DK144568B - Fremgangsmaade til fremstilling af sterile enhedsportioner af dyrkningsmedier - Google Patents

Description

144568

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af sterile enhedsportioner af dyrkningsmedier, der er egnet til dyrkning af bakterier.

Det er kendt at sterilisere ved hjælp af ioniserende stråler. Det foretrækkes normalt at foretage en sådan sterilisering med gammastråler.

Det er dog også muligt at anvende andre slags ioniserende stråler såsom røntgenstråler og elektronstråler af passende intensitet.

Ved strålesterilisering må der drages omsorg for at benytte sådanne stråler, at der ikke sker en dannelse af radioaktive eller toxiske produkter i materialet, som steriliseres.

Man har tidligere udført forsøg med henblik på at undersøge virkningen af gammastråling på dyrkningsmedier, og i de fleste tilfælde har man iagttaget skadelige virkninger. Resultatet har generelt været, at sådanne bestrålede mediers evne til at opretholde bakterievækst var alvorligt forringet sammenlignet med varmesteriliserede dyrkningsmedier med samme begyndelsessammensætning. Virkningen af gammastråling på dyrkningsmedier er bl.a. undersøgt af: a. H.E. Frey et al, Radiation Research, 28. 668-672 (1966); b. H.E. Frey et al, Radiation Research, 36, 59-67 (1968); c. V.L. Chopra, Mutation Res., 8, 25-33 (1969); d. I.H. Blank et al, J. Bac., 30, 21-32 (1935); e. E.C. Pollard et al, Radiation Res. Supp., 6, 194-200 (1966); f. J.H. Becking, Misc. Papers, 9 (1971) Landbouwhogschool

Wageningen, Netherlands.

g. P.C. Kesawan, Radiation Botany 11, 253-281 (1971).

I lyset af ovenstående er det generelt blevet antaget, at gammastråling ikke på effektiv måde kan anvendes til sterilisering af emballerede dyrkningsmedier. Den skadelige virkning af en sådan bestråling skyldes almindeligvis dannelsen af visse nedbrydningsprodukter og også koncentrationsfaldet af visse nødvendige bestanddele i dyrkningsmediet.

I visse tilfælde dannes toxiske produkter, og disse hæmmer eller endog hindrer væksten af mikroorganismer. Redox-potentialer forandres, og visse almindeligt anvendte indikatorer ødelægges ved denne bestråling.

Det har nu vist sig muligt at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af sterile dyrkningsmedier, som er egnet til dyrkning af bakterier, ved hvilken fremgangsmåde sterilisationen gennemføres ved hjælp af ioniserende stråler.

2 144568

Dette opnås med fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som er ejendommelig ved, at der til dyrkningsmediet sættes et eller flere sådanne stoffer valgt blandt katalase, thioglycollat, cystein, cysteamin, vitaminer og oxiderbare organiske indikatorer, som virker strålingsbeskyttende ved helt eller delvis at dekomponeres ved bestråling eller ved at hæmme dannelsen eller fremme nedbrydningen af toxiske produkter, hvorefter det således modificerede dyrkningsmedium steriliseres ved behandling med ioniserende stråler.

