DK146138B - Fremgangsmaade til fremstilling af stabile erythrocytpraeparater - Google Patents

Description

«9) DANMARK (w

|j| (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT <«> 146138 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Patentansøgning nr.: 5109/76 (51) Int.CI.3: G01N 33/54 (22) Indleveringsdag: 12 nov 1976 (41) Aim. tilgængelig: 15 maj 1977 (44) Fremlagt: 04 jul 1983 (86) International ansøgning nr.:-(30) Prioritet: 14 nov 1975 DE 2551200 (71) Ansøger. ‘BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT; Marburg/Lahn, DE.

(72) Opfinder: Hans ‘Schweinsberg; DE, Guenter *Zuelch; DE.

(74) Fuldmægtig: Ingeniørfirmaet Budde, Schou & Co__ (54) Fremgangsmåde til fremstilling af stabile erythro-cytpræparater

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af stabile erythrocytpræparater til belægning med antigen,ved hvilken man lader et lavere aliphatisk aldehyd indvirke på i en vandig isotonisk opløsning suspenderede erythrocyter og vasker dem.

Antistoffer er længe blevet påvist ved en passiv eller indirekte hæmagglutinationstest. Herved anvendes blodlegemer fra for- ® skellige dyrearter, for det meste beder, som bærestof for opløst 00 (V) antigen. Da native erythrocyter kun er stabile i et kort tidsrum, Φ har man senere foretaget en behandling af cellerne med aldehyder ^ (formaldehyd, pyruvaldehyd, glutardialdehyd) eller sulfosalicylsyre.

^ Således behandlede celler kan konserveres i længere tid. De belas- O tes først før anvendelsen med det tilsvarende antigen.

2 146138 Sådanne med antigen belastede erythrocyter er i almindelighed kun suspensionsstabile i kolloide, f.eks. serum-, albumin-og gelatine-holdige opløsninger. Alt efter mængden af de i det anvendelsesfærdige reagens tilstedeværende stabilisatorstoffer kan det serum, der skal tindersøges, anvendes i et kogsaltmiljø eller i et andet egnet medium. Anvendelsesvarigheden afhænger alt efter det anvendte antigen fra timer til dage. En forbedring af holdbarheden kan opnås ved frysetørring.

Det er endvidere kendt fra DK fremlæggelsesskrift nr. 126.452 og artiklen af N.R. Ling i Brit. J. Haemat., 7 (1961), side 299-302, at kombinere aldehydbehandlingen af erythrocyter med en behandling med garvemidlet tannin.

Det er også allerede beskrevet at behandle erythrocyter samtidig med chrom-(III)-chlorid og et antigen, hvorved antigenet kobles til erythrocyterne.

De af forskellige forfattere foretagne koblinger af antigen til native bede-erythrocyter ved samtidig indvirkning af antigen og chrom- (III)-chlorid har væsentlige ulemper, fordi chromsaltene både indvirker på erythrocytoverfladen og på det tilsatte antigen og dermed vanskeliggør en optimal indstilling af reagenset.

Ved fremstillingen, opbevaringen og anvendelsen af med antigener belagte erythrocyt-præparater er yderligere en række problemer ikke løst, f.eks. den netop nævnte optimale indstilling af påvisningsfølsomheden af hæmagglutinationsantigener. Også hvad angår stabiliteten af erythrocyterne under opbevaringsbetingelserne og reproducerbarheden lader undertiden de dermed gennemførte hæmagglutinationsundersøgelser noget tilbage at ønske.

Der bestod derfor et behov for at fremstille til belægning med antigener egnede erythrocytpræparater, der ved den kvantitative bestemmelse ved hæmagglutinationsundersøgelser giver tilforladelige resultater, der også kan reproduceres ved i lang tid opbevarede præparater.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde af den i beskrivelsens indledning anførte art, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man samtidig eller i vilkårlig rækkefølge efter hinanden lader det lavere aliphatiske aldehyd og et vandopløseligt salt af di- eller trivalent chrom indvirke på de i den vandige isotoniske opløsning suspenderede erythrocyter og om ønsket lyophiliserer.

3 146138

Erythrocytpræparaterne, der er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, udviser følgende fordele i forhold til den ovenfor omtalte kendte teknik: 1. Den optimale antigenkoncentration til binding af et antigen til de ved den omhandlede fremgangsmåde fremstillede erythrocyter kan bestemmes mere enkelt.

2. De ved den omhandlede fremgangsmåde fremstillede erythrocyter er bedre egnet til at binde mindre, ikke opløste, partikulære antigener.

3. De ved den omhandlede fremgangsmåde fremstillede og med en antigen belagte erythrocyter sedimenterer hurtigere, således at det nødvendige tidsrum til reaktion med de specifikke antistoffer er kortere.

