DK148885B - Fremgangsmaade til fremstilling af en aktiveret baerer til fiksering afaminoforbindelser - Google Patents

Description

148885

Fikseringen af forbindelser af peptidnatur (f.eks. peptidhormoner, enzymer, antistoffer) på fortrinsvis uopløselige bærere har allerede i længere tid været taget i betragtning på grund af disse stoffers interessante og mangesidede anvendelsmulig- heder [Grubhofer og Scheith, Z. Physiol. Chem. (Hoppe Seyler) 297, 108 (1954);

Micheel og Ewers, Makromol, Chem., 3_, 200 (1949); Levin, Pecht, Goldstein og Kat- chalski, Biochemistry 3^, 1905 (1964); Weetall og Weliky, Nature 204, 896 (1964)].

De ifølge de første offentliggørelser foretagne anstrengelser i denne retning har givet sig udslag i en omfangsrig patentlitteratur.

1 praksis har fikseringen på polysaccharider og polysaccharidderivater vist sig særlig succesfuld. Denne omstændighed hænger formodentlig sammen med arten af vekselvirkningen mellem fikseret stof og bærer, på den måde, at f.eks. et fikseret enzym på et hydratiseret, af et polysaccharid bestående underlag befinder sig i 2 148885 en quasi naturlig omgivelse. Tværbundne dextraner anvendes fortrinsvis som bærer på grund af deres forholdsvis veldefinerede natur, hvilke tværbundne dextraner man f.eks. opnår ved omsætning mellem dextran og epichlorhydrin (f.eks. ifølge schweizisk patentskrift nr. 501.695). I samme patentskrift foreslås også tilsvarende tværbundne stivelsesgeler og agarose samt merceriseret cellulose på grund af deres store evne til at kvælde.

De nævnte bærermaterialer må til fiksering af peptid-stofferne "aktiveres” ved indføring af funktionelle grupper af en sådan art, at der ved kemisk reaktion mellem bærerbunden funktionel gruppe og peptid-stof pr. peptidmolekyle dannes mindst én kemisk binding til bæreren. Atter er forslagene talrige £der kan bl.a.

henvises til Axén et al., Nature (1967) 214, 1302]. Som en særlig mild metode foreslås deri samt i det allerede nævnte schweiziske patentskrift nr, 501.695 en aktivering ved behandling af hydroxyl- eller aminogruppeholdige polymere med et halogencyanid. Denne fremgangsmåde har sidenhen uagtet sine forholdsvis kostbare udgangsmaterialer (dels for-tværbunden polymer, dels bromcyanid) og uagtet halogencyanidernes ubehagelige egenskaber fundet stor udbredelse.

Om den kemiske mekanisme ved aktiveringsprocessen, naturen af den aktive funktionelle gruppe og dens reaktionsmåde med peptid-stoffet er det kun med sikkerhed kendt, at aktiveringen sker ved bærerens hydroxylgrupper og fikseringen over basisk nitrogen fra peptid-stoffet.

Under disse omstændigheder syntes det håbløst at finde en i henseende til produktkvaliteten lige så god, i henseende til udgangsmaterialerne mindre krævende og i henseende til det tekniske forbrug enklere, altså i det hele taget en i sin nyttighed lige så god, men teknisk mere overlegen fremgangsmåde. Behovet for en sådan fremgangsmåde skulle på den anden side være ubestridt, da fremstillingen og anvendelsen af fikserede enzymer, navnlig i bioteknologien, ved det nuværende teknikkens stade frem for alt er et spørgsmål om pris.

Det har nu overraskende vist sig, at det ikke desto mindre er muligt på en kort, billig og meget enkel måde at nå frem til bærere med aminfikseringsevne og til kvalitativt såvel som kvantitativt yderst værdifulde, eventuelt biologisk aktive, bærerfikserede aminoforbindelser, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man lader blåsyre og/eller et vandopløseligt cyanid og et reagens, der indeholder chlor eller brom i et positivt oxidationstrin, nemlig chlor-undersyrling eller bromundersyrling og/eller et vandopløseligt salt af chlorundersyr1ing eller bromundersyrling eller en chlor- eller bromforbindelse, som ved hydrolyse giver en af de nævnte syrer, eller en blanding af sådanne halogenderivater indvirke på en vandopløselig eller kvældbar, vanduopløselig poly-hydroxyforbindelse i alkalisk milieu, fortrinsvis i kulden , eventuelt neutraliserer reaktionsblandingen og a), hvor der er tale om en opløsning, ved klaring og dialyse eller gelfiltrering, b) hvor der er tale om en suspension, ved filtrering.

143885 3 eller centrifugering og udvaskning, fjerner lavmolekylære bestanddele, og, om ønsket, lader den i opløsningen eller suspensionen foreliggende aktiverede bærer indvirke på en sådan eventuelt biologisk aktiv, vandopløselig, ved mindst ét basisk nitrogenatom substituerbar aminoforbindelse, i nærværelse af vand og eventuelt et puffersystem, ved en temperatur under 50°C, fortrinsvis i kulden, og uddialyserer eller udfiltrerer eller udvasker dialyserbart eller på opløst form tilbageblevet materiale med vand eller en vandig saltopløsning fra omsætningsproduktet,

Som vandopløseligt cyanid egner sig især et alkalimetalcyanid, f.eks. natrium- eller kaliumcyanid. Det samlede cyanid, dvs. summen af blåsyre og vandopløseligt cyanid, anvendes med henblik på udbyttet med fordel i en mængde, der uden skarp grænse bevæger sig i området mellem 0,25 og 6 gramækvivalenter pr. gramækvivalent polymerbundet hydroxylgruppe.

Man kan forelægge det samlede cyanid sammen med polyhydroxylforbindeIsen og tilsætte reagenset, som indeholder chlor og brom i positive oxidationstrin, i det følgende kort betegnet som "reagens". Tværbindingsgraden og aminfikseringsevnen afhænger da af mængden af reagenset, så længe dette forbliver iunderskud i forhold til den samlede mængde cyanid. Yderligere faktorer er Mhydroxylgruppetætheden" i den anvendte polyhydroxylforbindelse og dennes molekylvægt samt reaktivitet.

Når den pr. gramækvivalent organisk bundet hydroxyl anvendte reagensmængde er større end 1/4 til 1/2 grammol, har tilbageblivende og overskydende cyanid ingen nævneværdig indflydelse på tværbindings- og aktiveringsreaktionen. Det er i-midlertid mere hensigtsmæssigt i vidtgående gradeller helt at udnytte den samlede mængde cyanid, der er taget i arbejde, idet man kun tilsætter et lille overskud eller også den teoretiske mængde reagens. I sidstnævnte tilfælde erkender man ofte overskridelsen af ækvivalentpunktet, f.eks. ved arbejde med hypochlorit, som en blåfarvning af kaliuraiodidstivelsespapir på grund af den alkaliske reaktionsopløsning. Hensigtsmæssigt nærmer man sig først ækvivalentpunktet, når tværbindingsreaktionen er i det væsentlige fuldbyrdet. På et tidligere tidspunkt kan overskud af reagenset afbryde tværbindingsreaktionen og aktiveringen for tidligt, efter udført tværbinding og aktivering er et reagensoverskud ganske vist uhensigtsmæssigt, men uskadeligt, så længe det ikke i væsentlig grad overskrider 100 %. I modsat fald er det i en bireaktion dannede cyanat eventuelt ikke længere tilstrækkeligt til at beskytte den tværbundne og aktiverede polymere mod beskadigelse, f.eks. af hypochlorit; cyanat reducerer nemlig hypochlorit efter ligningen : 2 NCO' + 3 0C1" + H20 --► 2 HCOg" + 3 Cl" + N2 [Lister, Can. J. Chem. jtø, 426 - 440 (1955)].

4 148885

Det er således også en fordel, at man tilsætter chlorundersyrlingen eller bromundersyrlingen og/eller salte og/eller de tilsvarende hydrolyserbare chlor- eller bromforbindelser i en samlet mængde, som pr. gramækvivalent organisk bundet hydroxyl svarer til 0,25 - 6 gramækvivalenter chlor eller brom i positivt oxidationstrin.

De ovennævte mængdeangivelser angiyer det praktiske arbejdsområde, men udgør derved hverken en øvre eller en nedre grænse.

En udførelsesform, der ligner den netop omtalte, består deri, at kun en del af den samlede cyanidmængde forelægges sammen med polyhydroxylforbindelsen, og resten indføres i reaktionsblandingen sammen med reagenset. Herved er det hensigtsmæssigt åt sørge for,at cyanid er tilstede i reaktionsblandingen i overskud til i hvert fald afsluttet tilsætning.

Man kan også begynde med reagenset og tilsætte blandingen af det samlede cyanid og polyhydroxylforbindelse. I dette tilfælde er det uhensigtsmæssigt at arbejde med et reagensoverskud, fordi cyanidet ellers opbruges.

Tilsætningen af reagens, især hypochlorit, til polyhydroxyforbindelsen kan også ske før tilsætningen af cyanidet. Her tildrypper man hensigtsmæssigt den vandige opløsning af f.eks. hypochlorit og polyhydroxylforbindelsen til den vandige cyånidopløsning under omrøring og god køling ved ca. 0°C. Som beskrevet i det følgende kan man under bestemte forudsætninger også sætte cyanidopløsningen til blandingen af f.eks. hypochlorit og polyhydroxylforbindelse på én gang. Den betragtelige varmeudvikling kræver i sidstnævnte tilfælde en særlig virksom køling.

