DK149202B - Claudogene/interceptive ovulationsinducerende lrh-nonapeptidanaloge - Google Patents

Description

149202

Den foreliggende opfindelse angår claudogene-interceptive ovulationsinducerende LRH-nonapeptidanaloge til anvendelse .-som kontraceptiv og til bekæmpelse af uønskede populationer, især gnaverbestande.

Mange LRH-analoge er i den senere tid blevet fremstillet og afprøvet som midler til inducering af ovulation. Modificering af aminosyresekvensen i LRH har været mest fordelagtig med fjernelse af Gly^-gruppen og dannelse af Pro-NHC2Hg-endegruppen, hvorved der fås en forbindelse, der angives at være 3-5 gange så aktive som LRH selv, jvf. Fujino et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 49^ 863 (1972).

Det er senere blevet vist, at D-Ala^-LRH har kraftigere virkning end LRH, jvf. Monahan et al., Biochemistry 12 4616 (1973). Forskellige 2 149202 andre D-aminosyrer er blevet indsat i 6-stillingen i LRH og des--Gly10-Pro-NHC2Hg-LRH til dannelse af produkter med forbedrede egenskaber med hensyn til inducering af ovulation, jvf. beskrivelsen til US-patent nr. 3.914.412 og Vilchez-Martinez et al., 6

Biochem. Biophys. Res. Commun. 59 1226 (1974). Styrken af D-Ala , des-Gly^-LRH-ethylamid er angivet til at være ca. den dobbelte g af styrken af D-Ala -LRH med hensyn til stimulering af LH-sekre-tion, jvf. Coy et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 57 335 g (1974). Fremstillingen og den biologiske virkning af D-Ala , /v 7 (N -Me)Leu-LRH med hensyn til stimulering af sekretionen af LH, som er angivet at være 560% af styrken af LRH, hvilket placerer denne forbindelse i samme styrkeområde som D-Ala**-LRH, er beskrevet af Ling et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. £3 801 (1975).

Coy m.fl. rapporterer i Biochem Biophys Res. Commun.

g 67, 576 (1975) endvidere, at [D-Trp ]-LRF er 100 gange kraftigere i sin virkning end LRF selv, og at des-Gly"^-6 9 -[D-Trp -Pro -KHK^H^]-LRF er ca. 6 gange mindre aktivt end LRF selv ved frigivelse af LH in vitro.

Desuden rapporterer Rivier m.fl. i Peptides,

Proceedings fra 14. Europæiske peptidsymposium (april 1976), at den relative biologiske aktivitet for [D-Trp**]-LRF og for des-Gly10-[D-Trp6,Pro9-NHEt]-LRF er hhv. 36 og 144 gange aktiviteten af LRF selv. Rivier m.fl. noterer -uden iøvrigt at forklare de pågældende uoverensstemmelser - at de af dem rapporterede resultater ikke er i overensstemmelse med eller kan bekræftes af Coy m.fl. (side 433).

.På grundlag af nu foretagne in vivo claudogene/-interceptive undersøgelser antages det, at forskellen i de in vitro data, som er rapporteret af hhv. Coy m.fl. og Rivier m.fl., kan forklares ved, at [D-Trp°]-LRF-aktivi-teten ikke frembyder nogen lineær dosis-responssammenhæng.

g Véd lavere doser er [D-Trp ]-LRF således kraftigere i sin virkning end des-Gly·^-[D-Trp6,Pro9-NHEt]-LRF, og ved højere doser er den betydeligt mindre kraftig med hensyn til at inhibere graviditet eller drægtighed.

7 N-Methylering af Leu resulterer i en kraftigere virkende forbindelse, hvilket sandsynligvis skyldes, at der herved indføres stabilitet mod enzymatisk nedbrydning.

