DK151919B

DK151919B - Fremgangsmaade, referencevaeske og referencevaeskesystem til samtidig kalibrering og/eller kvalitetskontrol af calciumfoelsomme elektroder og ph-elektroder

Info

Publication number: DK151919B
Application number: DK274779AA
Authority: DK
Inventors: Torben Falch Christiansen
Original assignee: Radiometer As
Priority date: 1979-06-28
Filing date: 1979-06-28
Publication date: 1988-01-11
Also published as: DE3024044A1; JPS632345B2; DE3024044C2; DK151919C; US4363633A; US4935373A; DK274779A; JPS5635052A

Description

i

DK 151919 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde, en referencevæske og et referencevæskesystem til kalibrering og/eller kvalitetskontrol af instrumenter, der er beregnet til bestemmelse af indholdet af calciumioner i væskeprøver. Opfindelsen angår også en fremgangs-5 måde til kalibrering og/eller kvalitetskontrol af sådanne instrumenter, ved hvilken fremgangsmåde en sådan referencevæske anvendes.

I nærværende beskrivelse og krav betegner "kvalitetskontrol" overvågningen af analysemetoders præcision og nøjagtighed.

Det er kendt, at aktiviteten eller koncentrationen af calciumioner i 10 biologiske væsker er af kritisk betydning for mange vigtige biologiske processer. Indholdet af calciumioner i serum eller plasma er af særlig interesse, da det spiller en vigtig rolle i den samlede calciummetabolisme. I de senere år er der fremkommet calciumfølsomme elektroder, som muliggør en nøjagtig og relativt simpel bestemmelse af calcium-15 ioner.

Det er kendt, at indholdet af calciumioner i serum er pH-afhængigt, hvilket især skyldes, at calciums binding til serumproteiner er pH-afhængig. Det er derfor af betydning at bestemme en serumprøves pH-værdi sammen med dens calciumionaktivitet, enten for at opgive 20 det målte sæt af calciumionaktivitet og pH-værdi eller for at foretage en omregning af calciumionaktiviteten til den calciumionaktivitet, der ville findes i prøven ved en forudbestemt "normal" pH-værdi, f.eks. pH 7,40. Relationen mellem calciumioner og pH er f.eks. behandlet af Moore i "The Journal of Clinical Investigation", volume 19, 1970, side 25 318 - 334, og i USA patentskrift 3.941.565. De mest hensigtsmæssige instrumenter til bestemmelse af calciumioner i biologiske væsker er derfor sådanne, som på den væskeprøve, hvis indhold af calciumioner skal bestemmes, måler både med en calciumfølsom elektrode og en pH-elektrode.

30 Ligesom andre elektrokemiske måleelektroder skal calcium- og pH-elek-troden i sådanne instrumenter til bestemmelse af calciumionaktivitet med jævne mellemrum kalibreres mod reference væsker, der udviser kendte nøjagtige værdier for den størrelse, der skal bestemmes med

DK 151919B

2 den pågældende elektrode. Ved den praktiske anvendelse af de pågældende instrumenter vil man til denne kalibrering foretrække at anvende kommercielle reference væsker, der er således fremstillet og emballeret, at de er langtidsstabile under bibeholdelse af deres fra 5 fabrikanten deklarerede data, og som er emballeret i hensigtsmæssige enhedsdosispakninger, fra hvilke de let kan overføres til det instrument, der skal kalibreres. Til kalibrering af pH-elektroder har det i mange år været kendt at anvende phosphatpufferopløsninger emballeret i glasampuller. Phosphatpuffere er imidlertid ubrugelige til an-10 vendelse i instrumenter indeholdende calciumfølsomme elektroder, da en forurening af en calciumfølsom elektrode med phosphat ville forstyrre elektrodens funktion. Til kalibrering af calciumfølsomme elektroder kendes f.eks. kommercielle referenceopløsninger, som indeholder 150 mmol NaCI/liter og henholdsvis 1,00 og 2,00 mmol CaC^/liter.

