DK144424B - Fremgangsmaade til fremstilling af glukoseiseomerase eller et enzympraeparat indeholdende glukoseisomerase - Google Patents

Description

144424

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af glukoseisomerase eller et enzympræparat indeholdende glukoseisomerase.

I de senere år er megen forskning blevet rettet mod ud-5 vikling af fremgangsmåder til omdannelse af glukose til fruktose, da fruktose er betydeligt sødere. De mest egnede fremgangsmåder er de, ved hvilken omdannelsen bevirkes med enzymet glukoseisomerase. Betydelig opmærksomhed har derfor været rettet mod fremgangsmåder til fremstilling af dette 10 enzym. Hidtil har de foreslåede fremgangsmåder til fremstilling af enzymet været portionsvise metoder.

Det har nu vist sig, at når glukoseisomerase fremstilles ved kontinuerlig forgæring under anvendelse af egnede betingelser, kan udbyttet af enzym (både udtrykt ved den pro-15 ducerede mængde enzym pr. gram kulstofkilde og udtrykt ved enzymproduktion pr. rumfangsenhed af forgæringsbeholderen), og dets aktivitet til isomerisering af glukose til fruktose forbedres.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved kon-20 tinuerlig dyrkning af en glukoseisomeraseproducerende mikroorganisme af gruppen af Arthrobacter nov. sp.-stammerne NRRL B-3724, B-3725, B-3726, B-3727 og B-3728 i et kulturmedium under anvendelse af glukose eller xylose som det begrænsende næringsstof og ved en temperatur i intervallet 25 20-55°C, en pH-værdi i intervallet 6,0 - 8,0 og en spænding af opløst oxygen (DOT) i kulturmediet i intervallet 0 -150 mm kviksølv og ved en fortyndingshastighed i intervallet 0,05 - 0,4 timer og kontinuerlig udvinding af enzymet eller enzympræparatet.

30 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen begyndes ved dyrkning af mikroorganismen på en sædvanlig portionsvis metode. Når 2 14442Λ kulturen vokser tilfredsstillende, påbegyndes kontinuerlig tilsætning af næringsstoffer, og kultur fjernes fra forgæringsbeholderen med lignende hastighed som den, hvormed næringsstofferne tilsættes. Egnede næringsstoffer er kilder til 5 kulstof, nitrogen, fosfor, magnium, svovl, kalium og sporstoffer. Hyppigt tilsættes også en kilde til organisk nitrogen, der kan indeholde vækstfaktorer, f.eks. gærekstrakt eller majsstøbevæske. Næringsstofferne tilsættes fortrinsvis til kulturen i koncentrationer (% w/w af kildeforbind-10 elsen) i intervallerne (vægtprocenter):

Kulstofkilde 0,05 - 10%

Nitrogenkilde 0,001 - 3%

Fosforkilde 0,01 - 0,5%

Magniumkilde 0,001 - 0,2% 15 Svovlkilde 0,01 - 0,25%

Kaliumkilde 0,01 - 0,25%

Organisk nitrogenkilde 0,01 - 5%

Sporstoffer i overskud.

Ved fremgangsmåde ifølge opfindelsen findes det begrænsende 20 næringsstof, det vil sige glukose eller xylose, i sådanne koncentrationer, at yderligere stigning i den tørre vægt af de anvendte mikroorganismer kun begrænses ved mangel på yderligere mængder af det begrænsende næringsstof.

Ved fremgangsmåden til fremstilling af glukoseisomerase 25 eller et enzympræparat indeholdende glukoseisomerase dyrkes den glukoseisomeraseproducerende mikroorganisme først i en portionskultur, før den overføres til kontinuerlig dyrkning. F.eks. fremstilles et podemateriale indeholdende en glu= koseisomeraseproducerende stamme, f.eks. på en agarskrå-30 kultur, og anvendes til at pode et egnet dyrkningsmedium.