På trods af den almindeligt akcepterede antagelse, at ioniserende stråling ikke kan anvendes på effektiv vis til den påtænkte sterilisation, overvindes førnævnte ulemper, når fremgangsmåden ifølge opfindelsen benyttes. Fremgangsmåden er anvendelig overfor kulturmedier, som bredt kan grupperes i faste medier og væskeformige medier. Dyrkningsmedier kan grupperes efter disses karakteristiske bestanddele. Manglerne ved gammabestrålede dyrkningsmedier undgås ifølge opfindelsen ved visse ændringer af dyrkningsmediernes begyndelsessammensætning, idet ændringens art afhænger af mediets sammensætning. For eksempel undgås nedbrydningen af visse kritiske bestanddele ved tilsætning af passende mængder af strålingsbeskyttere, dvs. kemisk labile forbindelser, som, når de er tilstede i mediet, nedbrydes før andre af mediets bestanddele, og derved - så længe de er tilstede i mediet - beskytter disse andre bestanddele mod nedbrydning forvoldt af den ioniserende stråling. Sådanne kemisk labile stoffer omfatter cysteamin, der er en mercaptoholdig amin, cystein og glutathion, der er mercaptoholdige aminosyrer, thioglycolsyre, der er en mercaptoholdig carboxylsyre eller de respektive salte heraf samt vitaminer, såsom vitamin C, og oxiderbare organiske indikatorer, såsom neutralrødt, phenolrødt og brom-thymolblåt. Visse bestanddele, såsom vitaminer eller indikatorer, forøges, således at der bliver en passende koncentration tilbage efter bestråling. Dannelsen af visse toxiske produkter, f.eks. peroxider, hæmmes eller nedbrydes ved at tilsætte enzymer, f.eks. katalase. Visse indikatorer holdes på virksomt niveau ved tilsætning af strålingsbeskyttere og/eller ved at begynde med en i sammenligning med koncentrationen i sædvandige dyrkningsmedier højere begyndelses koncentration, når indikatorerne i sig selv er strålingsbeskyttere.

Steriliserede dyrkningsmedier blev fremstillet ifølge opfindelsen og prøvet med en lang række mikroorganismer. Der opnåedes tilfredsstillende resultater sammenlignet med medier steriliseret på sædvanlig måde.

144568 3

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres ved indledningsvis at tilsætte den eller de valgte strålingsbeskyttere til dyrkningsmediet.

Mediet fyldes derpå i passende beholdere, og beholderne med indhold steriliseres ved hjælp af ioniserende stråling. Sterilisationen gennemføres med fordel ved en dosering på omkring 0,5 til 2,5 Mrad.

Yderligere aspekter ved opfindelsen vil fremgå af nedenstående eksempler.

EKSEMPEL 1 Triple sukker-jern-agar.

Sædvanlig sammensætning af dette dyrkningsmedium er: "Bacto"-oksekødekstrakt 3 g 11 Bacto"-gærekstrakt 3 g MBacto"-peptone 15 g

Proteasepepton "Difco" 5 g "Bacto"-lactose 10 g

Saccharose "Difco" 10 g "Bacto"-dextrose 1 g

Ferrosulfat 0,2 g

Natriumchlorid 5 g

Natriumthiosulfat 0,3 g "Bacto"-agar 12 g "Bacto"-phenolrødt 0,024 g

Vand op til 1 liter.

En blanding med sædvanlig sammensætning blev fremstillet med den ændring, at phenolrødt-indholdet blev forøget til 60 mg pr. liter. En del af dette phenolrødt dekomponeres ved bestråling. 65 Gram tørt kulturmedium blev kogt i 1000 ml vand, afkølet til 60°C og hældt på rør til opnåelse af nødvendig skråflade og en tyk endedel. Efter afkøling og dannelse af gelen blev rørene tilstoppet og steriliseret ved hjælp af gammastråling på 1,0 Mrad. Det således fremkomne dyrkningsmedium var sterilt. Det blev opbevaret i et antal uger og afprøvet efter steriliseringen og efter opbevaringen. Dette dyrkningsmediums anvendelighed blev afprøvet med følgende bakterier: Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, Salmonella haifa og andre serotyper tilhørende Salmonella-grupperne C, G + E. Shigella flexneri 2, Shigella flexneri 4, Shigella flexneri 5, Shigella flexneri 6, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Pasteurella pseudo-tuberculosis, Vibrio cholerae biotype El Tor, E. coli OSS, Proteus morgani, Proteus vulgaris, Proteus rettgeri, Providence, Citrobacter, Serratia, E. hafniae, E. cloaceae.