15 Da en kalibrering af en elektrode sædvanligvis involverer udmåling af elektroden mod to forskellige referencevæsker med hver sit niveau for den størrelse, der skal måles, omfatter kalibreringen af de ovennævnte instrumenter til bestemmelse af calciumionaktivitet og pH anvendelsen af fire forskellige reference væsker, to for calcium og to for pH.

20 Det vil være en stor betjeningsmæssig fordel at kunne kalibrere den calciumfølsomme elektrode og pH-elektroden samtidigt på samme referenceopløsning, så at kalibreringen af instrumentets to elektroder kunne foretages på én og samme type referencevæske med to forskellige niveauer for calciumaktivitet og pH-værdi. En sådan kombineret 25 referencevæske til samtidig kalibrering af calciumelektroder og pH- elektroder skal imidlertid opfylde en lang række krav, der til dels måtte forekomme indbyrdes uforenelige:

For at kunne anvendes til kalibrering af pH-elektroden skal den calciumionholdige referencevæske indeholde et pH-puffersystem, men 30 dette pH-puffersystem må ikke interferere med calciummålingen.

pH-puffersystemets bestanddele må således ikke være opløseligt i de calciumfølsomme elektroders calciummembran, det må ikke fælde calciumioner, og dets binding af calciumioner skal være stabil under de i praksis forekommende opbevarings- og anvendelsesbetingelser. End-35 videre er det af betydning, at liquid junction-potentialet mellem

DK 151919 B

3 pH-puffersystemet og en stærk KCI-opløsning, der anvendes som elektrolyt i referenceelektrodesystemet, er reproducerbart og helst det samme som i serum. De pH-puffere, der kendes til anvendelse i kommercielle langtidsstabile referencevæsker, opfylder ikke disse 5 krav. pH-pufferen bør endvidere kunne tåle autoklavering (opvarmning til 121°C).

Når reference væsken skal anvendes til at bestemme pH-værdi i fysiologiske væsker såsom serum/plasma, skal dens pH-værdi ved 37°C optimalt ligge ved ca. 7,4, hvilket er den normale pH-værdi i serum/-10 plasma, og ved ca. 6,8, jfr. næste afsnit, og pH-puffersystemet må vælges under hensyntagen hertil.

(Den fra 7,4 forskellige pH-værdi kunne vælges høj, f.eks. pH-værdi 8, men dette ville ikke være i overensstemmelse med de eksisterende pH-standarder til måling af pH-værdi i serum/plasma, og samtidig 15 ville en sådan reference væske have en for stor affinitet til CC^, hvilket ville føre til dannelse af carbonationer, med hvilke calciumioner kan fældes som calciumcarbonat, hvilket naturligvis er uønsket i en reference væske til bestemmelse af calcium).

Endelig skal pH-pufferen i referencevæsken have tilstrækkelig stor 20 pufferkapacitet.

Det har nu ifølge opfindelsen vist sig, at en bestemt type pH-puffe-re, nemlig puffere, der består af en alkansulfonsyre med 2-3 car-bonatomer i alkandelen og med en nitrogenholdig basisk gruppe knyttet til alkandelen via et nitrogenatom i gruppen og denne syres salt, 25 hvor en pK-værdi for syren ligger i området 6,6 - 7,6 ved 37°C, glimrende opfylder samtlige de ovennævnte betingelser, og at calcium-ionholdige referencevæsker med bestemt pufferkapacitet og ionstyrke indeholdende disse puffere derfor udviser særdeles fordelagtige egenskaber.

30 Opfindelsen angår således en reference væske til kalibrering og/eller kvalitetskontrol af både den calciumfølsomme elektrode og pH-elektro-den i instrumenter, der er beregnet til bestemmelse af indholdet af

DK 151919 B

4 calciumioner og pH i biologiske væsker, hvilken referencevæske ved en bestemt temperatur har en nærmere bestemt calciumionaktivitet og en nærmere bestemt pH-værdi, og denne reference væske er ejendommelig ved, at dens nærmere bestemte pH-værdier er tilvejebragt med 5 en pH-puffer, der består af en alkansulfonsyre med 2-3 carbonato-mer i alkandelen og med en nitrogenholdig basisk gruppe knyttet til alkandelen via et nitrogenatom i gruppen og denne syres salt, idet syren har en pK-værdi i området 6,6 - 7,6 ved 37°C, og at referencevæskens pufferkapacitet ligger i området 0,04 - 0,10, fortrinsvis i 10 området 0,05 - 0,08, og at referencevæsken har en ionstyrke på 0,15 - 0,17.

