det i nogle tilfælde være hensigtsmæssigt at lade enten exotoxiner eller cellerester eller begge dele 3 U4083 forblive forbundet med endotoxinerne, for det første fordi man derved sparer sig besværet med at adskille dem, og for det andet, for at man får mulighed for at udnytte deres antigene evne.

Som allerede nævnt har indføring i tarmen ("indgiv-ning") af endotoxinerne af kun en enkelt af de ovenfor nævnte E. coli-serotyper nogen gunstig virkning, for så vidt som den nævnte serotypes evne til at gøre fortræd derved vil blive nedsat, men det er at foretrække at indgive endotoxinerne af alle serotyperne, og i overensstemmelse hermed er det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen særlig hensigtsmæssigt, at der i foderet inkorporeres endotoxiner fra alle de nævnte syv E. coli-serotyper. De endotoxiner, der skal indgives, kan op·’ nås ved dyrkning af hver serotype, hvoraf prøver kan fås fra Central Veterinary Laboratory, Ministry of Agriculture and Fischeries, New Haw, Weybridge, Surrey, UK, og når væksten af mikroorganismen og dermed dannelsen af endotoxiner er skredet frem i passende grad, dræbes de formeringsdygtige mikroorganismer og endotoxinerne frigøres, hvilket kan gøres ved kog” ning eller autoklavering. Hele de steriliserede kulturer, der hver indeholder exotoxiner og cellerester såvel som endotoxiner, kan derefter forenes og indgives, men i stedet for at sterilisere hele kulturerne er det at foretrække, at bakterierne fraskilles, således som det sker ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hensigtsmæssigt ved centrifugering, og behandles i et lille rumfang af et vandigt medium, f.eks. vand eller saltopløsning, til dræbning af bakterierne og frigørelse af endotoxinerne.

Den simpleste og mest økonomiske måde til dræbning af de fraskilte bakterier består i en opvarmning. Hvis opvarmningen er tilstrækkelig langvarig, f.eks. 1 time til 100°C, 20 minutter til 125°C, bliver det meste af endotoxinet befriet for at være forbundet med cellevæggene fra de dræbte bakterier og bliver frigjort i det medium, hvori opvarmningen udføres. De resterende bundne endotoxiner kan, som det er konstateret, bringes i opløsning ved behandling med et enzym såsom trypsin, lysozym, pepsin, lipase eller blandinger deraf. Resultaterne af typiske behandlingsmåder er sammenfattet i tabel I, der viser de rela- 4 144083 tive mængder (titeren) af endotoxiner, der er frigjort i vandet ved en indledende behandling til dræbning af bakterierne efterfulgt af en enzymbehandling til frigørelse af endotoxin, der er efterladt bundet til bakteriecellevæggene.

5 U4D63 o ο t- ια

A

tu ε ί> Ch I Ν Η ΟΟΟΟ οο

C φ Ο + m OJ OJ CM CM CVJ OD

Φ Ε Φ a η Η Η ΓΑ γΗ CM

.ρ η >3 ω in ιη ιλ ια η Ρ -Ρ Η & Φ

ι—I

bO

c -η ε c •Η *Η _ Η Ε Ν Φ ΟΟΟΟ Ο Ο Ό >, Ο + α C0 ΟΙ ΟΙ 4- VO νο C tsl Φ t>3 CVJ Η Η Ά ΙΑ ΙΑ

Βίβ ^ Η LA ΙΑ ΟΙ CVJ

,β Φ Η -Ρ Φ A Α m φ &ο ε β β Φ -Η _ Λ ^ -η C ra m οο ο οο C φ Cd a 00 VO 00 00 00 A-Hft+l>30JLniOJ cm oj

$ ^ ri Ιμ i—I OJ H HH

β Φ Η A

Α -P id A cd H)i «) „ ^ > w o o o o φ cd co uo co cvj .p -p o, oi ia i OJ rA i

β A H i—I OJ H

O s H

u

bOA

•H

β φ β HAH ΟΟΟΟ ΟΟ W Ά CM CM CO -3- 00

C Ή & LO Η H OJ Ά CM

•H CtJ Φ OJ LA LA i—f i—I

Η XI &

O bO

Η Α β

Φ OH

a ό η ε β β Ό >» „ _ „ ^ Ρη φβΝ ΟΟΟΟ ΟΟ

cdO -3- co νο CM VO

φ Α Μ VAOJlAVO ΙΑ LO Φ Α Φ >3 Η CM CM Ε hOA Η ω β Α S Ά g Β* c a A A Η „ β φ bO Φ ΟΟΟΟ ΟΟ Ο ΗΗ a CO Ά Ά VO -3" Ά ο ε β >3 ΟΙ ΙΑ ΙΑ in VAIA β idCi β Η (Μ ΟΙ οι οι id co a ε β Α Η Α β XI β ΟΟ ΟΟΟΟ ΟΟ Φ -pr^ ΟΙ 00 ΙΟ 4- -3" A" Φ Ο&ο ΓΑ CM LA Ά VAVO >3 Α Η ϋ Η ΟΙ Η β β