Reagens, især hypochlorit, og polyhydroxylforbindelse synes, som nærmere beskrevet i det følgende, at indvirke på hinanden, idet en del af hydroxylgrup-perne forestres med chlorundersyrling. Denne reaktion kan eventuelt begUnstiges ved indledning af CO^ eller indføring af tøris. Ved at arbejde med således forbehandlede blandinger, især af hypochlorit og polyhydroxylforbindelse, må man dog eventuelt iagttage, at alkaliniteten af cyanidopløsningen er tilstrækkelig til at udligne det i reagensopløsningen CO^-betingede tab i alkalinitet.

..... Et foretrukkent reagens er hypochlorit i form af nat'ronblegelud eller kali- fa legelud.

1 stedet for hypochlorit kan man også anvende en blanding af alkalimetal-lud eller alkalimetalcarbonatopløsning og gasformig chlor, hvorved alkali kan forelægges med polyhydroxylforbindelsen og cyanidet eller først lidt efter lidt sættes til reaktionsblandingen under tilledningen af chloret. Også her kan der byttes om på rækkefølgen, idet hydroxylforbindelsen og alkali først tilsættes chlor og først da cyanidet. I henseende til støkiometrien gælder det samme som ved anvendelse af hypochlorit. Som ved fremstillingen af hypochloritopløsningen anbefales med hensyn til chlor et lille overskud af alkali.

5 148885

Alment kan man ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen erstatte alkalimetal-hypochloritet med forbindelser, der ved hydrolyse danner chlorundersyrling. Hertil hører [Houben-Weyl 5/3 (1962),side 76θ] esteren af chlorundersyrling og nitrogenforbindelser, hvori chlor er bundet til nitrogen, som f.eks. chlorimider, chlor-amider, chloriminer samt chloraminer. Der skal nævnes ethyl-, propyl- og tert.-butylhypochlorit (Houben-Weyl 5/3, 765 og 6/3, 491, 492), N-chlorsuccinimid (Houben-Weyl 5/3, 800), N-chloracetamid (Houben-Weyl 5/3, 799), chloramin T og di-chloramin T (Houben-Weyl 5/3, 808) samt chloramin (Houben-Weyl 5/3, 796).

En angivelse, ifølge hvilken chloramin med kaliumcyanid skulle gå over i chlorcyan (Beilstein 3^ E II, 32) har vist sig urigtig; der dannes intet chlorcyan , men derimod betydelige mængder kaliumcyanat [Markwald og Wille, Ber. dtsch. chem. Ges. 56, 1325 (1923)].

Lige såvel som N-chlorforbindelser har analoge bromforbindelser, som f.eks. N-bromsuccinimid eller N-bromacetamid, vist sig anvendelige med det bedste resultat. Derfor kan der ved den hidtil ukendte fremgangsmåde også anvendes tilsvarende N-bromforbindelser og ikke mindst alkalimetalhypobromiter og selve bromundersyr-liageffii

Ved valget af N-halogeneret forbindelse med basisk nitrogenfunktion indskrænker man sig hensigtsmæssigt til produkter, som ved halogenafgivelsen direkte eller efter mild hydrolyse enten frigør ammoniak eller en tertiær amin. Eksempler er chloramin (NH^Cl) og pyridiniumbromid-perbromid [Bull. Soc. Chim. France 1952, 331]. Ammoniak lader erfaringsmæssigt de amin-fikserende grupper intakte, fordi dets indvirkning formodentlig indskrænker sig til en udbytningsreaktion; tertiære baser fikseres ikke på grund af mangel på substituerbart hydrogen. De lavere alifatiske alkoholer af hypochloriterne konkurrerer i regelen kun i uvæsentlig grad med polyhydroxylforbindelserne ved 0-cyaneringen.

Tværbindingen og aktiveringen kraver et alkalisk reaktionsmiljø, fortrinsvis i området på ca. pH 10 til ca. pH 13. Det indstiller dog sig selv, når man f.eks. til den vandige blanding af polyhydroxylforbindelse og natriumcyanid sætter en af de i det følgende beskrevne opløsninger af natriumhypochlorit (natronblege-lud) eller chloramin eller chloramin T eller t-butylhypochlorit som sådan. Dette gælder også, når man først tilbereder en vandig blanding af polyhydroxylforbindel-se og en af de lige nævnte halogenbærere og sætter blandingen til den vandige opløsning af natriumcyanid. I andre tilfælde, hvor den forelagte reaktionsblanding eller de komponenter, der skal indføres i reaktionsblandingen, er for alkaliske, for lidt alkaliske eller endog for sure, og de andre komponenter har utilstrækkelig pufferkapacitet til at give det ønskede pH i blandingen af komponenterne, tilsætter man den ene eller begge komponenter i tilstrækkelig mængde stærk eller svag syre, stærk eller svag base eller et puffersalt, som f.eks. saltsyre eller carbon- 6 148885 dioxid, alkalimetalhydroxid eller ammoniak, alkalimetalcarbonat eller alkalimetal-hydrogencarbonat eller ammoniumchlorid. Som eksempel kan nævnes anvendelsen af chlorvand-som kilde for chlor med et positivt oxidationstrin; et andet eksempel er anvendelse af blåsyre som kilde for cyanid. Selvsagt vil man også foretage-passende-foranstaltninger til pufring, når begge komponenter er for alkaliske, for lidt alkaliske eller for sure.

Ved den ene af reaktionsblandingens komponenter forstås alment blandingen af polyhydroxylforbindelsen og cyanidet og/eller blåsyre eller blandingen af poly-hydroxyiforbindelsen med reagenset. Den anden, yderligere komponent, er da det.til udøvelse.af fremgangsmåden ifølge opfindelsen yderligere nødvendige middel, nemlig reagenset, eller cyanid og/eller blåsyre. Man kan begynde med enhver af de således definerede komponenter til udøvelse af omsætningen, for så at tilsætte den manglende modkomponent.

Man bemærker, at ved den nedre grænse for det angivne pH-område er såvel blåsyre sonrchlorundersyrling og bromundersyrling ufuldstændigt neutraliseret.

Det er således ifølge det foregående eventuelt fordelagtigt helt eller delvis at. neutralisere chlorundersyrling eller bromundersyrling, som er dannet ved hydrolytisk.nedbrydning af organiske hypochloriter eller nitrogenforbindelser, som indeholder chlor eller brom i positivt iltningstrin. Når den pågældende nitrogen-forbindelse i sig selv har basisk karakter, mister neutraliseringen sin betydning. Den alkaliserende virkning af alkalimetalhydroxider og -carbonater kan også overtages af overskud af alkalimetalcyanid. Når N-halogenforbindelsen allerede er saltagtig, som det f.eks. er tilfældet med chloramin T med formlen C H^CC^NNaC1, er der sørget for neutraliseringen af den underhalogenerede syre, og yderligere alkali er snarere skadelig.

Som polyhydroxylforbindelse egner sig frem for alt kulhydrater, såsom stivelse, stivelsesklister, opløselig stivelse, dextriner, dextraner, tværbundne dex-traner, cellulose, specielt merceriseret cellulose, cellulosefibre, agarose, pektiner osv..

Polymerisationsgraden af de som udgangsmateriale brugbare polyhydroxylfor-bindelser fra klassen af kulhydrater kan frit vælges inden for rammen af opløselighed eller kvældbarhed af disse forbindelser. Endog saccharose giver ifølge opfindelsen et uopløseligt produkt med meget god enzymfikseringsevne. Man er dog ikke udelukkende henvist til at anvende kulhydrater. Også. vandopløselige polyvinylalkohol er tværbindes, f.eks. i systemet cyanid/hypochlorit, til uopløselige hydrofile produkter med tilfredsstillende aminfikseringsevne.

Tværbinding og aktivering af polyhydroxylforbindelsen udføres i temperaturområdet mellem størkningspunktet for opløsningen og ca. 50°Chensigtsmæssigt arbejder man mellem 0°C og stuetemperatur.

7 148885

Ved behandlingen af de nævnte polyhydroxylforbindelser med reagens og cyanid opnår man altså ifølge opfindelsen følgende:

Er den anvendte polyhydroxylforbindelse vandopløselig og dialyserbar, som f.eks. saccharose (rørsukker), eller er den kun vandopløselig, såsom opløselig stivelse, dextriner og dextraner, dannes der deraf på korteste tid et i tætte fnug udfældende polykondensat i praktisk talt kvantitativt udbytte. Stoffer med større molekyler, såsom stivelsesklister, mister deres gelagtige natur, bliver fnuggede og filtrerbare. Tværbundne dextraner, som er uopløselige, fortættes i deres struktur. Mindre tydelige, men ikke desto mindre konstaterbare, forandringer ser man ved merceriseret cellulose og agarose. Alle disse stoffer udmærker sig ved en udpræget evne til aminfiksering; de er fikseringsaktive.

I kombinationen af tværbinding og aktivering, som også muliggør anvendelse af de billigste polyhydroxylforbindelser ag i et enkelt trin giver et kvalitativt yderst værdifuldt aktiveret tværbindingsprodukt og dertil kun kræver anvendelse af de mest sædvanlige kemikalier og apparater, ses et betydeligt, uventet og økonomisk betydningsfuldt teknisk fremskridt. Det aktiverede produkt egner sig fortrinligt til fiksering -af proteiner, polypeptider, oligopeptider, aminosyrer eller aminer med mindst ét og højst to hydrogenatomer bundet til samme aminnitro-genatom. Der tilvejebringes altså en meget enkel måde til udvinding af polysaccharider med - i henseende til vandbestandigheden vilkårlige - funktionelle yderligere grupper.