pH-Puffersystemer bestående af en nitrogenholdig organisk sulfonsyre og denne syres salt er en kendt klasse af puffersystemer, der er beskrevet f.eks. i Biochem., 5, (1966), 467 og Analytical Chemistry, 15 50, (1978) 1922. Velegnede eksempler på sådanne syrer, der er alkansulfonsyrer med nitrogenholdige basiske grupper knyttet til alkandelen, som specielt er ethan eller propan (med andre ord, alkandelen indeholder især 2-3 carbonatomer), via et nitrogenatom i de nitrogenholdige basiske grupper, er 3-(N-morpholino)propansulfonsyre 20 (MOPS), pK-værdi 7,18 ved 25°C, piperazin-N,N'-bis(2-ethansulfon-syre) (PIPES), pK-værdi 6,8 ved 20°C, N-(2-acetamido)-2-aminoethan-sulfonsyre (ACES), pK-værdi 6,9 ved 20°C, N,N-bis(2-hydroxyeth-yl)-2-aminoethansulfonsyre (BES), pK-værdi 7,15 ved 20°C, N-TRIS-(hydroxymethyl)methy[-2-aminoethansulfonsyre (TES), pK-værdi 7,5 25 ved 20°C, og N-2-hydroxyethyIpiperazin-N-2-ethansulfonsyre (HEPES), pK-værdi 7,55 ved 20°C.

Referencevæsken ifølge opfindelsen sammensættes normalt til optimal anvendelse ved den temperatur, der er den normale arbejdstemperatur for de. instrumenter til bestemmelse af calciumionaktivitet, der skal 30 kalibreres eller underkastes kvalitetskontrol under anvendelse af referencevæsken, dvs. den temperatur, til hvilken instrumentet termostaterer de i instrumentet indførte prøver, f.eks. 37°C eller 25°C, og referencevæskens ionstyrke svarer til ionstyrken af en isotonisk saltopløsning, dvs. 0,15 - 0,17. Ved 37°C og en ionstyrke

DK 151919 B

5 på 0,15 falder de ovennævnte pK-værdier med 0,25 - 0,35. Som eksempler kan nævnes, at BES, som ved 37°C og en ionstyrke på 0,15 har en pK-værdi på 6,9, er velegnet til at fremstille en pH-puffer med pH-værdi 6,8 (HBES:BES = 1,25:1), TES, som ved 37°C og 5 ionstyrke 0,15 har en pK-værdi på 7,22, er velegnet til at fremstille en pH-puffer med pH-værdi 7,4 (HTES:TES = 1:1,5), og HEPES, som ved 37°C og en ionstyrke på 0,15 har en pK-værdi på 7,34, er velegnet til at fremstille en pH-puffer med pH-værdi 7,4 (HHEPES: HEPES = 1:1,15).

10 En hensigtsmæssig angivelse af de koncentrationer af puffer, der anvendes i referencevæsken ifølge opfindelsen, er en angivelse af den pufferkapacitet, der skal tilstræbes i systemet. Denne ligger ifølge opfindelsen i området 0,05 - 0,08. Således er pufferkapaciteten {5 for TES/HTES i en anion koncentration på 0,05 mol/liter, svarende til en 15 total pufferkoncentration på 0,125 mol/liter, 0,0695, for BES/HBES med en pufferanionkoncentration på 0,05 mol/liter, svarende til en puffertotal koncentration på 0,1125 mol/liter, 0,0695, og for HEPES/-HHEPES i en pufferanionkoncentration på 0,05 mol/liter, svarende til en puffertotal koncentration på 0,1075 mol/liter, 0,0617. Den tilsva-20 rende kation er fortrinsvis natriumionen.

