DK148942B - Fremgangsmaade til fremstilling af et vanduoploeseligt enzympraeparat - Google Patents

Description

148942 i

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et vanduopløseligt enzympræparat med til mikrobielle celler bundet glucoseisomerase og tværbundet gelatine i form af ekstruderede fibre.

5

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man i rækkefølge: (1) danner en inderlig blanding af et mikrobielt celleslam 10 og af geldannende smeltet gelatine, (2) leder den således opnåede blanding gennem en spindedyse til opdeling af den i tråde og direkte ind i koldt vand, idet 15 det således opnåede trådbundt i tilstrækkelig lang tid holdes i kontakt med et tværbindingsmiddel, og derpå (3) snitter trådene i stykker af passende længde i forhold til trådenes diameter.

20 I patentkravene 2-6 er angivet fordelagtige udførelsesformer for fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Fra dansk fremlæggelsesskrift nr. 133,380 kendes en fremgangs-25 måde til fremstilling af vanduopløselige enzympræparater i par tikelform. Disse fremstilles ved blanding af et enzym, f.eks. i form af en enzymindeholdende mikroorganisme med et geldannende protein, f.eks. gelatine og overføring af blandingen i partikelform og behandling af partiklerne med et tværbindingsmiddel. Par-30 tikelformen af blandingen af enzym og geldannende protein opnås her ved hjælp af sprøjtetørring eller prill-metoden eller fortrinsvis ved behandling af en opløsning eller suspension af enzymet i vandig opløsning af det gelerende protein med en organisk væske og efterfølgende tværbinding, hvorhos den organiske 35 væske naturligvis fjernes før eller efter tværbindingen.

I modsætning hertil opnås partikelformen ved fremgangsmåden i- 2 148942 følge den foreliggende opfindelse ved indføring af blandingen af mikrobielt celleslam og gelatine direkte i koldt vand og indvirkning af tværbindingsmidlet.

5 Det er overraskende og på ingen måde forudseeligt, at det efter blanding af de to udgangsmaterialer foreliggende materiale ved og efter ekstrusion heraf i koldt vand ikke flyder ud. Man ville tværtimod på grund af gelatinens kendte vand-opløselighed forestille sig det modsatte.

10

Ifølge tysk fremlæggelsesskrift nr. 22 23 340 fremstilles et mikrobielt celleslam, hvorved i hver af cellerne det deri forekommende enzym bliver fikseret ved hjælp af en intracellulær tværbinding.

15

Bestanddelene af det således opnåede celleslam har en diameter på nogle mikroner, dvs. en diameter, der svarer til cellerne. Sådant celleslam kan ikke i en isomerisationssøjle anvendes til kontinuerlig isomerisering, da en sådan søjle, 20 som ville blive belagt med et sådant celleslam, ville blive tilstoppet i løbet af kort tid. Dette er ikke tilfældet med enzympræparatet i partikelform opnået ifølge den foreliggende opfindelse.

25 Det ifølge opfindelsen opnåede vanduopløselige enzympræparat foreligger i almindelighed i form af en masse af fiberdele i ''spaghetti"-form med en middellængde over 0,2 mm og i almindelighed under 10 mm og fortrinsvis på ca. 1 mm og med en diameter på 0,2-5 mm, som dannes af en inderlig blanding af endocel- 30 lulær glucoseisomerase og med et brodannende middel tværbundet gelatine.

Den efterfølgende beskrivelse med tilhørende tegning tjener til at lette forståelsen af opfindelsen og angiver fordel- 35 agtige udførelsesformer for opfindelsen.

3 148942

Tegningen viser et skematisk snit af væsentlige elementer af et anlæg til udførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Til fremstilling ifølge opfindelsen af uopløselige partikler 5 med enzymatisk aktivitet går man frem som angivet nedenfor eller på hermed analog måde.

Man fremstiller først et endocellulært enzym i form af et slam bestående af mikrobielle celler.

10

For at opnå dette kan man gå frem således som beskrevet nedenfor.

Man dyrker på i og for sig kendt måde den udvalgte mikroor-15 ganismestamme for at fremstille en kulturbouillon.

Da partiklerne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal udvise størst mulig enzymatisk aktivitet, isolerer man hensigtsmæssigt fra den forannævnte kulturbouillon et 20 slam med det højst mulige indhold af tørstof. For at opnå dette kan man centrifugere.