Hvor de aktiverede produkter er vanduopløselige kan de forblive i suspension og efter afstumpning af alkalien direkte videreomsættes med aminoforbindelsen. Det er dog i mange tilfælde fordelagtigere at samle detuopløselige materiale på et filter, udvaske det, hvortil der kan anvendes vand, saltopløsninger og puffer, med eller uden tilsætning af proteinstabilisatorer (f.eks. glycerol eller kompleksdan-nere), og derpå omsætte den fugtige filterrest med en vandopløselig aminoforbindeIse, atter uden ophold på grund af de aktive funktionelle gruppers begrænsede levetid.

Såfremt de aktiverede produkter er vandopløselige, kan man, eventuelt efter afstumpning af alkalien,dirdcte videreomsætte dem med aminoforbindelsen. Det er dog i mange tilfælde mere fordelagtigt, eventuelt efter afstumpning af alkalien, at fjerne lavmolekylært materiale ved dialyse og først da foretage omsætningen med aminoforbindelsen.

De uopløselige fikseringsprodukter er udmærket filtrerbare og på grund af deres hydrodynamiske egenskaber også bedst egnet til anvendelse i flydende reak- 8 148885 tionssystemer (kontinuerlig søjledrift).

Opløselige, men ikke dialyserbare, fikseringsprodukter opnår man eventuelt ved omsætning mellem lavmolekylære aminoforbindelser og aktiverede tværbindingsprodukter af f.eks. opløselig stivelse, der kun er svagt tværbundet og derfor ikke udfnugger, eller med aktiverede pektiner og slimstoffer, der trods tværbinding forbliver i opløsning.

Omsætningen mellem den cyanid/reagens-tværbundne og -aktiverede polyhydroxyl-forbindelse og aminoforbindelsen udføres fortrinsvis i neutralt til svagt til middelalkalisk område, f.eks. i nærværelse af vand eller natriumhydrogencarbonat eller natriumcarbonat. Det har vist sig fordelagtigt at anvende aminoforbindelsen i overskud og eventuelt arbejde i kulden, hvorved det er hensigtsmæssigt at holde koncentrationen så høj som muligt. Dannes der en filterrest, er det ofte tilstrækkeligt at løse op for det indesluttede vand for at opnå en tør, på lyofiliseret form foreliggende aminoforbindelse. Aminoforbindelsen omrøres hertil ganske enkelt med filterresten. Fikseringen sker så ved henstand; den kan fremskyndes ved lejlighedsvis omvæltning af filterresten.

Til de i det foregående beskrevne vandopløselige polymere fikseredes følgende forbindelser i vandig alkalimetalhydrogencarbonatopløsnings oxytocin, vasopres-1-24 sin, angiotensin, β -corticotropin. Efter afsluttet reaktion filtreres eller dialyseres til fjernelse af ikke omsat materiale. Produkterne indeholder efter aminosyreanalyse pr. gram tørstof mellem 2 og 20 % peptid-materiale.· Følgende enzymer blev ved indrøring i filterresten påført og fikseret på de i det foregående beskrevne vanduopløselige polymere i nærværelse af natriumhydrogencarbonat, som stammede fra vaskevæske fra filterresten (1%'s NaHCO^-opløsning), og i en anden forsøgsrække yderligere i nærværelse af glycerol, der ligeledes stammede fra vaskeprocessen (sidste vaskevæske: 10%'s glycerol, 17.'s NaHCO^):

Hexokinase

Ribonuclease

Trypsin

Chymotrypsin

Carboxypeptidase

Acyl-L-aminosyre-acylase

Til 1 del (tørvægt) aktiveret bærer anvendes fordelagtigt 1/4 til 1/2, eventuelt også en hel vægtdel protein. Proteinandelen i bærer-proteinforbindelsen ligger på ca. 3 til 30% af tørvægten (aminosyreanalyse). Samtlige aktiveringstrin på basis af 50 til 400 mg natriumcyanid pr. 100 mg (tørvægt) "amylopektinfraktion", stivelse, vandopløselig stivelse, dextrin, dextran, cellulose, cellulosefibre, 148385 9 svagt tværbundet dextran (kugleform), saccharose og polyvxnylalkohol giver enzymatisk aktivt materiale, der har den for kulhydratfikserede præparater karakteristiske bestandighed.

Skønt man altså i reglen bedst sætter enzymet til kagen tørt, viser det sig ofte fordelagtigt at bringe lavmolekylære aminoforbindelser, såsom oligo-peptider, aliphatiske og aromatiske aminocarboxyl- eller -sulfonsyrer, arainopheno-ler, aliphatiske og aromatiske aminoalkoholer, diaminer og polyaminer, samt aliphatiske, alicycliske og heterocycliske aminer og vandopløselige derivater af disse stoffer med endnu tilstedeværende substituerbart og basisk nitrogen til fiksering i form af mere eller mindre koncentrerede vandige opløsninger.

Således er for eksempel følgende aminoforbindelser med godt resultat fikseret fra vandige opløsninger af en cyanid/hypochlorit-behandlet'¾mylopektin-fraktion',: Sekvenspeptidet Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala til udøvelse af nedbrydningsreaktioner i heterogent milieu, S-peptidet af ribonuclease til anvendelse i affinitetschromatografien, p-Aminophenyl-Of-N-acetyl-alanin som substratanalog for en acylaminosyre-acylase, Glycyl-phenylalanin som substratanalog af samme acylaminosyre-acylase,

Glutaminsyre og sulfanilsyre til genvinding af chromatografiske adsorbenser, Dehydroabietylamin til genvinding af en optisk aktiv saltdanner,

Imidazol til genvinding af en hydrolysekatalysator,

Hydroxylamin, hydrazin, phenylhydrazin, p-aminophenol og p-Phenylsndiamdn til genvinding af reduktionsmidler.

Egenskaberne for de fikserede aminoforbindelser, specielt egenskaberne for fikserede biologisk aktive peptider og proteiner, bevæger sig inden for rammerne af de pågældendes angivelser i literaturen og patentliteraturen.

Det er uklart, hvilke kemiske reaktioner, der ligger til grund for tværbindingen af polyhydroxylforbindelserne, og hvorpå aktiviteten, dvs. de tværbundne produkters evne til fiksering af aminoforbindelser, beror. Hypotesen om en intermediær dannelse af chlorcyan kunne eksperimentelt udelukkes, idet cyanid/hypo-chlorit under sammenlignelige betingelser tydeligt reagerede anderledes end chlorcyan.

Det er ganske vist kendt, at chlor under pH 9 danner chlorcyan af alkalimetalcyanid, at chlorcyan med alkalimetallud omdannes i alkalimetalcyanat, og at der ved hypochloritoxydation af alkalimetalcyanid til alkalimetalcyanat optræder en lugt, der minder om chlorcyan.

I literaturen forsvares derfor den opfattelse, omend ikke uimodsagt^ at den praktisk talt momentane cyanatdamelse ved hypochloritoxydatiønen af cyanid forløber over chlorcyan.

Trods dette udgør hypohalogenit/cyanid-behandlingen af polyhydroxylforbindelserne ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen (i det følgende betegnet II) ingen variant af den kendte alkali/halogencyan-behandling af polyhydroxylforbindeIser (i 148885 ίο det følgende betegnet med I). Dette kan vises særligt enkelt og eftertrykkeligt, når der ved I og II anvendes vandopløselige polyhydroxylforbindelser, f.eks. vandopløselig stivelse. Den opløselige stivelse bliver under egnede betingelser såvel ifølge I som ifølge II uopløselig på grund af tværbindingen. Tværbindingsproduk-terne dannes i form af fnug, er let isolerbare og har den bekendte aminfikserings-evne for produkter, som man f.eks. opnår dem ifølge beskrivelsen til schweizisk patent nr. 501.695 ved halogencyanaktivering af tværbunden dextran (''Sephadex'1) eller cellulose.

Tværbindingen af stivelse og den åbenbart samtidige indføring af aminfikse-ringsevnen kan ifølge i dag diskuterede forestillinger f.eks. formuleres på følgende måde: i i i 0— i

NH I

II

-OH -0-CSN -oh -0—C—0-

I eller II H0- _* H0" -OH

(trin a) * ~ (trin b) ψ

I i I I

opløselig stivelse ubestandigt uopløseligt tværmellemprodukt bindingsprodukt med aminfikseringsevne

Tværbindingsreaktionen (trin b) ville ifølge dette være identisk for I og II, altså have den samme pH-afhængighed. 0-cyaneringen (trin a) er ved I bundet til nærværelsen af deprotoniserede hydroxylgrupper i stivelse og underkastet konkurrencen fra hydroxylioner fra det alkaliske medium (dannelse af alkalimetalcyanat som biprodukt). Ved II måtte forholdene ligge ligesådan, hvis det første skridt ifølge II virkelig bestod i en øjeblikkelig dannelse af halogencyan /jvf, Gmelins Handbuch der Anorganischen Chemie, 8. oplag, C (D 1) 14, side 35 og 37 (19712/; frem for alt måtte I stadig være mindst lige så hurtig som II under sammenlignelige betingelser.

