DK147053B - Fremgangsmaade til fremstilling af antibiotiket sisomicin eller farmaceutisk acceptable salte deraf ved aerob fermentering - Google Patents

Description

i 147053 o

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt fremgangsmåde til fremstilling af antibiotiket sisomicin eller de farmaceutisk acceptable salte deraf ad mikrobiel vej, nemlig ved aerob fermentering.

5 Sisomicin (0-2,6-diamino-2,3,4,6-tetradesoxy-D-gly- -cero-hex-4-enpyranosyl-(1—>4)-O-[(3-desoxy-4-C-methyl-3-me-thylamino)i3-L-arabopyranosyl-(1,6)]-2-desoxy-D-streptamin er et antibiotikum med et bredt spektrum.

Til fremstillingen af sisomicin kendes flere mikro-10 biologiske metoder således fra US-patentskrift nr. 3.S32.2S6 og 3.907.771. Ifølge disse patentskrifter producerer mikroorganismen Micromonospora inyoensis (NRRL 3292) det som hovedkomponent .

Stammen Micromonospora grisea (NRRL 3800) produce-15 rer desuden verdamicin (US-patentskrift nr. 3.951.746), Micromonospora zionensis (NRRL 5466) desuden antibiotiket G-52 (US-patentskrift nr. 3.956.068), og Micrononospora purpurea var. nigrescens (MNG 00122) desuden et gentamycinkompleks (HU-patentskrift nr. 168.778).

20 Under undersøgelsen af jordprøver fra Donaus mudder blev der isoleret en hidtil ukendt mikroorganisme, som producerede sisomicin. Denne hidtil ukendte mikroorganisme blev kaldt JMS-1. Stammen, som viste sig at være forskellig fra alle hidtil kendte mikroorganismer, blev benævnt som Micro-25 monospora danubiensis species nova. Ud fra denne mikroorganisme fremkom ved forskellige behandlinger til forfinelse af stammen den stamme, som betegnes JMS-3. Under fermenteringen af denne stamme, som blev deponeret ved den nationale mikroorganismesamling i Budapest den 19. juni 1978, fremkom der et 30 fermenteringsmedium med en meget høj sisomicinkoncentration.

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt fremgangsmåde til fremstilling af antibiotiket sisomicin og de farmaceutisk acceptable salte deraf, hvor en stamme af slægten Micromonospora dyrkes under aerobe betingelser i et 35 næringsmedium indeholdende assimilerbare carbon- og nitrogen- 2

O

147053 kilder og yderligere mineralsalte, og den opnåede sisomicin-base om ønsket omdannes til et salt, og den her omhandlede fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der som mikroorganisme anvendes en stamme af Micromonospora danubiensis, især MNG-5 -00171.

Den mikroorganisme, som anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, har de nedenfor anførte, mikroskopiske, makroskopiske og biokemiske egenskaber.

10 Morphologi

Makroskopiske iagttagelser: en 10 dage gammel kultur inkuberet ved 37°C på Czapek's agar viser en rimelig til moderat vækst, intet luftmycelium, kolonierne er brudt frem med en regelmæssig rund form, og de er farvet lyst rødligt-brunt.

i 5 Endvidere kan der på kolonierne ikke iagttages nogen sekretion af opløselige pigmenter.

Mikroskopiske iagttagelser: Lange, forgrenede filamenter uden skillevæg, filamentets diameter 0,5 pm, sporene bæres ved hjælp af simple sporofoner med en diame-20 ter på 1-1,5 pm. Sporene er ægformede til kugleformede af form.

Biokemiske og fysiologiske egenskaber: Stammen Micromonospora danubiensis MNG-00171 vokser rimeligt godt ved temperaturer mellem 28°C og 37°C, men der iagttages 25 ingen vækst ved temperaturer på 44°C og derover.

Udnyttelse af carbonkilder er blevet studeret på følgende næringsmedium: Gærekstrakt 0,5%, carbonkilde 1,0%,

CaCOg 0,1%, agar 1,5% i destilleret vand. Resultaterne er vist i tabel I.

