DK148633B - Fremgangsmaade til fremstilling af det i kulden uoploeselige globulin (cig) - Google Patents

Description

148633 i o

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af det i kulden uopløselige globulin (CIG) ud fra faktor VIII-koncentrater, især fremstillet af blodplasma, ved hvilken man til et faktor VIIl-koncentrat, der indeholder 5 dette globulin, sætter en godt vandopløselig aliphatisk aminosyre.

Det i kulden uopløselige globulin (= "cold insoluble globulin", CIG) har som et i plasma forekommende protein i længere tid været beskrevet i litteraturen under navnene 10 "large external transformation-sensitive protein" = LETS, "soluble fibroblast antigen" = SF, "cell surface protein" = CSP, "cell adhesion factor" = CAF eller fibronectin, og som bestanddel af overfladerne af fibroblaster.

Det er allerede kendt, at dette protein kan udvindes 15 af Cohn I-fraktionen eller af kryopræcipitatet fra ACD

(Acid Citric Dextrose)-plasma i præparative mængder, jfr.

Mosesson, M.W. und Umfleet, R.A., J. Biol. Chem., 245, 5728 (1970). Forfatterne går herved ud fra et udgangsmateriale, som ved siden af andre i kulden uopløselige sporpro-20 teiner hovedsageligt indeholder fibrinogen (80-85%) og CIG (max. 10%) .

Problemet ved fremstillingen af CIG beror i første række på fraskillelsen fra fibrinogenet, som med hensyn til fældnings- og fraktioneringsegenskaberne minder meget om CIG.

25 Denne fraskillelse er blevet forsøgt af Mosesson, jfr. ovenfor, ved en fraktionering med glycin/ethanol ved lavere temperaturer .

Det på denne måde koncentrerede protein indeholder imidlertid stadig ca. 50% fibrinogen, som først kan fjernes 30 i tilstrækkelig grad ved et efterindskudt ionbytningstrin.

Det er endvidere kendt, at de kommercielt fremstillelige faktor VIII-koncentrater, i vid udstrækning uafhængigt af oprindelse og fremstillingsmetoder, indeholder fibrinogen og CIG i forholdsvis høje koncentrationer og forskellige for-35 hold som ledsageproteiner.

2 148633

O

Det har nu overraskende vist sig, at det er muligt at fremstille CIG med høj renhed ud fra dette CIG indeholdende, fibrinogenfattige faktor VI11-koncentrater vinder anvendelse af få fraktioneringstrin. Herved fremkommer der 5 på den ene side CIG og på den anden side faktor VIII.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til fremstilling af i kulden uopløseligt globulin (CIG) ud fra dette globulin indeholdende, med fordel fibrinogenfattige faktor Vlll-koncentrater, hvilken fremgangsmåde er af den oven-10 for angivne art, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man ved en temperatur over 18°C tilsætter aminosyren i en koncentration på 1,8-2,6 mol pr. liter, hvorefter man tilsætter 8-12% (w/v) neutralsalt, skiller den ovenstående væske fra den fremkomne fældning og i væsken forøger koncen-15 trationen af neutralsaltet til en koncentration på 16-33% (w/v), hvorved CIG'et udfældes, idet man eventuelt til yderligere koncentrering af CIG-et optager fældningen i en pufferopløsning og igen fælder under de ovenfor angivne betingelser.

20 Ved denne fremgangsmåde kan der også samtidig ud fra det samme udgangsmateriale fremstilles CIG-frit faktor VIII--koncentrat og CIG.

Udvælgelsen af det egnede udgangsmateriale sker på basis af bestemmelsen af CIG'et, f.eks. ifølge Mosesson 25 og Umfleet, J. Biol. Chem., 245, 5728 (1970), af faktoren VIII, f.eks. ifølge proctor, M. and Rapaport, 0., Am. J.

Clin. Path., 3>6, 212 (1961), og af fibrinogenet, f.eks. ifølge Clauss, A., Acta Haemat., 17, 237 (1957) .

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen går man ud fra 30 ClG-indeholdende faktor VIIl-koncentrater, fortrinsvis fra fibrinogenfattige faktor Vlll-koncentrater, navnlig sådanne, der indeholder 0-2 mg fibrinogen pr. 20 enheder faktor VIII.