For at forbedre kulturbouillonens egnethed til centrifugering mest muligt underkaster man den en mild termisk behandling ved 25 en temperatur på højst ca. 55°C.

Førend den termiske behandling sigter eller sier man kulturbouillonen for at fjerne større uopløselige partikler.

30 Man centrifugerer den siede bouillon således, at man opnår et slam med et indhold af tørstof på mindst 10%, sædvanligvis på ca. 14%.

Dette slam udgør udgangsmaterialet for fremgangsmåden ifølge 35 opfindelsen og underkastes ifølge denne fremgangsmåde følgende processer.

Det blandes først inderligt med geldannende gelatine.

4 148942

Gelatinedelen, udregnet på slammængden, andrager 3-20 vægt% og er fortrinsvis af størrelsesordenen 10 vægt%, idet gelatinen foreligger i pulverform.

5 For at opnå en god dispersion af den geldannende gelatine, holder man slammets temperatur under tilsætning af gelatinepul veret, der sker under stærk omrøring, på ca. 55°G.

Samtidig med gelatinen tilsætter man fortrinsvis en virksom 10 mængde af en stabilisator for enzymet.

Stabilisatoren kan vælges fra gruppen bestående af magnesium-og cobaltsalte, specielt magnesiumchlorid og -sulfat, og mængden af stabilisator er i almindelighed af størrelsesordenen 1 15 pr. 1000, udregnet på slammets masse.

Sønderdelingen af blandingen sker ved gennemledning gennem en i koldt vand neddyppet spindedyse på en sådan måde, at de tråde eller fibre, der kommer ud af spindedysen, befinder sig i vand.

20 Det opnåede trådbundt holdes i tilstrækkelig tid i kontakt med en virksom mængde af et tværbindingsmiddel.

Førend gennemledningen af den ovenfor nævnte blanding gennem spindedysen sigtes eller sies den fortrinsvis for at fjerne 25 uopløselige partikler, som eventuelt kan være bragt med gelatinen .

Førend gennemledningen gennem spindedysen, som man fordelagtigt har valgt på den måde, at de opnåede tråde udviser en diameter 30 af størrelsesordenen 0,2-5 mm, påfører man den forannævnte blan ding et tryk, der er tilstrækkeligt til, at der sker en jævn udtræden gennem spindedysens åbninger, og som ikke er for højt, således at man undgår en dispergering i det kolde vand. Prak- 2 sis har vist, at et tryk af størrelsesordenen 0,2 kg/cm er 35 velegnet.

Temperaturen af det isvand, som trådene fra spindedysen kommer ud i, kan være ca. 1-2°C.

5 148942

Ved den pludselige afkøling af trådene ved neddypning i isvandet størkner gelatinen i massen af mikrobielle celler.

Under hele spindingens forløb opretholder man fordelagtigt 5 en let opadstigende strøm i isvandet for at undgå filtring af trådene.

Det kan være fordelagtigt at forny vandet, hvor trådene opsamles. Dette vand indeholder en vis mængde enzymstabilisator, 10 svarende til mængden af stabilisator i blandingen.

Tværbindingsmidlet for det geldannnende protein, der fortrinsvis er glutaraldehyd, kan være til stede i det isvand, i hvilket man indfører trådene.

15

Man kan også vente med at tilsætte tværbindingsmidlet, indtil hele blandingen er spundet.

Mængden af tværbindingsmiddel, udregnet på udgangsslammets mæng-20 de, er af størrelsesordenen fra 0,5 til 5%, sædvanligvis ca. 2%.

Det kan anvendes i form af en teknisk 50%'s opløsning i vand.

Kontakten mellem trådene og opløsningen af tværbindingsmidlet 25 opretholdes fortrinsvis under opadstigende cirkulation af van det i en tidsperiode, der er tilstrækkelig til at gøre doi forhåndenværende gelatine fuldstændig uopløseligt ved tværbinding.

Kontakttiden andrager sædvanligvis 10-15 timer.

30

Trådbundtet bliver herefter vasket for at fjerne spor af tværbindingsmiddel, der ikke er omsat, og herefter opskæres det, så man opnår trådstykker af en sådan længde, at der - trådenes diameter taget i betragtning - ikke sker nogen tilstopning ved 35 .deres anvendelse.