3 149202

Den særdeles nyttige virkning, som opnås med den her omhandlede forbindelse, består i en ovulationsinduk-tion, ved hjælp af hvilken man kan regulere et hunpattedyrs fertilitetsperiode, og i at forbindelsen ved anvendelse som claudogent/interceptivt middel kan benyttes til at afbryde en uønsket graviditet. Forbindelsen ifølge opfindelsen kan^ for såvidt angår dens virkningsevne groft sammenlignes med [D-Trp6]-LRF og des-Gly10-[D-Trp6,Pro9--NHC~Hc]-LRF som ovulationsinducerende middel, idet den

2 D

dog er mere effektiv end sidstnævnte ved lavere doseringer. Ved anvendelsen som claudogen, kan forbindelsen ifølge opfindelsen, for såvidt angår virkningsevne, sammenlig-

C

nes med [D-Trp ]-LRF, og den er ca. 10 gange så kraftigt virkende som des-Gly^- [D-Trp®,Pro^-NIK^H ]“LRF ved lavere doser, medens den ved højere doser har en kraft eller virkningsevne, som kan sammenlignes med sidstnævntes, og som er ca. 10 gange stærkere end førstnævntes. Som interceptivt middel er forbindelsen ifølge den foreliggende opfindelse nogenlunde lige så kraftigt virkende som [D-Trp6]-LRF, og den er ovenlegen i forhold til des-Gly ,Pro -NHC~Hc-ana-logen med hensyn til responseffekt som helhed.

I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse tilvejebringes en gruppe hidtil ukendte LRH-nonapeptidanaloge, der er ejendommelige ved, at de har formlen

L-p-Glu-L-His-L-Trp-L-Ser-L-Tyr-D-Trp-L-(N-me-thyl)Leu-L-Arg-L-Pro-NHCjH^ I

eller er ugiftige syreadditionssalte deraf. Disse forbindelser inducerer ovulation i dyr og er claudogene-interceptive midler, som er nyttige til at forebygge eller afbryde drægtighed hos pattedyr. I denne forbindelse virker forbindelserne som claudogene-interceptive midler, riår de indgives postcoitalt til et hunpattedyr efter ovulering, idet de afbryder de normale fysiologiske processer, som er nødvendige for implantation og/eller opretholdelse eller udvikling af et fertilt æg.

4 149202

Ved fremstillingen af det omhandlede nonapeptid benyttes en helt eller delvist beskyttet polypeptid-harpiks eller helt eller delvis beskyttede polypeptidethylamider med formlen p-Glu-His(R)-Trp-Ser(R1)-Tyr(R2)-D-Trp-L- -(N-methyl)Leu-Arg(R3)Pro-Z ^11^ hvor Z betyder OH i et acylerende derivat deraf, herunder en ester, f.eks. lavere alkylestere, benzylester eller ester med formlen -OCH2-[polystyrenharpiksbærer] eller -ΝΗ02Η^, R betyder hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for iminonitrogenet i histidyIdelen, og R3 betyder hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for guanylfuntionen i arginyl-delen, f.eks. tosyl, acetyl, benzoyl, tert.butyl, trityl, benzyl, benzyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl eller nitro. Tosylgruppen foretrækkes som beskyttelsesgruppe for både R og R . Imidlertid kan guanylgruppen i arginyIdelen være beskyttet via Nw - eller N"^--nitrogenatomerne ved hjælp af nitro- eller tosylbeskyttelsesgrup-perne og via N^ -nitrogenatomet eller et af Νω- eller N^-nitrogen- atomerne ved hjælp af benzyloxycarbonyl-, adamantyloxycarbonyl- el- 1 2 ler tritylgruppen. R og R er hver især hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for hydroxylgrupperne i serin og tyrosin. De hydroxy lbeskyttelsesgrupper, der konventionelt anvendes til dette formål, er acetyl, tosyl, benzoyl, tert.butyl, trityl, benzyl, benzyloxycarbonyl og 2,6-dichlorbenzyl, idet benzyl- og 2,6- -dichlorbenzylgrupper foretrækkes til dette formål, hvorhos mindst 12 3 en af grupperne R, R , R og R er forskellig fra hydrogen.

Fortrinsvis betyder R og R3 tosyl. Det foretrækkes, at R1 2 er benzyl, og R er 2,6-dichlorbenzyl.

Ved en fremgangsmåde til fremstilling af nonapeptidet med den ovenfor anførte formel I afbeskyttes et tilsvarende nonapeptid med formlen p-Glu-His(R) -Trp-Ser(R1)-Tyr(R2)-D-Trp-L-(N-methyl) Leu-Arg(R3)-Pro-NHEt II(a) 5 149202 12 3 hvor R, R , R og R har de ovenfor angivne betydninger. Afbeskyttelsen kan gennemføres på i og for sig kendt måde, fortrinsvis i enkelt trin under anvendelse af flydende hydrogenfluorid i nærværelse af anisol.

