DK149868B - Fremgangsmaade til fremstilling af 2-keto-l-gulonsyre eller salte deraf ved dyrkning af en 2-keto-l-gulonsyre-producerende mikroorganisme - Google Patents

Description

i 149868

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre eller et salt deraf ved dyrkning af en 2-keto-L-gulonsyre-producerende mikroorganisme i et vandigt næringsmedium i nærværelse 5 af 2,5-diketo-D-gluconsyre eller et salt deraf.

2-Keto-L-gulonsyre er et værdifuldt mellemprodukt ved fremstillingen af ascorbinsyre (vitamin C), der er et væsentligt vitamin for den menneskelige ernæring. Fremgangsmåder til omdannelse af 2-keto-L-gulonsyre til 10 ascorbinsyre, for eksempel ved opvarmning i nærværelse af en base, er velkendte på området.

Kun et begrænset antal mikroorganismer er på området kendt som værende effektive til reduktion af 2,5-di-keto-D-gluconsyre til dannelse af 2-keto-L-gulonsyre, 15 som vist for eksempel i US-patentskrifterne nr. 3.963.574, nr. 3.922.194 og nr. 3.959.076. Mikroorganismer af slægten Citrobacter er ikke tidligere beskrevet som værende effektive ved denne reaktion.

Ifølge den foreliggende opfindelse har det nu 20 vist sig, at der kan opnås overraskende gode udbytter af 2-keto-L-gulonsyre eller salte deraf ved som mikroorganisme af anvende Citrobacter freundii ATCC nr.

6750 eller en mutant deraf med væsentligt samme egenskaber som denne.

25 Forgæringen gennemføres fortrinsvis ved en temperatur på fra ca. 25° til ca. 35°C, navnlig ved fra ca. 25°C til 30°C, og ved et pH i området fra ca. 5,5 til 7,5. 2,5-Diketo-D-gluconsyresaltene er fortrinsvis - natrium-2,5-diketo-D-gluconat og calcium-2,5-diketo-D-30 gluconat.

Et antal Citrobacter-arter kendes, og stammer deraf er offentligt tilgængelige fra kultursamlinger, f.eks. the American Type Culture Collection. Som det ses i the American Culture Collection Catalogue (13. udgave) 35 var adskillige deponerede stammer af Citrobacter freundii tidligere blevet klassificeret som hørende til andre slægter eller arter, og Citrobacter freundii ATCC nr.

6750 er således også beskrevet som Citrobacter inter- 149868 2 medium og som Escherichia intermedium. Til det foreliggende formål er sådan tidligere klassificering afløst af identificeringen som Citrobacter freundii ATCC nr.

6750. De til den foreliggende fremgangsmåde anvendelige 5 mutanter af denne mikroorganisme kan være vundet ud fra denne ved hjælp af forskellige midler, såsom ved bestråling med røntgenstråler eller ultraviolet lys eller ved behandling med nitrogensenneper. Den 2-keto-L-gulonsyre-producerende evne hos en hvilken som 10 helst mikroorganismestamme i forbindelse med den foreliggende opfindelse kan let bestemmes ved at dyrke mikroorganismen i nærværelse af 2,5-diketo-D-gluconsyre eller et salt deraf i et vandigt næringsmedium i overensstemmelse med beskrivelsen og de anførte eksempler.

15 Citrobacter-stammen dyrkes i nærværelse af 2,5-di keto-D-gluconsyre eller et salt deraf i et vandigt næringsmedium indeholdende en carbonkilde, såsom glucose, sorbitol, fructose, sucrose eller glycerol.

Glucose, navnlig i form af glucosemonohydrat (cerelose), 20 er en foretrukken carbonkilde. Det skal forstås, at næringsmidlet, i overensstemmelse med sædvanlig forgæringspraksis, også vil indeholde kilder for nitrogen, kalium, phosphor og magnesium. Ved udtrykket vandigt næringsmedium skal i den foreliggende beskrivelse med krav forstås 25 et medium indeholdende de ovenfor beskrevne næringsmidler sammen med, om ønsket, hvilke som helst yderligere kilder for næringselementer. Carbonkilden vil i almindelighed være til stede i næringsmediet i en koncentration på fra ca. 0,5 til 15 gram pr.liter, fortrinsvis ca. 1-5 gram 30 pr.liter. Nitrogen kan på økonomisk måde tilvejebringes ved anvendelse af urinstof eller uorganiske nitrogenkilder, såsom ammoniumsulfat, ammoniumnitrat,eller ammoniumphosphat, hver i koncentrationer på fra -ca. 0,1 gram til 2 gram pr.liter af næringsmediet. Kali-35 um, magnesium og phosphor tilvejebringes let ved tilsætning af salte, såsom kaliumphosphat, ammoniumphosphat, eller magnesiumsulfat, sædvanligvis i .

mængder på fra ca. 0,1 gram til ca. 2 gram pr.liter for- 3 149368 gæringsmedium. Koncentrationen af de ovennævnte næringsmidler er ikke kritisk, og betydelig variation i sammensætningen af næringsmediet er mulig.