Lader man derimod den hypotese falde, at II forløber over halogencyan, bliver der ! ved II der, hvor trin a bliver hastighedsbestemmende for den samlede reaktion (udskillelse af et uopløseligt tværbindingsprodukt), en pH-afhængighed mulig, hvilken afhængighed er forskellig fra den for I gældende. Netop dette findes eksperimentelt, hvilket nærmere beskrives i det følgende.

De efterfølgende eksempler forklarer tværbindings- og aktiveringsreaktionen i og aminfikseringen nærmere. Temperaturen er overalt angivet i °G.

i i 11 148885

Eksperimentel del I. Tværbindings- og aktiveringsreaktionen Reagenser:

Natronblegelud. Der blev anvendt de præparater, som man opnår, når 80 g NaOH, 375 g vand og 375 g is under 0°C under kraftig omrøring behandles med gasformig chlor til en vægtoptagelse på 66 g (5 timer). Sådanne frisk fremstillede opløsninger indeholder ca. 7,5 vægtprocent natriumhypochlorit (jodometrisk analyse); pH-værdien ligger ved 11,5.

Natriumcyanid. Handelsvare af kvaliteten ’'pract." gav ved titrering med natronblegelud et indhold på næsten 100%.

Polyhydroxylforbindelser: Vandopløselig stivelse, kartoffelstivelse, vandopløse lig polyvinylalkohol, sukker (saccharose), mikrokrystallinsk cellulosepulver (merceriseret), pulveriseret fibercellulose MN 300 (Firma Macherey und Nagel), bomuldsgarn (merceriseret), viskosesilke (merceriseret) var handelspræparater. Forsøgsopstilling: se de enkelte eksempler i det følgende.

Oparbe j dning:

Opløselige tværbindingsprodukter blev forrenset ved filtrering og centrifugering (klaring) af opløsninger deraf og befriet for lavmolekylære stoffer ved dialyse eller gelfiltrering. Uopløselige tværbindingsprodukter dannedes i reglen som fnug, var i almindelighed let filtrerbare og blev så hurtigt som muligt ved filtrering og udvaskning med vand befriet for alkali og andre opløselige stoffer. Såfremt de ikke straks blev videreanvendt til aminfiksering, blev de fortrinsvis opbevaret i kulden. Aminfikseringsevnen er ganske vist forbavsende stabil. Flere dages henstand i fugtig tilstand ved stuetemperatur viste sig i mange tilfælde at kunne tillades.

12 148885

Eksempel 1

Vandopløselig stivelse/hypochlorit eller chlorundersyrling.

Man suspenderer 2 g vandopløselig stivelse i 100 ml vand, opvarmer på dampbadet til opløsning og lader afkøle. Til 5 ml af denne stivelsesopløsning (100 mg stivelse svarende til ca. 2 mval -OH) sætter man 100 mg (2 mmol) natriumcyanid, fortynder med vand til 10,25 eller 50 ml, afkøler til -5° eller 0° eller 10°C og tilsætter under god køling dråbevis blegelud svarende til en mængde på 1/2 eller 1 eller 2 eller 4 mmol natriumhypochlorit. Efter tilsætning af 0,5 til 1 mmol natri-umhypochlorit begynder en udfnugning, i vidtgående grad uafhængig af temperatur og volumen for reaktionsblandingen. Tørvægten af det udfældede ligger ved ca. 100 mg. Denne forsøgsrække giver med kun 50 mg (1 mmol) natriumcyanid omtrent samme resultat.

Gennemfører man disse forsøg på den måde, at hele hypochloritmængden på én gang sættes til stivelse/cyanid-blandingen, sker udfnugningen kun med sikkerhed, hvis man anvender cyanid i overskud. 1 tilfælde af underskud af cyanid synes reaktionen i det væsentlige at indskrænke sig til oxidation af cyanidet.

Dette sidste indtryk bekræftes, når man begynder med hypochlorit og dertil sætter stivelse/cyanid-blandingen. Sker tilsætningen dråbevis, sker der heller ikke ved cyanidoverskud nogen produktudfnugning. Sker tilsætningen derimod på én gang, iagttages der i tilfælde af cyanidoverskud produktudfnugning. Bemærk her diskussionen om reaktionsmekanismen i tillægget.

pH-værdien for de i det foregående nævnte reaktionsopløsninger ligger ved ca. 12. Fortynder man stivelse/cyanid-blandingen med 0,1 n natronlud i stedet for vand, sker der ingen produktudfnugning. Et pH på 13 udgør altså omtrent den øvre grænse. Begynder man med 100 mg stivelse og 100 mg natriumcyanid i 15 ml vand (pH 11,2), og tilsætter man derpå i løbet af 5 minutter ved 0 - 5°C 2 mmol natriumhypochlorit og 2 mmol natriumhydrogencarbonat i lo ml vand (pH 10,8) eller reaktionsproduktet af 2mmol natriumhypochlorit og 1 g fast CO2 i 10 ml vand (pH 7,8), sker der i begge tilfælde en udfnugning allerede før afslutning af tilsætningen; pH-værdierne efter endt tilsætning ligger ved 11,0 og 10,6.

Sætter man derimod til selve stivelse/cyanid-blandingen 2 mmol HC1 og 2,5 mmol K2CO3 (totalvolumen 15 ml, pH 10,0), bevirker ovennævnte opløsning afchlorundersyrling med pH 7,8 ikke længere i alle tilfælde en produktudfnugning. pH-slutværdien af sådanne reaktionsblandinger ligger ved 10,0. Der sker ingen udfnugning, hvis stivelse/cyanid-blandingen på grund af tilsætning af 2 mmol HC1 og 0,1 mmol K^CO^ har et pH på 9,8 eller på grund af tilsætning af 2 mmol HG1 har et pH på ca. 7, og pH efter reaktion med opløsningen af chlorundersyrling ligger på pH 7,8, ved 9,6 eller 7,5. Deraf følger for den nedre pH-grænse en værdi på ca. 10. Alkali-niteten af stivelse/cyanid-blandingen kan om ønsket også pufres ved tilsætning af ammoniumchlorid.

13 148885

Eksempel 2

Vandopløselig stivelse/chlor og natronlud eller kaliumcarbonat.

Til 5 ml stivelsesopløsning (100 mg stivelse) sætter man 100 mg (2 mmol) natriumcyanid, 2 ml eller mere af en 1 m opløsning af kaliumcarbonat (mindst 2 mmol) og 8 ml vand, afkøler til 0°C, tilsætter 10 g is og tilfører under god køling gas-formig chlor (2 mmol), til reaktionsblandingen giver positiv reaktion på kalium-jodid/stivelse-papir. Produktet udfælder fnugget. Dette er også tilfældet, når 5 ml stivelsesopløsning, 2 ml 2 n natronlud, 3 ml vand og 10 g is under køling behandles med chlor (ca. 2 mmol), til pH-værdien ligger mellem 9,5 og 10, og derpå på én gang overhældes med en opløsning af mindst 100 mg natriumcyanid i 5 ml vand. Man iagttager, at ved denne udførelsesform er et cyanidoverskud nødvendigt.

Eksempe1 3

Stivelsesklister/brom og natronlud eller kallumhydrogencarbonat.

Man opvarmer 300 mg stivelse i 35 ml vand til 70°C, lader afkøle, centrifugerer i 5 minutter ved 3000 omdrejninger pr. minut, dekanterer det ovenstående fra, sætter til resten, der har en tørvægt på ca. 100 mg, 2 ml 2 n natronlud og 0,5 ml af en opløsning af 110 mg (2,2 mmol) natriumcyanid i 5 ml vand, afkøler til 0 - 5°C og lader nu samtidig, men adskilt, den resterende cyanidopløsning og 320 mg brom (2 mmol) tildryppe under kraftig omrøring på en sådan måde, at overskud af brom eller hypobromit på intet tidspunkt kan eftervises med kaliurajodid/stivelse-papir. . Der udfnugger et vel filtrerbart tværbindingsprodukt. Resultatet er næsten det samme ved anvendelse af den dobbelte mængde natronlud, cyanid og brom, men dårligere ved anvendelse af de halve mængder.

Man kan også tilsætte stivelsesklisteret 110 mg natriumcyanid (2,2 mmol), mindst 4 ml af en 1 m opløsning af kaliumhydrogencarbonat og derpå dråbevis under afkøling 320 mg brom (2 mmol), hvorpå klisteret på grund af ændring som følge af tværbinding bliver filtrerbart.

Ifølge en tredje variant tilsætter man stivelsesklisteret 320 mg brom, tildrypper under god omrøring og køling mindst 4 ml 1 m kaliumhydrogencarbonat-opløs-ning, lader henstå 15 minutter og tilsætter på én gang opløsningen af 140 mg natriumcyanid (2,8 mmol) i 5 ml vand, idet der sørges for intensiv omrøring.

Eksempel 4

Vandopløselig stivelse/chloramin T.

Til 5 ml stivelsesopløsning (100 mg stivelse) sætter man 100 mg (2 mmol) natriumcyanid i 20 ml vand og tildrypper i løbet af 11 minutter ved 5°C en opløsning af 562 mg (2 mmol) .trihydrat af chloramin T i 2 ml dioxan under god omrøring. Pro-duktudfnugningen sker allerede før afslutningen af chloramintilsætningen. Man kan med samme resultat arbejde ved 20°C og/eller benytte en vandig opløsning af chlor- 14 148885 amin T.