W Η bO

Η Η — β ^ a β β &ο β ε η φ a

Ci φ cd · ο ε β

Η bO β β Η C

,—1C 1—I ΙΑ Η Η Cd A

AO · * A *. Ε A A

c a c β a η ο β cm φ cd Η Η O LA Α Α Φ Ε Ε Φ **>IA -=J· h Φ ra id Φ bO a AH ο ο φ > h A ho β ω Φ CM CM H TS. Φ « AO o bOA I ββΟ >β fil· -2 c A H H O ao Η cd ΙΑ ω Η SB m O LA E t> Η

Cm o o cd Ε r Α β aa o o β ε a ao ra φ ά iBC O LA Α Φ M0 - > irf

β^ o oj η σ\ > k >R

p HH pw a LA

6 144083 I praksis sker indgivningen af endotoxinerne til svinet selvfølgelig gennem munden, enten simpelt hen ved tvunget indgivning af sterilt kulturmateriale eller med drikkevandet eller som en bestanddel af et svinefoder, hensigtsmæssigt et foder, der indeholder det protein, den carbon-hydratkilde, f.eks. korn, og de mineraler og mineralstoffer, der er essentielle bestanddele for svinekost.

Det er konstateret, at sådanne svinefoderbestanddele som sildemel, gær, hvedemel, knust havre, malet byg og skummetmælkspulver er tilbøjelige til at binde E. coli-endotoxiner til sig ved pH-værdier på 5,9 og derover, således som det fremgår af tabel II.

Tabel II

Titer af bundet endotoxin pr. enhedsvægt bestanddel ved pH =

Kostbestanddel 5,3 5,9 6,3 6,8 7,2

Hvedemel 0 480 480 480 560

Havreskrå 000 320 560

Malet byg 0 0 320 320 480

Sildemel 0 480 480 480 560 Gær 0 320 480 480 560 t

Skummetmælkspulver j 0 320 480 480 560

Det er også konstateret, at proteolytiske enzymer som f.eks. trypsin er i stand til at frigøre det på denne måde bundne endotoxin. Således vil trypsin ved en pH-værdi på 7,2 frigøre ca. halvdelen af det ovenfor bundne endotoxin-indhold i gær og skummetmælkspulver.

Desuden er det konstateret, at E. coli-endotoxiner udfældes fra vandige systemer ved pH-værdier på under 5, som det fremgår af tabel III.

144083 7

Tabel III

pH- Titer for endotoxin i standardværdi opl. efter indstilling på den angivne pH-vardi_ 7.0 320 6.5 320 6.0 320 5.5 320 5.0 320 4.5 160 4.0 80 3,2 40 2.5 40

Det er hensigtsmæssigt at inkorporere endotoxinerne i et foder ved, at man først fremstiller en for-blanding af endotoxinerne med en af foderbestanddelene (hensigtsmæssigt skummetmælk) og vand, hvorefter denne for-blanding blandes med de øvrige af foderets bestanddele. Ved anvendelse af denne metode er det ønskeligt, med henblik til de i tabellerne II og III anførte resultater, at indstille for-blandingens pH-værdi på 5-6 til sikring af, at i det mindste en del af indholdet af endotoxiner i foderet straks efter synkningen bliver stillet til rådighed for stimulering af immunsystemet i svinets tarme. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er det således hensigtsmæssigt, at der fremstilles en for-blanding af endotoxinerne med ét eller flere næringsstoffer ved en pH-værdi på 5-6, og at denne for-blanding derefter blandes med de øvrige næringsstoffer.

Opfindelsen er især af betydning til forbedring af infektionsresistensen hos svin på afvænningsstadiet, hvor de er særlig udsatte for stress. Ved indgivning af endotoxinmateria-let før svinet vænnes fra, begyndende f.eks., når det er 4-10 døgn gammelt, og fortsættende indtil afvænningen, kan svinetarmen stimuleres til at danne passende antistoffer, således at der, på det tidspunkt, hvor grisen tages fra soen, er en tilstrækkelig stor antistofcirkulation i tarmen til at dække enhver 8 144083 E. coli-formering eller i det mindste at formindske alvorligheden af enhver sygdomstilstand fremkaldt deraf. Endotoxin-ma-terialet kan til dette formål inkorporeres i et såkaldt "stiv-sygefoder", dvs. et foder, der er specielt sammensat til at opfylde næringskravene for svin på afvænningsstadiet. Foderet gives i dette tilfælde til grisene, idet man sørger for at forhindre soen i at æde det, almindeligvis ved kun at gøre det tilgængeligt gennem en smal åbning.