3

Tabel I

0 147053

Carbonkilde Micromonospora 5 danubiensis _ MNG 00171

Melibiose svag (-)

Arabinose svag (-)

Ribose moderat (+) 10 Xylose svag (-)

Rhamnose svag (-)

Fructose rimslig (+++)

Galactose moderat (+)

Glucose rimelig (+++) 15 Lactose svag (-)

Saccharose rimelig (+++)

Raffinose svag (-)

Dulcitol svag (-)

Mannitol rimelig (+++) 20 Inositol svag (-)

Stivelse rimelig (+++)

Udnyttelsen af nitrogenkilder er blevet studeret 25 på følgende næringsmedium: glucose 1%, agar 1,5% i destilleret vand. Resultaterne er vist i tabel II.

0

Tabel II

4 147053

Nitrogenudnyttelse

Nitrogenkilde Micromonospora danubiensis 5 _ _MNG 00171 _ 0,5% Gærekstrakt rimelig (+++) 1% N-Z-amin, type A rimelig (+++) 1% Asparagin moderat-svag (+) 10 1% Glutaminsyre svag (-) 1% KN03 svag (-)

En voksende koloni af Micromonospora danubiensis 15 vil hydrolysere gelatine, mælk og stivelse og reducere nitrat til nitrit. Mikroorganismen tåler maksimalt 2% natriumchlorid i et vækstmedium.

Dyrkningskarakteristika 20 I tabel III er der vist dyrkningskarakteristika for Micromonospora danubiensis JMS-3. Ved beskrivelsen af farvedannelserne er der til disse iagttagelser anvendt følgende reference: Baumenns Farbtonkarte Atla II.,

Paul Baumann, Aue I-SA 87350 LAu 302, Forbundsrepublikken 25 Tyskland.

5

Tabel III

0 147053

Dyrkningskarakteristika

Micromonospora danubiensis 5 Medium _MNG 00171_

Bennett agar svag vækst, levende orange farve

Oc 97-98

Czapek's agar rimelig vækst, rødlig-brun farve 10 O 142-145

Emerson's agar ingen vækst

Glucose- asparagin-agar ingen vækst

Glucose-gærekstrakt-agar rimelig vækst, levende orange farve

Oc 99 15 Næringsagar rimelig vækst, vinrød, visse steder gul-brun farve, hhv. Ro 193 og Or 165-166

Pepton-jern-agar ingen vadest, eller kun spor, små kolonier, blegorange farve, 20 Oc 97 og CO 69, intet diffunderbart pigment

Tyrosinagar vækst i spor, farve kan ikke bestemmes, intet diffunderbart pigment 25 Kartoffelprop uden CaCOg ingen vækst

Kartoffelprop med CaCO^ moderat vækst, rødligbrun farve, 0 136 og O 145-147 6 147053

O

Micromonospora danubiensis er med hensyn til sine egenskaber til udnyttelse af carbonkilder forskellig fra andre Mier omono spor aarter. Således er den arabinosenegativ og manni-tolpositiv, medens Micromonospora purpurea er arabinosepo-5 sitiv og mannitolnegativ. Det samme gælder for Micromonospora echinospora, som tillige afviger ved at være rhamnose-positiv. Endvidere er afvigelser fra Micromonospora chalcea for fire carbonkilder (raffinose, mannitol, melibiose, ara-binose), fra Micromonospora carbonacea (arabinose, melibio-10 se), fra Micromonospora coerulea (melibiose, raffinose) og fra Micromonospora purpureochromogenes (melibiose, mannitol, raffinose).

Endvidere er NaCl-toleranceintervallet for Micromonospora danubiensis ikke så stort som for arterne Micromonospo-15 ra narashinoensis, megalomica, chalcea og halophytica.

Også i forhold til andre sisomicinproducerende arter er der forskelle. Dette gælder således Micromonospora resea for raffinose og mannitol, og forskellene i forhold til andre arter fremgår af nedenstående tabel.

