DK146511B - Fremgangsmaade til formindskelse af lipid- og nucleinsyreindholdet i mikrobiel cellemasse - Google Patents

Description

(19) DANMARK (W)

§ „g FREMLÆGGELSESSKRIFT ,,,)146511 B

DIREKTORATET FOR PATENT- 06 VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Patentansøgning nr.: 3376/77 (51) Irrt.CI.3: C12N 1/08 , „ . . C12 N 1/32 (22) Indlevenngsdag: 26 jul 1977 (41) Aim. tilgængelig: 28 jan 1978 (44) Fremlagt: 24 okt 1983 (86) International ansøgning nr.:- (30) Prioritet: 27 jul 1976 DE 2633666 (71) Ansøger: ‘HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT; 6230 Frankfurt/Main 80, DE.

(72) Opfinder: Merten *Schlingmann; DE, Laslo *Vertesy; DE.

(74) Fuldmægtig: Ingeniørfirmaet Budde, Schou & Co_ (54) Fremgangsmåde til formindskelse af lipid- og nucleinsyreindholdet i mikrobiel cellemasse

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til formindskelse af lipid- og nucleinsyreindholdet i mikrobiel cellemasse. Hver mikroorganismecelle indeholder carbonhydrater, proteiner, lipider og nucleinsyrer. Mikrobiel cellemasses anvendelig-__ hed som næringskilde i fodere påvirkes imidlertid negativt af ind-

OQ

hold af nucleinsyrer og lipider.

T· Et indhold af nucleinsyrer er betænkeligt, da det fører til L|) (O patologiske tilstande (gigt, stendannelser). Lipider begrænser la- h

Jpl ger holdbar heden, fordi de bliver harske og ødelægger smagen.

jjjjjj Det er derfor den foreliggende opfindelses formål at sænke li- Ω pid- og nucleinsyreindholdet i mikrobiel cellemasse. Ved kendte 2 146511 fremgangsmåder enten opløses lipiderne fra cellevæg og membran ved hjælp af organiske opløsningsmidler eller hydrolyseres ved behandling med vandige alkalier.

En kendt fremgangsmåde til opløsning af lipider fra mikroorganismer arbejder med blandinger af methanol og chloroform. Fremgangsmåden er kostbar og kan føre til toksiske produkter. Lipidekstrak-tioner med alkohol/vand-blandinger, ifølge tyske fremlæggelsesskrifter nr. 2.405.593 eller 2.137.038, egner sig dårligt til bakterier og er i teknisk udførelse ligeledes kostbar.

Andre kendte fremgangsmåder med henblik på at gøre mikrobiel cellemasse fattige på nucleinsyrer og lipider benytter alkalisk oplukning ved forhøjede temperaturer. En ulempe herved er frigørelsen af de ved hydrolysen opståede frie fedtsyrer, der udskilles sammen med proteinet.

Desuden overgår en del af de i proteinet indeholdte essentielle aminosyrer, f.eks. lysin, til en form, der ikke kan udnyttes af organismen.

Man hår nu fundet en fremgangsmåde til formindskelse af lipid-og nucleinsyreindholdet i mikrobiel cellemasse, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man i et første trin behandler cellemassen ved en temperatur mellem -20°C og 60°C med en ekstraktionsblanding af ammoniak eller ammoniumhydroxid og et organisk opløsningsmiddel valgt blandt alkoholer med formlen ROH, hvor R er en alkylgruppe, og glycoler og deres monoethere med formlen

H0-(CH9) -OR1 I

« XX

hvor R er hydrogen, methyl eller ethyl, og n er 2 eller 3, idet det samlede vandindhold under oplukningen er 0-30 vægtprocent og ammoniakkoncentrationen er 1-10 vægtprocent beregnet på den anvendte mængde opløsningsmiddel, og at man i et andet trin efter fraskil-lelse af ekstraktionsblandingen behandler cellemassen med vand ved en pH-værdi på 5-8,5 jfr. krav 1, skiller den vandige fase fra og, eventuelt efter ekstraktion med et af ovennævnte opløsningsmidler, tørrer cellemassen.