I overensstemmelse med sædvanlig forgæringspraksis 5 vil Citrobacter-stammen i almindelighed indledningsvis blive indført i et vandigt inokulummedium indeholdende næringsmidler, som beskrevet ovenfor, og gerne indeholdende yderligere næringsmidler, såsom gærekstrakt eller pepton. Mikroorganismen dyrkes derefter over en periode 10 på ca. 1-3 dage, fortrinsvis ved en temperatur på fra ca. 25°C til ca. 35“C, navnlig fra ca. 25“ til 30“C og ved et pH inden for området ca. 5-7,5.

Et egnet volumen, for eksempel ca. 1 til 10% (vol./ vol.) af det resulterende inokulummedium indeholdende 15 Citrobacter-stammen indføres derefter i det vandige næringsmedium, der anvendes ved reduktionen af 2,5-diketo-D-gluconsyre. 2,5-Diketo-D-gluconsyren kan være til stede i det vandige næringsmedium, når inokulum'et tilsættes, eller den kan fortrinsvis indføres efter en yderli-20 gere periode, for eksempel efter ca. 8-36 timers inkubation. 2,5-Diketo-D-gluconsyren kan tilsættes i form af den frie syre eller som et salt deraf, for eksempel som et alkalimetalsalt eller et jordalkalimetalsalt deraf.

Foretrukne salte er natrium- og calcium-2,5-diketo-D-25 gluconat. 2,5-Diketo-D-gluconsyren eller et salt deraf kan fremstilles ved forgæringsmetoder, der er velkendte på området, jf. for eksempel US-patentskrift nr. 3.790.444.

En aliquot af 2,5-diketo-D-gluconsyre-forgæringsvæsken kan sættes til den vandige næringsopløsning indeholdende 30 Citrobacter-stammen. Alternativt kan 2,5-diketo-D-glucon-syren eller saltet deraf isoleres fra forgæringsvæsken og sættes til det Citrobacter-holdige næringsmedium. 2,5-Diketo-D-gluconsyre-udgangsmaterialet tilsættes fortrinsvis som en aliquot af den 2,5-diketo-D-gluconsyre-holdige 149868 4 forgæringsvæske fremstillet ved aerob dyrkning af Aceto-bacter cerinus i et glucoseholdigt medium, som beskrevet i belgisk patentskrift nr. 872095. En sådan forgæringsvæske vil indeholde fra ca. 5 til ca. 20% (vægt/volumen) 5 af 2,5-diketo-D-gluconsyre, eller et salt deraf, og et tilstrækkeligt volumen væske skal sættes til Citrobacter-næringsmediet til at tilvejebringe en indledende koncentration af 2,5-diketo-D-gluconsyre eller et salt deraf på ca. 1,0-10% (vægt/volumen). Alternativt kan isoleret 10 2,5-diketo-D-gluconsyre eller et salt deraf tilsættes til tilvejebringelse af denne koncentration af 2,5-diketo-D-gluconsyre i Citrobacter-forgæringsmediet. Forgæringen af Citrobacter-stammen i det 2,5-diketo-D-gluconsyre-holdige næringsmedium foregår ved en temperatur på fra 15 ca. 25“C til ca. 35°C, fortrinsvis fra ca. 25°C til 30"C.

Under forgæringen bliver pH af mediet fortrinsvis holdt inden for området fra ca. 5,5 til 7,5 ved tilsætning af en syre eller base, som nødvendigt. Egnede syrer omfatter svovlsyre og phosphorsyre. Egnede baser omfatter alkali-20 metalhydroxider, fortrinsvis natriumhydroxid eller alkalimetal- eller jordalkalimetalcarbonat, såsom natrium-carbonat eller calciumcarbonat. Det skal forstås, at når sådanne salte sættes til næringsmediet med henblik på pH-styring, vil 2-keto-L-gulonsyren blive vundet i form af 25 det tilsvarende metalsalt, for eksempel natrium- eller calcium-saltet eller blandinger deraf. Under forgæringen vil blandingen blive omrørt, for eksempel med .en mekanisk omrører eller ved rystning af reaktionsbeholderen.