Det beskyttede peptid med formlen 11(a) kan fremstilles ved at acylere ethylamin med et passende beskyttet nonapeptid med formlen p-Glu-His(R)-Trp-Ser(R1)-Tyr(R2)-D-Trp-L--(N-methyl)Leu-Arg(R3)-Pro-Z1. II (b) 12 3 hvor R, R , R og R har de ovenfor angivne betydninger, og 7?~ betyder OH eller et funktionelt acyleringsderivat deraf.

Som eksempler på acyleringsderivater kan nævnes estere, f.eks. lavere alkyl- eller benzylestere eller en ester dannet med en harpiksbærer, i hvilke tilfælde Z^ betyder -OC^[polystyrenhar-piksbærer]. Acyleringen kan gennemføres på i og for sig kendt måde, f.eks. når Z1 er OH, ved anvendelse af et kondensationsmiddel såsom dicyclohexylcarbodiimid.

Forbindelserne med formlen 11(b), hvor Z1 betyder OH eller et acylerende funktionelt derivat deraf, kan fremstilles ved anvendelse af kendte fremgangsmåder til opbygning af en aminosyre-sekvens, jvf. standardlærebøger vedrørende peptidsyntese. Når der ønskes et nonapeptid, hvor Z^ er -OCH2[polystyrenharpiksbærer], kan denne forbindelse fremstilles ved hjælp af fastfasemetodik under anvendelse af teknik, som er almindelig kendt ved opbygning af en aminosyresekvens ud fra en harpiksbåret aminosyre. Den generelt anvendelige teknik er beskrevet af Merrified, J.A.C.S. 85, 2149 (1963).

Den anvendte harpiksbærer kan være en vilkårlig egnet harpiks, som konventionelt anvendes ved fastfasefremstillingen af polypeptider, fortrinsvis polystyren, som er blevet tværbundet med 0,5-3% divinylbenzen, som er blevet chlormethyleret til dannelse af steder for esterdannelse med den i starten introducerede, beskyttede aminosyre. Det aminobeskyttede prolin kan kobles til den chlormethylerede harpiks i overensstemmelse med fremgangsmå- 6 149202 den ifølge Gisin, Helv. Chim. Acta., 5j5, 1476 (1973). Efter koblingen af det aminobeskyttede prolin til harpiksbæreren kan amino-beskyttelsesgruppen fjernes ved standardmetoder under anvendelse af trifluoreddikesyre i methylenchlorid, trifluoreddikesyre alene eller HC1 i dioxan. Afb e skyttel sen kan gennemføres ved en temperatur mellem ca. 0°C og stuetemperatur. Efter fjernelse af a-minobeskyttelsesgruppen kobles de tilbageblevne a-aminobeskyttede og, om nødvendigt, sidekædebeskyttede aminosyrer i rækkefølge i den Ønskede orden til dannelse af produktet. Eventuelt kan flere aminosyregrupper kobles ved opløsningsmetoden inden kobling med den harpiksbårne aminosyresekvens. Udvælgelsen af et passende koblingsreagens er en rutine for fagfolk. Et særligt foretrukket koblingsreagens er Ν,Ν'-diisopropylcarbodiimid. Et andet almindeligt koblingsmiddel er Ν,Ν'-dicyclohexylcarbodiimid.

Hver beskyttet aminosyre eller aminosyresekvens sættes til fastfasereaktoren i et 2-6 dobbelt overskud, og koblingen gennemføres i et medium bestående af dimethylformamid: methylenchlorid eller i enten dimethylformamid eller methylenchlorid alene. I tilfælde, hvor der optræder ufuldstændig kobling, gentages koblingsproceduren inden fjernelse af α-aminobeskyttelsesgruppen, inden den næste aminosyre sættes til fastfasereaktoren. Resultatet af koblingsreaktionen i hvert trin af syntesen følges ved hjælp af nin-hydrinreaktionen som beskrevet af E. Kaiser et al., Analyt. Biochem. 34, 595 (1970).

Den nødvendige α-aminobeskyttelsesgruppe, som anvendes til hver aminosyre, der indføres i polypeptidet, er fortrinsvis tert.butyloxycarbonyl, men en vilkårlig anden beskyttelsesgruppe kan anvendes, når blot den ikke fjernes under koblingsbetingelser og let fjernes selektivt i forhold til de andre beskyttelsesgrupper i molekylet under betingelser, som ellers ikke påvirker det dannede molekyle. Yderligere eksempler på sådanne a-aminobeskyttelsesgrup-per, som kan vælges under hensyntagen til resten af polypeptidmo-lekylet, er trityl, phthalyl, tosyl, allyloxycarbonyl, cyclopen-tyloxycarbonyl, tert.amyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl pg p- eller p-nitrobenzyloxycarbonyl.