Der dyrkes organismen i portionskultur, fortrinsvis i 4-48 timer. En aliquot af hele kulturen anvendes så til at pode et større rumfang næringsstof. Dette kan gentages en eller flere gange, før kontinuerlig dyrkning påbegyndes.

144424 3

Mikrobielle celler indeholdende enzymet kan skilles fra dyrkningsmediet, som kontinuerligt udtages fra enzymproduktionsprocessen på enhver kendt måde. Fortrinsvis anvendes de hele celler til at udføre isomeriseringen af glukose til 5 fruktose. Hvis det ønskes, kan enzymet dog ekstraheres fra cellerne på enhver egnet måde, eller den færdige kultur selv kan anvendes uden at fraskille cellerne til omdannelse af glukose til fruktose. Anvendelse af den færdige kultur selv på denne måde gør det muligt, at isomeriseringen af 10 glukose til fruktose kan udføres på kontinuerlig basis, idet kulturen forløber kontinuerligt fra isomeraseproduktions-processen til isomeriseringsprocessen.

Kulturmediet til fremstilling af enzymet eller enzympræparatet indeholder glukose og/eller xylose og fortrinsvis 15 også komplekse organiske næringsstoffer såsom en vitamin rig suppe omfattende gærekstrakt, kødekstrakt, majsstøbevæske o.s.v. Nitrogenkilden er hensigsmæssigt ammoniak, et ammoniumsalt, et nitrat, en aminosyre eller urinstof, og fosforkilden er hensigsmæssigt et fosfat. Andre tilstede-20 værende grundstoffer indbefatter fortrinsvis magnium, kalium og svovl, f.eks. tilsat som magniumsulfat og kaliumsulfat samt sporstoffer såsom jern, kobolt, zink, kobber, mangan, kalcium o.s.v. De foretrukne mængder, hvori de forskellige næringsstoffer findes i kulturmediet til fremstilling af 25 enzymet, varierer i nogen grad med den anvendte mikroorgan isme og andre faktorer. Egnede mængder i ethvert givet tilfælde kan let bestemmes af en kompetent mikrobiolog.

Under fremstilling af glukoseisomerase holdes kulturmediet, som nævnt, ved en temperatur i intervallet 20-55°0, idet 30 den nøjagtige temperatur afhænger af den anvendte organisme.

Temperaturen er hensigtsmæssigt i intervallet 25 til 37°C, idet intervallet 25 til 33°C foretrækkes, og intervallet 28 til 32°C er særlig velegnet. pH-værdien af mediet holdes 14442 4 4 i intervallet 6,0 til 8,0, igen afhængende af den anvendte organisme.

Spændingen af opløst oxygen i mediet reguleres i intervallet fra 0 - 150 mm kviksølv, idet intervallet 1 - 100 5 mm kviksølv foretrækkes, og intervallet 30 - 100 mm kviksølv er særligt velegnet.

Udtrykket spænding af opløst oxygen (DOT) betyder partialtrykket af oxygen i væsken, jvf. artiklen af Maclennan og Pirt, J. Gen Microbiol. (1966), 45, 286-302, især side 290.

10 Fortyndingshastigheden er i intervallet 0,05 til 0,4 timer-1.

Fortyndingshastigheden D er hastigheden af udskiftningen af medium i forgæringsbeholderen og er givet ved forholdet mellem strømningshastigheden F og det totale medierumfang V i forgæringsbeholderen, det vil sige D = (F) og har 15 dimensionen timer 1. ^

Glukoseisomerasen fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes til at omdanne glukose til fruktose ved en fremgangsmåde, hvorunder temperaturen fortrinsvis holdes i intervallet 20 til 90°C, især 50 til 75°C.