20

Tabel IV

_Micromonospora__

Carbonkilde_danubiensis inyoensis grisea zionensis

Arabinose - - +++ +++ 25 Xylose - + +++ +++

Fruetose +++ - +++ +

Galactose + +(?) +++ +++

Lactose - + - +

Mannitol_+++_-_ -_-_ 30

Disse data viser klart, at Micromonospora danubiensis afviger fra andre sisomicinproducerende mieromonosporaarter. Faktisk må man sige, at Micromonospora danubiensis er den mest "individuelle" eller mest "specielle" blandt disse arter. Dette 35 understøttes af de efterfølgende egenskaber ved dyrkning på forskellige medier.

o 7

Tabel V

147053 , Micromonospora

Kultur- --- _ medium danubiensis inyoensis grisea zionensis O " — — ' ' ' ' —

Bennett's Dårlig vækst. Rimelig vækst, Kraftig vækst, Kraftig vækst, agar lyse orange- kolonierne gråliggrønne sorte kolo- farvede kolo- bliver mørke- kolonier nier nier, Oc 97-99 re, er in- ____tenst brune_

Czapek's Rimelig vækst Dårlig vækst Dårlig vækst Næppe nogen 10 agar rødligbrune vækst kolonier, _Oc 142-145_

Emerson's Ingen vækst Dårlig vækst, Dårlig vækst, Dårlig vækst, agar røde kolonier gulligbrune sorte kolonier ___kolonier_ 15 Glucose- Ingen vækst Næppe nogen Meget dårlig Meget dårlig -asparagin- vækst vækst vækst -agar_

Glucose-gær- Rimelig vækst, God vækst, God vækst, God vækst, ekstrakt- orange koloni- gråligrøde gulligbrune grålige, rød- -agar er, Oc 99 kolonier kolonier ligbrune ko- _lonier_ 20 Næringsagar Rimelig vækst, - Næppe nogen Næppe nogen purpurfarvede vækst vækst kolonier, _Ro 193, Oc 114_

Jern-pep- Vækst i spor, Dårlig vækst Dårlig vækst Dårlig vækst ton-agar blegorange

Co 69 25

Tyrosinagar Vækst i spor Meget dårlig Meget dårlig Meget dårlig _vækst_vækst_vækst_

Kartoffel- Ingen vækst Kun vækst i Kun vækst i Kun vækst i prop uden spor spor spor

CaC03 30 Kartoffel- Rødligbrune, ik- Kraftig vækst - Kraftig vækst prop med ke særlig velud-

CaCO viklede koloni- J_er, 0 136, O 145_ 8 147053

O

Baseret på ovenstående resultater blev det fastslået, at den Micromonosporastamme, som betegnes JMS-3, afviger fra de fra litteraturen kendte Micromonosporaarter.

Når de opførte taksonomiske kendetegn sammenlignes med 5 Luedemann's Micromonosporasystem, er stammen JMS-3 kvalifi ceret som en ny art, som efter dens isoleringssted blev betegnet Micromonospora danubiensis species nova.

Ved en fordelagtig udførelsesform dyrkes Micromonospora danubiensis-stammen i dybkultur under aerobe be-10 tingelser.

I næringsmediet til produktionen af sisomicin kan der være adskillige carbon- og nitrogenkilder, som kan assimileres af mikroorganismen Micromonospora danubiensis, uorganiske salte, sporgrundstoffer og antiskummidler til 15 stede. Som carbon-, nitrogen- og energikilder kan der f.eks. anvendes stivelse, opløselig stivelse, dextrin, glucose, saccharose, majsmel, soyamel, hydrolysat af soyamel, hydrolysat af casein, majsstøbevæske og gærekstrakt.

Som uorganiske salte kan der anvendes adskillige 20 ammonium-, jern-, zink-, mangan-, magnesium-, natrium-, kalium- og cobaltsalte. Til forøgelse af næringsmediets pufferkapacitet anvendes der med fordel calciumcarbonat, og som antiskummidler anvendes der forskellige vegetabilske olier, f.eks. palmeolie, solsikkeolie og soyaolie.

25 Anvendelsen af forskellige næringsmediumkomponen ter tillader frembringelsen af forskellige næringsmedier. Næringsbehovet for produktionen af inokulet afviger fra behovet til hovedfermenteringen. Til produktionen af sisomicin har et af de fordelagtigste næringsmedier vist 30 sig at være et næringsmedium, som indeholder soyamel, majsstøbevæske, majsmel, stivelse, saccharose, calciumcarbonat, cobaltchlorid og palmeolie.