η 149202 3

Kriterierne for valg af beskyttelsesgrupper til R-R er (a) beskyttelsesgruppen skal være stabil overfor reagenset og under de reaktionsbetingelser, som vælges til fjernelse af a-amino-beskyttelsesgruppen i hvert af syntesetrinnene, (b) beskyttelsesgruppen skal bibeholde beskyttelsesegenskaberne, dvs. må ikke fraspaltes under koblingsbetingelser, og (c) beskyttelsesgruppen skal være let af fjerne efter afslutning af polypeptidsyntesen under betingelser, som ikke på anden måde påvirker polypeptidstrukturen.

De helt beskyttede, harpiksbårne nonapeptider har følgende aminosyresekvens: 1 2 p-Glu-His(R)-Trp-Ser(R )-Tyr(R )-D-Trp-L-(N-me- 3 , II(c) thyl)Leu-Arg(R )-Pro-0-CH2-[polystyrenharpiksbærer] hvor gruppen -0-CH2-Lpolystyrenharpiksbærer] repræsenterer esterdelen af én af de mange funktionelle grupper, som findes i polystyrenharpiksen .

De helt beskyttede nonapeptider adskilles fortrinsvis fra deres harpiksbærer ved behandling med ethylamin ved stuetemperatur, hvorefter alt overskud af ethylamin fjernes til dannelse af mellemproduktet.

p-Gly-His (R) -Trp-Ser (R1) -Tyr (R2) - D-Trp-L- (N-me- thyl)Leu-Arg(R3j-Pro-NHC2H5 II (a)

Fortrinsvis afbeskyttes ovennævnte helt beskyttede mellemprodukt med flydende hydrogenfluorid i nærværelse af anisol til dannelse af det omhandlede claudogene-interceptive nonapep-tid.

Eventuelt kan det harpiksbårne nonapeptid med formlen 11(c) spaltes ved transesterificering til dannelse af en ester, f.eks. en lavere alkyl- eller benzylester ved transesterificering med en lavere alkanol eller benzylalkohol i nærværelse af en base såsom triethylamin. Disse esterderivater med formlen 11(b) kan anvendes til fremstilling af mellemprodukterne med formlen 11(a) som beskrevet ovenfor.

Ved en anden fremgangsmåde til fremstilling af det beskyttede nonapeptid med formlen 11(a) kobles de fornødne aminosyrer, .. 8 149202 om nødvendigt passende beskyttede og/eller aktiverede, og ethyl-amin i vilkårlig rækkefølge til dannelse af den ønskede peptidsekvens .

Koblingen af aminosyrerne og ethylamin ved ovennævnte fremgangsmåde kan gennemføres under anvendelse af standardmetoder inden for peptidkemien. Sådanne metoder er beskrevet i litteraturen, f.eks. i standardlærebøger vedrørende peptidsyntese, jvf. f.eks. Schroder og Lubke, "The Peptides", Academic Press 1965 og Greenstein og Winitz, "Chemistry of the Amino Acids", Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., 1961. Et eksempel på en fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse med formlen 11(a) ud fra komponentaminosyrer og ethylamin er vist i nedenstående skema I. Standardforkortelser for aminosyrer, beskyttelsesgrupper og koblingsmidler er anvendt i skemaet, og angående deres betydning henvises f.eks. til ovennævnte værk af Schroder og Lubke, pp XIII-XXIX. Det i skemaet anvendte udtryk "azid" refererer til azidmetoden til kobling af aminosyrer.

Det første trin involvere således dannelsen af dipeptid p-Glu-His--OMe ved kondensation under anvendelse af DCC (dicyclohexylcarbo-diimid) af p-GluOH og His-OMe. Dipeptidet omsættes med hydrazin til dannelse af hydrazidet p-Glu-His-NHNH2, som kobles med HTrp-OBzl under anvendelse af azidmetoden til dannelse af tripeptidet p-Glu--His-Trp-OBzl. Ved kobling af yderligere peptidbestanddele dannes de N02-beskyttede peptid med formlen 11(a), som åfbeskyttes som vist i sluttrinnet til dannelse af en forbindelse med formlen I.

