DK150202B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af farmaceutisk acceptable syreadditionssalte af 1-n-ethylsisomicin - Google Patents

Description

i 150202

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte farmaceutisk acceptable syreadditionssalte af 1-N-ethylsiso-micin, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at 5 forbindelsen med formlen Is py®2 Mj q__j£r

2 H

HOJ-O 0 M?HCHp/|_ omsættes med en syre, og at det således vundne syreadditionssalt isoleres.

I stamansøgningen, dansk patentansøgning nr.

20 4124/74, er omhandlet en analogifremgangsmåde til fremstilling af en række 1-N-substituerede derivater af 4,6-di-(aminoglycosyl)-l,3-diaminocyclitoler eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf, herunder også derivater af sisomicin. Den i stamansøg-25 ningens beskrivelse dokumenterede uventede, nyttige antibiotiske aktivitet af de fremstillede forbindelser er den samme for henholdsvis de frie baser og deres syreadditionssalte, idet den antibiotiske aktivitet skyldes basedelen.

30 Den foreliggende opfindelse er baseret på den erkendelse, at syreadditionssaltene af 1-N-ethylsiso-micin er meget let fremstillelige i ren krystallinsk form, og at de er meget opløselige i vand ved det pH-område, der normalt benyttes til injicerbare anti-35 biotica, nemlig pH 4-7. Disse egenskaber ved syreadditionssaltene af 1-N-ethylsisomicin gør disse salte særligt velegnede at benytte i praksis.

150202 2

Det har ved den omhandlede fremgangsmåde navnlig vist sig hensigtsmæssigt, at forbindelsen med formlen I omsættes med svovlsyre.

Saltene fremstilles ved i og for sig kendte fremgangsmåder, såsom ved at neutralisere den fri base 5 med den pågældende syre sædvanligvis til ca. pH 5. Egnede syrer til dette formål omfatter sådanne syrer som saltsyre, svovlsyre, phosphorsyre, salpetersyre, hydrogen-bromidsyre, eddikesyre, propionsyre, maleinsyre, ascor-binsyre og citronsyre. Fysisk karakteriseres syreaddi-10 tionssaltene af 1-N-ethylsisomicin som hvide faste stoffer, der er opløselige i vand, sparsomt opløselige i de fleste polære opløsningsmidler og uopløselige i ikke-po-lære opløsningsmidler.

Forbindelserne er, som dokumenteret i stamansøg-15 ningens beskrivelse, bredspektrede antibakterielle midler, der fordelagtigt udviser aktivitet over for mange organismer, navnlig gram-negative organismer. Aktiviteten af forbindelserne over for gram-negative bakterier gør forbindelserne nyttige til bekæmpelse af infektioner 20 forårsaget af gram-negative organismer, f.eks. arter af Proteus og Pseudomonas. De har veterinære anvendelser, navnlig ved behandling af mastitis hos kvæg og Salmonella-induceret diarré hos husdyr, såsom hunde og katte.

25 Udgangsmaterialet for fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan fremstilles ved i og for sig kendte fremgangsmåder ud fra sisomicin eller ved fermentering af stammen Micromonospora inyoensis 1550F-1G, hvoraf en kultur er deponeret hos U.S. Department of Agricul-30 ture, Northern Utilization Research and Development

Division, Peoria, Illinois, under betegnelsen NRRL 5742.

1-N-Ethylering af sisomicin gennemføres fortrinsvis ved omsætning med acetaldehyd i nærværelse af et reduktionsmiddel.

35 Dyrkning af NRRL 5742 skal foregå i nærværelse af l-N-ethyl-2-deoxy-D-streptamin.

3 150202

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen beskrives nærmere gennem følgende eksempel.

Eksempel 5 l-N-Ethylsisomicinsulfat.

A, l-N-Ethylsisomicin a) 1-N-Ethylering af sisomicin.

