DK147073B - Fremgangsmaade til fremstilling af 4-desacetoxy-4-oxo-derivater af vinca-alkaloider - Google Patents

Description

147073

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte 4-desacetoxy-4-oxo-derivater af Vinca-akaloider med den i krav l's indledning anførte almene formel III, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er 5 ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

De omhandlede forbindelser kan finde anvendelse som udgangsmaterialer til fremstilling af 4a-hydroxy-derivater af Vinca-alkaloider, der har anti-tumor-virkning, jvf. beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 4941/78.

10 De såkaldte "Vinca-alkaloider" har opnået en betydelig stil ling som markedsførte eller experimentelle kemoterapeutiske midler til behandling af forekomster af carcinoma, sarcoma og leukæmi. Disse midler kan både anvendes alene og i kombination med andre onkolytiske midler. Som klasse betragtet 15 omfatter Vinca-alkaloiderne forbindelser, der kan udvindes fra bladene af Vinca-rosea, derivater fremstillet ved kemisk modifikation deraf samt dimere alkaloider, der fremstilles ved at sammenkoble de to "monomere" dele af Vinca-alkaloid-skelettet ved hjælp af en modificeret Polonovski-reaktion 20 (Langlois og Potier, Tetrahedron Letters, 1099, (1976),

Potier et al., J.C.S. Chem. Comm., 670, (1975), Kutney et al., Heterocycles, 3, 205, (1975) og Atta-ur-Rahman, Tetrahedron Letters, 2351, (1976).

Størstedelen af de kendte Vinca-alkaloider kan karakteriseres 25 ved følgende formel: 2 147073 r r3 , f----R4 /\,0'k \y~p'

•*1 f* f^C-0-CH3 14 I II

H j O

• A

I 9 / 8 x • Fl 1 jaA’A/ c/"3 •J? ft. n"

V18 V

V V*QH

RZ · • C-O-CHs

N

0 1 2 3 Når R i ovenstående formel er acetoxy, R er methyl, R er hydroxyl, R^ er ethyl og R^ er H, angiver formlen vinblastin (VLB).

Når R^ er acetoxy, R2 er formyl, R^ er hydroxyl, R^ er ethyl og R"* er H, angiver formlen vincristin. Når R^ er acetoxy, 5 R2 er methyl, R^ er ethyl, R^ er hydroxyl, og R^ er H, an- 1 2 giver formlen leurosidin. Når R er acetoxy, R er methyl, R^ og R^ er H og R^ er ethyl, angiver formlen deoxy-VLB "A".

12 5 Når R , R og R er de samme som i deoxy-VLB "A" (4'-deoxy- 3 4 vinblastin), mens R er ethyl og R er hydrogen, angiver 10 formlen deoxy-VLB "B" (4'-deoxyleurosidin). Når R^ er ace- 2 3 4 5 toxy, R er methyl, R er ethyl og R og R tilsammen danner en α-apoxidring, angiver formlen leurosin. Og når R^, R^, R^ og R^ er de samme som i leurosin, mens R2 er formyl, angiver formlen leuroformin (N-formylleurosin).

De ovennævnte alkaloider er beskrevet i de følgende publika- 3 147073 tioner: Leurosin (vinleurosinen; U.S.A. patentskrift nr.

3 370 057). VLB (vincaleukoblastin, vinblastin; U.S.A patentskrift nr. 3 097 137), leurosidin (vinrosidin) og vin-cristin (leurocristin eller VCR) ( begge i U.S.A. patent-5 skrift nr. 3 205 220), og deoxy-VLB "A" og "B", Tetrahedron

Letters, 783 (1958). Andre alkaloider, der kan fås fra Vinca rosea, omfatter 4-desacetoxy-vinblastin (U.S.A. patentskrift nr. 3 954 773); 4-desacetoxy-3'-hydroxyvinblastin (U.S.A. patentskrift nr. 3 944 554); leurocolombin (2'-hydroxy-VBL, 10 U.S.A. patentskrift nr. 3 890 325) og vincadiolin (3'-hydroxy- -VLB, U.S.A. patentskrift nr. 3 887 565).