4 14Å568 I alle tilfælde opnåedes samme vækst som med tilsvarende dyrkningsmedier, der var blevet varmesteriliseret på sædvanlig måde.

Der opnåedes tilsvarende resultater ved røntgenbestråling af tilsvarende enheder.

Ved anvendelse af bestråling til steriliseringen er det muligt at benytte beholdere af materialer, f.eks. plast, som ikke tåler opvarming til de ved varmesteriliseringen forekommende temperaturer.

EKSEMPEL 2 Mueller-Hinton-agar.

Sædvanlig sammensætning af dette dyrkningsmedium er:

Oksekødsinfusionsvæske 300 g X ) "Bacto Casaminosyrer" , teknisk kvalitet 17,5 g

Stivelse 1,5 g II Bacto"-agar 17 g

Vand op til 1 liter X ^ 'aminosyrer fremstillet ved syre-hydrolyse af casein (DIFCO Manual, 9. udg. 1953, trykkeår 1971, side 265).

Et sædvanligt præparat blev fremstillet med den ændring, at agar-indholdet blev forøget med 25%. Der tilsattes katalase til et indhold på 10 keil enheder pr. liter. En keil enhed katalaseaktivitet defineres som den enzymmængde, der vil dekomponere 1 g 100% hydrogenperoxid i 10 minutter ved 25°C under betingelserne for analyseproceduren. Tilsætningen og koncentrationsforandringen af disse stoffer blev foretaget for at opnå den ønskede gelstyrke og undgå toxiske virkninger forårsaget af gammastråling. En mængde på 38 g af dette præparat (tilsat agar indbefattet) blev kogt i 1000 ml destilleret vand, og efter afkøling til 50°C blev ka-talasen tilsat, plader blev udhældt, og disse blev pakket i polyethylen-hylstre, som blev hermetisk lukket.

De lukkede hylstre indeholdende agar-pladerne blev steriliseret ved en dosis på 1-2 Mrad. De steriliserede plader blev opbevaret i 6 uger og undersøgt såvel efter sterilisationen som efter opbevaringen.

De til undersøgelsen benyttede mikroorganismer var:

Streptococcus faecalis, N. meningitidis, Pasteurella pseudotuberculo-sis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Staphylococcus aureus, Shigella flexneri, Serratia, Vibrio cholerae biotype El Tor, Klebsiella, Proteus, E. coli 055, Pseudomonas aeruginosa.

Med alle stammer fremkom tilfredsstillende vækst på dette medium.

144568 5 EKSEMPEL 3 Væskeformigt thioglycollat-medium.

Sædvanlig sammensætning af dette dyrkningsmedium er: " Bacto"-casitoneXX^ 15 g "BactoM-gærekstrakt 5 g "Bacto"-dextrose 5,5 g

Natriumchlorid 2,5 g L-cystin 0,5 g

Natriumthioglycoflat 0,5 g 11 Bacto"-agar 0,75 g

Resazurin 0,001 g

Vand op til 1 liter.

XX } nedbrydningsprodukt af casein frembragt ved indvirkning af pancreas-enzymer (DIFCO Manual side 264).

Et sædvanligt præparat blev modificeret ved en forøgelse af begyndelsesindholdet af thioglycollat til 1,5 g pr. liter. Denne modifikation er nødvendig for at opretholde det nødvendige redox-potential for væksten af anaerobe bakterier. 29,5 g af præparatet blev kogt i 1000 ml destilleret vand, afkølet til 60°C og hældt i plastrør. Disse blev tilproppet og steriliseret ved hjælp af gammastråling på 1-2 Mrad. Efter sterilisation og efter opbevaring i 6 uger blev kulturmediet afprøvet og viste sig at være egnet til bakteriologisk arbejde.

Clostridium perfringens, Strep/hemolyticus gruppe A, Strep, fae-calis, Strep/viridans og E. coli blev indpodet, og der opnåedes tilfredsstillende vækst, selv med små podemængder.