Til en opløsning af 5 g sisomicin i 250 ml vand blev der sat IN svovlsyre, indtil opløsningens pH-værdi 10 var indstillet på ca. 5. Til den derved dannede opløsning af sisomicin-svovlsyreadditionssalt blev der sat 2 ral acetaldehyd, og der blev omrørt i 10 minutter, hvorefter der blev tilsat 0,85 g natriumcyanoborhydrid. Omrøring blev fortsat ved stuetemperatur i 15 minutter, 15 hvorefter opløsningen blev koncentreret i vakuum til et volumen på ca. 100 ml, og opløsningen blev derefter behandlet med en basisk ionbytterharpiks (f.eks. "Amber-lite"® IRA 401S (Oh")), hvorefter der blev lyofiliseret til en rest omfattende 1-N-ethylsisomicin.

20 Der blev renset ved chromatografering på 200 g silicagel, idet der blev elueret med den nedre fase af et chloroformtmethanol:7% vandig ammoniumhydroxid (2:1: 1)-system. De ensartede eluater, bestemt ved tyndtlags-chromatografi, blev samlet, og de samlede eluater af 25 hovedkomponenten blev koncentreret i vakuum til en rest omfattende 1-N-ethylsisomicin (udbytte 1,25 g). Der blev renset yderligere ved igen at chromatografere på 100 g silicagel, idet der blev elueret med et chloroform: methanol: 3, 5% ammoniumhydroxid (1:2:1)-system. De 30 samlede ensartede eluater (bestemt ved tyndtlagschroma-tografi) blev ledt gennem en søjle af basisk ionbytterharpiks, og eluatet blev lyofiliseret, hvorved vandtes 1-N-ethylsisomicin (udbytte 0,54 g).

[a]36 + 164° (0,3%, H20), PMR (ppm) (D20):6 1,05 (3H, t, 35 J=7HZ, -CH2CH3), 1,19 (3H, S, -C-CH-j) , 2,5 (3H, s, N-CH3), 4,85 (IH, m, =CH-), 4,95 (IH, d, J=4Hz, H^') , 4 150202 5,33’(IH, d, J=2,5 Hz, H,').

^ +

Massespektrum: (M + 1) m/e 476, også m/e 127, 154, 160, 173, 191, 201, 219, 256, 299, 317, 332, 345, 350, 360, 378, 390, 5 400.

b) Fremstilling af 1-N-ethylsisomicin ved forgæring.

(i); Fremstilling af inokulum af Micromonospora inyoensis stamme 1550F-1G.

10 Spiringstrin 1:

Under aseptiske betingelser blev en lyofiliseret kultur (eller celler vundet fra en skråkultur) af Micromonospora inyoensis stamme 1550F-1G sat til en 300 ml-rystekolbe indeholdende 100 ml af følgende sterile me-15 dium: Kødekstrakt 3 g

Tryptose 5 g Gærekstrakt 5 g

Dextrose 1 g 20 Stivele 24 g

Calciumcarbonat 2 g

Vandværksvand 1000 ml

Kolben og dens indhold blev inkuberet i 2-5 dage ved 35°C på en roterryster (280 rpm, udsving 5 cm).

25 Spiringstrin 2:

Af forgasringsmediet fra spiringstrin 1 blev 25ml aseptisk overført til en 2 liter-rystekolbe indeholdende 500 ml af ovennævnte sterile spiringsmedium. Kolben og dens indhold blev inkuberet i 3 dage ved 28°C på en 30 roterryster (280 rpm, udsving 5 cm).

Forgæringstrin:

Af det ved spiringstrin 2 vundne inokulum blev 500 ml aseptisk overført til en 14 liters forgæringstank indeholdende 9,5 liter af følgende sterile medium: 35 Dextrin 50 g

Dextrose 5 g

Sojabønnemel 35 g 5 150202

Calciuxncarbonat 7 g

Cobaltchlorid 10 molær

Vandværksvand 1000 ml

Antiskummemiddel 5 (GE 60) 10 ml (ii) : Forud for sterilisering af det i trin (i) beskrev ne medium blev pH indstillet på 8, og der blev tilsat en vandig opløsning indeholdende 8,0 g l-N-ethyl-2-deoxy-D-streptamin. Indholdet blev forgæret under aerobe betin-10 gelser i 48-240 timer under omrøring ved 250 rpm, med en lufttilførsel på 4,5 liter pr. minut og ved 2,5 at. Forgæringsmediets pH-værdi ændredes en lille smule under antibiotikum-produktionen, idet den varierede inden for området fra ca. 6,8 til ca. 7,3.