20 pH-værdien af den glukoseholdige væske, som undergår iso-mering, holdes fortrinsvis i intervallet 5 til 9, især 7 til 8,5 om nødvendigt under anvendelse af et egnet stødpudesystem, f.eks. en fosfatstødpude. Anvendelse af stødpude skal dog undgås, hvis det er muligt, ved en proces i stor 25 målestok. Andre aktivatorer såsom magnium, kobolt eller manganioner kan være til stede. Enzymaktiviteten kan forøges til et maksimum ved anvendelse af en enzymkofaktor, f.eks. koboltioner tilsat i form af et koboltsalt såsom kobolt-klorid. Meget hensigtsmæssigt kan enzymet eller enzympræ-30 paratet immobiliseres, f.eks. som beskrevet i Britisk patent nr. 1.368.650, hvorunder flokkulerede hele mikrobielle celler indeholdende enzymet anvendes, og bruges som en 5 U4424 del af en kontinuerlig søjleproces.

Glukosen selv kan findes i væsken i mængder op til ca. 70%, fortrinsvis 20 til 50%. Den kan tilsættes til væsken som glukose eller som en glukosesirup indeholdende andre sukker-5 arter, f.eks. maltose, maltotriose og dekstriner.

Glukoseisomerasen eller enzympræparatet indeholdende den kan sættes til væsken i mængder mellem 4 og 20 GIU (glukoseiso= meraseenheder) pr. gram glukose i opløsningen. Når stigende mængder enzym op til flere tusinde GIU pr. gram glukose 10 tilsættes, vokser hastigheden af isomeriseringsreaktionen.

Fortrinsvis immobiliseres enzymet eller enzympræparatet i et fikseret leje, hvorigennem den glukoseholdige væske kan perkoleres og omdannes til isomeriseret sirup.

Den fruktoseproducerende aktivitet af glukoseisomerasen 15 fremstillet ifølge opfindelsen kan bestemmes ved følgende metode:

Glukoseisomerase - Bestemmelsesmetode

Bestemmelse af aktiviteten af glukoseisomeriserende enzym blev udført i følgende reaktionsblanding: 20 0,2 M fosfatstødpude (pH 7,5) 0,5 ml 2 M glukose 0,5 ml 0,1 M MgS04,7H20 0,1 ml 0,2 M CoCl2 0,1 ml

Enzymopløsning 0,3 ml 25 Opløsningen blev fyldt op til 2 ml med destilleret vand og inkuberet ved 70°C i 1 time. Reaktionen blev standset ved at tilsætte 4 ml 0,5 M perklorsyre, og fruktosen blev bestemt ved cystein-karbazol-metoden (Z Dische & E Boren= 144424 6 freund, J. Biol. Chemi, 195,583 (1951)).

Aktivitetsniveauer på mindst 64 enheder pr. ml kultur er blevet iagttaget under standardbestemmelsesbetingelser.

Den mængde enzym, som er nødvendig til at fremstille 1 mg 5 fruktose af glukose pr. time ved 70°C under ovenstående betingelser, blev defineret som 1 enhed enzym.

Under anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen er det muligt at opnå gode udbytter af enzym både baseret på mængden af brugt kulstofkilde og på rumfanget af forgærings-10 beholderen. Det fremstillede enzym udviser også en højere aktivitetsgrad ved omdannelse af glukose til fruktose.

Opfindelsen illustreres af følgende eksempel.

EKSEMPEL

Arthrobacter nov. sp stamme NRRL B-3728 blev dyrket konti-15 nuerligt under betingelser med kulstofbegrænsning i kulturmedier indeholdende to alternative kulstofkilder, glu= kose og xylose. De af kulturen frembragte mængder af glu= koseisomerase blev bestemt og sat i relation til dyrkningsbetingelser.

20 Det anvendte medium var følgende: 1,596 g/1 P043-2 ml 40% Mg SO^/liter 0,075 g/1 Na2 S04 0,45 g/1 K2 S04 25 0 ,05 g/1 gærekstrakt

Sporstoffer (alle ppm): Fe2+-3, Cu2+-0,075, Mn2+= -0,375, Zn2+-0,345, Ca2+-0,075, Η3ΒΟ3~0,384, Na2= MoO4-0,135.