4. De ved den omhandlede fremgangsmåde fremstillede og sensibiliserede erythrocyter udviser en større følsomhed, især over for antistoffer fra immunoglobulinklas-se M.

5. Stabiliteten af reagenser, der indeholder de ved den omhandlede fremgangsmåde fremstillede erythrocyter i suspension, er bedre.

Som erythrocyter anvendes fortrinsvis kerneholdige fugle-erythrocyter. Ved anvendelse af cellekerneholdige fugleerythrocyter sker der en fremning af sedimentationen og samtidig et mere simpelt aflæseligt sedimentationsmønster. Herved opnås en hurtig og sikker bedømmelse af reaktionen.

Behandlingen af cellerne med et chromsalt forbedrer frem for alt væsentlig deres opbevaringsevne ved ca. 37°C. En yderligere fordel ved de ifølge opfindelsen behandlede erythrocyter ligger i den ringe tendens til uspecifikke positive reaktioner, hvorved i de fleste tilfælde anvendelsen af et kontrolreagens bliver overflødig. Især de behandlede fjerkræerythrocyter udmærker sig ved en hurtig, følsom og specifik reaktionsevne ved hæmagglutinationstester og ved en stabilitet i flydende og lyophil tørret form.

Dé med aldehyder og chromsalte forbehandlede fjerkræery-throcyter er egnede til adsorption af forskellige bakterie-, parasitog virus-antigener og muliggør også en opbevaring af antistoffer til påvisning af antigener.

4 166138

Til brug ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen samles native erythrocyter i fuldblod fra forskellige dyr samt mennesker, fortrinsvis imidlertid kerneholdige, såsom fra fugle, f.eks. høns, duer og kalkuner. Til blodprøverne sættes sædvanlige størkningshæmmende stoffer, hvorpå erythrocyterne f.eks. udvindes ved centrifugering og vaskes flere gange ned forenelige isotoniske pufferopløsninger for at fjerne de i blodet endnu tilstedeværende antigener. Det vaskede erythrocytsediment suspenderes i ikke mindre end 8 rumfangsdele af en isotonisk neutral pufferopløsning eller en isotonisk saltopløsning. Til denne suspension sættes en vandig opløsning af et lavere aliphatisk aldehyd, fortrinsvis et aldehyd med en kædelængde på fra 1 til 6 carbonatomer, f.eks. formaldehyd, methylglyoxal eller glutaraldehyd, i en mængde på 0,2-10 vægtprocent af aldehydet henført til det fοΰιåndværende rumfang af erythrocytsedimentet. Reaktionstiden for indvirkningen af aldehydet på erythrocyterne afhænger af reaktionstemperaturen og den anvendte koncentration af aldehydet. Hensigtsmæssigt overholdes sådanne reaktionsbetingelser, der hærder erythrocyterne uden at der dannes aggregater. Aggregatdannelsen kan iagttages mikroskopisk.

Der anvendes især reaktionstider på fra 1 til 24 timer ved temperaturer fra 5 til 45°C. Ifølge særlig foretrukne betingelser ved anvendelse af formaldehyd, der er handelsgængs som en ca. 35%1 s opløsning, bringes en til 10-15% fortyndet formaldehydopløsning til indvirkning på erythrocytsuspensionen. I enkeltheder kan der gås frem efter forslaget af L. Csizmas, Proc. Exp. Biol. Med. 103 , 157 ff. (1960). Det beskrevne eksempel 1 belyser fremgangsmådeprincippet.

I tilslutning til aldehydbehandlingen vaskes erythrocyterne flere gange. Hvis de ikke umiddelbart skal videreforarbejdes, kan der til de således forbehandlede erythrocyter sættes et antimikrobielt virksomt middel, f.eks. natriumtimerfonat i en koncentration på 0,01-0,05%, og de kan opbevares som 10-30%'s, fortrinsvis 25%'s suspension ved 4°C.

Før behandlingen med et chrom-II- eller chrom-III-salt suspenderes de med aldehydbehandlede erythrocyter i et vandigt miljø. Hensigtsmæssigt anvendes hertil vand. Koncentrationen af erythrocyterne andrager 0,5-25%, fortrinsvis 1,25%. Til denne erythrocytsus-pension sættes en vandig chromsaltopløsning i en koncentration på 0,0001-2,0%, og efter blanding henstilles der i 5-30 min. ved 5-45°C.

5 146138

Derpå fraskilles erythrocyterne ved sedimentation eller centrifugering. Til fjernelse af overskydende chromsalt vaskes der flere gange. Som chromsalte til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kommer alle vandopløselige chrom-II- og chrom-III-salte på tale, f.eks. chrom-II- eller chrom-III-chlorid, -sulfat, -nitrat, -phos-phat eller -acetat.