Praksis har vist, at man opnår gode resultater med trådstykker 6 148942 med en længde på over 0,2 mm og under 10 mm og fortrinsvis på ca · 1 mm

De ituskårne tråde, der foreligger i form af "spaghetti-"/ kan, 5 efter at man har fjernet små partikler ved sigtning, anvendes direkte, eller de kan lagres efter tørring.

Produktet kan afnutsches til et indhold af tørstof på 23 til 25%.

10

Til lagring kan det f. eks. tørres i et hvirvellag på 60°C til et indhold af tørstof på over 90%.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan udføres i et anlæg som 15 vist på den skematiske tegning. Det omfatter : en fermentationsbeholder 1, hvori den udvalgte mikroorganisme dyrkes. Denne beholder er udstyret med et røresystem 2 og en 20 opvarmningsanordning 3; en lagerbeholder 4 til kulturbouillon, til hvilken bouillonen føres gennem en ledning 5, der er udrustet med en pumpe 6.

Ved ledningen 5's indføring i beholderen 4 findes en sianord-25 ning 7. Lagerbeholderen 4 indeholder desuden en opvarmningsan ordning 8, således at en termisk behandling af bouillonen er mulig; en centrifugeanordning, der generelt er angivet ved 9, til 30 hvilken bouillonen føres gennem en ledning 10, der er udrustet med en pumpe 11, og fra hvilken slammet fjernes gennem en ledning 12 ; en lagerbeholder 13 til slammet, pg en beholder 14 med et røre-35 system 15 og en opvarmningsanordning 16, i hvilken slammet blan des med den geldannende gelatine og stabiliseringsmidlet, som tilsættes afbildet ved pilen 18, idet beholderen 14 er forbundet med beholderen 13 med en ledning 19; 7 148942 et spindedysesystem 20a, 20b, 20c...... til hvilket blandingen føres gennem en ledning 21, i hvilken der befinder sig en si 22 og en volumetrisk pumpe 23, idet spindedyserne er anbragt på en sådan måde, at de udmunder under overfladen af et volumen is-5 vand 24, der findes i en beholder 25, i hvilken et tværbin dingsmiddel og en stabilisator for glucoseisomerasen indføres som vist ved pilen 26. Denne beholder 25, er udstyret med et ikke vist system, der muliggør et vandkredsløb i en opadstigende strøm* 10 en anordning, generelt betegnet med 27, der er egnet til at opskære de fra beholderen 25 vundne trådbundter F, og som munder ud i en lagerbeholder for de afsnittede tråde. Den af trådstykker bestående masse M udgør produktet.

15

For nærmere at anskueliggøre fremgangsmåden ifølge opfindelsen beskrives den i det følgende under anvendelse af en speciel' mikroorganisme, nemlig Streptomyces violaceoniger, især stammen CBS nr. 409-73 af denne mikroorganisme. Stamme nr. 409-73 20 er deponeret i "Centralbureau Voor Schimmel Cultures" i BAARN

(Holland (jvf. fransk patentskrift nr. 2.225.514)).Denne mikroorganisme frembringer endocellulær glucoseisomerase.

Man går ud fra en kultur af Streptomyces violaceoniger, stamme 25 CBS nr. 409-73, der er frembragt inden i en fermentator på 30 m , således som beskrevet i fransk patentskrift nr. 2.225.514, og 3 af denne kulturbouillon udtager man 6 m .

Denne kulturbouillon sies på en rotationssi af typen "LARSSON", 30 f.eks. den i handelen tilgængelige model fra firma ALFA-LAVAL, der er udrustet med en si bestående af et rustfrit trådnet med en maskestørrelse på 200 mirkon. Herefter opvarmer man til 55°C.

Herefter centrifugerer man bouillonen på en centrifuge, der 35 automatisk fraskiller slammet, af typen WESTFALIA SAMR 15037 3 med en gennemstrømning på 3 m /time. Man udfører for hvert 2 1/2 minut en delvis fjernelse af slammet på 1,4 sekunder. Ef- 8 148942 ter 1 times centrifugering er opnået 200 liter slam med et indhold af tørstof på 14% og en enzymatisk aktivitet på 1600 enheder pr. g slam (dvs. en lævulosedannelse på 1600 mg i 1 time, idet man går ud fra en 10%'s dextroseopløsning ved en 5 temperatur på 70°C og en pH-værdi på 8,5).