EKSEMPEL 4 Væskeformigt thioglycollat-medium.

Et medium blev fremstillet som i Eksempel 3, men der anvendtes det normale thioglycollat-indhold, hvortil der blev tilsat 1,00 g cystein pr. liter. Der opnåedes tilsvarende resultater.

EKSEMPEL 5 Agar-Mac Con key.

Sædvanlig sammensætning af dette dyrkningsmedium er følgende: "Bacto"-peptone 17 g

Proteasepeptone 3 g "Bacto"-lactose 10 g "Bacto"-galdesalte nr. 3 1/5 g

Natriumchlorid 5 g 6 U4568 "Bacton-agar 13,5 g "Bacto"-neutralrødt 0,03 g "Bacto"-krystalviolet 0,001 g

Vand op til 1 liter.

Den sædvanlige sammensætning blev forøget til 70 mg neutralrødt pr. liter og thioglycollat eller cystein tifsattes i en mængde på 0,01 M pr. liter. 50 Gram af mediet opløstes i 1000 ml destilleret vand, ud-hældtes i petriskåle, indpakkedes i polyethylenhylstre og steriliseredes med gammastråler ved 0,5-2,0 Mrad. Efter sterilisering og opbevaring i 4 uger blev mediet afprøvet og viste sig at være egnet til dyrkning af gramnegative stavbakterier.

Klebsiella, Herrelea, Serratia, Proteus, Levinea, Pseudomonas aeruginosa, E. coli, Shigella boydii og Salmonella typhimurium dyrkedes, og væksten var på højde med standardvækst.

EKSEMPEL 6 C.L.E.D.

Sædvanlig sammensætning af dette dyrkningsmedium er følgende:

Pepton 4 g

Lab Lemco ® x*x) 3 g

Tryptone 4 g

Lactose 10 g L-cystin 0,128 g -Bromthymolblåt 0,02 g

Agar 15 g

Vand op til 1 liter xxx)Et oksekødsekstrakt fremstillet af "Oxoid Ltd.", England.

Den sædvanlige sammensætning ændredes ved en forøgelse af brom-thymolblåt-indholdet til 40 mg pr. liter og ved tilsætning af 0,01 M thioglycollat eller cysteamin pr. liter. 36,2 Gram opløstes i 1000 ml kogende vand, afkøledes til 50°C og udhældtes i petriskåle af plast og blev forseglet i polyethylenhylstre. Efter sterilisation med 1-2 Mrad gammastråler blev mediet opbevaret i 6 uger og blev afprøvet efter sterilisering og efter opbevaring. Det viste sig at være egnet til alle former for bakteriologisk arbejde.

Nedenstående bakterier blev indpodet og viste sig at give et godt udbytte på dette medium: -•S.

144568 7

Proteus, Levinea, Pseudomonas aeruginosa, E. coli, Salmonella typhimurium, Klebsiella, Herrellea, Serratia, Shigella boydii, Staph, aureus, Strep, faecalis og Candida.

EKSEMPEL 7 Præparatglasudstyr.

Et præparatglasudstyr til dypning (eng.: dip slide kit) blev fremstillet efter Guttmann m.fl., Brit.Med. Journ. 111, 343-345 (1967), og de to sider af plastpræparatglasset blev dækket med henholdsvis C-L.E.D. og med MacConkey-agar. Præparatglasset blev indsat i en tæt, hermetisk tillukket plastbeholder, og denne blev steriliseret ved gammastråling på 2 Mrad. Dyrkningsmedierne blev afprøvet umiddelbart efter sterilisering, og et antal af beholderne blev opbevaret i 8 uger. Der opnåedes tilfredsstillende vækst på begge medier.

De fleste af eksemplerne blev gentaget, og i stedet for gammastråler anvendtes røntgenstråler eller bestråling med elektroner i tilsvarende dosering. Der fremkom tilsvarende resultater.