Minimumsdoserne ligger i området 1-5 enheder (angående målingen af en enhed, se de følgende eksempler) af endotoxiner-ne af hver E. coli-serotype pr. svin pr. dag, men det er iagttaget, at svin, der fik 1000 gange denne mængde, ikke viste nogen dårlige virkninger. En meget velegnet mængde til inkor- 4 5 porering i et svinefoder er 10 -10 enheder af endotoxinerne af hver serotype pr. kg foder, og det således ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen særlig hensigtsmæssigt, at endotoxinerne 4 5 af hver serotype E. coli inkorporeres i en mængde på 10 -10 hæmagglutinationsenheder pr. kg. foder.

De følgende eksempler skal tjene til nærmere illustrering af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Eksempel 1.

Fremstilling og isolering af endotoxiner

Der fremstilles endotoxiner fra hver af de ovenfor omtalte syv E. coli-serotyper, idet der generelt følges den metode, der er angivet af Westphal, Luderitz og Bister (1952) i Z. Natur. Forsch. 7, 148.

Et frysetørret kultur af E. coli rekonstitueres i pep-ton-vand og inkuberes ved 37°C i 6 timer. Efter passende vækst kontrolleres kulturen for renhed på en vasket fåreblod/agar-pla-de, hvorefter den anvendes til podning af skråkulturer af næringsagar (Oxoid) i Roux-kolber. Kulturen dyrkes ved 37°C natten over, hvorefter bakterierne høstes i sterilt destilleret vand.

Den opnåede bakteriesuspension fordeles aseptisk i Universal--flasker på 30 ml og centrifugeres med 4000 rpm i 10 minutter.

Den overliggende væske fjernes, og den tilbageværende kage af 9 144083 bakterier resuspenderes i 4 ml sterilt destilleret vand og frysetørres.

Til isolering af endotoxinerne suspenderes 0,5 g frysetørret E. coli i 5 ml 0,15 M NaCl, og 10 ml 90%'s vandig phenol tilsættes som lyseringsmiddel. Blandingen opvarmes til 68°C i 30 minutter under kontinuert omrøring, hvorefter den centrifugeres ved 4000 rpm til sammenpakning af celleresterne.

Den vandige fase fjernes og køles til 4°C, hvorpå den langsomt tilsættes 10 rumfang iskold ethanol. Det herved fremkomne bundfald genopløses i vand, og nucleinsyrer udfældes fra opløsningen ved tilsætning af 2 rumfang ethanol og fjernes. Fra den tilbageblivende opløsning udfældes endotoxinerne ved tilsætning af yderligere 8 rumfang ethanol, hvorpå de fraskilles ved centrifugering, vaskes med iskold ethanol og genopløses i 0,15 M NaCl.

Denne opløsning af endotoxiner vil der i det følgende blive henvist til som Reagens 1.

EE£¥CiQ2_å£_§SdQtQ2iner a. Fremstilling af antiserum

Specifikke hyperimmune sera ("antisera") fremstilles i hvide New Zealand-kaniner mod vaskede, varmedræbte (100°C, 21/2 time) organismer af hver af E. coli-serotyperne.

Derefter fremstilles suspensioner af de varmedræbte or- q ganismer i 0,15 M NaCl (ca. 3 x 10 organismer pr. ml), og disse suspensioner injiceres intravenøst. Immuniseringsskemaet begynder ved et injektionsrumfang på 0,1 ml og fortsættes hver 4. dag med fordobling af rumfangene til 1,6 ml. Kaninerne tappes for blod 10 dage efter afslutning af immuniseringsskemaet, og det opnåede blod centrifugeres, idet det øverste lag af hype-rimmun-serum samles. Dette antiserum vil i det følgende blive betegnet som Reagens 2.

b. Måling af antistof (anti-endotoxin)-aktiviteten i antiserum Fåreerythrocyter sensibiliseres ved behandling af en 5%'s suspension af vaskede sammenpakkede celler med et lige så stort 10 144083 rumfang aÆ endotoxin-opløsningen Reagens 1 ved 37°C i 30 minutter, hvorefter de sensibiliserede celler fraskilles ved centrifugering, vaskes fri for overskud af endotoxiner og gensuspenderes i 0,15 M NaCl til dannelse af en 2,5%'s suspension af endotoxin-sensibiliserede fåreerythrocyter. Denne suspension vil i det følgende blive betegnet som Reagens 3.