Som mikrobiel cellemasse anvendes fortrinsvis mikroorganismer, der f.eks. er fremstillet ved dyrkning på alkohol eller n-paraffi- 3 146511 ner i nærværelse af et vandigt næringsmedium og en gas, der indeholder frit oxygen. Som mikroorganismer anvendes fortrinsvis bakterier, gærsvampe og svampe.

Eksempler på sådanne mikroorganismer er bakterier, der udnytter methanol, af slægten Methylomonas, f.eks. Methylomonas Clara ATCC 31226, eller gærarter såsom Candida lipolytica ATCC 20.383, der kan fås ved dyrkning på n-paraffiner i nærværelse af et vandigt næringsmedium.

Der kan ligeledes anvendes svampetørmycelier. Dette cellemateriale fås som biprodukt fra antibiotikaudvinding, f.eks. fra penicillinfermenteringer, efter at antibiotiket er ekstraheret.

Som opløsningsmidler med ovenstående formler kommer alkoholer med førstnævnte formel såsom methanol, ethanol, n-propanol og isopropanol i betragtning. Foretrukket er methanol og ethanol, især methanol. Foruden de nævnte alkoholer egner sig glycoler og deres monoethere med sidstnævnte formel især glycol og monomethyl-glycol.

Der kan sættes ammoniak i gasform (NH^) eller som koncentreret vandig opløsning (NH^OH) til de nævnte opløsningsmidler. Valget bestemmes af celletørmaterialets vandindhold og af mængden af og vandindholdet i det anvendte opløsningsmiddel. NH^OH egner sig til cellemasser med ringe fugtighedsindhold (0-15%), NH^ derimod bedre til cellemasser med højere vandindhold (10-30%).

Den mængde lipider, der fjernes ved ekstraktion med ammoniak og opløsningsmiddel, afhænger af det samlede vandindhold, der beregnes i vægtprocent på den anvendte mængde opløsningsmiddel, og af NH^-koncentrationen i vægtprocent beregnet på det anvendte opløsningsmiddel .

Særlig gode forsøgsresultater opnås med et vægtforhold mellem cellemasse og opløsningsmiddel på 1:3 til 1:6 med methanol og ehta-nol, og 1:8 til 1:12 med propanol, glycol og monoglycolethere. Ammoniakkoncentrationen beregnet på mængden af opløsningsmiddel er ifølge opfindelsen hensigtsmæssigt 2-8 vægtprocent, fortrinsvis 3-5 vægtprocent. Summen af de vandmængder, der stammer fra cellemasse, opløsningsmiddel og eventuelt den vandige ammoniak, beløber sig til 0-30 vægtprocent, fortrinsvis 0-20 og særlig foretrukket 4 1465 11 0-10 vægtprocent beregnet på den anvendte mængde opløsningsmiddel, jfr. krav 2.

Når der arbejdes i teknisk målestok, kan man efter fermentering give afkald på en tørring af cellerne til et ringe restindhold af vand på 4% eller mindre. Det er tilstrækkeligt, at cellemassen har en sådan celletørvægt, at det samlede vandindhold efter tilsætning af den nødvendige mængde opløsningsmiddel ligger inden for det optimale område; eventuelt kan man tilsætte opløsningsmidlet gasformig NH^.

Opløsningen af fedtstoffer fra de mikrobielle cellemasser foregår på den måde, at cellematerialet suspenderes i et eller flere af de nævnte opløsningsmidler og der tilføres NH^ eller tilsættes NH^OH. Fortrinsvis Sker blandingen af suspensionen ved omrøring. Behandlingstemperaturerne ligger som nævnt i intervallet -20 til +60°C, idet et interval på 5-50 og især på 10-30°C er foretrukket. Behandlingens varighed er 5-120 minutter, fortrinsvis 25-35 minutter. Behandlingen sker i reglen ved normaltryk.

Efter at behandlingen med opløsningsmiddel/ammoniak er afsluttet, fraskilles det opnåede cellemateriale (protein) ved en fremgangsmåde efter behag såsom centrifugering, filtrering og sedimentering fra opløsningsmidlet.

Filtrering er det foretrukne. Det opnåede faste cellemateriale kan for at fjerne lipiderne så fuldstændigt som muligt behandles endnu engang med et af de nævnte organiske opløsningsmidler.