144424 7 pH-værdien blev reguleret under anvendelse af luftformig ammoniak, der også virkede som nitrogenkilde.

Kulstofkilden blev tilført som en 40% w/v opløsning af glukose eller xylose og blev pumpet ind i forgæringsbe-5 holderen adskilt fra mineralsaltmediet, således at det gav en endelig koncentration på 20 g/liter kulhydrat.

Forgæringsbetingelser a. Der blev i alle tilfælde anvendt en 5 liter forgæringsbeholder med et arbejdsrumfang på ca. 2 liter.

10 b. Omrøringshastighed 1500 omdr. pr. min.

c. pH-værdi reguleret til 6,9 ved automatisk tilsætning af luftformig ammoniak.

d. Temperaturen blev reguleret automatisk til 30°C.

e. Spændingen af opløst oxygen blev målt kontinuerligt, 15 optegnet og reguleret manuelt, således at den var i intervallet 50 til 150 mm kviksølv partialtryk.

f. Antiskumning. Skummet blev reguleret på automatisk programmeret basis. Hastigheden af tilsætning af antiskum-memiddel varierede med de anvendte dyrkningsbetingelser.

20 g. Fortyndingshastigheden var 0,11.

Enzymbestemmelser: Disse blev udført på den bestemmelses måde, der er beskrevet ovenfor.

Proteinbestemmelser er udtrykt som totalt nitrogen x 6,25. Prøveudtagelse·. Der blev taget en 250 ml kulturprøve, cel- 8 U4424 lerne blev centrifugeret og vasket og derpå frysetørret. Bestemmelser blev foretaget på den frysetørrede prøve. Prøverne blev taget fra samlebeholderen, som var afkølet i en fryseblanding. Det foretrækkes at tage prøverne direkte 5 fra forgæringsbeholderen, da det ikke indebærer fjernelse af en stor prøve fra forgæringsbeholderen.

Podning: Et podemateriale, der var blevet subkultiveret i kun 8 timer, før podemateriale blev anvendt.

En opsummering af kulstofomdannelserne og enzymudbytterne 10 fremkommet ved de forskellige forgæringer findes i tabel 1.

Det vil ses af tabel 1, at der ikke var nogen kendelig forskel i enzymudbytte udtrykt som enheder pr. gram tør vægt, når substratet blev ændret.

Tabel 1 15 Kulstofkilde Kulstofom- Enzymudbytte omdannelse (enheder/g (%) tør vægt)

Xylose 34 1150

Glukose 46 1150 i_.__ 20 Et sammenlignende portionsvis dyrkningsforsøg blev udført under anvendelse af glukose som kulstofkilde. Ved dette forsøg var det anvendte næringsmedium det samme som til kontinuerlig dyrkning med en begyndelseskoncentration af glukose på 20,0 g/1, og pH-værdien blev reguleret til 6,9 25 . til 7,0 under anvendelse af luftformig ammoniak.

144424 9

Forgæringsbetingelser a. Den anvendte forgæringsbeholder havde et arbejdsrumfang på 5 liter.

b. Omrøringshastighed 750 omdr. pr. min.

5 c. pH-værdien blev reguleret til 6,9 til 7,0 ved automatisk tilsætning af luftformig ammoniak.

d, Temperaturen blev automatisk reguleret til 30°C.

e. Spændingen af opløst oxygen blev målt og optegnet, men ikke reguleret.

10 f. Antiskumning. Skummet blev reguleret ved manuel tilsæt ning af antiskummemiddel efter behov.

g. Forgæringstiden var 30-35 timer.

h. Podematerialet var 1 rumfangs! af en rysteflaskekultur.

Enzymbestemmelser og proteinbestemmelser blev udført som 15 beskrevet for kontinuerlig dyrkning.

Resultaterne var følgende:

Kulstofomdannelse 35%

Enzymudbytte (enheder/g tør vægt) 730