Egnede faktor Vlll-koncentrater er plasmoproteinfrak-tioner, der er berigede med faktor VIII. De kan f.eks. fås 35 ved kryopræcipiteringsmetoden eller ved fældningsmetoder med 148633 3

O

aminosyrer og kan om ønsket frysetørres.

Eksempelvis kan et frysetørret faktor VHI-koncen-trat opløses i en 0,02-0,12 M puffer, fortrinsvis citrat--NaCl-puffer, 0,08 mol/liter, med en pH-værdi på 6,0-8,0, 5 fortrinsvis 6,9, i en koncentration på 0,2-20%, fortrinsvis 1%, beregnet protein.

Ved en temperatur over 18°C, dog begrænset af denatureringen ved høje temperaturer, fortrinsvis ved 20-25°C, tilsættes der 1,8-2,6, fortrinsvis 2,2 mol pr. liter af en 10 godt vandopløselig aliphatisk aminosyre, f.eks. glycin, a-eller β-alanin, hydroxyprolin, prolin, glutamin eller a-, β- eller γ-aminosmørsyre, ifølge opfindelsen fortrinsvis glycin, og 8-12%, fortrinsvis 12% (w/v) neutralsalt, især NaCl, i fast tilstand. Fældningen skilles fra, idet den 15 fortrinsvis fraskilles ved centrifugering, og den kan om ønsket videreanvendes til faktor Vlll-fremstilling.

Den ovenstående væske bringes med neutralsalt og på et saltindhold på 16-33% (w/v), fortrinsvis 17%. Egnede neutralsalte er ammoniumsalte eller fortrinsvis alkalimetal-20 halogenider med tilstrækkelig opløselighed i vand.

Bundfaldet udvindes som ovenfor beskrevet. Til yderligere koncentrering kan det optages i en til udgangsrumfanget svarende eller mindre mængde pufferopløsning, fortrinsvis en opløsning af den nævnte citratpuffer, hvorpå den 25 ovenfor beskrevne fældningsprocedure gentages.

Afhængigt af den ønskede renhed af produktet kan dette fældningstrin gentages flere gange, men det kan også udelades. Slutproduktet skal mindst indeholde 60% CIG, beregnet på protein, og være frit for med thrombin koaguler-30 bart protein. Renheden af slutproduktet kontrolleres ved de gængse proteinanalytiske metoder, såsom polyacrylamid-elek-troforese eller immunelektroforese under anvendelse af standarder eller specifikke antisera, med henblik på ledsagende gammaglobulin og fibrinogen.

35 CIG er et værdifuldt lægemiddel. Det kan især anven- 148633

O

4 des til chokterapi. Eksperimentelt kan dette vises på tre dyremodellers a) ved den passiv-kutane anafylaksi-reaktion hos marsvin, 5 b) ved endotoksinchok med lipopolysaccharid hos kat te og c) ved histaminchok hos marsvin.

Med en intravenøs indgivelse af 10 mg CIG pr. kg før eller efter fremkaldelsen af choktilstanden kan chok-10 virkningen formindskes, og den til chokudløsning nødvendige dosis af histaminet eller endotoksinet andrager ca. det 3-dobbelte af kontrollen.

CIG anvendes som lægemiddel på i og for sig kendt måde i form af et præparat til parenteral, fortrinsvis in-15 travenøs indgivelse. Det foreligger her i en koncentration på ca. 10 mg pr. ml i en vandig opløsning eller på tørret, fortrinsvis frysetørret form. Til stabilisering af CIG-ak-tiviteten anvendes der hensigtsmæssigt tilsvarende tilsætninger af carbonhydrater, i vand godt opløselige aminosyrer 20 og puffersalte såsom glucose, glycin og Na-citrat. Præpara tet. er også egnet til forøgelse af den opsonerende virkning af fagocyterende celler.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere i de følgende eksempler.

25

Eksempel 1

Fibrinogenfattigt faktor Vlll-koncentrat, fremstillet ifølge K.M. Brinkhous et al. JAMA, 205, 67 (1968) , eller M. Wickerhauser, Vox. Sang., 2j3, 402 (1972), opløses i en ci-30 trat-NaCl-puffer, pH 6,9, 0,02 resp. 0,06 mol pr. liter, til en 1%'s opløsning, beregnet på protein. Under omrøring tilsættes der derpå ved 22°C først 2,2 mol glycin pr. liter og dernæst 12% (w/v) NaCl, hver gang i fast tilstand og portionsvis. Der videreomrøres i 2 timer ved denne temperatur, hvor-35 på fældningen fracentrifugeres ved 3000 G i løbet af 30 minut- 5

O

148633 ter. Fældningen kan videreforarbejdes som faktor VIII-kon-centrat.