Reagenset 2 (antiserummet) fortyndes serievis med 0,15 M NaCl til opnåelse af en række opløsninger med lige stort rumfang (1 vol) og med en antistofkoncentration på 1/5, 1/10, 1/20, „ _i 1/40.... 1/(5 x 2 ) af Reagens 2's koncentration, og til hver af disse opløsninger sættes 1/5 rumfang af Reagens 3. I de stærkere antiserum-opløsninger, men ikke i de svagere sker der en hæmagglutinering, og slutpunktet for titreringen (udført ved 4°C) tages som den opløsning, hvori der lige netop sker en hæmaggluti-nering. Ved en typisk metode kan dette slutpunkt være ved den tolvte opløsning, dvs. den opløsning, som har en antistofkoncen-tration på 1/(5 x 2^"*") af Reagens 2's koncentration. Reagens 2 siges da at have en antiserum-titer på 5 x 2^(= 10.240) .

c. Måling af koncentrationen af endotoxiner i en opløsning af ukendt koncentration_

Den opløsning (Y), der skal måles, fortyndes seriemæssigt med 0,15 M NaCl til opnåelse af en række opløsninger med lige stort rumfang (3 vol) og med endotoxin-koncentrationer på 1/3, 1/6, 1/12, 1/24 etc. af opløsningen Y's koncentration. Til hver af disse opløsninger sættes 1 rumfang Reagens 2 (antiserum) fortyndet til en titer på 20 (se b. ovenfor) og derefter (efter nogle få minutter) 1 rumfang af Reagens 3 (sensibiliserede fåreerythrocyter) , således at der fås slutkoncentrationer af endotoxiner på 1/5, 1/10, 1/20... 1/(5 x 2n”"^) af opløsning Y's. Hæmaggluti-neringen hæmmes i de stærkere endotoxiner-opløsninger men sker i de svagere, og endepunktet for titreringen tages som den op-løsning, hvori hæmagglutineringen lige netop hæmmes. Ved en typisk metode kan dette være ved den sjette opløsning, dvs. en en-dotoxin-koncentration på 1/(5 x 2 ) af opløsning Y's. Opløsning Y siges da at have en titer på 5 x 2^ (= 160), svarende til 160 enheder endotoxin pr. ml (se eksempel 3).

144083 11

Eksempel 2.

A. Fremstilling af endotoxinmaterlale

Den nedenfor anførte metode fulgtes særskilt for hver af de tidligere nævnte E. coli-serotyper.

(I) Bakterien stryges ud fra en opbevaringskultur på vaskede blodagarplader og inkuberes ved 37°C i 24 timer, hvorefter pladerne kontrolleres på sædvanlig måde for stammens renhed.

(II) Kolonier af bakterien overføres fra pladerne til 5Q ml Oxoid Nutrient Broth No. 2 (katalog nr. CM 67), og dyrkningsvæsken holdes på 37°C i 24 timer.

(III) Hele den i (II) opnåede kultur anvendtes til podning af 1,5 liter Oxoid Nutrient Broth No. 2, og dyrkningsvæsken inkuberedes under omrystning ved 37°C i 24 timer.

Hver således fremstillet slutkultur indeholdt ca. 101^ levedygtige bakterier pr. ml, og en prøve af kulturen gav, efter dampbehandling ved 125°C i 2 timer og udsættelse for den i eksempel 2 beskrevne prøvemetode, en titer på 2560, svarende til 2560 endotoxin-enheder pr. ml dampbehandlet kultur.

Kulturerne af alle serotyperne samledes sammen, og det samlede produkt dampbehandledes i 2 timer i en autoklav (125°C) til dræbning af bakterierne.

B. Fremstilling af svinefoder

Hele den steriliserede dyrkningsvæske opnået som beskrevet under A indstilles på en pH-værdi på 5 og inkorporeres i et vægtforhold på 15:85 i et sædvanligt svineafvænningsfoder af følgende sammensætning: 12 144083 * Vægtprocent

Valsetørret skummetmælk 20

Hvidt fiskemel 25

Valsede havregryn (havreflager) 36 Sukker (saccharose) 10 Tørret gær (75% uekstraheret) 5,5

Torskeleverolie 2

Natriumchlorid 0,5

Mineralsk supplement 1,0

Det herved fremkomne blandfoder tørres ved 65°C til et fug-tighedsindhold på ca. 15%.

Eksempel 3.

Den endelige kultur af hver serotype opnået på den under A i eksempel 2 beskrevne måde centrifugeres til fra-skillelse af bakterierne som derefter resuspenderes i vand og opvarmes til 125°C i 30 minutter. De dræbte bakterier behandles derefter i 3 timer ved 37°C med en blanding af enzymerne lysozym og pepsin, og det samlede endotoxinmateriale fra dræbningsbehandlingen og enzymbehandlingen prøves. Det prøvede endotoxin-materiale fra alle serotyperne samles sammen, indstilles på en pH-værdi på 5 og sættes til skummetmælk. Blandingen inkorporeres derefter i et sædvanligt svinefoder af den i eksempel 2 angivne sammensætning, således at der fås en kon- 4 centration på 10 endotoxin-enheder af hver serotype pr. kg foder .