To af de ovenfor nævnte alkaloider, VLB og vincristin, forhandles nu som medicin til behandling af visse ondartede sygdomme, specielt leukæmi-sygdomme og lignende sygdomme hos 15 mennesker. Af disse markedsførte forbindelser er vincristin det mest virksomme og nyttige middel ved behandling af leukæmi, men denne forbindelse er samtidig den mindst forekommende af de antineoplatiske alkaloider i Vinca rosea. I U.S.A. patentskrift nr. 3 899 493 (Jovanovics et al.) er beskrevet 20 en fortrinlig oxidativ metode til omdannelse af alkaloidet VLB, som forekommer i større mængder, til vincristin ved anvendelse af chromsyre i acetone og eddikesyre ved omkring -60 °C. Den samme metode har været anvendt til fremstilling af leuroformin (N-formyl-leurosin) ud fra leurosin (belgisk 25 patentskrift nr. 811 110). Leuroformin undergår for tiden en klinisk afprøvning i Europa, specielt til behandling af leukæmi-sygdomme og et antal myeloma-sygdomme.

Metoder til kemisk modifikation af VLB og vincristin omfatter hydrolyse af 4-acetoxygruppen til opnåelse af 4-deacetyl-30 -VLB (DAVLB) eller 4-desacetylvincristin (DAVCR) efterfulgt af en genforestring heraf med en anden acyl- eller aminoacyl-gruppe (U.S.A. patentskrift nr. 3 392 173 og 3 387 001) og udskiftning af C-3-estergruppen med en amidgruppe (belgisk 4 147073 patentskrift nr. 837 390). Et af de førstnævnte 4-acylderi-vater, 4-N,N-dimethylglycinester, har undergået en kortvarig klinisk afprøvning, og en af de sidstnævnte forbindelser, vindesin, bliver for øjeblikket klinisk testet over for en 5 række neoplasmaarter.

Andre metoder til kemisk modifikation af VLB-molekylet såsom hydrolyse og decarboxylering af C-18'-earbomethoxy-gruppen har medført et tab i den cancer-bekæmpende virkning.

Det samme gælder dannelsen af N-oxider, dvs. pleurosin 10 (leurosin-N-oxid). Oxidative angreb på VLB ved temperaturer på over -60 °C eller i neutral eller basisk opløsning resulterer i dannelse af en kemoterapeutisk inaktiv forbindelse, vinamidin, der har følgende formel: S'CH0 CaHs 1 I · t—f *'f°- .

A,0X X7 m: ' X15 \^C-0-CH3

14 I T II

. . Η I O

! !/\ W\/ /** r'sX|^! Ί .....

CH3O-»?6 * e« O-CO-CH3 wv I ;^0H Ix CHa ; C-O-CHa

II

O

5 1Λ 7 O 7 3

Oxidation af VLB med Mn02 i acetone eller methylenchlorid ved rumtemperatur har også resulteret i dannelse af vinami-din. Det samme alkaloid er fundet i alkaloide fraktioner fra blade af Vinca rosea, hvilket er beskrevet af Tafur et al., 5 i J. Pharm. Sci., 64, 1953 (1975), men den anførte struktur (II på side 1956) menes nu at være ukorrekt, og den ovenfor anførte struktur svarer bedre til de data (NMR, IR og masse-spektroskopi), der er fundet ved fysisk-kemiske studier af forbindelsen. Ved dannelsen af vinamidin ved oxidative an-10 greb på VLB dannes der et 4',5'-dihydroxy-derivat af vincinal med glycol. Dette vil ved yderligere oxidation spalte imellem hydroxylgrupperne (4',5'-bindingen), hvilket resulterer i en ringåbning og dannelse af et derivat som II ovenfor.

4-desacetyl-VLB og andre 4-deacetyl-forbindelser, dvs. så-15 danne, hvori R^ i formel I betegner hydroxyl, oxideres ikke til det tilsvarende 4-oxo-derivat ved den ovenfor beskrevne chromsyre-oxidation ved lav temperatur. Teoretiske overvejelser understreger vanskeligheden ved at oxidere den sekundære hydroxylgruppe ved C-4 20 tilencarbonylgruppe. Ringen, der indeholder C-4, er fast låst i sin stilling, idet fire af ringens carbonatomer indgår i andre ringe i molekylets vindolin-del. For at kunne undergå oxidation fra en sekundær hydroxylgruppe til en car-bonylgruppe skal bindingsvinklen i C-4 ændre sig fra den 25 tetraederiske vinkel (108°) til sp^-vinklen (120°). En sådan ændring vil medføre betydelige spændinger i det system af sammenhængende ringe, hvori C-4 befinder sig.