Eksempel 5

Vandopløselig stivelse/N-bromsuccinimid.

Til 5 ml stivelsesopløsning (100 mg stivelse) sætter man 100 mg (2 mmol) natriumcyanid i 15 ml vand og 1 ml 2 n natronlud og herpå ved 20°C dråbevis under omrøring en opløsning af 360 mg bromsuccinimid i 2 ml dioxan. Reaktionstid ca.

15 minutter. Omsætningen kan allerede ses efter ca. 7 minutter, idet der dannes en uklarhed.

1 stedet for N-bromsuccinimid kan også N-bromacetamid eller N-chlorsuccinimid anvendes.

Eksempel 6

Vandopløselig stivelse/chloramin.

Til en blanding af 1 n ammoniak og is sætter man natronblegelud (1 mol natri-umhypochlorit pr. mol ammoniak), destillerer i vakuum (kp2Q = 35°C) og kondenserer den vandige chloramin-opløsning i godt afkølet forlag. Indholdsbestemmelsen sker iodometrisk. Til 5 ml stivelsesopløsning (100 mg stivelse) sætter man 100 mg (2 mmol) natriumcyanid i 10 ml vand, afkøler til 2 - 4°C og tildrypper under god omrøring og afkøling 10 ml chloraminopløsning (2 mmol). Der udfælder et meget godt filtrerbart tværbindingsprodukt, tørvægt ca. 100 mg. Nogen ammoniak i chloraminop løsningen er uskadelig.

Eksempel 7

Vandopløselig stivelse/t-butylhypochlorit.

Til 5 ml stivelsesopløsning (100 mg stivelse) og 100 mg natriumcyanid (2 mmol) 1 20 ml vand (pH 11,1) drypper man ved 5°C under god omrøring 217 mg (2 mmol) frisk fremstillet, men ikke destilleret t-butylhypochlorit. Endnu før de gule esterdråber er fuldstændig forsvundet, sætter reaktionen ind (opålessens), og nogle sekunder senere sker udfnugningen af det tværbundne reaktionsprodukt (pH 10,8). Et lignende resultat opnås, når stivelse/cyanid-blandingen i forvejen tilsættes 1 eller 2 ml af en 1 m opløsning af potaske.

Med samme gode resultat anvender man esteren af chlorundersyrling og ethanol, propanol eller tert. amylalkohol.

Eksempel 8

Vandopløselige produkter med aminfikseringsevne.

Ved anvendelse af større fortyndinger (50 ml, 100 ml eller mere pr. 100 mg vandopløselig stivelse) når man efter de under eks.1-2 og 4-7 beskrevne fremgangsmåder i det foreskrevne ρΗ-område, især ved kraftig omrøring, frem til forhold, hvor der ikke længere indtræder nogen udfnugning, men opløst stof, for hvilket der alligevel kan eftervises en aminfikseringsevne, især over for lavmolekylære dia- 15 148885 lyserbare aminoforbindelser. En kvalitativ lige så god virkning opnår man ved nedsættelse af den tværbindingen begrænsende mængde cyanid eller hypochlorit til ca. 0,25 val pr. val organisk hydroxyl.

Eksempel 9

Saccharose/Hypochlorit.

Man opløser 100 mg saccharose(sukker) i 10 ml vand (2,34 milligramækvivalenter organisk hydroxyl), tilfører 100 mg natriumcyanid (2 mmol), afkøler til 5 -10°C og tilsætter under kraftig omrøring 2 mmol natriumhypochlorit i form af na-tronblegelud. Allerede efter tilsætning af den halve mængde hypochlorit udfeddes et fnugget twobingsprodukt. Det frafiltreres efter afslutning af hypochlorittilsæt-ningen og vaskes grundigt. Dets aminfikseringsevne er upåklagelig; tørvægten beløber sig til rundt regnet 100 mg. Det er bemærkelsesværdigt, at denne forbindelse ved henstand i alkalisk reaktionsmedium efter nogle timers forløb bliver flydende. Den samme egenskab har et produkt, som man opnår ud fra 100 mg saccharose, 10 ml vand og 106 mg (1 mmol) eller 212 mg (2 mmol) bromcyan og 1 eller 2 ml 1 n NaOH. Disse saccharosederivater er hidtil ukendte.

På tilsvarende måde forholder det sig med andre ikke reducerende oligosacchari-der, f.eks. trisaccharidet raffinose og tetrasaccharidet stachyose. Også andre tværbindingsprodukter er hidtil ukendte forbindelser.

Eksempel 10

Polyvinylalkohol/hypochlorlt.

Man opløser 100 mg polyvinylalkohol (2,3 milligramækvivalenter organisk hydroxyl) i 10 ml kogende vand, sætter til den afkølede opløsning 100 mg (2 mmol) natriumcyanid og derpå ved 0 - 5°C under omrøring 2 mmol natriumhypochlorit i form af natronblegelud. Tværbindingsproduktet udfælder som grove, noget fedtede fnug, men kan dog alligevel frafiltreres og udvaskes. Produktet er stabilt i kontakt med vand som produkterne ifølge eksempel 1-9, men bliver flydende som saccharcsederivatet ved henstand i alkalisk reaktionsmedium.

Eksempel 11

Bomuldsgarn/hypochlorit eller chlorundersyrling.

500 mg råt bomuldsgarn udkoges med vand og vaskes til affedtning to gange med alkohol, to gange med tetrachlormethan og to gange med ether og tørres i luften. Garnet henstår derefter natten over i 17%'s natronlud under luftudelukkelse, udvaskes godt, tilsættes 500 mg natriumcyanid i 10 ml vand og derefter ved 0 - 5°C dråbevis 10 mmol natriumhypochlorit i form af natronblegelud. Man udvasker grundigt og bestemmer aminbindingsevnen, idet man efter afsluttet enzymfiksering udfører flere på hinanden følgende aktiveringspiøver,idet der mellem hver afprøvning påny udvaskes grundigt. Disse forsigtighedsforanstaltninger er nødvendige, fordi 16 148885 også uspecifik enzymfiksering er iagttaget på merceriserede fibre, og fordi enzympræparatets syreømfindtlighed udelukker den ellers sædvanlige vaskeproces med en svagt sur puffer.

En variant består deri, at vasket og merceriseret garn behandles med den i det foregående angivne mængde af natronblegelud og overskud af fast C02, at fradekantere væsken og indføre garnet i den vandige opløsning af 500 mg natriumcyanid. Efter 5-10 minutters henstand frahældes opløsningen, og garnet vaskes med vand.

I en tredje variant inkuberes det vaskede og merceriserede garn (500 mg) med 3 g natriumcyanid i så lidt vand som muligt natten over, og efter fortynding med 25 ml vand under stærk køling tilsættes 60 mmol natriumhypochlorit, hvorunder kraftig omrøring er nødvendig.

Eksempel 12

Viscosegarn/hypochlorit.

Man suspenderer 250 mg viscosegarn i 2 n natronlud, frahælder efter 1 times forløb, udvasker med vand, overhælder med en opløsning af 500 mg natriumcyanid i 5 ml vand, inkuberer i 30 minutter, afkøler til 5°C og tilsætter i løbet af 30 minutter 10 mmol natriumhypochlorit i form af 7%*s natronblegelud, idet der kraftigt omrøres, og udvasker grundigt med vand.

Eksempel 13 I stedet for vandopløselig stivelse kan man ifølge eksempel 1-2 og 4-8 anvende dextriner eller blandinger af dextriner og vandopløselig stivelse eller blandinger af vandopløselig stivelse og polyvinylalkohol. Natronblegelud kan ligeledes erstattes med en ækvivalent mængde kaliblegelud og natriumcyanid med kaliumcyanid·, den anvendte blegelud titreres i hvert tilfælde.

Eksempel 14

Man anvender arbejdstemperaturer på 25-50°G for ved anvendelse af koncentrerede opløsninger af undgå gelering af eduktet såvel som produktet. F.eks. kan fremgangsmåden anvendes til tværbinding og aktivering af pektiner og af slimstoffer, hvis vandopløselighed bibeholdes ved moderat tværbinding.

Eksempel 14a l,Amylopektinfraktionll/hypochlorit.

1 g kartoffelstivelse suspenderes i 1 liter vand. Man opvarmer under omrøring til 70°C, holder denne temperatur i 1 time , lader afkøle og fraskiller den i høj grad kvældede, men uopløselig blivende fraktion ved centrifugering. Efter gentagelse af varmtvandsbehandlingen og fornyet fraskillelse på centrifugen bliver en "amylopektin"-fraktion tilbage med en tørvægt på ca. 1/3 af den anvendte mængde stivelse; se Advances in Carbohydrate Chemistry, bind 1, side 262, Aca- 17 148885 demie Press Inc. Publishers, New York 1945.

Hver gang suspenderes 100 mg (tørvægt) opblødt stivelse og "amylopektin-fraktion" i 35 ml vand, tilsættes 25 eller 50 eller 100 eller 200 eller 400 mg natriumcyanid og derefter, i en forsøgsrække under iskøling, i en anden forsøgsrække ved stuetemperatur dråbevist under stærk omrøring 3 %'s (vægt/vægt) 4avelle-vand (blegevand), indtil prøvningen med KI-stivelse netop viser et blivende overskud af hypochlorit. Hypochloritforbrug: 1 mol pr. mol natrhxncjaiid. pH-macttm stiger fra ca. 10,5 (cyanidopløsning) til ca. 12 ved en reaktionstid på 5-20 minutter. Resultat i henseende til tværbinding:

Stivelse viser allerede fra 25 mg cyanid god filtrerbarhed; "amylopektinfraktion" bliver allerede ved 50 mg cyanid fnugget og meget let at filtrere.