Pufferkapaciteten β er i denne sammenhæng beregnet ud fra formlen β =2,303 x c x (K x 10'pH) : (K - 10"pH)2, 3 3 hvor c = puffersystemets total koncentration, og K = puffersystemets 3 sy redissociations konstant.

25 Referencevæsken ifølge opfindelsen kan med hensyn til sit calciumindhold hensigtsmæssigt være en overvejende opløsning af frie calciumioner, f.eks. tilvejebragt ved tilsætning af et opløseligt calciumsalt såsom CaC^· En anden mulighed er at anvende en calcium-puffer.

Hvis der anvendes en calcium-puffer, skal ligandens egenskaber være 30 veldokumenterede og opfylde de samme betingelser som er nævnt ovenfor for pH-puffere. Den konditionelle bindingskonstant for cal-ciumioner skal ligge i området 10 - 10 mol x liter ved pH-værdi 7, og f.eks. opfylder nitrilotrieddikesyre (NTA) og citrat disse betingelser.

DK 151919B

6

Et hensigtsmæssigt referencevæskesystem ifølge opfindelsen består f.eks. af en referencevæske, der er 2,5 mmolær med hensyn til calciumioner og har en pH-værdi på ca. 6,8, og en referencevæske, der er ca. 1,25 mmolær med hensyn til calciumioner, og som har en 5 pH-værdi på ca. 7,4. lonstyrken for de to referencevæsker i systemet bør være den samme og er hensigtsmæssigt enten 0,150 ved 25°C eller 0,160 ved 25°C. I litteraturen (f.eks. J. H. Ladenson and G. N. Bowen, Clin. Chem., 19, (1973), 565 og B. Seamonds et. al., Clin. Chem., 18, (1972), I55) har ionstyrken for de standarder, der har 10 været anvendt i forbindelse med måling af calciumioner, ligget omkring 0,150, men i dag er der tendenser til, at standarder til elektrokemisk måling af elektrolyter i serum skal baseres på en ionstyrke på 0,160 (jvf. f.eks. M. S. Mohan and R. G. Bates, NBS Special Publication July 1975, p. 293 og H. D. Schwartz, Clin. Chem. Acta, 15 64, (1975), 227). Siggaard-Andersen (The Acid-Base Status of the

Blood, Munksgaard, Copenhagen 1974, p. 37) angiver ionstyrken i serum til 0,17. Den ønskede ionstyrke i referencevæsken ifølge opfindelsen tilvejebringes hensigtsmæssigt ved tilsætning af NaCI.

De primære standarder, mod hvilke referencevæsken ifølge opfindelsen 20 udmåles i fabrikationsleddet, er standarder for henholdsvis calcium og pH, der er fastlagt med henblik på opnåelsen af den størst mulige nøjagtighed og reproducerbarhed. Hensigtsmæssige primære calciumstandarder kan baseres på calciumcarbonat som referencemateriale, da calciumcarbonat kan fås som et meget rent stof og konventionelt er 25 primært referencemateriale for bestemmelser af totalt calcium i serum, og de primære calciumstandarder fremstilles herudfra ved vejning eller deraf direkte afledte metoder, jfv. den eksperimentelle del. Hensigtsmæssige primære calciumstandarder er f.eks. en standard, som er 1,25 mmolær med hensyn til CaC^ og 146,25 mmolær med hensyn til 30 NaCI, hvilken standard ved 25°C har en ionstyrke på 0,150, og en standard, som er 2,50 mmolær med hensyn til CaC^ og 142,50 mmolær med hensyn til NaCI, hvilken standard ved 25°C har en ionstyrke på 0,150. (Ved 37°C vil den molære koncentration og ionstyrken være 0,4% lavere.)

DK 151919 B

7

Calciumaktiviteten i standarder baseret på en ionstyrke på 0,150 vil være 1,2 - 1,5% højere end en standard baseret på en ionstyrke på 0,160, når standarderne tænkes udmålt mod hinanden med en mættet calomel referenceelektrode. Uoverensstemmelsen mellem standarderne 5 med forskellig ionstyrke kommer imidlertid kun til syne, fordi ioniseret calcium i serum konventionelt angives i koncentrationsenheder i stedet for at benytte en aktivitetsskala, hvor resultatet vil være uafhængigt af den benyttede standards ionstyrke.