Det har nu vist sig, at 4-deacetoxy-4-oxo-derivaterne med formel III kan fremstilles ved at oxidere en 48-hydroxyfor-30 bindelse med formlen V med Moffat's reagens, dvs. dimethyl- sulfoxid (DMS0), dicyclohexylcarbodiimid (DCC) og orthophos-phorsyre, eller med N-chlorsuccinimid og dimethylsulfid.

6 147073

Moffat's reagens er skabt af Pfitzner og Moffat, J. Am. Chem. Soc., 85, 3027, (1963), 87, 5661, 5670 (1965). Se også Fieser og Fieser, Reagents for Organic Synthesis, 1, 304, 2, 162, (John Wiley and Sons, Inc., (1967).

5 Når syntesen af 4-oxoforbindelserne (formel III) ifølge op findelsen gennemføres med Moffat's reagens, opløser man en 4R-hydroxyforbindelse med formel V (som fri base) og dicyclo-hexylcarbodiimid i DMSO ued rumtemperatur, hvorefter phosphor-syren tilsættes. Reaktionsblandingen omrystes, indtil opløs-10 ningen er fuldstændig (5 til 10 minutter). Derefter tillukkes reaktionskolben og hensættes ued rumtemperatur, indtil reaktionen er i det væsentlige fuldstændig (5 til 6 timer), hvilket eftervises ved TLC-analyse af prøver, der oparbejdes ved standardmetoder. Det ønskede produkt isoleres ved at fortynde 15 reaktionsproduktet med fortyndet svovlsyre, filtrere den re sulterende blanding og udvaske det udfældede dicyclohexyl-urinstof med 1¾ vandig svovlsyre. Filtratet gøres basisk med 14N vandig ammoniumhydroxid og extraheres over i et med vand ublandbart organisk opløsningsmiddel såsom methylenchlorid 20 eller ether. De organiske extrakter samles og tørres, og op løsningsmidlet fjernes ved inddampning. Inddampningsresten, som indeholder den ønskede 4-oxoforbindelse, renses ved chromatografi, gradienteluerings-chromatografi eller gradient--pH-extraktion. Den sidstnævnte procedure foretrækkes.

25 Når den ovenfor beskrevne oxidation gennemføres ved hjælp af Mof fat's reagens, anvender man normalt et overskud af reagenset. F.eks. kan man anvende et overskud af dicyclohexylcarbodiimid på 2 - 10 gange og et overskud af orthophosphorsyre på 2 - 5 gange. Dimethylsulfoxidet anvendes både som reaktant og som 30 opløsningsmiddel og benyttes derfor altid i et overskud på 10 til 20 gange. Det foretrækkes at anvende 6-7 mol dicyclo-carbodiimid og 2,5 - 3 mol orthophosphorsyre pr. mol udgangsmateriale. Reaktionen kan gennemføres ved temperaturer på mellem 20 °C og 50 °C, men det foretrækkes at anvende tempera-35 turer på omkring 20 °C. Som det måtte forventes, stiger 7 147073 reaktionshastigheden med stigende temperatur. Imidlertid kan temperaturer på over ca. 25 °C give anledning til dannelse af overskydende mængder dekompositionsprodukter. På den anden side forløber reaktionen langsomt ved 20 °C, og 5 der kræves tidsperioder på mellem 5 og 7 timer for at til endebringe oxidationsprocessen. Længere tidsperioder vil naturligvis være påkrævet, hvis man anvender lavere reaktionstemperaturer.

Alternativt kan man som nævnt som oxidationsmiddel anvende 10 en kombination af N-chlorsuccinimid og dimethylsulfid, som anvendes i forbindelse med en tertiær amin, såsom triethyl-amin.