Remanensen kan tørres til fjernelse af rester af opløsningsmiddel og ammoniak. Denne tørring foretages under formindsket tryk, fortrinsvis 80-150 torr, og ved forhøjet temperatur, fortrinsvis 40-50°C. Det således affedtede og tørrede produkt er lugtløst.

Den ved ovenstående nævnte fremgangsmåde af det faste cellemateriale fraskilte flydende fase inderholder ammoniak og opløste lipider. Det anvendte opløsningsmiddel kan ved vakuumdestillation skilles fra fedtstofferne og anvendes igen.

Derefter optages de affedtede og eventuelt tørrede cellemasser i vand. Det foretrukne vægtforhold mellem vandmængder og cellemasse er 1:1 til 1:30, især 1:5 til 1:15. Vandmængden skal i det mindste være afmålt således, at en omrøring af suspensionen er mulig.

5 146511 pH-værdien under vandbehandlingen skal ligge i området 5-8,5, fortrinsvis 6-7,5 og indstilles eventuelt til dette område. Dette er især nødvendigt, dersom der skal anvendes ikke eller ikke fuldstændig tørrede cellemasser fra første trin, der så også stadig indeholder restmængder af ammoniak, hvilket kan føre til en høj pH-værdi.

Denne ekstraktion af nucleinsyrer, salte, polysaccharider og vandopløselig sekundærmetabolitter med vand foregår i reglen i et temperaturinterval på 30-95°C ved normaltryk. Fortrinsvis er temperaturerne 40-70°C, særlig foretrukket 50-60°C. Ekstraktionens varighed kan alt efter ekstraktionstemperatur og vandmængde være 5-120 minutter, der opnås gode resultater med en ekstraktionstid på 25-45 minutter. Til adskillelse af faste og flydende bestanddele centrifugeres suspensionen, fortrinsvis ved temperaturer på 10-30°C. Andre egnede adskillelsesmetoder er sedimentering og filtrering.

For lettere at kunne skille cellemassen fra sættes der formålstjenligt til vandet i andet trin indtil 20 vægtprocent, fortrinsvis 5-15 vægtprocent af en lavere alkohol såsom ethanol eller methanol, fortrinsvis methanol.

Den faste fase befries efter gængse metoder såsom fryse-, vakuumeller sprøjtetørring for væskerester. Produktet er i besiddelse af behagelige lugtegenskaber, en lysere farve end udgangsmaterialet og en særlig god vandbindingsevne. På grund af fjernelsen af lipider og nucleinsyrer egner det sig især til fremstilling af foderstoffer.

Således er ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen lipiderne fjernet indtil et restindhold i produktet på 0,5-3,5 vægtprocent og nucleinsyrerne indtil et restindhold på 0,5-4,5 vægtprocent.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen undgås ulemperne ved de kendte fremgangsmåder såsom behandling med opløsningsmidler og alkalisk oplukning. Chlorerede carbonhydrider er ikke nødvendige. Fjernelsen med blandinger af ammoniak og opløsningsmiddel er, især for bakteriers vedkommende, betydelig mere fuldstændig end ved behandling af cellemassen med blandinger af opløsningsmiddel og vand. Ekstreme temperatur- og pH-intervaller, der begrænser produktets anvendelighed, undgås. Energiforbruget er mindre end ved de kendte alkaliske oplukningsmetoder. Proteinberigelsen sker uden forekomst af store mængder af neutraliseringssalte.

146511 6

Den af det faste cellemateriale fraskilte vandige fase indeholder foruden andre vandopløselige bestanddele nucleinsyrer, der kan udvindes ved kendte fremgangsmåder, f.eks. udfældning i sure medier, ultrafiltrering, dialyse eller enzymbehandling.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen vil i det følgende blive nærmere belyst ved hjælp af eksempler.

Eksempel 1

Methylomonas clara ATCC 31226 dyrkes i en næringsopløsning indeholdende methanol som eneste carbonkilde, ammoniak som eneste nitrogenkilde, phosphat, jern- og magnesiumsalte og andre gængse sporelementer under aerobe betingelser. Den således fremstillede bakteriecellemasse skilles fra opløsningen og underkastes sprøjtetørring.