Ved anvendelse af de ovennævnte standarder med en ionstyrke på 10 0,150 er der etableret en ny aktivitetsskala, der er proportional med den sande aktivitet med en proportionalitetsfaktor på ca. 3,4.

Til udmåling af referencevæskens pH anvendes som primær standard til anvendelse i fabrikationsleddet hensigtsmæssigt konventionelle phosphatpræcisionspuffere med pH-værdi henholdsvis 6,8 og 7,4, 15 f.eks. "S1500" (sammensætning 3,402 g KH2PO4, 4,450 g t^HPO^^O, 1,000 kg vand, pH-værdi 6,881 ved 20°C) og "S1510" (sammensætning 1,816 g KH2PO4, 9,501 g Na2HPO^.2H20, 1,000 kg vand, pH-værdi 7,426 ved 20°C) fra Radiometer A/S, København.

Ved anvendelsen af referencevæskesystemet .ifølge opfindelsen til 20 kalibrering af instrumenter til måling af calciumioner går man hensigtsmæssigt frem på den måde, at man indfører først den ene og derefter den anden af referencevæskerne i instrumentets indføringssystem for prøve og indstiller udlæsningen eller visningen for henholdsvis calciumelektroden og pH-elektroden på de værdier, der er 25 deklareret på de respektive referencevæsker.

I Analytical Biochemistry 89, 521 - 528 (1978) beskrives anvendelsen af en calciumholdig opløsning, som er 0,1 molær med hensyn til KCI og 20 mmolær med hensyn til HEPES, i forbindelse med kalibreringen af en calciumfølsom elektrode. I den pågældende sammenhæng anven-30 des HEPES imidlertid blot til stabilisering af pH-værdien ved calciummålingen, og der er ingen beskrivelse eller antydning af, at den pågældende væske ville kunne anvendes til samtidig kalibrering af

DK 151919B

8 calciumelektroden og en pH-elektrode, og den pågældende væske har da heller ikke en puffer konstant (5, der ligger i det ønskede område til dette formål, idet den efter den ovenfor angivne form beregnede pufferkonstant β for den pågældende væske er 0,0115, ligesom væsken 5 heller ikke har en ionstyrke, der ligger i det praktiske område 0,15 -0,17, men derimod en meget lavere ionstyrke (0,12).

I M. S. Mohan and R. G. Bates, NBS Special Publication July 1975, 293, beskrives anvendelsen af en standard, som er en blandingstandard for Na, K, Ca, Cl og pH, hvor det benyttede pH-system er 10 TRIS HCI/TRIS. Et sådant puffer-system ville ikke være hensigtsmæssigt til den foreliggende opfindelses formål. For det første har puffer-systemet en pK-værdi på 7,85 ved 37°C, hvilket medfører, at pufferen skulle være meget skævt sammensat for at opnå en pH-værdi omkring 7,4 (TRIS HCI: TRIS = 3:1), hvilket ville medføre, at puf-15 ferkapaciteten ville blive lav i forhold til den anvendte totalkoncentration af puffer, idet det erindres, at kravet til en ionstyrke i det ovenfor angivne område sætter en grænse på ca. 0,15M TRIS HCI.

Det ville være uheldigt at lade TRIS HCI/TRIS dominere opløsningen, da dette ville medføre en stor liquid junction/potential forskel (af 20 størrelsesordenen 2,5 mvolt) i forhold til de primære phosphat-pH-standarder (R. A. Durst and R. G. Bates, NBS Special Publication July 1975, 293). Endvidere er der konstateret uoverensstemmelser mellem TRIS-pufferen og phosphat-pufferen, når disse udmåles over for hinanden på forskelligt pH-blodgasudstyr (J. H. Ladenson et al., 25 Clin.,Chem., 20, (1974), 1337). Endelig ville det ikke være muligt at benytte en TRIS-puffer med pH 6,8 som pH-standard på grund af den endnu meget lavere pufferkapacitet ved denne pH-værdi (TRIS HCI: TRIS = 10:1).