9 149202 cd

Η H H

+J +) +J JJ +J +J

H H W Μ Η H

a a a å a a a a o p P as Saza _________ ft w v a „ © * a a s~ A A A A 7// a n a n a n a a a, a a

M CM CM CM CM CM CM

O O O O O O O

aM Ό @ φ a ή ? a φ i n a d) Q S EQ rii h! 0 2 1 Φ __________ 2 2 S n a

CM

o a . m u a ' æ

Q T

2 m <N 0) a \ a cm &_?______t

........ "6 6 5 5 3P

Q 0 0 0 O _ mm m m a y

N

<

CM

a ma) <u ω a h a a a a a u ο ο o o a

18 >t T

E gH ----—4----------- ω a A! a «, © U Β Ω a --2------

<v I

CQ N N a u . . a

N N

S g ® ft p p p vj ___ ___________________ a

CM CM

a a a Φ (1) t 2 S B § a-?---------------------—--------------------- ffi

U CM

B f

0 a zcm S

1 o a n &_I_ < 10 149202

Syreadditionssaltene af det omhandlede nonapeptid fremstilles på i og for sig kendt måde ud fra enten uorganiske eller organiske syrer, der vides at give farmaceutisk acceptable, ugiftige additionsprodukter, f.eks. saltsyre, hydrogenbromidsyre, svovlsyre, phosphorsyre, maleinsyre, eddikesyre, citronsyre, benzoesyre, ravsyre, æblesyre og ascorbinsyre.

De omhandlede claudogene-interceptive midler bevirker ved indgift til et hunpattedyr postcoitalt i overensstemmelse med et dagligt skema på mindst ca. 3 mikrogram pr. dag pr. kg legemsvægt i en periode på mindst 3 dage fuldstændig forebyggelse af drægtighed eller graviditet.

Baseret på en række undersøgelser gennemført med forskellige dyremodeller antages det, at det omhandlede nonapeptid udviser en claudogen/interceptiv virkning via stimulering af den hypophysiale--ovariesteroidaxe.

Uanset de fysiologiske mekanismer, som fører til slutresultatet, er det omhandlede nonapeptid effektivt til at forebygge drægtighed eller graviditet hos hunpattedyr ved indgivelse efter coitus.

Det omhandlede nonapeptid er derfor anvendeligt som såkaldt "morning-after" antikonceptionsmiddel til forebyggelse eller afbrydelse af graviditet og drægtighed hos henholdsvis kvinder og hunpattedyr. I denne sammenhæng kan nonapeptidet anvendes som anti--formeringsmiddel til bekæmpelse af gnaverbestande uden anvendelse af gnaverudryddelsesmidler og deres eventuelle uønskede virkning på andre dyr i miljøet.

Med dyreforsøgene blev drægtighed undgået ved daglig indgift af et nonapeptid i perioden fra 1. til 7. dag efter coitus samt ved daglig indgift i perioden fra 7. til 12. dagen efter coitus. Såvel en claudogen (præ-implantation) som en interceptiv (post-implantation) type af interferens med drægtighed er således påvist.

Der anvendes følgende fremgangsmåde ved bedømmelsen af de omhandlede nonapeptiders antigraviditetsegenskaber:

Voksne hunrotter (Sprague-Dawley) med en legemsvægt på 350^30 g, som holdes på et 14:10 lysrmørke skema, anbringes i bure med forplantningsdygtige hanrotter om aftenen for proøstrus. Tilstedeværelsen af sæd i vagina den følgende morgen betragtes som 11 149202 den første dag i drægtighedsperioden. Det i de- følgende eksempler fremstillede nonapeptidethylamid indgives subkutant i majsolie 1. til 7. dagen eller 7. til 12. dagen i drægtighedsperioderi i en mængde så lav som lpg/rotte/dag. Halvdelen af den daglige dosis indgives kl. 9 hver dag og den anden halvdel kl. 15 hver dag. Dyrene, som er blevet behandlet på 1. til 7. dagen, underkastes obduktion den 14. dag. Dyrene, som er blevet behandlet fra 7. til 12. dag, obduceres den 18. dag i drægtighedsperioden. Virkningen af ethyl-amidet og dets effektive dosis godtgøres ved fraværelsen af uterusimplantationssæder og foetus. Tilstedeværelsen af mindst et normalt foetus betragtes som kriteriet for drægtighed. De omhandlede nona-peptiders claudogene-interceptive virkning påvises derved ved en daglig dosis så lav som ca. 3 mikrogram pr. kg legemsvægt, og behandlingen af 100% effektiv ved en dosis på 1 mikrogram pr. rotte pr. dag i en gruppe på 5 rotter i perioden fra 1. til 7. dag og 10 mikrogram i perioden fra 7. til 12. dag.