Dette slam anbringes i en 250 liter beholder, der er udstyret med et røreværk med en ydelse på 3 HK af den slags, der findes i handelen fra firmaet RAYNERI. Beholderen er yderligere udru-10 stet med en varmeslange, i hvilken der cirkulerer varmt vand, ved hjælp af hvilket slammet holdes på 55°C.

Til dette slam sætter man under kraftig omrøring ved 55°C 20 kg gelatinepulver, dvs. 10% gelatine beregnet med hensyn til slam-15 volumenet (gelatinen er af en kvalitet svarende til 220 BL00M- enheder) og 200 mg magnesiumchlorid som stabilisator for enzymet.

Efter endnu en sigtning over en si med en maskevidde på 200 20 mikron spinder man den således fremstillede suspension gennem en spindedyse ud i en vandbeholder med 800 liter vand, der er nedkølet til 1 til 2 °C.

Til spindingen anvender man en volumetrisk pumpe af typen F 2 25 M fra firmaet P.C.M (licens MOINEAU). Som spindedyse anvender man en plade bestående af rustfrit stål med en diameter på 10 cm, der er perforeret med 400 huller med 500 mikron diameter. Spindegennemløbet andrager 70 liter/time, arbejdstrykket 0,2 kg/ - cm .

30 Når massen kommer ud af spindedysen, og de dannede tråde kommer ned i isvandet, størkner gelatinen og bliver fast inden i massen af streptarycesceller. Under hele spindeprocessen opretholder man en let opadgående strøm af koldt vand for at undgå en for stærk 35 filtring af de opnåede tråde.

Efter 3 timers spinding befinder al det i gelatinen indesluttede enzym sig i beholderen. Man fornyer vandet, hvori trådene 9 148942 blev optaget, i løbet af ca. en halv time, idet man under hele fremgangsmåden anvender afhærdet vand, der indeholder 1,0 g mag-nesiumchlorid pr. liter.

5 Til tværbinding af gelatinen tilsætter man 8 kg af en 50%'s teknisk opløsning af glutaraldehyd, dvs. 2% glutaraldehyd udregnet på slamvolumenet.

Herefter opretholder man kontakt i 15 timer ved en temperatur 10 på 2°C. Man måler den fremadskridende forsvinden af reagenset.

Man bibeholder en let cirkulation under hele fremgangsmåden for at gøre hele det enzymatiske præparat tilgængeligt for tværbindingsmidlet.

15 Efter at tværbindingen er afsluttet, og efter at der er vasket for at fjerne spor af fri glutaraldehyd, opskærer man bundtet ved hjælp af et apparat med roterende knive af den type, der findes i handelen fra firmaet HOBART, og som er udrustet med et gitter på 4 mm. Dette giver "spaghetti" med en middellængde 20 på 4 mm. Ved denne opskæring forbedrer man kolonnens fyldnings- køefficient.

De opskårede granulater kan direkte anvendes til kontinuerlig isomerisering. Deres aktivitet udregnet på 1 g fugtig, frasu-25 get granulat udgør 600-700 enheder/g ved et tørstofindhold på 23-25%. Man tørrer dette granulat i et hvirvellag ved 60°C og får efter 2 timer et granulat med et tørstofindhold på over 90%, hvis middelaktivitet andrager 2700 enheder/g/sekund.

30 Det således opnåede produkt kan anvendes til kontinuerlig iso merisering.

Til udførelse heraf går man frem på følgende måde: 35 Man tilbereder fire isomeriseringskolonner med en diameter på 25 cm og en højde på 200 cm. Disse kolonner udstyrer man forneden med et net med en maskevidde på 0,5 mm. På dette net overfører man ved hjælp af vand 4 liter sigtet grus med en mid- U89A2 ίο deldiameter på 1 mm. Herefter tilsætter man 70 kg af de fugtige spaghetti formede partikler svarende til ca. 9.4 liter af disse partikler, idet man drager omsorg for, at tilsætningen sker under et vandspejl, hvorved man undgår indeslutning af luft.