Rækkefølgen af anvendelsen af aldehyd og chromsalt kan ombyttes uden uheldig indflydelse på resultatet. Aldehyd og chromsalt kan ligeledes med godt resultat anvendes samtidig.

De på denne måde fremkomne formaldehyd- og chromsaltbehand-lede erythrocyter er egnede til at belægges med forskellige antigener.

Almindeligvis overtrækkes de stabiliserede erythrocyter med antigener i en vandig opløsning, der indstilles til en pH-vær-di under 7, hensigtsmæssigt til en svagt sur pH-værdi mellem 5,5 og 6,5. Til de eksempelvis udvalgte antigener, der med godt resultat kan anvendes til overtrækning af de stabiliserede erythrocytpræ-parater hører især proteinantigener, frem for alt plasmaprotein-antigenerne af human eller animalsk oprindelse, mikrobielle antigener, f.eks. toxoplasma-antigener, således som de fås ved ultralydindvirkning, eller Treponema pallidum-antigener, der udvindes fra inficerede kanintestikler. Det er en særlig fordel ved erythrocyt-præparatet fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse, at det er egnet til overtrækning med antigener med forskellig kemisk struktur.

De med antigener belagte stabiliserede erythrocyter suspenderes hensigtsmæssigt i en opløsning, der indeholder et lyophilt kolloid, f.eks. en 0,1-1%'s gummiarabicumopløsning eller i en tilsvarende opløsning af et gelatine-nedbrydningsprodukt eller polyvi-nylpyrrolidon hensigtsmæssig i nærværelse af yderligere stabiliserende stoffer, f.eks. aminosyre, såsom natriumglutaminat, eller gly-cin i en koncentration på 1-10% og/eller i et animalsk serum i en koncentration på 0,5-20%. I denne suspensionsvæske kan reagenset opbevares flydende ved køleskabstemperatur, altså ved ca. 4°C, eller kan frysetørres efter nedfrysning. Efter opløsning af det tørrede præparat i destilleret vand står reagenset til rådighed for gennemførelsen af hæmagglutinationstester i den samme kvalitet, således som det var tilfældet før tørringen.

6 146138

Gennemførelsen af hæmagglutinationsundersøgelserne er kendt for en fagmand. Almindeligvis blandes hertil en serumprøve, der indeholder de formodede antistoffer, med det tilsvarende antigenbelagte erythrocytpræparat i et vandigt miljø for at bestemme,om der indtræder en agglutination. Agglutinationsreaktionen gennemføres fordelagtigt på mikrotiterplader. Hertil blandes f.eks. 0,05 ml serum eller serumfortynding med 0,025 ml af de ifølge opfindelsen fremstillede erythrocytpræparater efter belægning med antigen (1,25%'s) og rystes i 30 sek. til 1 min. Ved anvendelse af den ovenfor beskrevne fremgangsmåde til fremstilling af belagte erythrocyter kan aflæsningen af forsøgsresultaterne ské allerede efter 30 min. forløb.

Som anført ovenfor kan de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen stabiliserede erythrocytpræparater belægges med proteinantigener. Dette betyder, at de også kan overtrækkes med et specifikt antistof, således at erythrocyterne ved den efterfølgende hæmagglu-tinationsundersøgelse agglutinerer i nærværelse af det tilsvarende specifikke antigen. Den passive hæmagglutinationstest kan anvendes til at påvise bakterielle infektioner, til afsløring af virusinfektioner, til bestemmelse af histokompatibilitet og til afsløring af autoimmunitetssygdomme.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal belyses nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

Eksempel 1 a) Stabilisering af erythrocyterne 300 ml hønseblod opfanges i 100 ml 3,5%'s citratopløsning og forarbejdes den samme dag.

Erythrocyterne fracentrifugeres ved ca. 2000 x g og vaskes 5 gange i 10 rumfang kold (ca. 10°C) 0,85%'s natriumchloridopløsning. Herved skal der undgås en skumdannelse. Det vaskede cellesediment suspenderes i 8 rumfang 0,85%’s natriumchloridopløsning med en pH--værdi" på 6,8. 1/4 af rumfanget af en cellesuspension af en 14%'s formaldehydopløsning med pH.5,5 hældes ud. i en cellofan-dialyseslange (bredde 2,5 cm) og lukkes i den ene ende. Herved holdes ca. 1/3 af slangen tom. Luften trykkes ud, den åbne ende bindes til, slangen anbringes på bunden af et bæger, og erythrocytsuspensionen hældes ud herover. Bægeret bevæges ved stuetemperatur med en mekanisk omryster. Hastigheden reguleres således, at der opnås en stærk blanding ved en så lille skumdannelse som mulig. Efter r 7 146138 3 timers forløb fjernes cellofansækken, dens indhold hældes ud i bægeret og rystes videre i 16-18 timer. Derpå findes sammenklumpede .cellerester på overfladen af væsken og på bægervæggene, der kan fjernes ved forsigtig dekantering.