Fermenteringstemperaturen kan variere mellem 25°C og 37°C. Fermenteringen er fordelagtigst ved en 35 temperatur på 28-33°C.

0 9 147053

Omrøringshastigheden varierer i afhængighed af fermenteringsbeholderens geometri mellem 100 og 600 omdrejninger pr. minut. En fordelagtig gennemluftning er ca. 1/1 volumen/volumen pr. minut.

5 Aktiviteten af de antibiotika, som produceres i løbet af fermenteringen (sisomicin og "mindre" komponenter), bestemmes ved hjælp af forsøgsorganismen Staphylococcus epidermidis ved agar-diffusionsmetoden i forhold til et standardsisomicinprodukt.

10 Under en fermentering på 96-120 timer når summen af aktivitet i fermenteringsvæsken en værdi på 400-450 U/ml (1 U = 1 jug sisomicinbaseaktivitet). Sisomicinaktiviteten beløber sig til ca. 85% af den totale antibiotiske aktivitet i fermenteringsvæsken.

15 Isoleringen af sisomicin kan gennemføres på kendt måde. Om ønsket kan den opnåede sisomicinbase omdannes til et farmaceutisk acceptabelt salt.

Den mængde sisomicin, som produceres af mikroorganismen Micromonospora danubiensis, er flere gange 20 den mængde, som produceres ved kendte metoder. I laborato riebetingelser overstiger den 450 U/ml, og i fermenteringsbeholderen i pilotanlægget er den 350-400 U/ml. Fermenteringsvæsken indeholder foruden sisomicin kun 10-15% ledsagende antibiotika.

25 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

Eksempel 1 100 ml af et sterilt næringsmedium med nedenstående 30 sammensætning i en 500 ml Erlenmeyerkolbe inokuleres under sterile betingelser med 1 ml af et mycelium (vegetative 7 8 kim 10 -10 /ml) af en underkølet stamme af Micromonospora danubiensis JMS-3 (MNG 00171): 35 147053 o ίο

Stivelse 25,0 g

Majsstøbevæske 7,0 g (NH4)2S04 3,5 g

NaCl 5,0 g 5 CaCO^ 8,0 g

Ledningsvand 1000 ml pH-værdien af næringsmediet indstilles på 7,5 før sterilisering, og pH-værdien vil således efter sterilise-10 ring være 7,0-7,2.

Kulturen inkuberes i 3 dage ved 28°C på en frem-og tilbagegående rystemaskine (220 omdr. pr. minut, afvigelse 7,5 cm). Med den således opnåede kultur inokuleres 6 liter af et sterilt næringsmedium (i en fermenterings-15 beholder af glas for 10 liter) under sterile betingelser.

Sammensætningen af næringsmediet er den samme som for det ovenfor anførte næringsmedium til inokulet.

Dyrkningen i glasfermenteringsbeholderen gennemføres ved 28°C, en roterende omrøring på 400 omdr. pr.

20 minut og en gennemluftning på 1/1 volumen/volumen pr.

minut. Som antiskummiddel anvendes efter behov palmeolie.

Det i løbet af 40 timer udviklede inokulum anvendes til inokuleringen af fermenteringsnæringsmediet. Mængden af inokulum er 600 ml, mængden af næringsmedium 6 liter, 25 pH-værdien er 7,0-7,2, og fermenteringsbeholderens volumen er 10 liter. Sammensætningen af næringsmediet er følgende:

Soyamel 50,0 g

Majsstivelse 10,0 g 30 Saccharose 30,0 g

CaCO^ 5,0 g

Majsstøbevæske 5,0 g

CoCl2 * 6H20 4,5 mg

Ledningsvand 1000 ml 35 li 147053 o

Dyrkningen gennemføres ved 31°C, roterende omrøring på 400 omdr. pr. minut, gennemluftning 6 liter pr. minut. Som antiskummiddel anvendes palmeolie.

Produktionen af antibiotika starter efter 28-34 ti-5 mers fermentering, og den højeste værdi opnås efter 110 ti mers fermentering.