100 g af denne cellemasse tilsættes 300 g methanol. Under omrøring af suspensionen ledes 10 g NH^-gas ind og opløses heri. Ved afkøling holdes temperaturen under tilførslen på 25-35°C. Blandingen af methanol, ammoniak og cellemasse omrøres i 30 minutter ved 20°C.

For at adskille den faste og den flydende fase filtreres der, og den faste remanens vaskes med 300 ml methanol. Efter gentagen filtrering forenes begge filtrater. Denne brune opløsning indeholder lipiderne fra den anvendte begyndelsessubstans. Methanol og ammoniak fjernes ved vakuumdestillation (100 torr, 40°C). Remanensen, der udgør 9,5 vægtprocent af det anvendte cellemateriale, er en mørkebrun, ildelugtende pasta, der består af frie fedtsyrer, glycerider, phospholipider og sekundærmetabolitter.

Den ved filtrering opnåede faste remanens af den ekstraherede cellemasse tørres i vakuum (100 torr) ved 40°C i 5 timer. Der fås herved 90 g affedtet cellemasse, der er lugtløs og har en lysere farve end udgangsmaterialet.

For at formindske indholdet af nucleinsyre suspenderes denne cellemasse i 900 ml vand. pH-værdien af den ved omrøring homogeniserede suspension er 6,9.

Efter at temperaturen er forhøjet til 55°C omrøres endnu i 20 minutter, afkøles til 30°C og der adskilles i fast og flydende fase ved centrifugering. Det fremkomne sediment blandes igen med 900 ml 7 U6511 vand og omrøres i 10 minutter ved 20°C. Derefter centrifugeres igen, og sedimentet tørres under formindsket tryk.

Udbyttet vejer 65 g. Indholdet af nucleinsyre er fra oprindelig 11,2% faldet til 1,5%. Produktet er lugtløst i tør tilstand, fugtet med vand har det en behagelig lugt.

Resultaterne af dette og de næste eksempler er anført i de efterfølgende tabeller la og Ib.

Eksempel 2

Som udgangsmateriale anvendes samme bakteriecellemasse som i eksempel 1. Den underkastes samme behandlingstrin og betingelser, dog anvendes der i stedet for gasformig NHg 30 ml koncentreret 33%'s NH^OH som reagens.

Eksempel 3

Man går frem som beskrevet i eksempel 2, dog anvendes 60 ml koncentreret 33%'s NH^OH.

Eksempel 4

Man går frem som beskrevet i eksempel 2, men anvender i stedet for methanol ethanol som opløsningsmiddel.

Eksempel 5

Man går frem som beskrevet i eksempel 3, men anvender i stedet for methanol glykolmonomethylether som opløsningsmiddel.

Eksempel 6

Man går frem som i eksempel 2, men anvender i stedet for methanol i-propanol som opløsningsmiddel.

Eksempel 7

Som udgangsmateriale anvendes en cellemasse af Methylomonas clara som beskrevet i eksempel 1. 100 g af det sprøjtetørrede pro dukt oplukkes som beskrevet i eksempel 1 og affedtes (15 g NHg). Men der foretages ingen fuldstændig tørring af remanensen. Den omhyggeligt 8 148511 drænede filterkage med et faststofindhold på 85% suspenderes i 900 ml vand. pH-værdien indstilles på 8,9 betinget af den i den fugtige biomasse tilbageblevne ammoniak.

Suspensionens temperatur forhøjes under omrøring til 65°C og efter 5 minutters forløb indstilles pH-værdien ved tilsætning af HC1 til 7,2. Herefter omrøres der i yderligere 15 minutter ved 65°C, derefter afkøles der til 40°C og centrifugeres. Det opnåede sediment tør res.

Eksempel 8

En carbonhydrid-forbrugende stamme af gærarten Candida lipolytica ATCC 20.383 dyrkes på n-paraffiner i nærværelse af et vandigt næringsmedium og en oxygenholdig gas. Gærcellemassen skilles fra næringsopløsningen og tørres.

100 g af den tørre gærcellemasse suspenderes ved stuetemperatur under normaltryk i 300 g methanol, og denne blanding tilføres i løbet af 15 minutter 10 g NH^-gas. Herved holdes suspensionens temperatur ved afkøling på 15°C. Efter at gassen er tilført, omrøres der endnu i 20 minutter ved 22°C og derefter filtreres over en sugefritte. Filterkagen blandes engang med 300 ml methanol på fritten og suges derefter tør. De to filtrater forenes. Opløsningen er gul og indeholder lipiderne fra det anvendte cellemateriale. Methanol og NH^ fjernes ved formindsket tryk (14 torr).