Til definition af de postcoitale drægtighedstilstande hos rotter som en forsøgsmodel anvendes følgende skema til definition af postcoitalt antikonceptionsvirkning, som til brug i denne sammenhæng skal omfatte så vel præ-(claudogen) og post-(interceptiv) im-plantationsantikonceptionsvirkning: 1. dag-sperma i vagina, 1. til 3. dag-ægtransport i æggeledere og befrugtning, 3. til 5. dag-forekomst af blastocyst i uterushulrummet, 5. til 7. dag-implantation i uterusvæggen, efter 7. dag-postimplantation.

Baseret på erkendelsen af virkning i forbindelse med præventionen af udvikling af drægtighed i rottemodellen og den kendsgerning, at den nuværende viden indicerer, at den hormonale situation i forbindelse med forplantningsprocessen til og med ovulering principielt er den samme hos alle hunkønshvirveldyr, f.eks. er menneskets forplantningsproces fysiologisk analog med rottens, fremkalder det omhandlede nonapeptid effektiv ingriben i udviklingen af blastocyt præ- og post-implantationen i uterus hos alle pattedyr, herunder mennesket.

I overensstemmelse hermed tilvejebringes således en måde til forebyggelse eller forhindring af drægtighed hos pattedyr, ved hvilken en forbindelse med formlen I, fortrinsvis 12 149202 L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D--tryptophyl-L-(N-methyl)leucyl-L-arginyl-L-prolylethylamid eller hydroohloridet, hydrobromidet, sulfatet, phosphatet, maleater, acetatet, citratet, benzoatet, succinatet, malatet, eller ascor-batet indgives postcoitalt til pattedyret i en daglig dosis omfattende mindst ca. 3 mikrogram pr. kg legemsvægt i en periode, der er tilstrækkelig til at afbryde drægtigheden. De omhandlede anti-graviditetsforbindelser virker på den måde, at de griber ind i drægtighedsmekanismen, enten ved en tidlig postcoital, præ-implantationsanti-konceptionsmekanisme eller ved en post-implantation interceptiv mekanisme. Den effektive daglige indgiftsekvens til kvinder er derfor fra 1. dagen for ovulation-befrugtning til ca. 6. dagen til frembringelse af et claudogent respons, eller fra 6. dagen til ca.

14. dagen post ovulerings-befrugtning til frembringelse af et in-terceptivt respons i graviditetsperioden. På baggrund af dosologien for forsøgsmodellen er dosis til kvinder ca. 1,5 mg pr. dag for en kvinde med en vægt på 50 kg. Til praktiske formål er den almindelige subkutane humane dosis ca. 50 pg/kg/dag eller 2,5 mg/kg legemsvægt for en claudogen virkning og ca. 500 pg/kg/dag eller 25 mg/50 kg/-dag for en interceptiv virkning.

Det omhandlede nonapeptid eller dets syreadditionssalte kan indgives i vilkårlig hensigtsmæssig form, oralt eller paren-teralt, med eller uden konventionelle farmaceutiske hjælpemidler. Endvidere kan der anvendes konventionelle additionsprodukter af nonapeptidet for at forlænge dets virkning, f.eks. protaminzink-eller aluminiumadditionsprodukterne, som fremstilles på konventionel måde. En foretrukken fremgangsmåde til afbrydelse af drægtighed omfatter oral eller parenteral indgift af nonapeptidet eller en saltform deraf til pattedyret, idet der følges et dagligt dosisskema, der begynder den 1. dag efter coitus og strækker sig til ca. den 8. dag efter implantation eller til ca. den 7. dag postcoitus.