På dette tidspunkt bestemmes det totale indhold af antibiotika i fermenteringsvæsken til at være 400 U/ml sammenlignet med et standardsisomicirb under anvendelse 10 af forsøgsorganismen Staphylococcus epidermidis og agar diffusionsmetoden (J.S. Simpson: Analytical Microbiology,

Acad. Press, New York, side 87-124, 1963).

Eksempel 2 15 Følgende næringsmedium inokuleres med den vege tative kultur, som er produceret af stammen Micromono-spora danubiensis JMS-3 (MNG 00171) på en frem- og tilbagegående rystemaskine ifølge eksempel 1:

Soyamel 10,0 g 20 Stivelse 10,0 g

Saccharose 10,0 g

CaCOg 4,0 g

Ledningsvand 1000 ml pH-værdien af næringsmediet er efter sterilisa-25 tion 7,0-7,2, mængden af medium er 6 liter (i en 10 liters fermenteringsbeholder af glas). Dyrkningen gennemføres ved 31°C, roterende omrøring 400 omdr. pr. minut og gennemluftning 6 liter/minut. Som antiskummiddel anvendes efter behov palmeolie.

30 600 ml af det i løbet af 36 timer udviklede inokulum anvendes til inokulering af fermenteringsnæringsmediet med følgende sammensætning: 0 12 147053

Soyamel 30,0 g

Majsmel 25,0 g

CaCOg 5,0 g C0CI2·6^0 10,0 mg 5 Ledningsvand 1000 ml pH-værdien af næringsmediet er efter sterilisation 7,0-7,2. Dyrkningstemperaturen er 33°C, den roterende omrøring 600 omdr. pr. minut og gennemluftningen 6 liter/minut. Som antiskummiddel anvendes palmeolie.

10 Produktionen af antibiotika starter efter mellem 26 og 30 timers fermentering, og den højeste værdi opnås efter 100 timers fermentering. På dette tidspunkt er det totale antibiotikumindhold i fermenteringsvæsken 420 U/ml i forhold til en standardsisomicinprøve.

15

Eksempel 3 Følgende næringsmedium inokuleres med den vegetative kultur, som er produceret af stammen Micromonospora danubiensis JMS-3 (MNG 00171) på en frem- og tilbagegående 20 rystemaskine ifølge den i eksempel 1 beskrevne fremgangs måde:

Stivelse 25,0 g

Soyamelhydrolysat 15,0 g (NH4)2S04 2,0 g 25 NaCl 3,0 g

ZnSC>4 0,5 g

CaCOg 8,0 g

Ledningsvand 1000 ml pH-værdien af næringsmediet er efter sterilisa-30 tion 7,0-7,2, mængden af medium er 6 liter (i en fer menteringsbeholder af glas på 10 liter). Hydrolysen af soyamelet gennemføres med en NOVO-bakteriel protease ved 60°C i 30 minutter ved en pH-værdi på 7,5.

Efter inokulering gennemføres dyrkningen ved 28°C, 35 roterende omrøring 400 omdr. pr. minut, gennemluftning 6 liter/minut. Som antiskummiddel anvendes palmeolie.

13 U7053

O

600 ml af det inokulum, som udvikles i løbet af 40 timer, anvendes til inokulering af følgende fermenteringsnæringsmedium :

Soyamelhydrolysat 50,0 g 5 Stivelse 10,0 g

Dextrin 25,0 g

CaCO^ 5,0 g

Saccharose 10,0 g

CoC12-6H20 4,5 g 10 Ledningsvand 1000 ml pH-værdien af næringsmediet er efter sterilisation 7,0-7,2, mængden af medium er 6 liter (i en fermenteringsbeholder af glas på 10 liter). Hydrolysen af soyamelet gennemføres med en NOVO-bakteriel protease ved 60°C i 30 minut-15 ter ved en pH-værdi på 7,5.

Efter inokuleringen blev dyrkningen gennemført ved 31°C, roterende omrøring 600 omdr. pr. minut, gennemluft-ning 6 liter/min. Som antiskummiddel anvendes palmeolie.

Produktionen af antibiotika starter efter mellem 20 26 og 30 timers fermentering, og den højeste værdi opnås efter 100 timers fermentering. På dette tidspunkt er det totale antibiotikaindhold i fermenteringsvæsken 430 U/ml i forhold til en standardsisomicinprøve.