Resultatet bliver praktisk talt det samme ved anvendelse af en 6Z*s (vægt/ vægt) opløsning af kaliumhypochlorit i vand.

Resultatet af en "amylopektinfraktion"-ansats med 50 mg cyanid ændrer sig heller ikke, når en 6%’s opløsning af kaliumhypochlorit i vand før anvendelse indstilles på pH 6: pH-værdien stiger også her fra til at begynde med 10,5 mod 11, og produktet er i henseende til fnuggethed, filtrerbarhed og aktiveringsgrad upåklageligt. Indstilles pH imidlertid efter cyanidtilsætningen på pH 6 eller 8, sker hypochlorittilsætningen da ved samme pH (pH-stat), udebliver enhver udfnugning; hypochloritforbruget pr. mol cyanid tiltager i alle disse tilfælde, formodentlig på grund af delvis disproportionering af hypochloritet under dannelse af chlorat og kogsalt, og på grund af oxidation til cyanat.

Eksempel 14b

Cellulose/hypochlorit.

Hver gang suspenderes 300 mg mikrokrystallinsk cellulosepulver og pulveriseret fibercellulose (Firma Macherey und Nagel) i vand i løbet af 2 timer.

En tredie prøve, ligeledes af fibercellulose, merceriseres natten over i 17,5 7.'s natronlud under luftudelukkelse. Derefter bliver de tre prøver aktiveret som beskrevet under I med hver 50 mg natriumcyanid og Javellevand.

I alle tilfælde bliver cellulosen kornet og tæt; den er meget let at filtrere.

Hypochloritforbruget andrager også her 1 mol pr. mol cyanid.

Nærværelsen af merceriseringsluden forstyrrer på grund af forøget alkalinitet reaktionsforløbet: Derfor anbefales en forudgående fraskillelse eller neutralisering af natronluden.

18 148885

Eksempel 14c "Sephadex G 200"/hypochlorit.

Hver gang aktiveres 100 mg svagt tværbundet dextran (kugleform) (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala) som beskrevet under 14a med mængder fra 25 til 400 mg natriumcyanid og Javellevand, idet hypochloritforbruget og pH-ændringen bevæger sig inden for de angivne rammer. Svagt tværbundet dextran (kugleform) bliver her ligeledes tættere, således at det nu f.eks. er anvendeligt i den hurtige væskechromatografi som søjlefyldning.

Eksempel 15

Kartoffelstivelse/hypochlorit.

Man suspenderer 10 g kartoffelstivelse til spiseformål i 1 liter vand, opvarmer 1 time ved 60°C og let omrøring, centrifugerer, frahælder det ovenstående, tilsætter resten, der har et volimen på ca.450 ni, 14,7 g (0,3 mol) natriumcyanid, omrører, afkøler til 10°C og lader i løbet af 30 minutter 130 ml (0,25 mol hypo-chlorit) natronblegelud løbe til. pH-værdien stiger fra 11 til 12,5. Man filtrerer på en glasfritte og vasker med 1,5 liter isvand. Produktet anvendes straks eller opbevares i frossen eller lyofiliseret tilstand.

I en variant A suspenderer man 10 g stivelse af samme kvalitet i 500 ml vand, opvarmer 30 minutter ved 60°C, lader afkøle, tilfører 24,5 g (0,5 mol) natriumcyanid, afkøler til 5°C og tilsætter under omrøring samtidigt med 200 ml (0,38 mol hypochlorit) natronblegelud 2 n saltsyre, således at pH-værdien i reaktionsblandingen forbliver i området 11-11,5. Operationen varer 30-40 minutter.

I en variant B tilsætter man gelen ifølge variant A 19,5 g natriumcyanid (0,4 mol).Herpå indledes chlor under omrøring ved 5°C, og pH-værdien holdes på 11-11,5 ved samtidig tilsætning af 2 n natronlud. Operationen afbrydes efter tilsætning af 200 ml lud (0,8 mol).

I en variant C opløser man 2,45 g natriumcyanid (0,05 mol) i stivelsesgel ifølge variant A. Man afkøler til 5°C og indleder under omrøring langsomt (boble for boble) chlor, hvorved pH-værdien ved kontinuerlig tilsætning af en opløsning af 22 g (0,45 mol) natriumcyanid i 300 ml 2 n natronlud holdes på ca. 11. Den tilførte chlormængde svarer til ca. 0,3 mol natriumhypochlorit.

I en variant D suspenderer man 20 g kartoffelstivelse af samme kvalitet i 800 ml 30-40°C varmt vand, opvarmer i løbet af 30 minutter til 60°C, afkøler den transparente gelatinøse masse til 5°C, tilsætter 25 ml af en opløsning af 25,5 g (0,52 mol) natriumcyanid i vand (totalvolumen 245 ml), omrører langsomt og tilfører i løbet af ca. 1 time samtidig: 220 ml (0,44 mol natriumhypochlorit) natronblegelud og den resterende mængde på 220 ml af førnævnte opløsning af natriumcyanid.

Efter afsluttet reaktion ligger pH-værdien på mellem 13 og 14. Man filtrerer ved 15°C, vasker chlorfrit med vand (2 liter) og opnår en filterkage på 157 g.

19 148885

Dens tørvægt andrager 22,6 g, nitrogenindholdet 6,4 %, baseret på tørvægten.

I en variant E går man frem nøjagtig som ved variant D, men arbejder med en opløsning af 49 g (1 mol) natriumcyanid (totalvolumen 245 ml). Resultatet er praktisk talt identisk med resultatet under variant D (vægt af filterkagen, tørvægt, nitrogenindhold) med undtagelse af den omstændighed, at filtrat og vaskevand i dette tilfælde indeholder 0,54 mol uomsat cyanid. Cyanidforbruget svarer altså til mængden af det anvendte hypochlorit.

I et fuldstændig identisk parallelforsøg er det løbende blevet prøvet, hvorledes en lille prøve af reaktionsblandingen, forholder sig i eddikesurt miljø i forhold til kaliumiodidstivelsespapir. Der indtrådte regelmæssigt en blåfarvning, når molforholdet mellem tilsat hypochlorit og cyanid overskred værdien 0,46. I alkalisk miljø indtrådte blåfarvningen som bekendt først, når det nævnte forhold overskred værdien 1. Betydningen af denne forskel forbliver foreløbig uklar. Muligvis er blåfarvningen i eddikesurt miljø en antydning om et mellemprodukt, som atter forsvinder, når molforholdet når under 0,46. Det kan ikke dreje sig om chlorcyan, for chlorcyan farver ikke kaliumiodid-stivelsesreagenset. Lige så lidt drejer det sig om uforbrugt hypochlorit, for dette farver allerede reagenset i alkalisk miljø.

En prøve af det lyofiliserede produkt absorberede i kaliumbromid mellem 3200 og 3600 cm-^ (0H-bånd) noget svagere end den som udgangsmateriale benyttede stivelse, endvidere svagt, men tydeligt ved 2150 cm-^ (tillægning usikker: cyanat? ^0=NH?) og stærkt ved 1720 cm 1 (>C=N-bånd).

16) Bemærkning til stivelseskvaliteten.

Ikke enhver industriel stivelse er som sådan egnet til anvendelse i fremgangsmåden ifølge opfindelsen til tværbinding og aktivering til aminfiksering.

Det er faktisk ikke overraskende, at udgangsmaterialet på den ene side, ekstraktion- og oplukningsmetoden på den anden side påvirker tilgængeligheden og reaktionsdygtigheden af de i fremgangsmåden ifølge opfindelsen involverede hydroxylgrup-per. Forholdene her ligner altså forholdene for cellulosepulver og cellulosefibre.

II. Aminfikseringsreaktion

Der kan nævnes følgende repræsentative eksempler:

Fikseringen af en acylase, som udbydes af firmaet Amano Pharmaceutical Co. Ltd., Nagoya (Japan) til industriel racematopspaltning af N-acylerede α-aminosyrer, fikseringen af krystalliseret chymotrypsin og fikseringen af valin og af glutamin-syre.

Det er i talrige forforsøg med den nævnte acylase blevet fastslået, at det er fordelagtigt at opbevare de aktiverede produkter ved 4 eller -15°C; aktivitetstab ved stuetemperatur i løbet af 48 timer i fugtig tilstand er imidlertid ubetydelig. I lyofiliseret tilstand spiller opbevaringstemperaturen ingen stor rolle. De 20 148885 res fiksering sker i vand eller 0,1 n tydrogmcarbonatop løsning under tilsætning af .Hf4 m cobaltchloridopløsning noget effektivere end i 0,1 n hydrogencarbonatopløsning. Forøger man ionstyrken ved tilsætning af kogsalt (0,1 n eller 0,5 n), tiltager fikseringen noget. Af større betydning er fortyndingen; i blandinger med hver 1 g lyofiliseret aktiv bærer og hver 0,1 g acylase i 4 20 eller 50 ml vand androg fikseringen 84, 79 og 68 % af den til det anvendte svarende maksimale aktivitet. Forholdet mellem bærer og enzym spiller også en vigtig rolle:

Hver gang blev 10 g fugtig bærer inkuberet med 0,02, 0,05, 0,1 og 0,2 g _4 enzym i 10 ml 0,1 n hydrogencarbonatopløsning og 10 m cobaltchloridopløsning i 72 timer ved 4°C. Efter udvaskning hver gang ved 1 liter af den samme puffer gav aktivitetsbestemmelsen i filtratet fiksering på 100, L00, 77,3 og 83,5 %.