Det omhandlede nonapeptids ovulationsinducerende egenska- 6 7 ber er bestemt under anvendelse af [D-Trp , (N-methylLeu ), des-Gly-NI^0, Pro-ethylamid]LRH på følgende måde:

Hunrotter (Sprague-Dawley) i den proøstrale periode injiceres intraperitonealt med en hypnotisk dosis nembutal (50 mg/kg) 13 U9202 kl 1330. Mellem kl 1340 og 1350 ingives rotterne forsøgsmaterialet via halsvenen. Den følgende morgen aflives dyrene, og æggelederne undersøges for æg under et dissektionsmikroskop. Resultatet af dette forsøg demonstrererovulationsinducerende virkning hos 100% af rotterne ved en dosis på 0,1 mg pr. rotte, hvilket skal sammenlignes med LRH, der kræver ca. 3 mg pr. rotte til op mod 100%'s ovulering r Tfi og [D-Ala , des-Gly-NH2 , proethylamid]LRH, som kræver ca. 1 mg pr. rotte for det samme respons. Med hensyn til ovulationsinduce-ring er den foretrukne forbindelse således ca. 10 gange så aktiv som de kendte nærmeste strukturanaloge.

I de følgende eksempler illustreres fremstillingen af p-Glu--His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-(N-methyl)Leu-Arg-Pro-NHC2H5,

Eksempel 1.

Fremstilling af tert.butyloxycarbonylprolinharpiks (fremgangsmåde ifølge Gisin, Helv. Chim. Acta, 56, 1476 [1973])_ 18,56 g (86,3 mmol) tert.butyloxycarbonylprolin i en blanding af 112 ml ethanol og 48 ml vand behandles med koncentreret vandig caesiumhydrogencarbonatopløsning, indtil opløsningen når en pH-værdi på 7. Reaktionsblandingen strippes, og tørres ved gentagen stripning under anvendelse af ethanol, ethanol-benzen og benzen (3 gange). Remanensen tørres over phosphorpentoxid i vakuum ved stuetemperatur natten over.

Det totale produkt omrøres natten over i 880 ml dimethyl-formamid ved 50°C under nitrogen med 80 g Bio-Beads®S.X. 1 Resin (sfærisk, porøs, styren-divinylbenzencopolymer med 2%'s tværbinding og med en chlormethyleret kapacitet 0,89 milliækvivalenter/ gram). Den filtrerede harpiks vaskes omhyggeligt 2 gange med di-methylformamid, 2 gange med dimethylformamid, 2 gange med methanol, 3 gange med chloroform og tørres over P205. Aminosyreanalyse indicerer en substitution på harpiksen på 0,56 milliækvivalenter/ gram.

149202 14

Eksempel 2.

L-Pyroglutamyl-Nim-tosyl-L-histidyl-L-tryptophyl-0-benzyl-L--sery1-0-(2,6-dichlorbenzyl)-L-tyrosyl-D-tryptophyl-N-methyl--L-leucyl-N^-tosyl-L-arginyl-L-prolyl-acylharpiksester_ 0,2,6-diClBzl N .Tos OBzl N^-Tosyl

I I

p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-N-Me-Leu-Arg-Pro-O-harpiks 4,725 g af den i eksempel 1 fremstillede tert.butyloxycar-bonylprolinharpiks anbringes i et peptidsyntetiseringsapparat af typen Beckman® 990 og behandles på følgende mådes 1. Vask med methanol.

2. Vask med methylenchlorid.

3. Vask med methanol (2 gange).

4. Vask med methylenchlorid (2 gange).

5. Forvask med 1:1 trifluoreddikesyre-methylenchlorid (rumfang/rumfang) indeholdende 0,5% dithioerythritol.

6. Afbeskyttelse med opløsningsmidlet fra trin 5 (2 gange hver på 15 minutter).

7. Vask med methylenchlorid.

8. Vask med dimethylformamid.

9. Vask med 12,5%'s triethylamin i dimethylformamid (rumfang/rumfang) i 10 minutter (2 gange).

10. Vask med dimethylformamid.

11. Vask med methylenchlorid (2 gange).

12. Vask med methanol (2 gange).

13. Vask med methylenchlorid (3 gange).

14. Peptidharpiksen røres forsigtigt med 9 mol af den ønskede tert.butyloxycarbonylaminosyre i ca. 30 ml af en 1:1 dimethylformamid-methylenchloridblanding (rumfang/rumfang).

15. 1M diisopropylcarboximid (DIC) i methylenchlorid (10 mmol) tilsættes i to portioner i løbet af 30 minutter.

16. Reaktionsblandingen omrøres i 7 timer.

I hvert trin anvendes en kontakttid på 1,5 minutter, med mindre andet er anført.