Den ovenstående væske opvarmes til 37°C. Under omrøring tilsættes der fast NaCl til en koncentration på 5 17% (w/v). Der omrøres yderligere i 30 minutter ved 37°C, og fældningen udvindes ved centrifugering ved 3000 G i 30 minutter. Den ovenstående væske bortkastes.

Fældningen optages i 1/4 rumfang af den oprindeligt anvendte citrat-NaCl-puffer, der opvarmes igen til 37°C, 10 og der tilsættes 2,2 mol glycin pr. liter og 17% (w/v)

NaCl, hvorpå der igen centrifugeres.

Den herved fremkomne fældning optages i 1/10 af det oprindeligt anvendte rumfang af citrat-NaCl-pufferen og dialyseres mod det 30-dobbelte rumfang af denne puffer i 15 3 timer. Derefter opvarmes opløsningen til 30°C og centri fugeres til klaring i 60 minutter ved 3000 G.

Den ovenstående væske, der indeholder CIG'et, fortyndes med citrat-NaCl-puffer til en koncentration på 1%, beregnet på protein, og der tilsættes 5% glucose (w/v), 20 sterilfiltreres og frysetørres.

Ekesmpel 2

Fibrinogenfattigt faktor VIII-koncentrat ifølge eksempel 1 opløses i en citrat-NaCl-puffer (pH = 6,9) i en 25 koncentration på 0,02 henholdsvis 0,06 mol pr. liter til dannelse af en 1%'s opløsning, beregnet på protein. Under omrøring tilsættes der hver gang i fast tilstand portionsvis og ved 22°C først 2,0 mol L-alanin pr. liter og derpå 9% (w/v) ammoniumsulfat. Der omrøres i 2 timer ved denne 30 temperatur, og fældningen fracentrifugeres dernæst ved 3000 G i løbet af 30 minutter. Fældningen kan videreforarbejdes som faktor VIII-koncentrat.

Den ovenstående væske opvarmes til 37°C. Under omrøring sættes der hertil fast ammoniumsulfat til en kon-35 centration på 20% (w/v). Der omrøres i yderligere 30 minut-

O

6 148633 ter ved 37°C, og fældningen udvindes ved centrifugering ved 3000 G i 30 minutter. Den ovenstående væske kasseres.

Fældningen optages i 1/4 rumfang af den oprindelige anvendte citrat-NaCl-puffer, opvarmes igen til 37°C, 5 og der tilsættes 2,0 mol L-alanin pr. liter og 20% (w/v) ammoniumsulfat, og der centrifugeres atter.

Der gås derefter frem svarende til eksempel 1.

Eksempel 3 10 Fibrinogenfattigt faktor VIII-koncentrat ifølge ek sempel 1 opløses i en citrat-NaCl-puffer (pH = 6,9) i en koncentration på 0,02 henholdsvis 0,06 mol pr. liter til dannelse af en 1%'s opløsning, beregnet på protein. Under omrøring tilsættes der hver gang i fast tilstand portions- 15 vis ved 22°C først 2,0 mol β-alanin pr. liter og derpå 12% (w/v) KC1. Der omrøres i 2 timer ved denne temperatur, og fældningen fracentrifugeres dernæst ved 3000 G i løbet af 30 minutter. Fældningen kan videreforarbejdes som faktor VIII-koncentrat.

20 Den ovenstående væske opvarmes til 37°C. Under omrø ring sættes der hertil fast KC1 til en koncentration på 25% (w/v). Der omrøres i yderligere 30 minutter ved 37°C, og fældningen udvindes ved centrifugering ved 3000 G i 30 minutter. Den ovenstående væske kasseres.

25 Fældningen optages i 1/4 rumfang af den oprindeligt anvendte citrat-NaCl-puffer, der opvarmes igen til 37°C, der tilsættes 2,0 mol β-alanin pr. liter og 25% (w/v) KC1, og der centrifugeres atter.

Der gås derefter frem svarende til eksempel 1.

30