Fikseringen sker forholdsvis langsomt:

Hver gang blev 5 g fugtig bærer, 0,1 g acylase og 5 ml vand inkuberet ved 4°C i 1, 2, 12 og 24 timer. Efter filtrering og udvaskning havde filtratet 46, 47, 39, 27 og 13 7= af aktiviteten.

Mest virkningsfuld synes den allerede i indledningen foreslåede metode, ved hvilken man indrører det lyofiliserede eller på anden måde efter mulighed afvandede enzym i den ved filtrering af den aktiverede bærer opnåede fugtige filterkage, hvorved det kan være fordelagtigt i forvejen at suspendere filterkagen i puffer, ved filtrering at fjerne overskud af puffer og at anvende den nu pufrede filterkage.

Eksempel 17

Acylase, fikseringstest.

Man anvender de fugtige filterkager af hver gang 100 mg vandopløselig stivelse fra eksemplerne 1, 2, 4, 5, 6 og 7, af 100 mg saccharose ifølge eksempel 9 og af 100 mg polyvinylalkohol ifølge eksempel 10 med 25 mg af et enzympræparat, som blev opnået ved dialyse af den nævnte acylase og lyofilisering af den ikke-dialyser-bare del, lader henstå natten over i kulden, udvasker med 200 ml af den i det foregående nævnte hydrogencarbonat/cobaltchlorid-puffer og tilsætter til aktivitetsprøvning en standardopløsning af natriumsaltet af acetyl-DL-phenylalanin. En forbehandling af filterkagen med pufferblanding viste sig i de fleste tilfælde overflødig.

På tilsvarende måde behandler man filterkagen ifølge eksempel 3 og fibrene ifølge eksempel 11 og 12.

Eksempel 18 21 148885

Acylase, anvendelsesforsøg.

I den fugtige filterrest (aktiveret "amylopektinfraktion" fra 10 g kartof- _4 felstivelse og 9 g natriumcyanid), der fra vaskeprocessen (0,1 n NaHCO. +10 m ++ ^

CoCl„) noget base og noget Co -ion, indrøres 1 g ved dialyse forrenset lyofilise- ^ o -4 ret acylase. Man lader henstå natten over ved 4 C, optager i 0,1 m NaHCO^ +10 m C0CI2, filtrerer cg Asdær larøomt og grundigt efter med 1 liter af den samme saltopløsning. Man sætter nu acylase-påført filterrest til en opløsning af 24 g acetyl-DL- _4 phenylalanin-natrium i 300 ml 10 m CoCl^ og inkuberer under langsom omrøring ved 40°C i nærværelse af noget thymol. Efter 2 dages forløb, i løbet af hvilke man kan følge reaktionens fremskridenpolarimetrisk, frafiltreres der fra fikseret enzym, og filterresten indføres - uden så meget som, at den udvaskes - i en yderli- -4 gere portion på 24 g DL-phenylalanin-natrium i 300 ml 10 m CoCl^ osv. (2. nedbrydningscyklus) .

Fra det inddampede filtrat udkrystalliseres L-phenylalanin i et udbytte på 60-70 %, og acetylphenylalanin fra den syrnede moderlud, udbytte 70-80 %, overvejende på D-form. Stoftabene skyldes væskeretentionen på grund af den voluminøse filterrest. De nedsættes allerede ved oparbejdning af filtratet fra den 2. nedbrydningscyklus. Der kan let udføres mindst 100-150 nedbrydningscykler, før enzyminaktiveringen kræver en udskiftning af enzympræparatet. Den fikserede acylase er, især i nærværelse af natriumacetat og acetyl-D-phenylalanin-natrium i kulden uændret holdbar i måneder.

Eksempel 19

Chymotrypsin.

Man opløser en blanding af 25 mg chymotrypsin og 25 mg natriumsulfat i 2 ml vand, lyofiliserer og river resten under tilsætning af 2 ml 0,1 n natriumhydrogen-carbonatopløsning med en ifølge eksempel 1 ved 0-5°C holdt filterkage af 200 mg opløselig stivelse, 200 mg natriumcyanid, 20 ml vand og 4 mmol natriumhypochlorit (blegelud), lader henstå 30 timer ved stuetemperatur, vasker grundigt med 1,5 liter vand og lyofiliserer resten: tørvægt ca. 220 mg med et vandindhold på 11,5 % (Karl Fischer-titrering). En prøve blev hydrolyseret 36 timer ved 110°C i 20 70's saltsyre og hydrolysatet analyseret efter D.H.Spackman, W.H.Stein og S.Moore, Anal.Chem., 30 (1958),1190, Man fandt de ventede aminosyrer i det ventede mængdeforhold; den samlede mængde deraf svarede til en fiksering af 16,5 g chymotrypsin.

Eksempel 20 22 148885

Valin på opløselig bærer.

Til de dialyserede opløsninger ifølge eksempel 8 og eksempel 14 sætter man i 1 vægt% af opløsningen valin, pufrer med noget hydrogencarbonat ved pH 9, lader henstå natten over ved 0°C, dialyserer ved 0°C til fuldstændig fjernelse af natriumionerne og lyofiliserer. I hydrolysatet fra de lyofiliserede produkter finder man valin.

Eksempel 21

Glutamlnsyre på uopløselig bærer.

Hver gang blev en af de ifølge hovedforskriften i eksempel 15 fremstillede filterkager behandlet i forskellig fortynding ved forskellig temperatur i forskellige tidsrum med 8 g glutaminsyre (54 mmol) og 5,6 g natriumcarbonat (54 mmol).

Den opnåede påføring tiltager i koncentrationsområdet fra 0,01-0,1 g glutaminsyre pr. ml med en faktor 6,5, fra 0-20°C med en faktor 1,3, fra 20-40°C med en faktor 1,16, og fra 2,5-5 timer med en faktor 1,17, fra 5-50 timer endnu med den samme faktor. Ved konstant volumen tiltager den ved femdobling af glutaminsyremængden med en faktor på 3,5. Ved fortynding med 20 ml, stuetemperatur og 15 timers reaktionsforløb opnåedes en fiksering af gennemsnitlig 10 mmol glutaminsyre (bestem-. melse ved syremåling og ved amino syreanalyse efter Spackman, Stein og Moore,supra). Den fikserede glutaminsyre bruger 1 mol lud pr. mol; dens titreringskurve minder om kurven for mononatriumglutamat i nærværelse af formaldehyd.

III. Analytisk eftervisning af fikseret enzymaktivitet.

Eksempel 22

Fikseret acylase.

En filterkage eller en fibermængde, som oprindeligt svarer til 100 mg an- _4 vendt polyhydroxylforbindelse, optages i 4 ml 10 m cobaltchloridopløsning, opvarmes til 40°G og tilsættes 4 ml af en til 40°C opvarmet opløsning, som indehol- -3 -3 der DL-acetylphenylalanin (4,5 x 10 m), natriumhydrogencarbonat (6,6 x 10 m)

—4 O

og cobaltchlorid (10 m). Man inkuberer 30 minutter ved 40 C under omrøring, filtrerer og fører 5 μΐ af filtratet på et tyndt lag af silicagel og ved siden af 5 μΐ sammenligningsopløsninger, som indeholder netop så meget phenylalanin, at der på chromatogrammet dannes pletter, som svarer til en enzymatisk nedbrydning på 5, 10, 20 og 40 7o. Den mobile fase er chloroform/methanol/iseddike/pyridin (70/25/5/5). De på denne måde bedømte mål for den enzymatiske nedbrydning lå for alle de i eksemplerne beskrevne udførelsesformer på mellem 5 og 40 %.

Eksempel 23 23 148885

Fikseret chymotrypsin.

Man sætter opløsningen af 20 mg acetyl-L-tyrosin-ethylester i 3 ml ethanol til 9 ml 0,1 m phosphatpuffer (pH 7,8), tilsætter enzympræparatet, tilslutter pH-staten og følger reaktionen ved forbruget af 0,2 n natronlud ved 27-28°C. Aktiviteten af præparatet fra eksempel 19 var halvt så stort, som den fikserede chymotryp-sinmængde lod vente.

Tillæg.

1» Eksperimentel sammenligning mellem reaktionsvejene I og II.

Reaktionsvejene 1 og II ifølge skemaet i det foregående skal diskuteres.

Som følge af I frigøres en vis mængde syre på grund af reaktionen: XCN + i ROH + (1-8 ) HOH —é ROCN + (1- é ) HOCN + HX Som følge af II frigøres derimod uafhængigt af mekanismen en vis mængde alkalime-talhydroxid på grund af reaktionen:

NaOCl + NaCN + 8ROH + (1- 8 ) HOH—- 8 ROCN +(1-8) NaOCN +iNaOH + NaCl Desuden indeholder hypochlorit en del fri alkalimetallud. Syre såvel som lud lader sig i det foreliggende tilfælde opfange på grund af tilstedeværelsen af stærk car-bonatpuffer, i så høj grad, at pH-forskydningerne ligger inden for rammerne 0,3-0,4 ρΗ-enheder. En pH-regulering ved hjælp af pH-stat måtte lades ude af betragtning på grund af de store reaktionshastigheder.