De ovenfor anførte trin gentages, indtil alle de ønskede aminosyrer er tilsat.

De følgende aminosyrerester indføres derpå efter hinanden: 15 149202 t-Boc-N^-tosyl-L-arginin (9 iranol), t-Boc-N-methyl-L-leucin (9 iranol), t-Boc-D-troptophan (9 mmol), derpå uden deblokering omsættes med en anden portion t-Boc-D-tryptophan (9 mmol). Derpå tilsættes under genoptagelse af den normale sekvens t-Boc-2,6-dichlor-benzyl-L~tyro-sin (9 mmol), t-Boc,0-benzyl-L-serin (9 mmol), t-Boc-L-tryptophan (9 mmol), t-Boc-im-tosyl-L-histidin (9 mmol) og L-2-pyrrolidon-5--carboxylsyre (9 mmol). Den vaskede peptidharpiks tørres i vakuum og vejer 8,422.

Eksempel 3.

L-pyroglutamyl-Nim-L-histidyl-L-tryptophyl-0-benzyl-L--seryl-O-(2,6-dichlorbenzyl)-L-tyrosyl-D-tryptophyl-N--methyl-L-leucyl-N^-tosyl-L-arginyl-prolinethylamid 8,44 g beskyttet peptid-harpiks fra eksempel 2 og 120 ml ethylamin omrøres natten over i en glastrykflaske. Ethylenamin fjernes under formindsket tryk, og remanensen vaskes med methanol-di-methylformamid (4 gange), methanol og methylenchlorid. De kombinerede filtrater inddampes i vakuum under 35°C, hvorved fås 3,277 g af den ønskede forbindelse.

Eksempel 4.

L-pyro<jlutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D- -tryptophyl-N-methyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolinethylamid

Det ifølge eksempel 3 fremstillede produkt behandles i vakuum med vandfri flydende hydrogenfluorid (120 ml) og anisol (35 ml) i 50 minutter ved 0°C. Hydrogenfluorid fjernes under formindsket tryk, hvorefter remanensen fordeles mellem diethylether og 10%'s vandig eddikesyre. Lyophilisering af syrelaget giver det rå ønskede produkt i en mængde på 2,404 g.

Eksempel 5.

Rensning og karakterisering af L-pyroglutamyl-L-histidyl--L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-tryptophyl-N-methyl-L-leucyl--L-arginyl-Xi-prolin-ethylamid_ 2,404 g af det i eksempel 4 fremstillede rå peptid iinindst mulig rumfang 0,2N eddikesyre sættes til en søjle af Bio GerT^ 16 149202 (et 2%'s tværbundet porøst polyacrylamid til gelfiltrering og lavet af acrylamid og N,N'-methylenbisacrylamid), som forinden er ækvilibreret med 0,2 N eddikesyre og derpå elueret med samme opløsningsmiddel. Fraktioner på 10 ml opsamles. Peptidmaterialet lokaliseres ved hjælp af Ehrlich spot test og UV analyse. Der fås en hovedfraktion, 34-50 (2,234 g). En anden Bio Gel P-2 søjle giver 1,928 g af det ønskede materiale. Dette materiale re-chromatograferes på en fordelingskolonne af "Sephadex G 25" ® fine (2,5 x 100 cm) fremstillet ved ækvilibrering med nedrefase og derpå øvrefase af BAW systemet (n-butanol: eddikesyre:vand = 4:1:5). Eluering med øvre fase giver fraktioner A 36-48 (820 mg) B 49-64 (633 mg). Fraktion A rechromatograferes under anvendelse af samme system, hvorved fås 295 mg af det ønskede peptid.

Rf-værdien for peptidet (30 pg tilsat) i tyndtlagschroma-tograferingssystemet (siliciumdioxidplader-Brinkman) n-butanol: eddikesyre: vand (4:1:5, øvre fase) Rf 0,21 n-butanol: eddikesyre: ethylacetat: vand (1:1:1:1) Rf 0,57.

Den optiske drejningsevne målt på et Carl Zeiss LEP A-2 o a fotoelektrisk præsisionspolarimeter [a]p = -80,91° (c-0,98, 1%'s eddikesyre).

Hydrolyse af peptidet i methansulfonsyre (0,2 ml/1 mg peptid) i 20 timer ved 110°C i et lukket evakueret system viser at alle de nødvendige aminosyre er tilstede.