Til den homogene cellesuspension hældes et halvt rumfang isotonisk natriumchloridopløsning, og der vaskes derpå 6 gange med hver gang 750 ml. Derpå suspenderes det vaskede, formaliniserede cellesediment i en phosphatpufret kogsaltopløsning med pH 7,2 (PBS) med 0,02% natriumtimerfonat, således at der dannes en 25%'s opløsning, der opbevares ved 4°C.

Til behandling af de aldehydbehandlede, vaskede, stabiliserede erythrocyter med CrCl^ suspenderes de i ca. l:4-fortyndet pufret kogsaltopløsning med pH 7,5. Til denne suspension sættes det samme rumfang af en vandig chrom-(lll)-chlorid-opløsning i en koncentration på 0,002%, og blandingen henstilles i 10 min. ved 37°C. Derpå fjernes chromsaltet ved flere gange vask med en fysiologisk kogsaltopløsning.

b) Belægning med antigen.

1. Et ved ultralydindvirkning (2x1 min. 22 KHz) fra toxoplasma fremstillet og ved centrifugering for partikelformige bestanddele renset antigenekstrakt tilsættes i egnet fortynding, der bestemmes ved et forforsøg, med den aldehyd-chrom—{III)chlorid-behandlede erythrocytsuspension (1,25%'s) og henstilles til indvirkning i 1 time ved 37°C. pH-Værdien holdes herved ved 6,4.

Derpå foretages en vask i to omgange i en 0,1-1%'s gummi -arabicumopløsning og suspenderingen af sedimentet i m/15 trishydroxy-methyl-aminomethan-HCl-puffer med pH 8,0, til hvilken der er sat 5% natriumglutaminat og 15% kaninserum.

Suspensionen indeholder 1,25% erythrocyter.

I denne suspensions- og stabilisatorvæske kan reagenset opbevares flydende ved 4°C eller kan frysetørres. Opløsningen sker i det oprindelige rumfang destilleret vand.

2. På tilsvarende måde kan der fremstilles et Lues-reagens, ved at man i stedet for en ultralydekstrakt af toxoplasma anvender en ekstrakt af Treponema pallidum af inficerede kanintestikler og gennemfører serumfortyndelsen i et absorptionsmedium.

8 146138

Eksempel 2

Frisk udvundne fåreerythrocyter suspenderes i det dobbelte rumfang af en Alsever's-opløsning med følgende sammensætning: 20,5 g dextrose 8 g natriumcitrat (Na^gH^C^ · 2H20) 0,552 g citronsyre (H^CgHgO^ Γ H20) 4,2 g natriumchlorid ad 1000 ml med destillereret vand.

Derpå fracentrifugeres erythrocyterne ved ca. 2000 x g og vaskes fem gange i 10 rumfangsdele kold phosphatpufret 0,15 molær kogsaltopløsning med en pH-værdi på 7,2. Efter vask suspenderes erythrocyterne til en koncentration på 8% (rumfang/rumfang) i en 0,15 molær pufret kogsaltopløsning med en pH-værdi på 7,2. Til en rumfangsdel af denne erythrocytsuspension tilsættes der dråbevis under langsom omrøring af cellesuspensionen det samme rumfang af en 3%'s glutardialdehydopløsning i en pufret kogsaltopløsning med en pH-værdi på 7,2. Derpå omrører man i 17 timer ved stuetemperatur, vasker suspensionen fem gange med en pufret kogsaltopløsning med pH-værdi 7,2 og resuspenderer de aldehydbehandlede erythrocyter i en kogsaltopløøning, således at der dannes en 15%'s (rumfang/rumfang) suspension af de på denne måde stabiliserede erythrocyter.

Til behandlingen af de aldehydbehandlede, vaskede, stabiliserede erythrocyter med chrom(II)chlorid suspenderes de i en ca. l:4-fortyndet pufret kogsaltopløsning med pH-værdi 7,2. Til denne suspension sættes det samme rumfang af en vandig chrom(ll)chlorid-opløsning i en koncentration på 0,05%, og blandingen henstilles ved 37°C i 30 min. Derpå fjernes chromsaltet ved flere ganges vask med en fysiologisk kogsaltopløsning.

Belægningen med antigen kan foretages på samme måde som beskrevet under eksempel lb).

Egnede erythroeytpræparater til belægning med antigen får man også, når man i stedet for glutaraldehyd, som i det foreliggende eksempel, anvender methylglyoxal.