Referencevæsken ifølge den foreliggende opfindelse med dennes ene-30 stående egenskaber og overraskende stabilitetsforhold, som dokumenteres nærmere i den eksperimentelle del, er således ikke nærliggende på baggrund af de ovennævnte litteratursteder.

DK 151919 B

9

Eksperimentel Del.

Opfindelsen belyses nærmere ved følgende eksempler, hvor der anvendes følgende materialer og procedurer:

Calciumcarbonat: Calciumcarbonat zur Analyze, 5 Urtitersubstanz, Merck nr.

2060.

Natriumchlorid: Natriumchlorid, Suprapur,

Merck nr. 6406, calciumindhold: max 1 x 10 ^%.

10 Saltsyre: Salzsaure min. 30% Suprapur,

Merck nr. 318, calciumindhold: max 5 x 10 %.

TRIS: TRIS(hydroxymethyl)amino- methan, TRIZMA BASE, Sigma 15 nr. T1503 Reagent Grade,

Crystalline, Approx. 99,9%.

Deioniseret vand: carbondioxidfrit, lednings evne: < 1μ$.

TES: Sigma nr. T1375, vandfri 20 mol vægt 229,2.

BES: Sigma nr. B9879, vandfri molvægt 213,3.

1M Natriumhydroxidopløsning: Fremstilles som beskrevet af 25 I. Μ. K. Kolthoff og E. B.

Sandell i "Textbook of Quantitative Inorganic Analyses", The Macmillan Company, New York, 1964, 30 side 526 ff.

DK 151919 B

10

Ved fremstilling af calciumstandarder og referencevæsker påses det, at der kun anvendes apparatur, der ikke afgiver calcium eller nogen anden forbindelse, der ville påvirke en calciumionbestemmelse, til den fremstillede væske. Der kan til fremstillingen hensigtsmæssigt anven-5 des specielt rengjort glasapparatur af Duran® eller Pyrex®, der ikke indeholder calcium i glasset. Apparaturet renses først med 10%'s saltsyre i 24 timer og skylles derefter grundigt med deioniseret vand.

Til anvendelse i den primære calciumstandard fremstilles som stamop-løsning en 0,1M calciumchloridopløsning ved at opløse calciumcarbonat 10 i deioniseret, carbondioxidfrit vand og et overskud af 30%'s ren saltsyre og afkoge carbondioxidet.

De anvendte primære standarder betegnet "1,25 mM Ca" og "2,50 mM Ca", fremstilles som følger: a) "1,25 mM Ca": 15 12,50 ml 0,1000 M calciumchloridopløsning, 8,488 g natriumchlorid, 0,1211 g TRIS og ca. 950 ml deioniseret vand omrøres, indtil alt fast stof er opløst, pH-værdien indstilles til 7,38 med saltsyre, og der opfyldes med deioniseret vand til et totalvolumen på 1 liter. Opløsningen fyldes på klare Fiolax-glasampuller, der lukkes og autoklave-20 res.

Den færdige opløsning har følgende sammensætning: 1,250 mM Ca

145,25 mM NaCI

1.00 mM TRIS 25 pH = 7,40

I = 0,150 M

b) "2,50 mM Ca": 25.00 ml 0,1000 M calciumchloridopløsning, 8,269 g natriumchlorid, 0,1211 g TRIS og ca. 950 ml deioniseret vand blandes og omrøres, 30 indtil alt fast stof er opløst, pH-værdien indstilles til 6,84 med salt-

DK 151919B

11 syre, og der tilsættes deioniseret vand til et totalvolumen på 1 liter. Opløsningen fyldes på klare Fiolax-glasampuller, som lukkes og autoklaveres.

Den færdige opløsning har følgende sammensætning: 5 2,500 mM Ca

141,5 mM NaCI

1,00 mM TRIS pH = 6,85 I = 0,150 M

10 Eksempel 1.

Til 19,07 g TES, 14,30 ml 0,1000 M calciumchloridopløsning, 50,286 ml 1M natriumhydroxidopløsning og 5>597 g natriumchlorid sættes deioniseret, carbondioxidfrit og kimfrit vand til et totalvolumen på 1000 ml, og komponenterne omrøres under argon, indtil alt fast stof er opløst.