Udgangsmaterialerne, der anvendes til fremstilling af 4--oxo-forbindelserne ifølge opfindelsen (dvs. forbindelser 15 med formel V), kan fremstilles ved hydrolyse af de til svarende C-4-acetater, som er kendte forbindelser. De tilsvarende 4-desacetyl-forbindelser kan fremstilles ud fra de ovenfor anførte Vinca-alkaloider ved hydrolyse, enten under sure eller basiske betingelser. 4-desacetyl-vinbla-20 stin blev først fremstillet af Hargrove, Lloydia, 27_, 340, (1964) ved sur hydrolyse af vinblastin under anvendelse af store mængder absolut methanol, der var mættet ved 0 °C med vandfri hydrogenchlorid. Der anvendtes en kontakttid på omkring 6 timer. Hydrolyse under sure betingelser synes 25 at være den foretrukne metode til fremstilling af 4-des- acetyl-deoxy-VLB "B" og "A". Det har imidlertid vist sig, at basisk hydrolyse foretrækkes ved fremstillingen af 4--desacetyl-derivater af såvel leurosin som vinblastin. Ved denne metode anvendes natriumcarbonat i kogende methanol 30 under tilbagesvaling som hydrolysemedium.

Opfindelsen illustreres nærmere ved de følgende eksempler.

8 147073 EKSEMPEL 1 4-desacetoxy-4-oxovinblastin

En reaktionsblanding blev fremstillet ved at sætte 3,0739 g 4-desacetylvinblastin og 3,8929 g dicyclohexylcarbodiimid 5 til 20 ml DMSO. Til denne blanding blev sat 1,2185 g vandfri orthophosphorsyre opløst i 5 ml DMSO. Reaktionskolben blev tillukket og omrystet, indtil opløsningen var fuldstændig. Blandingen blev hensat ved omgi velsestemperatur (18 - 22 °C) i 5 timer, hvorefter den blev udhældt i en blanding af is 10 og l/ό vandig svovlsyre. Det udfældede dicyclohexylurinstof blev fjernet ved filtrering, og filterkagen blev udvasket med l?i vandig svovlsyre. Den vandige fase blev gjort basisk med 14 N vandig ammoniumhydroxid. Denne vandige basiske blanding blev extraheret flere gange med methylenchlorid .

15 De samlede methylenchlorid-extrakter blev tørret, og op^ løsningsmidlet blev fjernet ved inddampning i vacuum, hvilket efterlod en rest, der indeholdt 4-desacetoxy-4-oxovin-blastin (2,6534 g). Denne rest blev opløst i 1¾ vandig svovlsyre, og den resulterende opløsning blev filtreret, hvor-20 efter filtratet blev gjort basisk med 14N ammoniumhydroxid som ovenfor. Extraktion med methylenchlorid efterfulgt af tørring og inddampning gav en rest. Tyndtlagschromatografi af en prøve over silicagel ved anvendelse af en opløsningsmiddel-blanding af ethylacetat og ethanol (1:1) viste, at 25 denne rest blev kombineret med 298 mg af en tilsvarende rest fra en chromatografisk separationsproces i et tidligere forsøg, og det samlede materiale blev opløst i 400 ml af en 0,1M citronsyrepuffer (pH 2,35) og underkastet en gradient-pH-extraktionsprocedure. Den sure opløsning blev 30 extraheret med 400 ml benzen, og pH blev indstillet til 3,0.

Opløsningen blev igen extraheret med 400 ml benzen, og pH blev igen forøget. Denne procedure blev gentaget et antal gange. 1 den efterfølgende tabel 1 er anført pH i opløsningen 9 1A7Q73 og uægten af materialet i fraktionen efter fjernelse af benzenen. Huer fraktion bleu analyseret ued tyndtlags-chromatografi som beskreuet ouenfor for tilstedeuærelse af 4-desacetoxy-4-oxouinblastin.

TABEL 1 pH i uandiq fase Vægt i mg extraheret produkt 2,35 205,8 (borthældt) 3.0 167,1 3.5 270,6 4.0 671,4 (kombineret) 4.5 740,1 5.0 257,7 5.5 123,0 6.0 66,7 6.5 26,7 (borthældt) 7.0 23,8 7.5 12,8 8.0 22,7 9.0 17,8 5 Fraktionerne udtaget ued pH 3,0 til 5,0 bleu kombineret med et filtrat fra en udkrystallisation af 4-desacetoxy--4-oxouinblastin, der i foruejen uar opnået ued chromato-grafi, og de kombinerede fraktioner bleu opløst i 400 ml 0,1M citronsyrepuffer som beskreuet ouenfor. En ny gradient-10 -pH-extraktionsprocedure bleu gennemført som beskreuet ouen for med den undtagelse, at der i uisse tilfælde bleu gennemført mere end en extraktion med 400 ml benzen. I tabel 2 er anført resultaterne af denne extraktionsprocedure. I uenstre kolonne er anført pH af den uandig fase, i midterste 15 kolonne er anført antallet af extraktioner med benzen i por tioner å 400 ml, og i højre kolonne er anført uægten i mg af extraheret produkt efter bortdampning af opløsningsmidlet.