25 Eksempel 4

Nedenstående næringsmedium i en mængde på 200 liter (volumen af forfermenteringsbehoIderen bygget af rustfrit stål er 300 liter) inokuleres med den vegetative kultur, som er produceret af stammen Micromonospora danubiensis 30 JMS-3 (MNG 00171) i en glasfermenteringsbeholder ifølge eksempel 2:

O

14 147053

Soyamel 10,0 g

Stivelse 10,0 g

Saccharose 10,0 g

CaCO^ 4,0 g 5 Ledningsvand 1000 ml pH-værdien af næringsmediet er efter sterilisation 7.0- 7,2. Som antiskummiddel anvendes palmeolie.

Dyrkningen gennemføres ved 31°C, roterende omrøring 180 omdrejninger pr. minut, gennemluftning 200 liter/min.

10 Det inokulum, som udvikles i løbet af 36 timer, anvendes til inokulering af fermenteringsnæringsmediet med følgende sammensætning (mediets volumen er 2000 liter):

Soyamel 30,0 g

Majsmel 25,0 g 15 CaC03 5,0 g C0CI2 · 6^0 1010111?

Ledningsvand 1000 ml pH-værdien af næringsmediet er efter sterilisation 7.0- 7,2. Dyrkningstemperaturen er 33°C, roterende omrøring 3 20 220 omdr. pr. minut, gennemluftning 2 m /min., som anti skummiddel anvendes en blanding af soyaolie og palmeolie (50%-50%).

Produktionen af antibiotika starter efter mellem 26 og 30 timers fermentering, og den højeste værdi opnås 25 efter 100 timers fermentering. På dette tidspunkt er det totale indhold af antibiotika i fermenteringsvæsken 300 U/ml i forhold til en standardsisomicinprøve.

Efter fermenteringens afslutning gås der frem på kendt måde og opnås 288 g rent sisomicin, som også indehol-30 der bundet vand.

0 15 147053

Produktets egenskaber:

Smeltepunkt: 19 8-2 01°C.

[a]^ = +188° (c = 0,3, vand).

Elementæranalyse: 5 Beregnet på monohydrat: C = 49,80%, H = 8,2%, N = 14,95%.

Fundet: C = 49,15%, H = 8,37%, N = 15,15%.

IR-spektrum (KBr) : VOH, NH 3170-3360, \>CH=COC 1690, VCOC 1060 cm"1.

PMR-spektrum (D20): £l,20 (Me-4",s,3H), &2,50 (Me-N-3",s,3H), 10 ^2,56 (H-3", d, J^,, = 10 Hz, lH) £3,17 (H-6*, bs, 2H), £3,30 (Η3χ-5", d, Jgem = = 12 Hz, IH), Å3,80 (H-2", dd, J2„ 3„ = = 10 Hz, Jr, 2„ = 4 Hz, IH), £>4,04 (He-5", d, Jgem = 12 Hz, IH),£4,88 (H-4', 15 bt, IH), å5,09 (H-l", d, J^, 2„ = 4 Hz, IH), Å5,35 (H-l', d, Jx, 2, = 2Hz, IH) ppm. Massetal af de karakteristiske ioner (m/e): 447, 332, 304, 160, 145, 127, 118, 110, 100.

20 Fremstilling af sisomicin-sulfat 15 g ren sisomicin-base opløses i 60 ml ionfrit vand, og til den fremkomne opløsning sættes der dråbevist så meget af en 5 N svovlsyreopløsning, at pH-værdien er 4,3. Derefter sættes der til opløsningen 1,5 g aktivt kul, og blandingen 25 omrøres i 30 minutter og filtreres dernæst på et Seitz-filter. Filteret vaskes med 3 x 50 ml ionfrit vand, og det forenede filtrat sættes under kontinuerlig omrøring til 1 liter metha-nol. Opløsningen indeholdende udskilt bundfald får lov at henstå i et køleskab, hvorefter bundfaldet frafiltreres. Det 30 frafiltrerede sisomicin-sulfat vaskes med 3 x 50 ml methanol og tørres i vakuum ved 50°C over konstant vægt.

På denne måde fås 22 g sisomicin-sulfat.