15 Den færdige referencevæske opbevares under argon og kontrolmåles for pH-værdi og calciumioner som forklaret nedenfor.

Når referencevæsken er kontrolmålt og eventuelt korrigeret, fyldes den under en argonatmosfære i 3 ml's knækampuller af klart Fiolax-glas, idet ampullerne før påfyldningen er skyllet med argon. Ampul-20 lerne tilsmeltes og opvarmes til 120°C i 20 minutter, idet opvarmningen fra 100 til 120°C og afkølingen fra 120 til 100°C sker på 10 minutter.

Den fremstillede referencevæske har en fri calciumionkoncentration på 1,25 mM, en pH-værdi på 7,383 og en ionstyrke på 0,150.

25 Eksempel 2.

På lignende måde som beskrevet i eksempel 1 fremstilles ud fra 22,98 g BES, 27,51 ml 0,1000 M calciumchloridopløsning, 50,578 ml 1M

DK 151919 B

12 natriumhydroxidopløsning, 5,357 g natriumchlorid og deioniseret, carbondioxidfrit og kimfrit vand til et totalvolumen på 1000 ml en referencevæske, som ligeledes under en argonatmosfære på den i eksempel 1 beskrevne måde fyldes i 3 ml’s knækampuller af glas.

5 Den fremstillede referencevæske har en fri calciumion koncentration på 2,50 mM, en pH-værdi på 6,841 og en ionstyrke på 0,150.

De i eksempel 1 og 2 fremstillede referencevæsker kontrolmåles for pH-værdi og calciumioner ved 37°C. Målingerne udføres som sammenlignende, relative potentiometriske målinger. pH-elektroden er kali-10 breret på phosphatpuffere med kendte korrektioner. Calciumelektroden er kalibreret på "1,25 mM Ca"- og "2,50 mM Ca"-standardopløsnin-gerne.

Såfremt kontrolmålingen viser, at referencevæsken afviger fra de ovennævnte værdier, foretages der en korrektion af referencevæsken 15 på følgende måde:

Hvis indholdet af calciumioner findes at være højere end den deklarerede værdi, tilsættes den beregnede mængde deioniseret, carbondioxidfrit og kimfrit vand. Såfremt calciumionindholdet er for lavt, tilsættes den beregnede mængde 0,1000 M calciumchloridopløsning. En 20 afvigelse af pH-værdien for den ønskede værdi reguleres af tilsætning af enten den beregnede mængde natriumhydroxidopløsning eller den beregnede mængde saltsyre. Efter denne eventuelle korrektion af hovedbatchen foretages der kontrolmåling til sikring af, at den fremtidige referencevæske nu overholder de deklarerede værdier for pH 25 og indholdet af calciumioner. De foretagne finjusteringer er i praksis så små, at eventuelle ionstyrkeændringer er betydningsløse.

Eksempel 3.

To referencevæsker fremstilles og langtidstestes til konstatering af deres langtidsstabilitet. Referencevæskerne fremstilles som følger:

DK 151919 B

13 "TES 1,25".

Denne fremstilles på lignende måde som beskrevet i eksempel 1 ud fra 27,958 g NaCI, 96,24 g TES, 71,50 ml 0,1000 M calciumchloridopløsning og 253,33 ml 0,9928 molær natriumhydroxidopløsning og deioniseret, 5 carbondioxidfrit og kimfrit vand til et totalvolumen på 5 liter.

"BES 2,50".

Denne fremstilles på lignende måde som beskrevet i eksempel 1 ud fra 26,785 g NaCI, 114,79 g BES, 137,55 ml 0,1000 M CaCI2 og 254,72 ml 0,9928 molær natriumhydroxidopløsning og deioniseret, carbondioxid-10 frit og kimfrit vand til et totalvolumen på 5 liter.