Den efter den anden filtrering tilbageblevne remanens, der består af ødelagte og affedtede mikroorganismeceller,tørres i et vakuumtørre-skab ved 40°C (100 torr) i 5 timer. Det herved fremkomne produkt har en lysere farve end den i begyndelsen anvendte gærcellemasse og er lugtløs.

Til formindskelse af nucleinsyreindholdet fra oprindelig 7,5 vægtprocent beregnet på udgangsmaterialet suspenderes 100 g af den affedtede og tørrede gær i en opløsning af 1 liter destilleret vand og 100 ml methanol. Under omrøring bringes blandingens temperatur ved en pH-værdi på 6,8, der indstilles, i 15 minutter op på 50°C og adskilles ved centrifugering i et sediment, der indeholder gærproteinet, og en flydende fase, der indeholder opløseliggjort nucleinsyre. Sedimentet underkastes efter endnu engang vask ved stuetemperatur frysetørring.

Nucleinsyreindholdet i det tørrede materiale er faldet fra oprindelig 7,5 til 0,4 vægtprocent.

9 146511

Eksempel 9

Man går frem som beskrevet i eksempel 8, men anvender i stedet for methanol ethanol og i stedet for 10 g gasformig NH^ 60 ml 33%'s nh4oh.

Eksempel 10

Penicillium chrysogenum ATCC 10.238 dyrkes i en næringsopløsning indeholdende lactose, majsstivelse, flydende,, phosphat, carbonat og magnesiumsulfat aerobt på gængs måde. Efter fraskillelse af det producerede penicillin bliver myceliet tilbage, der tørret fungerer som udgangsmateriale.

Man går frem som beskrevet i eksempel 8, men i stedet for NH^ anvendes 33%'s NH^OH. Det affedtede tørmycelium vaskes med vand ved 30PC.

Eksempel 11

Som udgangsmateriale anvendes den samme cellemasse som beskrevet i eksempel 10. I stedet for methanol anvendes ethanol. Temperaturen under vandekstraktionen forhøjes til 85°C og holdes her i 15 minutter.

I følgende tabel I a+b er resultaterne af eksemplerne 1-11 anført.

10 146511

Tabel la

Fjernelse af lipiderne 100 g anvendt cellemasse_

Nuclein- NH^ (g) el.

Fedt syre Opløsningsmiddel NH.OH

Eks. Art_ vægt% vægt%_300 g_(33%'s, ml) 1 Methylomona 7 11,2 Methanol NH3 10 2 " 7 11,2 Methanol NH4OH 30 3 " 7 11,2 Methanol NH^OH 60 4 " 7 11,2 Ethanol NH4OH 30 5 " 7 11,2 Glykolmonome- NH4OH 60 thylether 6 " 7 11,2 i-Propanol NH4OH 30 7 " 9,6 15,4 Methanol NH^ 15 8 Candida lipo- 8,2 7,5 Methanol NH^ 10 lytica 9 " 8,2 7,5 Ethanol ΝΗ^ΟΗ 60 10 Tørmycelium 3,5 2,6 Methanol NH4OH 30 11 " 3,5 2,6 Ethanol NH4OH 30

Tabel Ib

Fjernelse af nucleinsyrerne _Vaskevand_ Opnået cellemasse_ Mængde Temp. Mængde Fedtstoffer Nucleinsyre

Eks._liter pH ^_(£)_vægt%_vsgt% 1 0,9 6,9 55 68 0,8 1,5 2 0,9 6,9 60 67 1,3 1,2 3 0,9 7,0 65 63 2,0 1,1 4 0,9 6,9 50 67 2,2 1,5 5 0,9 7,1 55 63 2,8 2,3 6 0,9 7,0 60 64 3,4 4,0 7 0,9 7,2 65 62 1,2 1,4 8 1,0 6,8 50 68 1,4 0,4 9 1,0 6,5 45 67 1,8 0,7 10 0,9 6,5 30 78 1,1 0,5 11 0,9 6,5 85 79 1,3 0,8