10 147073 TABEL 2 pH i vandig fase Antal extraktioner Vægt i mg af extraheret produkt 2,35 3 252,4 (borthældt) 2,75 2 97,1 3,15 1 114,2 3,55 1 276,1 4.00 3 1154,2 4.5 1 213,2 5.0 1 89,7 5.5 1 32,2 6.0 1 18,7 8.0 1 13,5

Fraktionen ved pH 4,0, som vejede 1,1542 g, blev udkrystalliseret fra en blanding af methanol og vand. Der opnåedes 854,3 mg krystallinsk 4-desacetoxy-4-oxovinblastin. IR- og NMR-spektre viste sig at være i overensstemmelse med den 5 formodede struktur.

EKSEMPEL 2

Alternativ fremstilling af 4-desacetoxy-4-oxovinblastin

Der fremstilledes en opløsning indeholdende 2,47 g 4-des-acetylvinblastin i 37 ml toluen og 7,4 ml methylenchlorid.

10 1,29 g N-chlorsuccinimid blev suspenderet i 30 ml vandfri toluen, og suspensionen blev omrørt i nitrogenatmosfære under afkøling. Til denne suspension blev dråbevis sat 1,06 ml (0,9 g) dimethylsulfid, og blandingen blev omrørt i yderligere 15 minutter. Derefter blev opløsningen af 4-desacetyl-15 vinblastin dråbevis sat til blandingen af N-chlorsuccinimid og dimethylsulfid i toluen over en periode på 5 minutter ved 0 °C. Der anvendtes følgende volumener opløsningsmiddel: 11 147073 15 gange vægten af udgangsmaterialet for toluen på vægt/ volumenbasis, 3 gange vægten af udgangsmaterialet for N--chlorsuccinimid på vægt/volumenbasis, samt et overskud af dimethylsulfid. Efter omrøring i 5,6 timer ved 0 °C blev 5 tilsat 2,03 ml (1,47 g) triethylamin, og reaktionsblandingen blev omrørt i yderligere 1,5 timer ved rumtemperatur og derefter opbevaret natten over i køleskab. Tyndtlagschromato-grafi viste, at alt udgangsmaterialet, 4-desacetylvinblastin, var forbrugt, og at reaktionsblandingen i det væsentlige 10 bestod af materiale, der gav anledning til en enkelt plet.

Reaktionsblandingen blev fortyndet med ether og methylen-chlorid, og den resulterende organiske fase blev udvasket tre gange med vand og derefter tørret. Fjernelse af opløsningsmidlerne i vacuum gav et gult stof, der indeholdt 15 4-desacetoxy-4-oxovinblastin; vægt 2,39 g. Dette materiale blev chromatograferet over 240 g silicagel (aktivitet I). Chromatogrammet blev udviklet med 1:1 methylenchlorid/ehtyl-acetat i portioner å 400 ml indeholdende 9, 13,5, 20 og 45 procent methanol. Efter at der var opsamlet 700 ml eluent 20 blev der udtaget fraktioner på 20 ml. Fraktionerne 21 - 45 blev samlet og inddampet, hvilket gav 1,28 g af et fast brunt stof, 4-desacetoxy-4-oxovinblastin.

Claims (2)

12 147073 Patentkrav :

1. Fremgangsmåde til fremstilling af 4-desacetoxy-4--oxo-derivater af Vinca-alkaloider med den almene formel *' R3 r-Y>f—«· ζ(χτρ,;;. ti N^C-OCHa 14 I II H j O Rl2 · : 111 C-O-CHa II o 2 5 hvori R betegner CH, eller CHO, R betegner H, og en af 3^4 substituenterne R og R betegner OH eller H, medens den 5 anden betegner C-H,.; eller R^ eller R^ tilsammen betegner L -3 3 en epoxidring, medens R er kendetegnet ved, at man omsætter et 4-desacetyl-derivat af et Vinca-alkaloid med formlen