Den pufferbetingede høje saltkoncentration gør såvel I som II langsommere. Lige sådan virker nedsættelse af reaktionstemperaturen fra 20 til 0°C. Ved kumulering af disse virkninger kan I og II let sammenlignes. De efterfølgende sammenligningsforsøg er typiske i henseende til reaktionsbetingelserne og resultaterne:

En staoøpløsning af 5 ml 2 %'s stivelsesopløsning (vægt/vægt) 10 ml 2 m K2C03 tilsætter man enten 10 ml vand 1,17 g NaCl (20 mmol) 5 ml 1 m KHC03 138 mg NaCl (2,34 mmol) og opnår således opløsning A, pH 10,55 eller 10 ml 2 m K2C03 5 ml 1 m KHC03 138 mg NaCl (2,34 mmol) og opnår således opløsning B, pH 11,1 24 148885 eller 10 ml vand 1,17 g NaCl (20 mmol) eller 2,84 g Na2S0^ 5 ml 1 m KHCO^ 128 mg NaCN (2,6 mmol) og opnår således opløsning C, pH 10,6 eller 5 ml vand 293 mg NaCl (5 mmol) 10 ml 2 m K2C03 138 mg NaCl (2,34 mmol) og opnår således opløsning D, pH 12,0 Man afkøler opløsningerne A, B, C og D til -1°C og tildrypper under kraftig omrøring i løbet af 1 minut til A, B og D hver 3 ml (2,26 mmol) af en frisk fremstillet vandig opløsning af frisk fremstillet chlorcyan (fremgangsmåde ifølge I), og til C 2,53 g (2,34 mmol NaOCl) blegelud (fremgangsmåde ifølge II). A og B (fremgangsmåde I)reagerer svagt exotermt; temperaturen holdes ved køling på ca.

0°C. Efter 13 minutters forløb kan lugten af chlorcyan endnu svagt mærkes; pH-værdien ligger ved 10,25 (A) eller 10,8 (B). Der sker ingen udskillelse af et uopløseligt tværbindingsprodukt. C (fremgangsmåde II) reagerer stæikt exotermt; temperaturen stiger trods køling forbigående til 3°C. Endnu før afslutning af hypo-chlont^tilsætningen bliver reaktionsblandingen mælkeagtig, og derpå sker i løbet af sekunder udfældningen af tværbindingsproduktet på fnugget, god filtrerbar form.

En stærk lugt forsvinder temmelig hurtigt. 13 minutter efter forsøgets begyndelse ligger pH-værdien ved 11,0. Forsøget med opløsning D tjener til kontrol af chlor-cyan-kvaliteten; endnu før afslutning af chlorcyan-tilsætningen optræder den for tværbinding typisk mælkeagtige uklarhed, og i løbet af sekunder sker da udfloknin-gen af tværbindingsproduktet. Man holder temperaturen ved 0°C i endnu 12 minutter; pH ligger ved 11,2. Chlorcyan-lugten forsvinder som ventet hurtigere end ved forsøgene ved opløsningerne A og B.

Kommentar;

Man iagttager, at I i tilfælde B) forløber i pH-området for II i tilfælde Q.

De forskellige resultater fører til den uafviselige følgeslutning, at den ifølge II iagttagede tværbinding ikke kan føres tilbage til virkningen af intermediært dannet chlorcyan. Udbytte og aminfikseringsevne for det ifølge II under anvendelse af opløsning C opnåede produkt bevæger sig inden for de for fremgangsmåde II alment sædvanlige rammer.

25 .

148885 2, Bemærkninger til arten af den kemiske reaktion, som ifølge opfindelsen fgirer til tværbundne polyhydroxylforbindalser med aminfikseringsevne.

En yderligere, af det ovennævnte resultat uafhængig henvisning til forskellig-artetheden af I og IX fremgår af den iagttagelse, at det forholder sig således, som det var at vente, når det første trin bestod i én forestring af hydroxylgrup-per fra stivelse med chlorundersyrling. Lader man nemlig en blanding af 2%1s (vægt/vægt) stivelsesopløsning og 7%'s (vægt/vægt) natriumhypochloritopløsning med blandingsforholdet 100 rag stivelse : 2 mmol NaOCl véd 0 - 5°C under kraftig omrøring inddryppe i en godt kølet 17,'s opløsning af natriumcyanid, sker der uafhængigt af det støkiometriske forhold mellem 001" og CN~ en Øjeblikkelig udfnugning af tværbundet stivelse med fremragende aminfikseringsevne. Lader man omvendt cyanidet dryppe til blandingen af stivelse og hypochlorit, udfælder der intet tværbindingsprodukt.. Øjensynligt opfanges cyanidet af hypochlorit, så at stivelsen kan indgå i reaktionen. Overhælder man imidlertid stivelsé/hypochlorit-blandingen på én gang med den støkiometriske mængde cyanidopløsning, sker dér én udfnugning af aminfikseringsaktivt tværbindingsprodukt under den påfaldende forudsætning, at stivelse/hypochlorit-blandingen før cyanidtilsætningen først blev inkuberet i kort tid, f.eks. 5-15.minutter ved 20°C. En del af cyanidet finder her åbenbart mulighed for direkte at reagere med en formodentlig stivelsesbunden del af hypochlori-te.t, f.eks. efter skemaet; R0C1 + CN--^ ROCN + Cl"

Tilsvarende kan man inkubere en i vand opkvældet, uopløselig polyhydroxylforbindel-se (tørvægt 100 mg), som for eksempel "Sephadex G 200" eller merceriseret cellulose ("Avicel") med hypochlorit-opløsning (2 mmol NaOCl).i 15-30 minutter ved stuetemperatur, eventuelt under tilsætning af tøris, efter tilsætning af 100 ml vand skille fra væsken (centrifuge), optage resten i 100 ml vand, afdekantere væsken (centrifuge), overhælde resten med 10 ml 1%'s natriumcyanidopløsning og derpå vaske den cyanidfri på centrifugen. Produktet har en aminfikseringsevne, som er u-afhængig af varigheden af inkuberingen med hypochlorit.

Den i eksemplerne beskrevne, ganske særligt milde og harmonisk forløbende., tværbindingsreaktion ved indvirkning af t-butylhypochlorit på en blanding af opløselig stivelse og natriumcyanid kunne derefter ligeledes opfattes som resultat af en primær omestringsreaktion mellem det organiske hypochlorit og stivelsen.

Claims (6)

148885

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en aktiveret bærer til fiksering af en eventuelt biologisk aktiv, vandopløselig, ved mindst ét basisk nitrogenatom substituerbar aminoforbindelse, samt om ønsket af en sådan aminoforbindelse fiksere-ret til en sådan aktiveret bærer, kendetegnet ved, at man lader blåsyre og/eller et vandopløseligt cyanid og et reagens, der indeholder chlor eller brom i et positivt oxidationstrin, nemlig chlorundersyrling eller bromundersyrling og/eller et vandopløseligt salt af chlorundersyrling eller bromundersyrling eller en chlor- eller bromforbindelse, som ved hydrolyse giver en af de nævnte syrer, eller en blanding af sådanne halogenderivater indvirke på en vandopløselig eller kvældbar, vanduopløselig polyhydroxylforbindelse i alkalisk milieu, fortrinsvis i kulden, eventuelt neutraliserer reaktionsblandingen og a), hvor der er tale om en opløsning, ved klaring og dialyse eller gelfiltrering, b) hvor der er tale om en suspension, ved filtrering eller centrifugering og udvaskning, fjerner lavmolekylære bestanddele, og, om ønsket, lader den i opløsningen eller suspensionen foreliggende aktiverede bærer indvirke på en eventuelt biologisk aktiv, vandopløselig, ved mindst ét basisk nitrogenatom substituerbar aminoforbindelse, i nærværelse af vand og eventuelt et puffersystem,ved en temperatur under 50°C, fortrinsvis i kulden, og uddialyserer eller udfiltrerer eller udvasker dialyserbart eller på opløst form tilbageblevet materiale med vand eller en vandig saltopløsning fra omsætningsproduktet.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man tilsætter blåsyre og/eller cyanid i en samlet mængde, som pr. gramækvivalent organisk bundet hydroxyl svarer til en samlet mængde cyanid på 0,25 - 6 gramækvivalenter.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kende te gnet ved, at man tilsætter chlorundersyrlingen eller bromundersyrlingen og/eller salte og/eller de tilsvarende hydrolyserbare chlor- eller bromforbindelser i en samlet mængde, som pr. gramækvivalent organisk bundet hydroxyl svarer til 0,25 - 6 gramækvivalenter chlor eller brom i positivt oxidationstrin.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at man som cyanid anvender et alkalimetalcyanid.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 3, kendetegnet ved, at man som salt af chlorundersyrling eller bromundersyrling anvender et alkalimetalhypo-chlorit eller -hypobromit, fortrinsvis natronblegelud eller kaliblegelud, eller chlor eller bromqg et alkalimetalhydroxyd eller -carbonat eller -hydrogencarbonat.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 3, kendetegnet ved, at man som til chlorundersyrling eller bromundersyrling hydrolyserbar forbindelse anvender en ester af den nævnte syre, fortrinsvis et alkylhypochlorit med 2-5 carbon-atomer i alkylgruppen.