Efter kontrolmåling som beskrevet ovenfor emballeres de to referencevæsker i 3 ml's knækampuller og autoklaveres på samme måde som beskrevet i eksempel 1. Ampullerne med referencevæske opbevares ved 25°C, og referencevæskernes data bestemmes (måletemperatur 15 37°C) over en længere periode. Resultaterne fremgår af nedenstående tabel, hvor de anførte værdier er middeltal og standardafvigelser baseret på 12 prøver.

TABEL

Tid efter fremstilling TES 1,25 BES 2,50 20 _ pH mM Ca pH mM Ca 1 uge 7,386 1,245 6,841 2,494 ± 0,002 ± 0,008 ± 0,001 ± 0,009 25 3 uger 7,386 1,251 6,840 2,495 ±0,001 ± 0,006 ±0,001 ±0,011 3 måneder 7,386 1,246 6,841 2,504 ± 0,001 t 0,006 ± 0,001 ± 0,008

Claims

1. Fremgangsmåde til kalibrering og/eller kvalitetskontrol af både den calciumfølsomme elektrode og pH-elektroden i instrumenter, der er beregnet til bestemmelse af calciumioner og pH-vasrdi i biologiske 5 væsker, og som indeholder en calciumfølsom elektrode og en pH-elek-trode, ved hvilken fremgangsmåde den calciumfølsomme elektrode og pH-elektroden samtidig underkastes kalibrering og/eller kvalitetskontrol under anvendelse af en referencevæske, som ved en nærmere bestemt temperatur har en nærmere bestemt calciumionaktivitet og en 10 nærmere bestemt pH-værdi, kendetegnet ved, at referencevæskens nærmere bestemte pH-værdi er tilvejebragt med en pH-puffer, der består af en alkansulfonsyre med 2-3 carbonato-mer i alkandelen og med en nitrogenholdig basisk gruppe knyttet til 15 alkandelen via et nitrogenatom i gruppen, og denne syres salt, idet syren har en pK-værdi i området 6,6 - 7,6 ved 37°C, at referencevæskens pufferkapacitet ligger i området 0,04 - 0,10, fortrinsvis i området 0,05 - 0,08, og at referencevæsken har en ionstyrke på 0,15 - 0,17.

2. Referencevæske til kalibrering og/eller kvalitetskontrol af både den calciumfølsomme elektrode og pH-elektroden i instrumenter, der er beregnet til bestemmelse af indholdet af ioniseret calcium og pH i biologiske væsker, hvilken referencevæske ved en nærmere bestemt temperatur har en nærmere bestemt calciumionaktivitet og en nærmere 25 bestemt pH-værdi, kendetegnet ved, at referencevæskens nærmere bestemte pH-værdier er tilvejebragt med en pH-puffer, der består af en alkansulfonsyre med 2-3 carbonatomer i alkandelen og med en nitrogen-holdig basisk gruppe knyttet til alkandelen via et nitrogenatom i 30 gruppen, og denne syres salt, idet syren har en pK-værdi i området 6,6-7,6 ved 37°C, DK 151919B at referencevæskens pufferkapacitet ligger i området 0,04 - 0,10, fortrinsvis i området 0,05 - 0,08, og at referencevæsken har en ionstyrke på 0,15 - 0,17.

3. Referencevæske ifølge krav 2, 5 kendetegnet ved, at alkansulfonsyren er valgt blandt 3-(N-morpholino)propansulfonsyre (MOPS), piperazin-N,N'-bis(2-ethansulfonsyre) (PI PES), N- (2-acetamido) -2-ami noethansulfonsy re (ACES), N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsyre (BES), N-TRIS(hydroxymethyl)-methyl-2-aminoethansulfonsyre (TES) og 10 N-2-hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsyre (HEPES).

4. Reference væskesystem til topunktskalibrering eller kvalitetskontrol af instrumenter til bestemmelse af ioniseret calcium og pH i biologiske væsker omfattende to referencevæsker ifølge krav 2 eller 3, kendetegnet ved, at den ene reference væskes pH-værdi 15 ligger i den nedre ende af det biologiske område, fortrinsvis omkring pH 6,8, og at den anden referencevæskes pH-værdi ligger omkring normalværdien for plasma, dvs. omkring pH 7,4.