5

Man sætter til disse kolonner et stivelseshydrolysat med 94% ægte dextrose og et indhold på 5-6% polyholosider med en absolut drejningsevne på ca. +56°C og et indhold af tørstofmateriale på 42% ved en temperatur på 64-65°C, idet pH-værdien 10 af hydrolysatet indstilles til en værdi på 8,5 med natriumcar- bonat.

Ved disse betingelser kunne man gennemføre en isomerisering af stivelseshydrolysatet indtil 42% fructose i løbet af 4 uger.

15

De ugentlige middelgennemløb androg : 80 liter/time i den første uge 60 liter/time i den anden uge 20 40 liter/time i den tredje uge 20 liter/time i den fjerde uge hvilket gav et middelgennemløb pr. time på 50 liter/time i løbet af de 4 uger.

25

Den samlede mængde af behandlet opløsning androg 35000 liter pr. kolonne.

2

Tryktabet overskred under disse betingelser aldrig 0,5 kg/cm .

30

Man behandlede således på denne måde --- = 16170 kg tørt hydrolysat.

100 35

Dette resultat blev opnået, idet man gik ud fra 70 kg fugtigt granulat ifølge opfindelsen med et tørstofindhold på 23%, dvs.

Claims (5)

148942 ZP .x = 16,1 kg tørt granulat ifølge opfindelsen. 100 Dette resultat giver et forhold på 1000 kg tørret, til 42% 5 fructose isomeriseret hydrolysat pr. 1 kg tørret enzym. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen får man, uafhængig af den valgte udførelsesform, partikler, der 10 besidder høj enzymatisk aktivitet, idet andelen af celler i den geldannende gelatine er høj; er uopløselige i reaktionsmiljøet under anvendelsesbetingelserne (temperatur, pH-værdi, tryk); 15 er mekanisk modstandsdygtige, dvs. at de ved håndtering eller ved transport eller ved anbringelse i kolonnerne eller under selve processen ikke sønderbrydes, hvilket forhindrer, at der er tendens til tilstopning; 20 har en egnet størrelse med hensyn til den størst mulige tilsyneladende enzymatiske aktivitet og de hydrodynamiske egenskaber af de reaktorer, der er påfyldt disse partikler, og 25 er temperaturresistente. Patentkrav. 30

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et vanduopløseligt enzympræparat med til mikrobielle celler bundet glucoseisomerase og tværbundet gelatine i form af ekstruderede fibre, kendetegnet ved, at man i rækkefølge: 35 (1) danner en inderlig blanding af et mikrobielt celleslam og af geldannende smeltet gelatine, 148942 (2) leder den således opnåede blanding gennem en spindedyse til opdeling af den i tråde og direkte ind i koldt vand/ idet det således opnåede trådbundt i tilstrækkelig lang tid holdes i kontakt med et tværbindingsmiddel/ og derpå 5 (3) snitter trådene i stykker af passende længde i forhold til trådenes diameter.

2. Fremgangsmåde ifølge krav lfkendetegnet ved, at 10 den dannede inderlige blanding består af et slam af Strepto-mycesceller, specielt af Streptomyces violaceoniger, med et indhold af tørstof på mindst ca. 10% og med en temperatur på ca. 55°c, og 3-20 vægt% gelatine, beregnet på slammet, og at man vælger spindedysen således, at man får tråde med en diame-15 ter på ca. 0,2-5 mm, idet det opnåede trådbundt i 10-15 timer holdes i kontakt med en mængde på 0,5-5 vægt% glutaraldehyd, udregnet på udgangsslammet, og derefter skæres i stykker med en længde på over 0,2 mm og under 10 mm.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at man anvender et celleslam af Streptomyces violaceoniger, med et tørstofindhold på ca. 14 vægt%, en gelatinemængde til dannelse af den inderlige blanding på ca. 10 vægt% og en glutar-aldehydmængde på ca. 2 vægt%, begge beregnet på slammet, og at 25 man fremstiller tråde med en diameter på ca. 0,5 mm og en læng de af trådstykkerne efter-afskæring på ca. 1 mm i gennemsnit.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at man til den inderlige blanding af det mikrobielle celleslam 30 og gelatinen sætter et stabiliseringsmiddel for enzymet, fortrinsvis valgt blandt magnesium- og koboltsalte.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2-4, kendete g net ved, at man sætter glutaraldehyd til det isvand, hvori spindedy- 35 sen er neddyppet.