Om ønsket kan yderligere 2,5-diketo-D-gluconsyre 30 eller et salt deraf sættes til mediet under forløbet af forgæringen, efter at noget af den oprindelige 2,5-diketo-D-gluconsyre er forbrugt af Citrobacter freundii-or-ganismen, med henblik på at opnå højere koncentrationer af den ønskede 2-keto-L-gulonsyre eller salt deraf i re-35 aktionsmediet.

149868 5

Citrobacter freundii-mikroorganismen dyrkes, indtil omdannelse til 2-keto-L-gulonsyre er i det væsentlige fuldendt, for eksempel i løbet af fra ca. 36 til ca. 72 5 timer, alt efter den indledende koncentration af 2,5-diketo-D-gluconsyre, forgæringstemperaturen og andre betingelser, og vil tilvejebringe 2-keto-L-gulonsyre i et udbytte på ca. 30% baseret på 2,5-diketo-D-gluconsyre-udgangsmaterialet. Forgæringsreaktionens fremadskriden 10 kan følges ved bestemmelse af den koncentration af 2,5-diketo-D-gluconsyre, der er tilbage i reaktionsmediet, og koncentrationen af dannet 2-keto-L-gulonsyre ved anvendelse af på området velkendte analysemetoder omfattende papirchromatografi, tyndtlagschromatografi og 15 højtryksvæskechromatografi. Identiteten af produktet som 2-keto-L-gulonsyre kan derefter bekræftes ved isolering og karakterisering under anvendelse af sædvanlige metoder. Se for eksempel J.C.S.Chem.Comm. 1979, 740.

2-Keto-L-gulonsyre eller et salt deraf fremstillet 20 ved den ovenfor beskrevne forgæring kan isoleres og renses ved på området kendte midler. For eksempel kan forgæringsvæsken filtreres, og 2-keto-L-gulonsyren, eller dens natrium- eller calciumsalt, kan udfældes ved tilsætning af et ikke-opløsningsmiddel, såsom en lavere alkylalkohol, 25 navnlig methanol eller ethanol. Andre metoder til isolering, såsom fjernelse af opløsningsmidlet, f.eks. ved frysetørring, kan også anvendes.

Når forbindelsen isoleres i form af et salt, kan den frie 2-keto-L-gulonsyre vindes ved tilsætning af en 30 mineralsyre til en opløsning af saltet, for eksempel ved anvendelse af svovlsyre eller saltsyre, eller ved anvendelse af en kationbytterharpiks. Når 2-keto-L-gulonsyren isoleres som den frie syre, kan de tilsvarende salte let fremstilles ved sædvanlige midler, såsom ved omsætning 35 med et passende alkalimetalhydroxid eller -carbonat eller et jordalkalimetalcarbonat.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen beskrives nærmere gennem følgende eksempler.

149868 6

Eksempel 1

Det følgende inokulummedium med en pH-værdi på 7,0 blev fremstillet: 5 Sorbitol 3 g/1 Gærekstrakt 2 g/1

Pepton 2 g/1 KH2P04 1 g/1

MgS04,7H20 0,2 g/1 lø En kolbe på 300 ml indeholdende 100 ml af dette inokulummedium blev inokuleret med celler af Citrobacter freundii ATCC nr. 6750 fra en næringsagar-skråkultur (1 ml af en 10 ml steril vandig suspension). Cellerne blev dyrket i 24 timer ved en temperatur på 28°C, mens kolben 15 befandt sig på en roterryster. Af det følgende forgæringsmedium:

Cerelose 2 g/1 (NH4)2HP04 1 g/1 KH2P04 1 g/1 20 MgS04,7H20 0,5 g/1

Roemelasse 2 g/1

Glycin 0,2 g/1 med et pH på 6,7 blev 100 ml anbragt i en kolbe på 300 ml og inokuleret med 5 volumenprocent af den ovenfor be-25 skrevne 24 timers inokulumkultur og rystet i 22 timer på en roterryster, på hvilket tidspunkt pH var ca. 5. 15 ml Forgæringsvæske indeholdende 15-20% (vægt/volumen) natri-um-2,5-diketo-D-gluconat og fremstillet ved forgæring af Acetobacter cerinus stamme IFO 3263 i et glucoseholdigt 30 medium ved 28°C i 50 timer blev sat til Citrobacter freundii-kulturen, og pH blev indstillet på 6,5 ved tilsætning af natriumhydroxyd. Forgæringen blev fortsat ved 28°C, idet pH blev justeret til 6,5 hver 24 timer. Efter 52 timer var 2,5-diketogluconatet i det væsentlige for-35 brugt, hvorved vandtes natrium-2-keto-L-gulonat i et udbytte på ca. 30%, baseret på 2,5-diketo-D-gluconat-ud-gangsmaterialet.