15 Antibiotikum-produktionen fulgtes ved anvendelse af prøvemetoden beskrevet i J. Antibiotics (Japan) Vol.

XXIII, og da spidsproduktion var nået, blev produktet indhøstet (forgæringen er sædvanligvis fuldendt i løbet af ca. 7 dage).

20 (iii) ·* Isolering af 1-N-ethylsisomicin.

Til hele væsken fra trin (II) blev der under omrøring sat 7,0 g oxalsyre. Væsken blev syrnet til pH 2,0 under anvendelse af 6N svovlsyre. Blandingen blev omrørt i ca. 15 minutter og filtreret under anvendelse af et 25 egnet filterhjælpestof. Filtratet blev neutraliseret (pH 7,0) med 6N ammoniumhydroxid. Filtratet blev ledt gennem en 1,0 liters kationbytterharpikssøjle i ammonium-formen (f.eks. "Amberlite"®IRC-50, Rohm og Haas, Philadelphia, Pa.). Den forbrugte væske blev bortkastet, 30 og søjlen blev elueret med 2N ammoniumhydroxid, idet der • blev opsamlet fraktioner på ca. 100 ml. Søjleeluatet fulgtes ved at pladeprøve hver fraktion over for Staphyl· ococcus aureus ATCC 6538P. De aktive fraktioner blev samlet og inddampet til ca. 100 ml i vakuum, hvorefter 35 der blev lyofiliseret til opnåelse af et fast produkt.

Produktet blev tritureret flere gange med varm methanol, filtreret, og filtratet blev inddampet til en rest. Pro- 6 150202 duktet blev chromatograferet på silicagel (25 g) under anvendelse af den nedre fase af et chloroformsmethanol: koncentreret ammoniumhydroxid (1:1:1)-system som elue-ringsmiddel. Fraktionerne indeholdende antibiotisk akti-5 vitet blev samlet og inddampet, hvorved vandtes 1-N-ethylsisomicin.

B. 1-N-Ethylsisomicinsulfat 5,0 g 1-N-Ethylsisomicin blev opløst i 25 ml 10 vand, og pH af opløsningen blev indstillet på 4,5 med IN svovlsyre. Der blev hældt i ca. 300 ml methanol under kraftig omrøring, og omrøring blev fortsat i ca.

10-20 minutter, hvorefter der blev filtreret. Bundfaldet blev vasket med methanol og tørret ved ca. 60°C i 15- vakuum, hvorved vandtes 1-N-ethylsisomicinsulfat.

NMR-Spektrum for 1-N-ethylsisomicinsulfat, 20%'s opløsning (vægt/vol.) i denteriumoxid med natrium-2,2-dimethyl-2-sila-pentan-5-sulfonat som indre reference, 2 0°C.

20 Proton Kemisk forskydning Intensitet Multipli-__S (PPm)_ citet 1-NHCH CH 1,33 3H triplet, J = 7Hz 4"-CH3 1,35 3H singlet 25 2,3 1,67-2,83 4H multiplet ter 3"-NHCH3 2,93 3H singlet 1—NHCH„CH_ 3,18 2H kvartet, J = 7Hz 3" 3,45 IH dublet, J = 11Hz 30 5 "-axial 3,47 IH dublet, 7 = 12Hz 2" 4,26 IH dublet af dubletter J=4Hz, J=10Hz 3" 5,20 IH dublet, J = 4Hz 35 4' 5,25 IH multiplet 1' 5,67 IH dublet, J = 1,5Hz HDO 4,78